CN104068945B

CN104068945B - 一种人工皮肤及其制备方法

Info

Publication number: CN104068945B
Application number: CN201410301553.0A
Authority: CN
Inventors: 谭荣伟; 许孟强
Original assignee: SHENZHEN QIKANG MEDICAL DEVICES CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN QIKANG MEDICAL DEVICES CO Ltd
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2034-06-27
Also published as: CN104068945A

Abstract

本发明公开了一种人工皮肤及其制备方法。本发明提供了一种结构可控的、包括表皮层和双层真皮层的人工皮肤，真皮层上层为平行排列的微槽结构，下层为三维网状结构。该人工皮肤在成纤维细胞迁移速率、降解速率和抗瘢痕效果上具有明显的优势。本发明通过三维打印的方式制备得到真皮支架，结构控制更加精确，制备工艺简单，废品率低，经济效益更显著。

Description

一种人工皮肤及其制备方法

技术领域

本发明属于仿生材料技术领域，特别涉及一种人工皮肤及其制备方法。

背景技术

皮肤作为人体最大的器官，起到保护、感知和调节作用。当由于外界损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时，其危害可以极轻微，也可以是致命的。

从上世纪90年代初，国外皮肤修复技术开始以人工合成真皮支架为主流，已有多种产品得到广泛应用，如Integra、Dermagraft、皮耐克等，其临床效果较好，但在长期效果如抑制瘢痕增生、皮肤外观和功能恢复与重建等方面还存在诸多挑战。

天然的真皮基质主要是胶原纤维和弹性纤维构成，二者互相交织在一起，真皮组织的厚薄与其纤维组织和基质的多少关系密切，并与皮肤的致密性、饱满度、松弛和起皱现象密切相关。同时真皮中的胶原纤维均结合成束。真皮越往上部越细，越往下越粗。在真皮中部和下部，胶原束的方向几乎与皮面平行，并互相交织在一起，在同一水平面上向各个方向延伸，有利于血管化和自体细胞长入。

目前，在胎儿无瘢痕愈合的研究中已证实，胎儿真皮的胶原纤维排列成网状，纤维较细但纤维间间隙致密，创伤愈合后的胶原支架与周围正常组织几乎完全相同；成人真皮胶原纤维束粗大，胶原纤维间间隙较胎儿真皮明显疏松，创伤愈合后真皮胶原纤维的网状结构消失，胶原纤维呈平行排列，与创面垂直，导致瘢痕形成。进一步的研究发现，成纤维细胞的迁移、分裂和分泌细胞外基质的速度等都是其无瘢痕愈合的基础，真皮中胶原纤维排列的方式对创面愈合后有无瘢痕形成至关重要。

目前的人工真皮支架模拟了胶原纤维的三维网状结构，研究发现，虽然致密的支架抗瘢痕效果好，但会限制成纤维细胞快速达到创面位置，导致真皮支架渗透性差、血管化速率慢、抗感染效果不佳；疏松的支架有利于血管和成纤维细胞的快速长入，但后期抗瘢痕效果较差。

另外，现有人工皮肤的缺点还表现在：应用于创伤处时较难实现可靠固定（尤其对于不规则或凹面的身体部位，或者小孩），植入后人工皮肤下面容易引起感染，或有血块产生，能否克服该缺点将对产品植入的成功与否有着重要影响。研究证明，采用联合使用负压引流护理，可以有效地实现产品的可靠固定，并且可及时排除伤口分泌物、血块等，降低了血清凝块、血肿以及感染的发生。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人工皮肤及其制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种人工皮肤，包括真皮层，所述真皮层为由胶原束制成的双层结构，其中，上层为平行排列的微槽结构，下层与创面接触，为三维网状结构。

优选的，所述真皮层上层的厚度为10～200μm，相邻微槽间距为10～100μm，胶原束直径为10～200μm；所述真皮层下层的厚度为2～4mm，三维网状结构的孔径为100～200μm，胶原束直径为100～200μm。

优选的，所述胶原束包含I型胶原蛋白和载生长因子的微球，其中，微球直径为20～100nm。

优选的，所述人工皮肤还包括与真皮层上层结合的表皮层。

优选的，所述表皮层上密布有微孔，微孔孔径为0.1～3mm，孔间距为1～10mm，表皮层厚度为0.2～0.5mm。

优选的，所述表皮层由聚氨酯、硅橡胶或聚对苯二甲酸乙二醇酯制成。

一种人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：将真皮层的双层结构模型导入三维打印机中；将I型胶原蛋白用醋酸溶液溶解，加入戊二醛和载生长因子的微球，混均，真空脱泡，得打印材料；将打印材料置于三维打印设备的墨盒中，进行三维打印，得到真皮层，即为人工皮肤。

优选的，打印材料中I型胶原蛋白的浓度为1～20wt%，戊二醛的浓度为0.10～0.50wt%，微球的浓度为0.01～0.2wt%。

优选的，利用两个喷嘴分别打印真皮层的上下层结构，喷嘴到打印平台的距离为20～40mm，打印材料的挤出速率为6～10mm•s^-1，打印平台的温度为-10～4℃。

优选的，还包括以下步骤：在聚氨酯、硅橡胶或聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上制备微孔，得到表皮层；将表皮层和真皮层通过黏合剂结合，即为人工皮肤。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种结构可控的、包括表皮层和双层真皮层的人工皮肤，真皮层上层为平行排列的微槽结构，有利于成纤维细胞快速迁移，长入创面，促进创面愈合；真皮层下层为三维网状结构，降解速度较为缓慢，在愈合后期发挥抗瘢痕作用。

本发明人工皮肤具有很好的生长因子缓释功能，缓释周期为3～4周；并且，通过精确的尺寸控制，使得真皮层在创面愈合后迅速降解。因此，该人工皮肤在成纤维细胞迁移速率、降解速率和抗瘢痕效果上具有明显的优势。

本发明方法制备的人工皮肤，具有较高的撕裂强度，在临床上使用更加方便，可与负压引流装置联合使用；通过三维打印的方式制备得到的真皮支架，结构控制更加精确，制备工艺简单，废品率低，经济效益更显著。

附图说明

图1为人工皮肤的结构示意图。

具体实施方式

本发明所采取的技术方案是：

如图1所示的，一种人工皮肤，包括真皮层，所述真皮层为由胶原束制成的双层结构，其中，上层为平行排列的微槽结构，下层与创面接触，为三维网状结构。优选的，所述真皮层上层的厚度为10～200μm，相邻微槽间距为10～100μm，胶原束直径为10～200μm；所述真皮层下层的厚度为2～4mm，三维网状结构的孔径为100～200μm，胶原束直径为100～200μm。优选的，所述胶原束包含I型胶原蛋白和载生长因子的微球，其中，微球直径为20～100nm。

所述生长因子优选为表皮细胞生长因子、重组表皮细胞生长因子、真皮细胞生长因子、重组真皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子中的至少一种。微球中生长因子占0.05～1wt%。微球优选由聚乳酸-聚乙醇酸组成。

如图1所示的，优选的，所述人工皮肤还包括与真皮层上层结合的表皮层。

优选的，所述表皮层上密布有微孔，微孔孔径为0.1～3mm，孔间距为1～10mm，表皮层厚度为0.2～0.5mm。优选的，所述表皮层由聚氨酯、硅橡胶或聚对苯二甲酸乙二醇酯制成。

优选的，醋酸溶液的浓度为0.10～0.50mol/L。

优选的，利用两个喷嘴分别打印真皮层的上下层结构，用于打印下层的喷嘴口径为100～200μm，用于打印上层的喷嘴口径为10～200μm，喷嘴到打印平台的距离为20～40mm，打印材料的挤出速率为6～10mm•s^-1，打印平台的温度为-10～4℃。

黏合剂优选为生物相容性良好的制剂，例如α-氨基丙烯酸酯、硅橡胶粘合剂等。

优选的，所述表皮层通过激光微加工技术制备。激光微加工技术打孔可制备小孔径、边缘光滑清洁的微孔，避免传统机械打孔工艺容易产生碎屑的缺陷，也不会产生边缘缺陷导致应力集中而降低表皮层的力学强度。

实施例 1

一种人工皮肤，包括表皮层和真皮层；其中，表皮层上密布有孔径为100μm的微孔，孔间距为1mm，表皮层厚度为0.2mm；真皮层为由胶原束制成的双层结构，其中，上层与表皮层结合，为平行排列的微槽结构，其厚度为10μm，相邻微槽间距为10μm，胶原束直径为10μm，下层与创面接触，为三维网状结构，其厚度为2mm，三维网状结构的孔径为100μm，胶原束直径为150μm。所述胶原束包含I型胶原蛋白和载生长因子的微球。

上述人工皮肤的制备方法，制备方法如下：

（1）将上述真皮层的双层结构模型导入三维打印机中；

（2）将I型胶原蛋白用0.1mol/L醋酸溶液溶解混匀后，加入戊二醛和直径为20nm的载有0.05wt%表皮细胞生长因子的微球，继续搅拌30min，混均，真空脱泡，得打印材料，打印材料中I型胶原蛋白的浓度为1wt%，戊二醛的浓度为0.20wt%，微球的浓度为0.01wt%；

（3）将打印材料置于三维打印设备的墨盒中，进行三维打印，利用两个喷嘴分别打印真皮层的上下层结构，得到真皮层：其中，一个喷嘴用于打印下层，喷嘴口径为100μm；另一个喷嘴用于打印上层，喷嘴口径为10μm；喷嘴到打印平台的距离为20mm，打印材料挤出速率为6mm·s^-1，打印平台的温度为-10℃；

（4）通过激光微加工技术在聚氨酯薄膜上制备微孔，得到表皮层；

（5）使用黏合剂α-氨基丙烯酸酯将表皮层和真皮层结合，得到人工皮肤。

实施例 2

一种人工皮肤，包括表皮层和真皮层；其中，表皮层上密布有孔径为300μm的微孔，孔间距为2mm，表皮层厚度为0.2mm；真皮层为由胶原束制成的双层结构，其中，上层与表皮层结合，为平行排列的微槽结构，其厚度为100μm，相邻微槽间距为100μm，胶原束直径为100μm，下层与创面接触，为三维网状结构，其厚度为3.5mm，三维网状结构的孔径为150μm，胶原束直径为100μm。所述胶原束包含I型胶原蛋白和载生长因子的微球。

上述人工皮肤的制备方法，制备方法如下：

（1）将上述真皮层的双层结构模型导入三维打印机中；

（2）将I型胶原蛋白用0.3mol/L醋酸溶液溶解混匀后，加入戊二醛和直径为50nm的载有0.30wt%表皮细胞生长因子的微球，继续搅拌40min，混均，真空脱泡，得打印材料，打印材料中I型胶原蛋白的浓度为5wt%，戊二醛的浓度为0.25wt%，微球的浓度为0.1wt%；

（3）将打印材料置于三维打印设备的墨盒中，进行三维打印，利用两个喷嘴分别打印真皮层的上下层结构，得到真皮层：其中，一个喷嘴用于打印下层，喷嘴口径为100μm；另一个喷嘴用于打印上层，喷嘴口径为100μm；喷嘴到打印平台的距离为30mm，打印材料挤出的速率为8mm·s^-1，打印平台的温度为0℃；

（4）通过激光微加工技术在硅橡胶薄膜上制备微孔，得到表皮层；

（5）使用黏合剂硅橡胶粘合剂将表皮层和真皮层结合，得到人工皮肤。

实施例 3

一种人工皮肤，包括表皮层和真皮层；其中，表皮层上密布有孔径为1mm的微孔，孔间距为5mm，表皮层厚度为0.4mm；真皮层为由胶原束制成的双层结构，其中，上层与表皮层结合，为平行排列的微槽结构，其厚度为200μm，相邻微槽间距为100μm，胶原束直径为200μm，下层与创面接触，为三维网状结构，其厚度为4mm，三维网状结构的孔径为200μm，胶原束直径为200μm。所述胶原束包含I型胶原蛋白和载生长因子的微球。

上述人工皮肤的制备方法，制备方法如下：

（1）将上述真皮层的双层结构模型导入三维打印机中；

（2）将I型胶原蛋白用0.5mol/L醋酸溶液溶解混匀后，加入戊二醛和直径为100nm的载有1wt%表皮细胞生长因子的微球，继续搅拌60min，混均，真空脱泡，得打印材料，打印材料中I型胶原蛋白的浓度为20wt%，戊二醛的浓度为0.50wt%，微球的浓度为0.2wt%；

（3）将打印材料置于三维打印设备的墨盒中，进行三维打印，利用两个喷嘴分别打印真皮层的上下层结构，得到真皮层：其中，一个喷嘴用于打印下层，喷嘴口径为200μm；另一个喷嘴用于打印上层，喷嘴口径为200μm；喷嘴到打印平台的距离为20mm，打印材料挤出的速率为10mm·s^-1，打印平台的温度为4℃；

实施例 4

一种人工皮肤，包括表皮层和真皮层；其中，表皮层上密布有孔径为2mm的微孔，孔间距为10mm，表皮层厚度为0.4mm；真皮层为由胶原束制成的双层结构，其中，上层与表皮层结合，为平行排列的微槽结构，其厚度为50μm，相邻微槽间距为50μm，胶原束直径为50μm，下层与创面接触，为三维网状结构，其厚度为4mm，三维网状结构的孔径为150μm，胶原束直径为100μm。所述胶原束包含I型胶原蛋白和载生长因子的微球。

上述人工皮肤的制备方法，制备方法如下：

（1）将上述真皮层的双层结构模型导入三维打印机中；

（2）将I型胶原蛋白用0.35mol/L醋酸溶液溶解混匀后，加入戊二醛和直径为40nm的载有0.60wt%表皮细胞生长因子的微球，继续搅拌40min，混均，真空脱泡，得打印材料，打印材料中I型胶原蛋白的浓度为10wt%，戊二醛的浓度为0.25wt%，微球的浓度为0.10wt%；

（3）将打印材料置于三维打印设备的墨盒中，进行三维打印，利用两个喷嘴分别打印真皮层的上下层结构，得到真皮层：其中，一个喷嘴用于打印下层，喷嘴口径为100μm；另一个喷嘴用于打印上层，喷嘴口径为50μm；喷嘴到打印平台的距离为20mm，打印材料挤出的速率为7mm·s^-1，打印平台的温度为2℃；

（4）通过激光微加工技术在聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上制备微孔，得到表皮层；

实施例 5

一种人工皮肤，包括表皮层和真皮层；其中，表皮层上密布有孔径为3mm的微孔，孔间距为5mm，表皮层厚度为0.5mm；真皮层为由胶原束制成的双层结构，其中，上层与表皮层结合，为平行排列的微槽结构，其厚度为100μm，相邻微槽间距为50μm，胶原束直径为100μm，下层与创面接触，为三维网状结构，其厚度为3mm，三维网状结构的孔径为150μm，胶原束直径为100μm。所述胶原束包含I型胶原蛋白和载生长因子的微球。

上述人工皮肤的制备方法，制备方法如下：

（1）将上述真皮层的双层结构模型导入三维打印机中；

（2）将I型胶原蛋白用0.1mol/L醋酸溶液溶解混匀后，加入戊二醛和直径为30nm的载有0.30wt%表皮细胞生长因子的微球，继续搅拌30min，混均，真空脱泡，得打印材料，打印材料中I型胶原蛋白的浓度为1wt%，戊二醛的浓度为0.30wt%，微球的浓度为0.10wt%；

（3）将打印材料置于三维打印设备的墨盒中，进行三维打印，利用两个喷嘴分别打印真皮层的上下层结构，得到真皮层：其中，一个喷嘴用于打印下层，喷嘴口径为150μm；另一个喷嘴用于打印上层，喷嘴口径为100μm；喷嘴到打印平台的距离为20mm，打印材料挤出的速率为6mm·s^-1，打印平台的温度为-10℃；

实施例6

一种人工皮肤，由真皮层单独组成；真皮层为由胶原束制成的双层结构，其中，上层与表皮层结合，为平行排列的微槽结构，其厚度为50μm，相邻微槽间距为60μm，胶原束直径为50μm，下层与创面接触，为三维网状结构，其厚度为3mm，三维网状结构的孔径为150μm，胶原束直径为200μm。所述胶原束包含I型胶原蛋白和载生长因子的微球。

上述人工皮肤的制备方法，制备方法如下：

（1）将上述真皮层的双层结构模型导入三维打印机中；

（3）将打印材料置于三维打印设备的墨盒中，进行三维打印，利用两个喷嘴分别打印真皮层的上下层结构，得到真皮层：其中，一个喷嘴用于打印下层，喷嘴口径为200μm；另一个喷嘴用于打印上层，喷嘴口径为50μm ；喷嘴到打印平台的距离为20mm，打印材料挤出的速率为5mm·s^-1，打印平台的温度为-10℃。

所得真皮层下层孔径大小为150μm，完全降解时间为21天，生长因子缓释周期为20天。

性能测试：

实施例1～5人工皮肤的相关性能测试结果如下表所示：

表皮层撕裂强度测试，采用传统的机械打孔制备微孔孔径为0.1～3mm、孔间距为1～10mm的表皮层，为对照组。

采用扫描电镜观察真皮层下层孔径大小，以涂膜冻干法制备的真皮层支架作为对照组。

真皮层下层降解周期测试：将真皮层（共5组样，每组样品数n=3）在28℃干燥箱中干燥48 h后称重，取20 mg浸入1 mL PBS 液（pH7.4，含0.2 U/mL蛋白酶XI V），置于37℃恒温箱中，每24小时更换1次降解液。于降解第1～7d及2、3、4周后取出样本，28℃干燥箱中干燥48 h后称重，观察降解完全所需要的时间，为实验组。同法取涂膜冻干法制备的真皮层支架进行降解周期测试，为对照组。

生长因子缓释周期测试，参考文献“Bioactivation of collagen matrices through sustained VEGF release from PLGA microspheres. J Biomed Mater Res A. 2010 Jan;92(1):94-102.”方法。

本发明人工皮肤包括表皮层和真皮层，真皮层为由胶原束制成的双层真皮支架，上层为平行排列的微槽结构，当成纤维细胞迁移的方向与槽方向一致时具有最快的迁移速度，因此，在创面修复过程中，创面周围的成纤维细胞可快速在上层迁移，促进成纤维细胞的长入而达到促修复的效果。本发明通过三维打印制备双层真皮支架，其微槽结构及孔结构的均匀性可精确控制，孔的贯通性较好，既避免因支架致密而限制成纤维细胞快速达到创面位置，继而导致真皮支架渗透性差、血管化速率慢、抗感染效果不佳的问题，也避免了因支架疏松导致后期抗瘢痕效果较差的问题，从而实现成纤维细胞迁移和血管快速长入，促进创面修复以及抑制瘢痕形成，进一步达到抗瘢痕效果，克服了现有的合成人工真皮孔径分布大带来的缺陷。

本发明真皮支架的降解周期有效控制在3～4周，而现有技术得到的真皮支架具有较宽的降解周期分布。降解速率对瘢痕的形成具有影响，若降解太慢，将妨碍成纤维细胞和血管的长入，延缓创面愈合，若降解太快，则容易形成瘢痕。因此，精确的控制降解速率对促进皮肤修复、抑制瘢痕形成有着非常大的影响。并且，本发明的真皮支架具有很好的生长因子缓释功能，3周后生长因子即释放完85%。生长因子具有质量浓度依赖性，质量浓度低时不能发挥调节功能，质量浓度高时又会引起不良反应。延缓生长因子的释放速率，使其释放速率与真皮层降解速率接近或一致，持续有效的发挥作用，从而起到更佳的治疗效果。

本发明人工皮肤可与负压引流装置联合使用，清创后，植入人工皮肤，并将负压引流海绵置于表皮层上，人工皮肤的边缘需要与附近的皮肤缝合在一起。负压引流的海绵每3天换一次，持续3周，21天后，硅胶层被去除，实施植皮手术。避免了创面局部渗液积聚，降低感染风险，提高皮片成活率，有利于新生血管的生成，促进组织和创面愈合。

Claims

1.一种人工皮肤，包括真皮层，其特征在于：所述真皮层为由胶原束制成的双层结构，其中，上层为平行排列的微槽结构，下层与创面接触，为三维网状结构。

2.根据权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于：所述真皮层上层的厚度为10～200μm，相邻微槽间距为10～100μm，胶原束直径为10～200μm；所述真皮层下层的厚度为2～4mm，三维网状结构的孔径为100～200μm，胶原束直径为100～200μm。

3.根据权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于：所述胶原束包含I型胶原蛋白和载生长因子的微球，其中，微球直径为20～100nm。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的人工皮肤，其特征在于：所述人工皮肤还包括与真皮层上层结合的表皮层。

5.根据权利要求4所述的人工皮肤，其特征在于：所述表皮层上密布有微孔，微孔孔径为0.1～3mm，孔间距为1～10mm，表皮层厚度为0.2～0.5mm。

6.根据权利要求4所述的人工皮肤，其特征在于：所述表皮层由聚氨酯、硅橡胶或聚对苯二甲酸乙二醇酯制成。

7.一种人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：将真皮层的双层结构模型导入三维打印机中；将I型胶原蛋白用醋酸溶液溶解，加入戊二醛和载生长因子的微球，混均，真空脱泡，得打印材料；将打印材料置于三维打印设备的墨盒中，进行三维打印，得到真皮层，即为人工皮肤；

所述人工皮肤的结构如权利要求1～3任意一项所述。

8.根据权利要求7所述的人工皮肤的制备方法，其特征在于：打印材料中I型胶原蛋白的浓度为1～20wt％，戊二醛的浓度为0.10～0.50wt％，微球的浓度为0.01～0.2wt％。

9.根据权利要求7所述的人工皮肤的制备方法，其特征在于：利用两个喷嘴分别打印真皮层的上下层结构，喷嘴到打印平台的距离为20～40mm，打印材料的挤出速率为6～10mm·s^-1，打印平台的温度为-10～4℃。

10.根据权利要求7～9任意一项所述的人工皮肤的制备方法，其特征在于：还包括以下步骤：在聚氨酯、硅橡胶或聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上制备微孔，得到表皮层；将表皮层和真皮层通过黏合剂结合，即为人工皮肤；

所述人工皮肤的结构如权利要求4～6任意一项所述。