CN1148230C - 复合人工皮肤的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于对人体各部的人造代用品或替代物，具体涉及一种人工皮肤的制备方法，它包括各种溶液的配制、基质凝胶的制备和细胞的三维培养，基质凝胶由I、III型人胶原，壳多糖，硫酸软骨素，硫酸肝素，弹性蛋白，透明质酸，或/和纤维粘连蛋白组成。本发明方法制备的人工皮肤，弹性和柔韧性好，能象天然皮肤一样剪切，缝合，收缩率低，抗感染能力高，用于皮肤缺损的移植治疗效果好。
Description
本发明属于对人体各部的人造代用品或替代物，具体涉及活性皮肤替代物——一种人工皮肤的制备方法。
复合人工皮肤在临床上用于皮肤缺损的移植治疗，促进皮肤创面的愈合，减少疤痕形成，尤其在大面积烧伤的情况下，自体皮源不足时，用这种人工皮肤能及时覆盖创面，减少体液丢失，减轻痛苦和避免感染，并使创伤皮肤得以修复。它是一种由表皮层和真皮层组成的双层复合人工皮肤，而表皮层是由表皮细胞(角质形成细胞)分化形成的，真皮层是由成纤维细胞或其它间质细胞(如毛乳细胞，真皮鞘细胞)接种于胶原基质中形成的。近十年来，人工皮肤的制备技术在不断进步，与本发明比较接近的现有技术有专利文献A——1991年10月31公开的世界专利WO9116,010，该复合活性皮肤替代物由培养的角朊细胞形成的表皮层，高纯度的无孔胶原层和培养的成纤维细胞接种于有孔的交联胶原海绵中形成的真皮层组成，胶原为I、III型牛胶原或者两种的混合物。这种人工皮肤的移植成功率可达90％，但它存在以下缺陷：①真皮基质成分单一，仅为胶原；②使用牛胶原，可能诱发免疫反应及传播病毒；③胶原海绵是用0.25％戊二醛交联的，而戊二醛是一种细胞毒剂会导致细胞死亡；④抵抗胶原酶消化和抗感染能力较差。还有专利文献B——1997年7月8日公开的日本特许公开JP97,173,362，它是用胶原、甲壳素、壳多糖、明胶、透明质酸、硫酸软骨素和聚乙醇酸作为培养皮肤的基本材料，培养哺乳动物皮肤来源的细胞，然后冻干制作出可长期保存的人工皮肤，但它存在着以下缺陷：①虽然在文献中述及有多种基质成分，但主要应用的是胶原和透明质酸两个成分，其他成分的组成未见叙述；②它利用氨气中和来制作胶原凝胶，不适合细胞培养；③抵抗胶原酶消化和抗感染能力较差；④使用的是牛胶原，有传播病毒的可能；⑤培养细胞的时间短，形成的培养皮肤在组织结构上与天然皮肤有较大差距。
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，设计一种基质原料组分和工艺技术都有别于现有技术的复合人工皮肤制备方法，使其制得的人工皮肤在物理学特征、组织学检查和动物移植试验结果方面都比现有技术的效果要好。
采用以下技术方案来实现本发明的目的。
一种复合人工皮肤的制备方法，包括溶液的配制、基质凝胶的制备和细胞的三维培养。
一.溶液的配制
在无菌条件下分别配制下列溶液：
A.按63∶37取I、III型人胶原，先用胃蛋白酶消化除去胶原的末端，然后用醋酸配制浓度为2-10mg/ml的胶原醋酸溶液；
B.取壳多糖配制浓度为0.1-5.0mg/ml的壳多糖醋酸溶液；
C.用pH8.0，0.2MTris液和弹性蛋白配制浓度为0.05-5.0mg/ml的弹性蛋白Tris溶液；
D.取透明质酸、硫酸软骨素和硫酸肝素配制出每毫升含0.002-0.3mg透明质酸，0.001-0.5mg硫酸软骨素和0.05-5.0ug硫酸肝素的水溶液；
E.用D-Hanks液和纤维粘连蛋白配制浓度为0.01-5mg/ml的纤维粘连蛋白溶液。
二.基质凝胶的制备
在冰浴中，用A溶液8份，B溶液1份，与浓缩了一倍的内含40％新生牛血清、200U/ml青霉素、200ug/ml链霉素的DMEM培养基10份，在已消毒的玻璃瓶中混合，加入C溶液0.5份和D溶液0.5份，最好再加入E溶液0.5份混均，然后用1NNaOH和1NHCl调节pH至7.2-7.4，再快速加入浓度为2-3×105个细胞/ml的成纤维细胞小牛血清悬液1份，快速混均后在室温下自然形成基质凝胶；
三.细胞的三维培养
在37℃，95％空气/5％CO2和饱和湿度下的CO2孵箱中对形成的基质凝胶进行细胞的三维培养基，即在孵箱中先将基质凝胶的成纤维细胞培养1-2周，每隔2-3天更换一次培养基，然后换用内含10％小牛血清、表皮细胞生长因子10ng/ml，氢化可以松0.4ug/ml、胰岛素5ug/ml的表皮细胞培养基40-80份，按1-5×105个细胞/cm2基质凝胶接种表皮细胞，浸没培养3-10天，在接种表皮细胞之前最好在基质凝胶上放置横截面略小于凝胶表面的导管，以避免接种的表皮细胞溢出凝胶，接种10-20分钟后取出导管；待表皮细胞生长融合后，用不锈钢筛网做支持，将人工皮肤升至气液界面，补加适量表皮细胞培养基，继续培养7-14天，待表皮细胞生长分化良好后即可进行人工皮肤的移植或进行组织学检查；在表皮细胞培养期间，每天更换一次培养基。
按照本发明方法制备的人工皮肤具有良好的物理学特征，它的弹性和柔韧性好，能抵抗一定的拉力，而且能象天然皮肤一样剪切，缝合，大小和形状可随创面而变，移植手术简单；基质凝胶的收缩率低，抵抗胶原酶消化和抗感染能力高，能够防止微生物的侵袭并能抵御伤口微生物的感染，移植后换药次数减少，术后护理也简单。本发明的人工皮肤经过组织学检查，真皮基质为均匀的有孔胶状基质，孔径略大于成纤维细胞，成纤维细胞在真皮基质中生长均匀；人工皮肤的表皮分化良好，层次清楚，有基底层、棘层、角质层；真表皮形成了呈波浪状的交界，并且出现了呈条索状细胞团向真皮替代物中生长。本发明的人工皮肤用新西兰家兔作了动物移植试验，试验结果表明，移植后的人工皮肤与周围皮肤融合成一体，真皮替代物中有大量的血管腔形成，胶原排列由紊乱变成规则的水平排列，表皮分化良好，有表皮钉突形成。
附图为本发明培养的人工皮肤组织学结构图(H.E染色X100倍)
实施例
在无菌条件下分别配制下列溶液：A-按63∶37取I、III型人胶原，先用胃蛋白酶消化除去胶原的求端，然后用醋酸配制浓度为4mg/ml的胶原醋酸溶液；B-取壳多糖配制浓度为4.5mg/ml的壳多糖醋酸溶液；C-用PH8.0，0.2MTris液和弹性蛋白配制浓度为1.5mg/ml的弹性蛋白Tris溶液；D-取透明质酸、硫酸软骨素和硫酸肝素配制出每毫升含0.1mg透明质酸、0.3mg硫酸软骨素和0.005mg硫酸肝素的水溶液；用D-Hanks液和纤维粘连蛋白配制浓度为5mg/ml的纤维粘连蛋白溶液。在冰浴中，用A溶液8ml，B溶液1ml，与浓缩了一倍的内含40％新生牛血清，200U/ml，青霉素，200ug/ml链霉素的DMEM培养基10ml，在已清毒的玻璃瓶中混合，加入C溶液0.5ml和D溶液0.5ml，再加E溶液0.5ml混均，然后用1NNaOH和1NHCl调节pH至7.2-7.4，再快速加入浓度为2.5×105个细胞/ml的成纤维细胞小牛血清悬液1ml，快速混均后在室温下自然形成基质凝胶。在37℃，95％空气/5％CO2和饱和湿度下的孵箱中对形成的基质凝胶进行细胞的三维培养，即在孵箱中先将基质凝胶的成纤维细胞培养1-2周，每隔2-3天更换一次培养基；然后换用内含10％小牛血清，表皮细胞生长因子10ng/ml、氢化可的松0.4ug/ml、胰岛素5ug/ml的表皮细胞培养基60ml，按2×105个细胞/cm2基质凝胶接种表皮细胞，浸没培养3-10天，待表皮细胞生长融合后，用不锈钢筛网做支持，将人工皮肤升至气液界面，补加适量表皮细胞培养基，再培养7-14天，待表皮细胞生长分化良好后即可进行人工皮肤的移植或进行组织学检查。为避免接种的表皮细胞溢出凝胶，接种时在凝胶上放置横截面略小于凝胶表面的玻璃导管，接种10-20分钟后取掉。在表皮细胞培养期间，每天更换一次培养基液。
Claims (3)
1.一种复合人工皮肤的制备方法，包括溶液的配制、基质凝胶的制备和细胞的三维培养，其特征在于：
1)所说的溶液的配制是在无菌条件下分别配制以下溶液，A.按63∶37取I、III型人胶原，先用胃蛋白酶消化除去胶原的末端，然后用醋酸配制浓度为2-10mg/ml的胶原醋酸溶液，B.取壳多糖配制浓度为0.1-5.0mg/ml的壳多糖醋酸溶液，C.用pH8.0，0.2MTris液和弹性蛋白配制浓度为0.05-5.0mg/ml的弹性蛋白Tris溶液，D.取透明质酸、硫酸软骨素和硫酸肝素配制出每毫升含0.002-0.3mg透明质酸，0.001-0.5mg硫酸软骨素和0.05-5.0ug硫酸肝素的水溶液，E.用D-Hanks液和纤维粘连蛋白配制浓度0.01-5mg/ml的纤维粘连蛋白溶液；
2)所说的基质凝胶的制备，是在冰浴中，用A溶液8份，B溶液1份，与浓缩了一倍的内含40％新生牛血清、200U/ml青霉素、200ug/ml链霉素的DMEM培养基10份，在已消毒的玻璃瓶中混合，加入C溶液0.5份和D溶液0.5份，混均，然后用1NNaOH和1NHCl调节pH至7.2-7.4，再快速加入浓度为2-3×105个细胞/ml的成纤维细胞小牛血清悬液1份，快速混均后在室温下自然形成基质凝胶；
3)所说的细胞的三维培养，是在37℃，95％空气/5％CO2和饱和湿度下的CO2孵箱中对形成的基质凝胶进行细胞的三维培养，即在孵箱中先将基质凝胶的成纤维细胞培养1-2周；然后换用内含10％小牛血清、表皮细胞生长因子10ng/ml、氢化可的松0.4ug/ml、胰岛素5ug/ml的表皮细胞培养基40-80份，按1-5×105个细胞/cm2基质凝胶接种表皮细胞，浸没培养3-10天；待表皮细胞生长融合后，用不锈钢筛网做支持，将人工皮肤升至气液界面，补加适量表皮细胞培养基，继续培养7-14天。
2.按照权利要求1所述的复合人工皮肤的制备方法，其特征还在于所说的基质凝胶的制备是在加入C溶液和D溶液之后再加入E溶液0.5份。
3.按照权利要求1或2所述的复合人工皮肤的制备方法，其特征还在于所述的细胞的三维培养，是在接种表皮细胞之前在基质凝胶上放置横截面略小于凝胶表面的导管，接种10-20分钟后取出导管。
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