KR102556540B1 - 천연 세포외기질 분자로 제조된 3차원(3-d) 프린팅 잉크 - Google Patents

천연 세포외기질 분자로 제조된 3차원(3-d) 프린팅 잉크 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비변성 콜라겐 기반 바이오잉크, 이를 포함하는 키트, 및 상기 바이오잉크를 사용하여 3차원 구조를 프린팅하는 방법에 관한 것이다.

Description

천연 세포외기질 분자로 제조된 3차원(3-D) 프린팅 잉크
우선권 진술
본 발명은 35 U.S.C. § 119(e)에 근거하여 2016년 10월 12일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/406,977호 및 2017년 7월 25일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/536,727호의 이익을 주장하며, 각각의 전체 내용은 본원에 참조에 의해 포함된다.
기술 분야
본 발명은 비변성 콜라겐에 기반한 바이오잉크, 이를 함유하는 키트, 및 상기 바이오잉크를 사용하여 3차원 구조를 프린팅하는 방법에 관한 것이다.
3차원(3-D) 프린팅은 30년 동안 활발히 발전해온 분야이다. 초기 작업은 분말 금속을 레이저 소결(sintering)하여 거친(rough) 형태를 제작하고, 최종 형태로 기계 가공하는 것으로 시작되었다. 지금까지 3-D 프린팅 기술은 수술용 임플란트를 포함한 상업적인 최종 용도 적용을 위한 최종 제품을 3-D 프린터로 제조할 정도로 발전해왔다.
생물학적 구조물의 3-D 바이오프린팅은 1990년대에 분말화된 생체 적합성 열가소성 플라스틱을 레이저 소결하는 것으로 시작되었고, 잉크젯 프린팅 방식 및 중합체를 첨가하고 냉각, 침전, 건조, 중합, 또는 가교 결합을 통해 최종 구조로 고형화시킴으로써 구조를 구축하는 정밀 압출(extrusion) 기술을 포함하도록 수년간 발전해왔다. 가장 최근의 진보는 살아있는 세포를 포함하는 구조의 3-D 프린팅을 가능케하는 '바이오잉크'의 도입이다. 오늘날 가장 대중적인 바이오잉크는 알지네이트(alginate), 젤라틴(변성 콜라겐), 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol), 및 관능화된 히알루론산(functionalized hyaluronic acid)을 포함한다. 이러한 바이오잉크들은 보다 이전의 합성 열가소성 플라스틱 및 선택된 세포와 조합되어 근접한 자연적인 공간 방위(natural spatial orientation)의 다양한 세포 유형을 갖는 오가노이드(organoid)를 제조하는데 사용되어왔다. 그러나, 세포들은 이 구조들에서 신체 내에서 하듯이 동일하게 부착(attachment), 이동(migration), 또는 분화하지 않는다.
신체의 거의 모든 세포들은 기저막(basement membrane), 힘줄 및 뼈와 같은 세포외기질(extracellular matrix) 구조에 부착되어 있다. 이러한 세포외기질 구조는 세포들 및 그들의 행동에 어느 정도 영향을 주며, 세포들은 다시 세포외기질을 재흡수 및 교체할 수 있다. 세포외기질(extracellular matrix, ECM)은 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 및 엘라스틴과 같은 단백질 및 종종 하일루론산 및 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate)과 같은 프로테오글리칸(proteoglycan)으로 구성된다. 이러한 ECM 분자들은 다수의 서로 다른 부착 부위와 신호 모티프(signaling motif)를 포함함으로써 다양한 세포들이 부착 및 이동할 수 있게 하고 또한 세포에서 다양한 행동들을 지시(signal)할 수 있다. ECM의 영향은 배양에서 여러 유형의 까다로운 세포들을 증식시키는 세포 생물학자들의 능력의 비결이었다. 또한 ECM을 동물에 이식하면 생체 내(in vivo)에서 반응을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 혈관 조직 ECM의 이식은 혈관내피세포(vascular endothelial) 및 평활근 세포(smooth muscle cell)은 물론 줄기세포의 신속한 이동을 촉진하여 빠르게 ECM에서 증식하고(colonized) 이를 새로운 혈관 구조를 재건하는데 사용한다.
최근 ECM을 포함함으로써 세포들이 부착, 이동, 및 3-D 프린팅된 구조를 재구성(remodeling)할 수 있는 바이오잉크에 대한 관심이 높다. 젤라틴이 시도되었다. 젤라틴은 실온 또는 그 미만에서 겔로 고형화될 것이나, 세포가 선호하는 더 높은 온도(예를 들어, 37℃)에서 액화된다. 그러므로, 젤라틴은 37℃에서 구조를 유지하기 위해 가교되도록 화학적으로 변형되거나 또는 다른 재료와 혼합되어야 한다. 젤라틴은 메타크릴화(methacrylated)되고, 3-D 형상으로 프린팅된 다음, 광개시제(photoinitiator)의 존재하에 자외선(UV light)에 노출되어 가교결합될 수 있다. 젤라틴은 피브리노겐(fibrinogen)과 혼합되고 피브린 가교결합을 위해 트롬빈에 노출될 수 있다. 또한 젤라틴은 알지네이트(alginate)와 혼합되고 알지네이트 가교결합을 위해 2가 염에 노출될 수 있다. 용액 중 젤라틴 입자는 다른 바이오잉크에 의해 바이오 프린팅 할 때 지지 배지(support media)로서 유용할 수 있다. 반응성 그룹들(reactive groups)로 개질된 히알루론산도 유사한 방식으로 사용되었다.
콜라겐은 신체의 주요한 ECM 분자이며 많은 세포들은 콜라겐을 결합(bind), 이동(migrate), 재흡수(resorb) 및 재구성(remodel)을 할 수 있는 능력을 갖는다. 28 종 이상의 콜라겐들이 있고 Type I이 가장 흔하다. 콜라겐이 변성된 형태인 젤라틴과 마찬가지로, 콜라겐은 세포 부착을 촉진하기 위해 37℃에서 겔화하는 바이오잉크에 저농도로 첨가된다. 그러나, 이런 낮은 농도에서는 세포 부착 및 신호 전달 부위(signaling sites)의 밀도가 부자연스럽게(unnaturally) 낮고, 콜라겐은 최종 3-D 구조에 최소의 구조적 완전함에만 기여할 수 있을 뿐이다.
현재 ECM 분자를 포함하는 바이오잉크는 몇 가지 단점이 있다. 세포들은 합성 재료들에 정상적으로 부착되고 행동하지 않으며 그 재료들을 재흡수하고 천연(natural) ECM 으로 대체할 수 없다. 지금까지의 테스트된 ECM 바이오잉크 제제(formulation)는 3-D 프린팅에 요구되는 기계적 성질(mechanical property)을 갖지 못했다. 지금까지의 원형의 재료들(native materials)은 프린팅되었을 때 전단 박화(shear thin) 및 강성(stiffness) 복구 능력이 없다. 중성화(neutralized) 콜라겐 잉크는 시린지(syringe)에서 겔화되어 프린터를 막는다.
본 발명은 전적으로 또는 주로 콜라겐으로 제조된 바이오잉크 및 이를 사용하는 방법을 제공함으로써 종래 기술의 문제점을 다룬다.
발명의 요약
본 발명은 전적으로 또는 주요하게 콜라겐으로 제조된 바이오잉크에 관한 것이다. 이러한 바이오잉크는 세포와, 예를 들면 중성 pH에서 혼합되고, 그 후 세포 배양 배지로 프린팅될 수 있다. 바이오잉크는 세포 배양 배지에 프린팅되는 경우 탁월한 작업시간 및 강성을 제공한다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 비변성 콜라겐을 포함하는 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 비변성 콜라겐을 포함하는 바이오잉크로서, 상기 바이오잉크는 약 100 내지 약 150,000Pa의 정적 강성(static stiffness)을 갖고, 실온에서 0.001sec-1보다 큰 전단 속도에서 약 50 Pa 미만의 전단 강성(shear stiffness)을 갖는 것인 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 3 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 콜라겐을 포함하는 바이오잉크로서, 상기 콜라겐이 바이오잉크 내의 유일한 세포외기질 단백질인 것인 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 1 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 중성화 콜라겐 및 가교제를 포함하는 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 1 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 콜라겐을 포함하는 바이오잉크로서, 상기 바이오잉크는 중성화되면 10℃보다 높은 온도에서 겔화되는 것인 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 10 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 산성화 콜라겐(undenatured acidified collagen)을 포함하는 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 1 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 침전(precipitated) 콜라겐을 포함하는 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 100 내지 150,000 Pa의 정적 강성을 갖고 0.001 sec-1보다 큰 전단 속도에서 약 50 Pa 미만의 전단 강성을 가지며 프린팅 후 15분 이내에 그의 정적 강성의 20% 이상을 회복하는 틱소트로피성(thixotropic) 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 프린팅 후 1분 이내에 100 Pa보다 큰 정적 강성을 달성하는 비변성 콜라겐-기반 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 본 발명의 바이오잉크를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 바이오잉크를 제조(preparation)하기 위한 키트로서, 비변성 콜라겐을 포함하는 것인 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 비변성 콜라겐을 포함하는 3-D 구조를 프린팅하는 방법으로서, 상기 방법은 3-D 프린터에 본 발명의 바이오잉크를 사용하는 단계를 포함하는 것인 3-D 구조를 프린팅하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 양태 및 기타 양태는 하기의 발명의 설명에서 보다 상세히 설명한다.
도 1은 TeloCol® 바이오잉크를 사용하여 맞춤형 3-D 프린터에 프린팅되고, 중성화되고, 지지 수조(support bath)에 프린팅된 격자를 보여준다.
도 2는 FibriCol® 바이오잉크를 사용하여 맞춤형 3-D 프린터에 프린팅되고, 중성화되고, 냉각된 지지 수조(support bath)에 프린팅된 대동맥 고리(aortic ring)를 나타낸 것이다.
도 3은 메타크릴화된 콜라겐 바이오잉크를 이용하여 맞춤형 3-D 프린터에 프린팅되고, 중성화 및 냉각된 지지 수조(support bath)로 프린팅되고 UV 가교처리(UV crosslinked)된 격자를 나타낸 것이다.
도 4는 프린팅한 직후의 인간 지방유래 줄기세포의 생존력을 보여준다. 녹색 세포들은 생존할 수 있는 것인 반면, 적색으로 염색된 세포들은 사멸한 것이다. 생존:사멸(live:dead)의 높은 비율은 콜라겐 바이오잉크가 전단 박화(shear thinning)되고 세포들이 심각한 손상없이 압출될 수 있음을 나타낸다.
도 5는 콜라겐 젤에 프린팅된 인간 지방 유래 줄기세포를 보여준다. 프린팅된 미세 섬유(filament)의 폭(width)은 160 마이크론(micron)이다.
도 6은 LifeInk® 200으로 3-D 바이오프린팅된 인간 섬유아세포(fibroblast)의 2 일간 배양 후를 보여준다. 높은 녹색:적색(생존:사멸) 비율은 높은 세포 생존력을 나타낸다.
도 7은 고농도에서 순수한 비변성 콜라겐 겔의 전단 박화(shear thinning) 특성을 보여준다.
도 8은 순수 콜라겐 바이오잉크인 LifeInk® 200을 사용하여 3-D 바이오 프린팅된 코(nose)를 보여준다.
도 9는 침전(precipitated) 콜라겐과 혼합되고, 프린팅되고, 및 UV 가교결합된 메타크릴화 젤라틴의 10 층 높이 구조(10 layer tall structure)를 보여준다.
도 10은 30 게이지 바늘을 통해 성공적으로 3-D 바이오프린팅된 후 30:70 비율로 LifeInk® 200 콜라겐 바이오잉크 내에 골고루 완전하게 분산된 바이오글라스(bioglass)의 현미경 이미지(5x)를 나타낸다.
도 11은 3 mg/ml에서 TeloCol® 텔로콜라겐(telocollagen)으로 프린팅한 구조를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 나타낸 첨부 도면들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 상이한 형태로 구현될 수 있으며 본 명세서에 제시된 구현예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이러한 구현예들은 본 개시가 철저하고 완전하며, 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달하기 위해 제공된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원의 발명의 설명에서 사용된 용어는 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
문맥이 다르게 지시하지 않는 한, 본원에 설명된 본 발명의 다양한 특징들은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 특별히 의도된다.
더 나아가, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 구현예에서 본원에 설명된 임의의 특징 또는 특징의 조합이 배제 또는 생략될 수 있음을 고려한다.
설명하자면, 명세서에 복합체가 성분 A, B, 및 C를 포함한다고 기재된 경우, A, B, 또는 C 중 임의의 것 또는 이들의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략 또는 포기되는 것으로 구체적으로 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고 문헌은 그 내용 전체가 본원에 참조에 의해 포함된다.
본원에서 사용된, 단수형(“a”, “an”, 또는 “the”)은 하나 이상을 의미할 수 있다. 예를 들면, 세포(“a” cell)는 단수의 세포 또는 다수의 세포들을 의미할 수 있다.
또한 본원에 사용된 “및/또는(and/or)” 은 연관되어 나열된 항목들 중 하나 또는 그 이상의 모든 가능한 조합, 및 선택적(“또는”)으로 해석되는 경우, 조합의 부재를 지칭하고 망라한다.
또한, 본원에서 사용된 용어 “약(about)”은 본 발명의 화합물 또는 작용제(agent)의 양, 투여량, 시간, 온도, 및 이와 유사한 것들과 같은 측정 가능한 값을 지칭하는 경우 특정된 양의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변화(variation)도 포함하는 것을 의미한다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구항에서 용어 “포함한다(comprise)”, “포함하다(comprises)”, 및 “포함하는(comprising)”과 같은 그의 변형들은 “포함하지만 이에 한정되지 않는(including, but not limited to)”과 같은 개방적이고 포괄적인 의미로 해석되어야 한다.
“구성되는(consisting of)”은 “구성되는” 문구 다음에 이어지는 구성들을 포함하고, 이에 제한되는 것을 의미한다. 따라서 문구 “구성되는(consisting of)”은 나열된 요소들이 요구되거나 또는 필수적이며, 다른 요소들은 존재할 수 없다는 것을 나타낸다.
본 발명의 조성물들에 적용된, 용어 “필수적으로 구성되는(consists essentially of)”(및 이의 문법적으로 변형된 것)은, 추가적인 성분이 그 조성물을 실질적으로 변화시키지 않는 한 그 추가적인 성분을 포함할 수 있음을 의미한다. 용어 “실질적으로 변화된(materially altered)”은 조성물에 사용되는 경우, 기재된 성분들로 구성된 조성물의 유효성과 비교하여 적어도 약 20% 이상 조성물의 유효성이 증가 또는 감소되는 것을 의미한다.
본원에서 사용된, 용어 “기능(function)” 및 “기능적인(functional)”, 및 이와 유사한 것은 생물학적, 효소적, 또는 치료적 기능을 의미한다.
“증가된(increased)” 또는 “강화된(enhanced)” 양(amount)은 일반적으로 “통계적으로 유의한(statistically significant)” 양이며, 본원에 기재된 양 또는 수준의 1.1배, 1.2배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 1.9 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 3.5 배, 4 배, 4.5 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 15 배, 20 배, 30 배, 40 배, 또는 50 배 또는 그 이상의 배수(예를 들면 100, 500, 1000배)(그 사이 및 1 보다 큰 모든 정수들 및 소수점을 포함함, 예를 들면 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 등)인 증가를 포함할 수 있다.
“감소된(decreased)” 양 또는 “줄어든(reduced)” 양 또는 “더 적은(lesser)” 양은 일반적으로 “통계적으로 유의한” 양이며, 본원에 기재된 양 또는 수준의 1.1배, 1.2배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 1.9 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 3.5 배, 4 배, 4.5 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 15 배, 20 배, 30 배, 40 배, 또는 50 배 또는 그 이상의 배수(예를 들면 100, 500, 1000배)(그 사이 및 1 보다 큰 모든 정수들 및 소수점을 포함함, 예를 들면 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 등)인 감소를 포함할 수 있다.
“~로부터 수득된(obtained from)”은 예를 들면 세포 또는 조직과 같은 샘플이 목적하는 유기체 또는 목적하는 유기체 내의 특정조직과 같은 특정 공급원으로부터 단리되거나 유래된 것을 의미한다.
용어 “세포외 기질 분자(extracellular matrix molecule)” 또는 “ECM”은 세포 외부의 조직에서 발견되는 거대 분자를 의미한다. 이러한 조직은 신체 내에서 기저막(basement membrane), 장기의 지지체(scaffolding for organ), 및 힘줄과 인대의 구조와 같은 다양한 기능을 수행한다. 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 엘라스틴(elastin), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 및 히알루론산이 일반적인 세포외기질 분자들이다.
“원형의 콜라겐(Native collagen)” 은 비가역적으로 가수분해된 콜라겐인 젤라틴과 달리, 정상(normal) 형태를 유지하는 콜라겐으로 정의된다.
“젤라틴(gelatin)”은 90%보다 높은 비율(>90%), 예를 들면 99%보다 높은 비율로(>99%) 가수분해되거나 또는 변성된 콜라겐으로 정의된다.
“콜라겐”은 아텔로콜라겐(atelocollagen), 텔로 콜라겐(telocollagen), 트로포콜라겐(tropocollagen), 프로콜라겐(procollagen), 고분자 콜라겐(polymeric collagen), 원섬유 콜라겐(fibrilla collagen), 전기방사 콜라겐(electrospun collagen), 불용성 콜라겐(insoluble collagen), 가용성 콜라겐(soluble collagen), 침전 콜라겐(precipitated collagen), 또는 콜라겐 도우(collagen dough)로 알려진 분자 구조를 갖는 천연 단백질로 정의된다.
용어 “비변성 콜라겐(undenatured collagen)”은 50% 미만으로 가수분해되거나 또는 변성된, 예를 들면 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 가수분해되거나 변성된 콜라겐을 의미한다.
“바이오잉크(bioink)”는 3-D 프린팅이 가능한 세포 적합성(cell compatible) 재료로 정의된다. 바이오잉크는 0 내지 37℃에서 바늘을 통해 압출될 수 있고, 그 후에는 겔화되거나 고화될(solidified) 수 있다. 바이오잉크는 잉크젯, 레이저 보조(laser-assisted), 또는 마이크로밸브 3-D 프린팅 장비에 적합하도록 제제(formulate)될 수 있다.
“가교 결합(crosslink)”은 공유 결합 또는 이온 결합에 의해 거대 분자가 화학적으로 연결되는 것으로 정의된다.
“주요하게(predominantly)”은 용액 또는 겔에 포함된 고체 성분들(solids)의 질량의 30%보다 높은 비율, 예를 들면 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70%보다 높은 비율을 구성(compose)하는 것으로 정의된다.
“순수한(pure)”는 용액 또는 겔 내 고체 성분들의 질량 중에서 70%보다 큰 비율로, 예를 들면 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%보다 큰 비율로 구성하는 것으로 정의된다.
“유독한(Toxic)”은 그 환경 중 세포의 5% 미만이 분열하고 복제하는 것인 환경으로 정의된다.
“실온(room temperature)”은 약 15℃ 내지 약 30℃로 정의된다.
“빛(light)”은 적외선 내지 자외선 범위 에 있는 임의의 전자기적 복사로 정의된다.
“틱소트로피성(thixotropic)”은 전단(예를 들면, 교반(stirred) 또는 진탕(shake))시 유체가 되고, 방치하면 반고체 상태로 복귀하는 일부 겔들이 보이는 특성으로 정의된다. 예를 들면, 틱소트로피성 바이오잉크는 전단시 점성 또는 강성이 감소되나, 전단의 중단시 시간의 경과에 따라 원래 값으로 복귀하는 것인 바이오잉크이다.
본 발명은 대체로 천연 ECM 분자들로만 제조되거나, 또는 합성 재료들과 혼합되어 제조된 3-D 프린팅 잉크에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 이러한 바이오잉크는 ECM 분자들을 주요하게(predominantly) 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, ECM 분자들은 타입 I 콜라겐, 다른 타입의 콜라겐, 히알루론산과 같은 글리코사미노 글라이칸들(glycosaminoglycans) 및 기타 ECM 분자들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 바이오잉크들은 다양한 농축물(concentrations)로 제제화되고, 일부는 완전히 원형(native)의 물질만으로, 일부는 화학적 개질(modification)을 포함하도록, 일부는 원형(native)의 세포외 기질 분자의 일부가 제거된 상태로, 일부는 합성 재료들과 혼합된 것으로 제조되었다. 천연 조성이면서 동시에 3-D 프린터로 프린팅되기에 적합한 바이오잉크를 생성하기 위해 구체적으로 다양한 배합(formulas) 및 개질이 이루어졌다. 상업적으로 유용한 천연 바이오잉크의 부재는 오늘날 3-D 바이오프린팅 기술의 진보에 있어서 단일의 가장 큰 장애물이다.
본 발명의 바이오잉크에서, 세포들은 그들이 신체 내에서 자연스럽게 행하던 거동에 보다 가깝게 행동한다. 바이오잉크 내의 세포들은 지지체(scaffold)를 재구성(remodel)할 수 있으며, 이후 지지체는 생체 내에서 재흡수될 수 있다. 세포들은 그 구조에 부착되고 이를 통해서 이동할 수 있다. 세포들은 이러한 천연 바이오잉크들과 결합되면 기존 3-D 프린팅 장비들에 의해 수행되는 가혹한 3-D 프린팅에서도 쉽게 생존할 수 있다. 천연 바이오잉크는 모양과 구조를 유지하는 3-D 구조물의 프린팅을 가능하게 하는 기계적 물성을 갖는다.
본 발명의 일 양태는 비변성 콜라겐을 포함하는 바이오잉크에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 콜라겐은 타입 I 콜라겐일 수 있다. 타입 I 콜라겐의 가장 흔한 공급원은 쥐(rat)의 꼬리, 소의 피부 및 힘줄 또는 돼지 피부이다. 일부 구체예에서, 콜라겐은 침전 콜라겐이다. 일부 구체예에서, 용액 내의 콜라겐은 이온 강도(염 농도), pH 및/또는 온도 증가를 이용하여 침전된다. 침전 콜라겐은 원형 원섬유(native-type fibril)를 형성하고, 그 후 농축되고 등장성 염수에 재현탁된다. 일부 구체예에서, 콜라겐은 산성화 콜라겐, 예를 들면 pH 4.0 미만, 예를 들면 pH 3.5 미만, pH 2.5, 또는 pH 2.0 을 갖는 콜라겐이다. 바이오잉크는 2종 이상의 콜라겐을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 콜라겐은 텔로콜라겐, 아텔로콜라겐, 또는 이들의 조합이다. 일부 구체예에서, 콜라겐은 바이오잉크 중 유일한 ECM 분자, 예를 들면, ECM 단백질 또는 당단백질(glycoprotein)이다.
바이오잉크는 농축 용액으로 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 비변성 콜라겐은 바이오잉크에 1 mg/ml보다 큰 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 비변성 콜라겐은 3 mg/ml보다 큰 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 비변성 콜라겐은 5 mg/ml보다 큰 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 비변성 콜라겐은 10 mg/ml보다 큰 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 비변성 콜라겐은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mg/ml보다 큰 농도로 존재한다.
바이오잉크는 약 100 내지 약 150,000 Pa 범위의 정적 강성, 예를 들면 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000 또는 150,000 Pa 또는 그 내부의 임의의 범위의 정적 강성을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 바이오잉크는 프린팅 후 1분 내에, 예를 들면 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 55 초 내에, 또는 프린팅 후 1, 2, 3, 4, 또는 5분 내에, 예를 들면, 100 Pa보다 큰 정적 강성을, 예를 들면, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 또는 150,000 Pa를 달성한다.
일부 구체예에서, 바이오잉크는 0.001 sec-1보다 큰 전단 속도(shear rate), 예를 들면 0.01 또는 0.1 sec-1보다 큰 전단 속도에서 약 50 Pa 미만의, 예를 들면 약 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 또는 1 Pa 미만의 전단 강성(shear stiffness)을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 비변성 콜라겐을 포함하는 바이오잉크로서, 상기 바이오잉크는 약 100 내지 약 150,000 Pa 범위의 정적 강성을 갖고, 실온에서 0.001 sec-1보다 큰 전단 속도에서 약 50 Pa 미만의 전단 강성을 갖는 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 3 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 콜라겐을 포함하는 바이오잉크로서, 상기 콜라겐은 바이오잉크에서 유일한 세포외기질 단백질인 것인 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 1 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 중성화 콜라겐 및 가교제를 포함하는 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 1 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 콜라겐을 포함하는 바이오잉크로서, 상기 바이오잉크는 중성화되면 10℃보다 높은 온도에서 겔화되는 것인 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 10 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 산성화 콜라겐을 포함하는 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 1 mg/ml보다 큰 농도의 비변성 침전 콜라겐을 포함하는 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 100 내지 150,000Pa의 정적 강성을 갖고 0.001 sec-1보다 큰 전단 속도에서 약 50 Pa 미만의 전단 강성을 가지며, 프린팅 후 15분 내에, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20분 내에, 정적 강성의 적어도 20%, 예를 들면 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 회복하는 틱소트로피성 바이오잉크에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는 프린팅 후 1분 내에 100 Pa보다 큰 정적 강성을 달성하는 비변성 콜라겐 기반 바이오잉크에 관한 것이다.
콜라겐은 온도에 민감하므로 대부분의 멸균(sterilization) 절차는 그들의 섬유(fibrilla) 구조를 변화시킨다. 낮은 기계적 물성, 멸균의 어려움, 및 흔히 관찰되는 세포 활동에 반응한 콜라겐 지지체의 수축이 이 물질의 주된 한계이다. 기계적 안정성을 향상시키고 분해 속도를 감소시키 위해, 콜라겐은 가교 결합되고, 다른 중합체와 혼합되어 이중 네트워크들을 형성하거나, 또는 무기 입자들과 복합 재료(composite material)를 형성할 수 있다.
콜라겐은 콜라겐의 가교 결합을 허용하는 화학기(chemical group)들에 의해 개질(modified)될 수 있다. 일부 구체예에서, 화학기들은 세포들에 비독성인 조건 하에서 가교 결합을 가능하게 한다. 임의의 적합한 화학기가 이용될 수 있다. 화학기의 예는 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 디바이닐 술폰(divinyl sulfone), 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 콜라겐은 화학기에 의해 먼저 개질되지 않고 가교 결합될 수 있다. 콜라겐은 가교제에 의해 가교 결합될 수 있다. 적합한 가교제가 사용될 수 있다. 예는, 한정없이, 리보플라빈(riboflavin), 메타크릴화 젤라틴(methacrylated gelatin)(GelMA), 폴리에틸렌 글라이콜 디아크릴레이트(PEGDA), 알지네이트(alginate), 피브리노겐(fibrinogen) 및 트롬빈(thrombin), 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 포름알데히드(formaldehyde), 게니핀(genipin), 암모늄 유도체(an ammonium derivative), 광개시제(photoinitiator), 이르가큐어®(Irgacure®), 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP), 루테늄(ruthenium), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 콜라겐은 화학적 개질 없이 가교 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 콜라겐은 광개시제 및 광 노출(light expose)에 의해 가교 결합될 수 있다.
Irgacure®는 일반적인 광개시제이지만, 다수의 다른 후보들이 있다. LAP가 널리 사용되고 있으며, Irgacure®보다 세포에 대한 독성이 더 낮다고 알려져 있다. LAP은 가시광선에 의해 활성화된다. 메타크릴화 콜라겐은 여전히 비변성 상태이고 세포들이 부착될 수 있으며 본래의 기작(MMPs)을 이용하여 재구성할 수 있으므로 매우 매력적인 가교제이다. 바이오잉크도 PEGDA를 사용하여 가교 결합할 수 있으나, 그 분자는 매우 비활성이고 세포들이 그에 자연적으로 부착하지 않을 것이다. 콜라겐은 빛, 열, 탈수, 알데히드, 게니핀 및 리보플라빈을 사용하여 가교 결합될 수 있다.
바이오잉크는 하나 또는 그 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 첨가제는 가교제(cross-linker), 보강제(stiffener), 합성 재료(synthetic material), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 가교제의 예는 리보플라빈, GelMA, PEGDA, 알긴산염(alginate), 글루타르알데히드, 포름알데히드, 게니핀, 암모늄 유도체, 광개시제, Irgacure®, LAP, 루테늄, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보강제의 예는 탄소 나노튜브, 탄소섬유, 바이오글라스(bioglass), 인산 칼슘 세라믹(calcium phosphate ceramic), 나노셀룰로오스, 탄소 나노-브러시, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
첨가제는 예를 들면 단백질, 글리코사미노글리칸, 성장 인자, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 첨가제는 ECM 분자, 탈세포화 조직(decellularized tissue), 또는 이들의 조합일 수 있다. ECM 분자 또는 탈세포화조직은 임의의 조직 또는 기관, 예를 들면 심장, 폐, 신장, 간, 피부, 태반, 장, 또는 방광으로부터 유래될 수 있다. ECM 분자 또는 탈세포화 조직은 선택적으로 가용화될 수 있다. 일부 구체예에서, 콜라겐이 바이오잉크의 유일한 ECM 분자일 수 있다. 특정 구체예에서, 바이오잉크는 상이한 ECM 분자를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 ECM 분자는 히알루론산일 수 있다. 일부 구체예에서, 바이오잉크는 세포를 포함할 수 있다. 바이오잉크는 하나 또는 그 이상의 유형의 세포들을 포함할 수 있다.
신체 내 조직들 간의 차이로 인해서, 하나의 표준 바이오잉크를 사용하여 모든 상이한 조직들을 프린팅할 수 있을 것 같지 않다. 프린팅할 특정 조직을 위한 맞춤형 바이오잉크를 생성하기 위해 추가적인 단백질을 첨가할 필요가 있다. 추가적인 ECM 분자들을 첨가하기 위해, ECM 분자를 잉크에 첨가될 세포 배양 배지/세포 현탁액(suspension)에 첨가할 수 있다. 배합물을 시린지(syringe)에 첨가하고, 상기 시린지를 바이오잉크가 담긴 시린지와 결합하고, 앞뒤로 흔들어 혼합하며, 예를 들면 40회 이상 흔들어 완전히 혼합되도록 한다.
동일한 기법을 이용하여 바이오잉크에 가교제를 첨가할 수 있다. 이러한 가교제는 아크릴레이트 개질된 폴리에틸렌 글리콜(acrylate modified polyethylene glycol), 메타크릴화 젤라틴, 메타크릴화 히알루론산, 게니핀, 리보플라빈, 글루타르알데히드, 포름알데히드, 및 아크릴레이트 또는 디바이닐 술폰과 같은 다른 가교결합성 작용기(crosslinkable group)들에 의해 개질된 거대분자들을 포함할 수 있다. 이와 동일한 기법이 또한 바이오글라스, 탄소 나노튜브, 나노브러쉬 또는 셀룰로오스와 같은 바이오잉크 보강제(stiffening agent)를 첨가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 바이오잉크는 액체 담체(liquid carrier)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 바이오잉크는 생리학적 염, 완충액, 및/또는 세포의 생존을 지원하는 다른 성분을 포함한다.
바이오잉크는 염기성 pH, 중성 pH, 또는 산성 pH 일 수 있다.
일부 구체예에서, 바이오잉크는 무균 상태이다. 일부 구체예에서, 바이오잉크는 항생제들 또는 무균 상태를 유도하는 기타 작용제를 포함한다. 세포와 함께 배양된 바이오프린트된 구조물은 바람직하게는 무균 상태이다. 이러한 필요는 때로는 항미생물제(antimicrobial)를 사용함으로써 충족될 수 있다. 그러나, 콜라겐 기반 바이오잉크는 pH를 4.6 미만으로 낮추고 세포와 혼합하기 전에 중성화함으로써 비교적 쉽게 멸균할 수 있다. 콜라겐 기반 바이오잉크는 또한 여과에 의해 멸균되고, 그 후 무균 처리(aseptic processing)에 의해 원하는 농도에 도달될 수 있다. 미생물 오염도(bioburden)는 조사(UV, E-빔, 감마) 또는 오존을 사용하여 감소시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 바이오잉크는 노즐 또는 개구(orifice)를 통해 배출시키기에 적절한 점도를 갖는다. 일부 구체예에서, 노즐 또는 개구는 250μm 미만, 예를 들면 250, 225, 200, 175, 150, 125, 또는 100 μm 미만의 직경을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 바이오잉크는 실온에서 3-D 구조물을 프린팅하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 바이오잉크를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 하나 또는 그 이상의 바이오잉크 용기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 시린지, 시린지 커플러, 첨가제, 완충액, 용매, 중성화 용액, 가교제 용액, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 추가 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 바이오잉크를 제조하기 위한 키트로서, 예를 들면, 신선한(fresh) 바이오잉크를 제공하기 위해 함께 혼합되는 성분들을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 키트는 비변성 콜라겐을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 콜라겐은 침전 콜라겐이다. 일부 구체예에서, 콜라겐은 가교 결합을 가능하게 하는 화학기에 의해 개질될 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 첨가제, 완충액, 용매, 중성화 용액, 가교제 용액, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 비변성 콜라겐을 포함하는 3-D 구조물 프린팅 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 3-D 프린터에서 본 발명의 바이오잉크를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 3-D 프린터를 사용하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 3-D 프린터는 현재 이용할 수 있거나 또는 나중에 개발될 임의의 3-D 프린터, 예를 들면, 잉크젯 프린터, 로봇 분배 프린터(robotic dispensing printer), 압출 기반 프린터(extrusion-based printer), 또는 레이저 기반 프린터일 수 있다.
잉크젯 프린팅은 최종 다층 패턴(multilayer pattern)을 형성하기 위해 사전 설계된 방식으로 바이오잉크 방울을 침착하는 것에 기반한 비접촉 전략이다. 로봇 분배 프린터는 잉크가 공기압 또는 기계적인 힘에 의해 분배되는 연속 압출 또는 잉크젯과 표준 압출 기법 사이의 기법인 마이크로밸브 기반 액적 분사(microvalve-based droplet ejection)일 수 있다. 레이저 기반 프린팅은 정확히 정의된 위치를 목표로 하는 레이저 빔 펄스에 의해 제어되어 도너 기판에서 수용 기판(receiving substrate)으로 바이오 잉크를 전달하는 것을 기반으로 한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조물이 프린팅될 때, 예를 들면 구조의 프린트가 완료되기 전에, 3-D 구조의 가교 결합을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조의 프린팅 후 3-D 구조의 가교 결합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조가 프린팅될 때 3-D 구조의 온도를 변화시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조가 프린팅된 후 3-D 구조의 온도를 변화시키는 것을 포함할 수 있다. 온도 변화는 예를 들면 구조의 겔화 및/또는 가교 결합을 촉진하기 위해 더 차가운 온도(예를 들면 0-10℃ 또는 20-30℃ 또는 실온)에서 더 따뜻한 온도(예를 들면 35-40℃ 또는 37℃)로 변화시키는 것일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조가 프린팅될 때 3-D 구조의 pH를 변화시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조의 프린팅 후 3-D 구조의 pH를 변화시키는 것을 포함할 수 있다. pH 변화는, 예를 들면, 구조의 겔화 및/또는 가교 결합을 촉진하기 위해 산성 pH 또는 염기성 pH로부터 중성 pH로 변화시키는 것일 수 있다. 예를 들면 pH는 구조가 프린팅되는 매체에 존재하는 완충액을 구비함으로써 변화될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조가 프린팅될 때 3-D 구조를 빛에 노출시키는 것을 포함시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조를 프린팅한 후 3-D 구조를 빛에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 빛은, 예를 들면 광개시제의 존재하에 구조의 겔화 및/또는 가교 결합을 촉진하기 위한, 예를 들면 자외선, 가시광선, 또는 적외선일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조가 프린팅될 때 3-D 구조에 세포를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 3-D 구조를 프린팅한 후 3-D 구조에 세포를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 프린팅 중 또는 후에 3-D 구조 상에 세포를 프린팅하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 둘 또는 그 이상의 노즐들을 가진 3-D 프린터는 교대로 또는 일부 다른 패턴으로 바이오잉크 층 및 세포 층을 프린팅할 수 있다. 일부 구체예에서, 3-D 구조를 프린팅한 후 세포들이 구조 위로 또는 내부로 이동할 수 있도록, 세포들이 3-D 구조에서 인큐베이션된다.
3-D 바이오프린팅으로 세포의 본래 환경을 가장 잘 모방하기 위해서, 종종 다수의 압출기가 사용된다. 각각의 압출기는 서로 다른 바이오잉크 및 서로 다른 유형의 세포로 채워져서, 조직의 복수의 층의 프린팅을 가능하게 한다. 또한 하나의 헤드로 합성 재료로부터 구조적 지지체(structural scaffold)를 프린팅하고, 다른 압출기에 의해 그를 본래 물질로 채우기 위해 멀티헤드 시스템(multi-head system)이 사용될 수 있다.
바이오잉크는 배지(media) 또는 조(bath)에 프린팅될 수 있다. 일부 구체예에서, 지지 배지(support media)는 세포들을 위한 영양분을 포함한다. 일부 구체예에서, 지지 배지는 3-D 구조에 일시적 지지를 제공하며, 예를 들면 구조가 겔화 또는 가교결합될 때까지 일시적 지지를 제공한다. 일시적 지지는 지지제(support agent)에 의해 제공될 수 있으며, 지지제는 젤라틴 슬러리, 수화겔 입자의 슬러리, 또는 친수성 입자의 슬러리와 같은 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 대한 최초의 콜라겐 개발은 3 mg/ml의 TeloCol® 타입 I 소(bovine) 콜라겐의 사용으로 이루어졌다. 콜라겐은 pH < 4로 산성화하고 1-10℃로 냉각함으로써 가용화될 수 있다. 세포를 10℃ 미만으로 냉각하고 콜라겐을 중성화시키기에 충분한 양의 세포 배양 배지에서 콜라겐과 혼합하거나, 또는 냉각된 세포 용액과 혼합하기 직전에 콜라겐을 중화시키기에 충분한 염기를 첨가하는 것에 의해 세포를 바이오잉크에 첨가한다. 그 후 바이오잉크가 3-D 프린터에 장전될 수 있고, 목적하는 구조로 압출될 수 있다. 바이오잉크는 가온된(warm) 세포 배양 배지로 프린팅될 때와 같이 10℃보다 높은 온도로 가온하면 신속하게 겔화된다. 도 1 에 도시된 바와 같이, 바이오잉크로 탁월한 해상도의 복잡한 구조들을 프린팅할 수 있다. 그러므로, 처음으로 순수한 비변성 콜라겐으로 구성된 유용한 바이오잉크가 성공적으로 제조되었다. 그러나, 바이오잉크는 1 - 10℃로 유지되어야 하고, 그렇지 않으면 프린터에서 겔화될 것이고, 바이오잉크를 그렇게 차가운 상태로 유지할 수 있는 3-D 프린터는 거의 없다. 결과적으로, 이 바이오잉크 제제(bioink formulation)를 이용하여 3-D 구조를 프린팅하기 위한 작업 시간은 종종 10분 또는 그 미만이다.
제한된 작업 시간을 극복하기 위해, 농축되고, 비변성되고, 아텔로-펩타이드(atelo-peptide) 타입 I 콜라겐 용액인 FibriCol®로부터 새로운 바이오잉크가 개발되었다. FibriCol은 중성화될 수 있으나, 실온에서 겔화를 시작하지 않는다. 37℃로 가온하면, 단단한 겔을 형성할 것이다. 이 재료는 사용하기 훨씬 쉽고 상당히 잘 기능하였으나, 콜라겐이 가온 및 겔화되기 전에 세포 배양 배지로 확산되기 때문에 프린팅시 해상도가 낮았다. 도 2를 참조한다.
확산 문제를 극복하기 위해, 타입 I 메타크릴화 소 콜라겐인 PhotoCol®로부터 바이오잉크를 개발하였다. 베이스 재료(base material)는 텔로콜라겐(telocollagen)이고, 중성화되면 신속하게 겔화된다. 이 재료는 농축된(10 mg/ml) 산성 용액으로서 중성 완충액으로 프린트되어 콜라겐을 중성화시키고 겔 형성을 시작될 수 있게 하였다. 확산을 제한하기 위해, 콜라겐은 콜라겐 분자상의 반응성 메타크릴레이트 부위 때문에 압출시 UV 가교결합되었다. 도 3을 참조한다. UV 가교결합은 즉각적으로 콜라겐을 강화시키고 확산을 제한한다. 이 재료는 다루기 쉽고 우수한 프린팅 해상도를 제공한다. 세포는 구조에서 배양되어 가교 결합 후 콜라겐에 침투할 수 있다.
Advanced Biomatrix는 메타크릴화된 라이신(lysine) 그룹이 25 - 40% 포함된 콜라겐(제품 번호 BRD5201)을 판매한다. 10 - 50ppm Irgacure® 2959를 포함하는 용액 중 이 콜라겐 3 내지 10 mg/ml 로 제조되고 UV 광(365 nm 파장)으로 가교 결합된 바이오잉크는 200 내지 8000 Pa 범위의 탄성 계수를 갖는 겔을 형성한다. 이 가교결합성 콜라겐은 다른 콜라겐, 다른 세포외기질 분자, 탈세포화 조직, 또는 심지어 합성 재료들과도 혼합될 수 있다. 도 5는 메타크릴화 콜라겐과 순수한 비변성 타입 I 콜라겐의 혼합물(blend)로 프린팅하고 2일이 지난 후 섬유아세포의 생존력을 나타낸 것이다.
많은 경우에는 pH 중성인 바이오 잉크를 사용하여 세포가 잉크에 첨가될 수 있는 것이 유리할 것이나, 실온에서 신속히 겔화되지 않는다. 일반적으로, 콜라겐의 농도를 증가시키면 겔화 속도 및 생성된 겔의 강성이 증가한다. 일단 콜라겐 용액이 겔화되면, 전단력이 겔의 강성보다 큰 경우에 부서진다. 만약 겔에 세포를 혼합하고자 하면, 겔화된 콜라겐의 섬(island) 및 용액 중 세포로 이루어진 영역을 얻게 된다. 만약 미세 바늘을 통해 겔화된 콜라겐을 압출하면, 필라멘트(filament)의 빈번한 깨짐(break)과 함께 용액 분출을 얻게 된다.
놀랍게도, 농축되고, 침전된 콜라겐의 겔이 매우 잘 작용한다는 것이 밝혀졌다. LifeInk® 200으로 알려진 이 바이오잉크는, Advanced Biomatrix (Carlsbad, CA)로부터 제품번호 #5202-1EA로 구입할 수 있다. 이 재료는 압출 중에 강한 필라멘트를 유지하며, 지지 수조(support bath)에 프린팅해도 거의 확산되지 않는다. 혼합 또는 프린트 노즐을 통한 압출시, 탄성 계수는 1 Pa 미만으로 떨어진다. 노즐을 떠난 후에는, 겔은 본래 겔 강도의 대부분을 회복하고, 37℃에서, 약 1000 Pa의 탄성 계수(elastic modulus)를 갖는 겔을 형성하여, 이 겔이 전단 박화(shear thin)되고 빠르게 회복한다는 것을 보여 준다. 이 전단 박화(shear-thinning) 특성은 세포가 혼합되고, 도 4에 나타낸 것과 같이 손상없이 노즐을 통해 압출될 수 있게 한다. 일단 바이오잉크가 압출되면 그것은 다시 겔화되고 도 5에 나타낸 것과 같이 높은 정확도(fidelity)로 모양을 유지한다. 이 잉크는 중성 pH에서 저장 및 사용할 수 있으며, 세포와 혼합될 수 있고, 적어도 38.5℃까지의 높은 온도에서 프린팅될 수 있다. 도 6에 나타나 있는 것처럼, LifeInk® 200으로 프린팅된 세포들은 본래의 콜라겐 환경에서 잘 증식한다.
본 발명은 하기 비제한적 실시 예들에 의해 보다 상세히 설명된다.
실시예 1
메타크릴화 콜라겐 바이오잉크(LifeInk®100)
메타크릴화되고 동결건조된 40%의 라이신을 갖는 텔로펩타이드(telo-peptide)를 포함하는 타입 I 콜라겐(Advanced Biomatrix 부품 번호 BRD5201)을 8 mg/ml의 농도로 20 mM 아세트산에 용해시켰다. 용액을 2℃로 냉각시키고, 차가운 알칼리성 인산염 완충 식염수로 중화시켰다. Irgacure® 2959를 첨가하여 20 ppm 용액을 제조하고 수득된 용액을 디쉬에 붓고 37℃에서 겔화시켰다. 15분간 겔화시킨 후, 용액을 UV 광으로 5분간 가교 결합시켰다. 겔의 강성(Stiffness)은 Bohlin 유량계(rheometer)(DVO-100)로 측정하였으며 6000 Pa로 나타났다.
실시예 2
순수 콜라겐 바이오잉크(LifeInk®200)
침전에 의해 텔로펩타이드(telo-peptide) 불포함 타입 I 콜라겐을 고농도로 준비하였다. 이 콜라겐은 Advanced Biomatrix(부품 번호 #5202-1EA)로부터 얻을 수 있다. 이 용액을 디쉬에 붓고 Bohlin 유량계에서 측정하기 전에 37℃에서 30분간 겔화될 수 있게 하였다. 겔은 초기에 1300 Pa의 강성을 가졌으나, 다소 낮은 속도로 전단시 매우 낮은 값으로 떨어진다. 전단력이 제거되면 겔은 초기의 높은 강성으로 돌아간다. 이 과정은 도 7에 나타난 바와 같이 각각의 테스트 사이에 15분의 휴지기를 두고 여러 사이클(cycle) 동안 반복 가능한 것으로 확인되었다.
실시예 3
순수 콜라겐 바이오잉크(LifeInk®200)로 프린트
코 재현물을 생성하기 위해 LifeInk®200(Advanced BioMatrix, 부품 번호 #5202-1EA)을 공압(pneumatic) 기반 압출 프린터를 사용하여 프린팅하였다. 콜라겐 바이오잉크를 실온에서 1시간의 과정 동안 프린팅하였다. 압출 압력은 모든 시간 동안 < 30 psi 이었고, ~160 마이크로미터의 최종 분해능으로 30 게이지 바늘을 통해 바이오잉크를 압출시켰다. 최종 프린트 구조는 길이가 >30 mm이고 높이는 10mm이었다(도 8). 구조는 세포 배양 배지에서 6 개월 이상 모양을 유지했다.
실시예 4
순수 콜라겐 및 메타크릴화 젤라틴의 혼합물 프린트
LifeInk®200(Advanced BioMatrix, 부품 번호 #5202-1EA)을 10분간 실온에서 방치하였다. 35℃로 가온한 용액 중 메타크릴화 젤라틴에 Irgacure® 2959를 첨가하였다. 5 mL의 메타크릴화 젤라틴을 시린지에 피펫팅하고 30℃ 미만으로 냉각시켰다. 메타크릴화 젤라틴 시린지를 LifeInk®200 콜라겐 바이오잉크에 커플링시키고, 완전히 혼합하기 위해 40 회 이상 앞뒤로 흔들어 혼합하였다. 이렇게 함으로써 콜라겐과 메타크릴화 젤라틴의 1:1 혼합물을 생성하였다. 생성된 혼합물을 공압(pneumatic) 프린터로 프린팅하여 10 층 높이의 구조를 생성할 수 있었다(도 9). UV 광을 사용하여 프린팅된 구조물을 경화시켰다.
실시예 5
리보플라빈에 의한 콜라겐 가교 결합
FibriCol®(Advanced BioMatrix, 부품 번호 #5133-20ML)를 중화시키고 디쉬에 분주하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 샘플의 겔 강성은 Bohlin 유량계로 측정하였다. FibriCol®의 다른 샘플을 리보플라빈과 혼합하였다. 재료들을 디쉬에 배치하고, 37℃에서 겔화시켰다. 30분 후, 이 샘플을 UV 챔버에 배치하고 UV 광에 5 분간 노출시켰다. 겔 강성을 Bohlin 유량계로 측정하였다. 표 1은 리보플라빈(가교제)을 콜라겐 바이오잉크에 내포(incorporate)시키는 것에 의해 겔 강성 증가를 보여준다.
리보플라빈/UV 가교의 유무에 따른 FibriCol의 겔 강성(Gel Stiffness)
조건 겔 강성
리보플라빈 없이 겔화된 FibriCol 616 Pa (2회 테스트의 평균)
콜라겐 겔화-UV처리(365nm, 5분간) 전 콜라겐에 리보플라빈(0.02%)을 첨가한 FibriCol 1623 Pa (5회 테스트의 평균)
실시예 6
순수 콜라겐 바이오잉크로의 히알루론산 첨가
분자량 1,300,000 Da인 히알루론 산 3%의 0.85mL 및 1.15mL의 세포 배양 배지에 LifeInk®200(Advanced BioMatrix, 부품 번호 #5202-1EA) 5 mL를 첨가하였다. 결과적으로 수득된 바이오잉크는 ~ 12% 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 및 88% 타입 I 콜라겐으로 구성된 천연 ECM과 더욱 유사하였다. 바이오잉크 혼합물을 30 게이지 바늘을 통해 압출시켰고 그 결과물인 필라멘트의 강도는 LifeInk® 200 만의 필라멘트 강도와 비교하였다. 필라멘트는 강도 충실도(strength fidelity)가 비슷하였고 바이오잉크 혼합물은 비슷한 프린트 작업성(printability)를 보였다.
실시예 7
순수 콜라겐 바이오잉크로의 생체 활성(bioactive) 유리 첨가
생체 활성 유리는 바늘에 유리가 침전되거나 막힘(clogging)을 일으키는 것을 방지하기 위해 3-D 바이오프린팅을 위해 점성 물질에 현탁되어야 한다. 생체 활성 유리를 LifeInk® 200에 다양한 비율(10:90, 30:70, 64:35 유리/콜라겐)로 첨가하고 30 게이지 바늘을 통해 지지 수조(support bath)에 3-D 바이오프린팅하였다(도 10). 결과물을 유사 생체 용액(simulated body fluid)에 적용시켜, 하이드록시 아파테이트(hydroxyapatite)로 전환될 수 있다. 이 새로운 환경은 뼈를 만드는 골아 세포(osteoblast)에 이상적이다.
실시예 8
pH 중성 10 mg/ml 타입 I 아텔로콜라겐에 의한 바이오프린팅
FibriCol ®(Advanced BioMatrix, 부품 번호 #5133-20ML)은 10 mg/ml 농도의 타입 I 아텔로콜라겐이다. 이 재료를 중성화하고 실온에서 지지 배지(support media)로 프린팅하였다. 아텔로콜라겐은 프린팅 전에 겔화 없이 상온에서 프린팅을 가능하게 한다. 일단 프린팅되면, 구조를 콜라겐의 열에 의한 겔화(thermal gelation)가 가능하도록 37℃에서 인큐베이션시켰다. 상기 콜라겐의 겔 강도는 30분의 인큐베이션 후 ~ 1000 Pa였다.
실시예 9
pH 중성 3 mg/ml 타입 I 텔로콜라겐에 의한 바이오프린팅
TeloCol®(Advanced BioMatrix, 부품 번호 5026-50ML)은 3 mg/ml 텔로콜라겐이다. 이 재료를 중성화하고 차가운 환경(< 10℃)에서 프린팅함으로써 프린팅 전 시린지에서 콜라겐이 겔화하는 것을 방지하였다. 이 재료를 실온에서 지지 수조(support bath)로 프린팅하여, 프린팅 시 콜라겐이 겔화되도록 하였다. 프린팅 후 구조는 추가적인 겔화를 위해 37℃의 인큐베이터에 30분간 배치하였다(도 11).
전술한 내용은 본 발명의 예시이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 하기 청구항에 의해 정의되며, 청구항의 균등물은 그에 포함된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 특허 공개, 및 기타 참고문헌은 그 참고문헌이 제시된 문장 및/또는 단락에 관련된 교시를 위해 전체로서 참조에 의해 포함된다.

Claims (63)

  1. 3 mg/ml보다 높은 바이오잉크 내의 농도의 비변성 콜라겐(undenatured collagen)을 포함하는 바이오잉크로서,
    상기 비변성 콜라겐은 10% 미만으로 변성된 것이고,
    상기 바이오잉크는 100 내지 150,000 Pa의 정적 강성(static stiffness)을 갖고, 실온에서 0.001 sec-1보다 큰 전단 속도에서 50 Pa 미만의 전단 강성(shear stiffness)을 갖는 것인 바이오잉크.
  2. 제1항에 있어서,
    콜라겐이 상기 바이오잉크 내의 유일한 세포외기질 단백질인 것인 바이오잉크.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비변성 콜라겐은 비변성 중성화 콜라겐이며, 상기 바이오잉크는 3 mg/ml보다 높은 바이오잉크 내의 농도의 비변성 중성화 콜라겐 및 가교제를 포함하는 것인, 바이오 잉크.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이오잉크는 중성화되면 10℃보다 높은 온도에서 겔화되는 것인 바이오잉크.
  5. 제1항에 있어서, 상기 비변성 콜라겐은 비변성 산성화 콜라겐이며, 상기 바이오 잉크는 10 mg/ml보다 높은 농도의 비변성 산성화 콜라겐을 포함하는 것인, 바이오잉크.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비변성 콜라겐은 침전 콜라겐인 것인, 바이오잉크.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜라겐은 타입 I 콜라겐인 것인 바이오잉크.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜라겐은 텔로콜라겐(telocollagen), 아텔로콜라겐(atelocollagen), 또는 이들의 혼합물인 것인 바이오잉크.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2종 이상의 콜라겐을 포함하는 것인 바이오잉크.
  10. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜라겐은 상기 바이오잉크 중 유일한 세포외기질 단백질인 것인 바이오잉크.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜라겐은 콜라겐의 가교 결합을 가능하게 하는 화학 작용기(chemical group)에 의해 개질된 것인 바이오잉크.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 콜라겐은 콜라겐의 화학적 개질없이 가교 결합될 수 있는 것인 바이오잉크.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    첨가제를 더 포함하는 것인 바이오잉크.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 첨가제는 단백질, 글루코사미노글리칸, 성장 인자, 또는 이들의 조합이거나; 또는 상기 첨가제는 세포외기질 분자, 탈세포화 조직, 또는 이들의 조합인 것인 바이오잉크.
  15. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이오잉크는 상이한 세포외기질 분자를 더 포함하는 것인 바이오잉크.
  16. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이오잉크는 세포를 더 포함하는 것인 바이오잉크.
  17. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이오잉크는 100 내지 150,000 Pa의 정적 강성을 갖고, 0.001 sec-1보다 큰 전단 속도에서 50 Pa 미만의 전단 강성을 갖는 것인 바이오잉크.
  18. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이오잉크는 실온에서 3-D 구조를 프린팅하는데 사용될 수 있는 것인 바이오잉크.
  19. 3 mg/ml 보다 높은 바이오잉크 내의 농도의 비변성 콜라겐을 포함하며, 상기 비변성 콜라겐은 10% 미만으로 변성된 것이고, 100 내지 150,000 Pa의 정적 강성을 갖고 0.001 sec-1보다 큰 전단 속도에서 50 Pa 미만의 전단 강성을 가지며 프린팅 후 15분 이내에 정적 강성의 20% 이상을 회복하는 틱소트로피성 바이오잉크(thixotropic bioink).
  20. 3 mg/ml 보다 높은 바이오잉크 내의 농도의 비변성 콜라겐을 포함하며, 상기 비변성 콜라겐은 10% 미만으로 변성된 것이고, 프린팅 후 1분 이내에 100 Pa보다 큰 전단 강성을 달성하는 비변성 콜라겐-기반 바이오잉크.
  21. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 바이오잉크를 포함하는 키트.
  22. 삭제
  23. 비변성 콜라겐을 포함하는 3-D 구조를 프린팅하는 방법으로서,
    상기 방법은 3-D 프린터에서 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 바이오잉크를 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 3-D 구조가 프린팅될 때 또는 프린팅된 후에 상기 3-D 구조를 가교 결합시키거나, 또는 상기 3-D 구조가 프린팅될 때 또는 프린팅된 후에 상기 3-D 구조의 온도를 변화시키거나, 또는 상기 3-D 구조가 프린팅될 때 또는 프린팅된 후에 상기 3-D 구조를 빛에 노출시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    상기 바이오잉크는 지지 배지(support media)에 프린팅되는 것인 방법.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018225076A1 (en) * 2017-06-09 2018-12-13 Collplant Ltd. Additive manufacturing using recombinant collagen-containing formulation
CN112469289B (zh) * 2018-07-06 2022-12-09 加利福尼亚大学董事会 由水性和/或有机材料制成的物体的并行-增材制造方法
CA3106944A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Lung Biotechnology Pbc Material and method for producing cell receiving scaffold
US11213608B2 (en) * 2018-08-14 2022-01-04 Wake Forest University Health Sciences Compositions including gelatin nanoparticles and methods of use thereof
CN109224133B (zh) * 2018-09-21 2020-06-30 浙江大学 一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法
KR102168094B1 (ko) 2018-10-02 2020-10-20 한국과학기술연구원 하이드로겔 조성물 및 그를 포함하는 바이오 잉크 조성물
CN109385140A (zh) * 2018-10-12 2019-02-26 深圳市康杰尔生物科技有限公司 一种3d生物打印纳米纤维素水凝胶墨水
JP7384453B2 (ja) * 2018-10-18 2023-11-21 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ３ｄ堆積用バイオインク
CN109513037B (zh) * 2018-11-14 2021-09-17 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种负载介孔生物玻璃的小肠粘膜下层创面敷料
CN109575673B (zh) 2019-01-14 2020-11-17 四川大学 一种适用于3d打印的功能墨水及其制备方法
JP7256494B2 (ja) * 2019-03-06 2023-04-12 国立大学法人大阪大学 細胞組織作製方法および細胞組織作製セット
US20240158727A1 (en) * 2019-03-06 2024-05-16 Osaka University Cell tissue production method, cell tissue production set, and cultivation container containing cell tissue produced by said production method
JP7340185B2 (ja) * 2019-04-25 2023-09-11 国立大学法人大阪大学 細胞組織作製方法および該作製方法により作製された細胞組織を含む培養容器
KR102261908B1 (ko) * 2019-05-15 2021-06-08 주식회사 이노리젠 이중 가교 가능한 2액형 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법
CN110304930A (zh) * 2019-07-29 2019-10-08 中国科学院空间应用工程与技术中心 一种用于微重力环境制造使用的软物质材料及其制备方法
WO2021040169A1 (ko) * 2019-08-30 2021-03-04 주식회사 이노리젠 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법
KR102293725B1 (ko) * 2019-11-29 2021-08-26 한국과학기술연구원 콜라겐을 포함하는 3d 프린팅용 바이오잉크의 제조방법 및 그에 따라 제조된 바이오잉크를 이용한 3d 프린팅 방법
CN113072834B (zh) * 2020-01-03 2023-01-06 胶原蛋白(武汉)生物科技有限公司 一种用于3d打印的胶原蛋白生物墨水及3d打印方法
CN111686306A (zh) * 2020-07-08 2020-09-22 四川大学 一种基于脱细胞肋软骨基质的3d打印生物墨水及其制备方法与应用
CN112079960B (zh) * 2020-08-10 2021-10-29 西北大学 一种基于正交光化学反应的韧性水凝胶及其制备方法
US11918703B2 (en) 2020-08-13 2024-03-05 Universidad De Los Andes Extrudable photocrosslinkable hydrogel and method for its preparation
US20230331771A1 (en) * 2020-09-10 2023-10-19 Union Korea Life Sciences Inc. Method for preparing atelocollagen prepared in high purity and high yield and use thereof
ES2904272B2 (es) * 2020-10-02 2023-10-09 Viscofan Sa Tinta de colágeno para impresión en 3d
CN112679759A (zh) * 2020-11-09 2021-04-20 康膝生物医疗(深圳)有限公司 一种可降解蛋白质的原位交联成型凝胶方法
KR102462953B1 (ko) * 2020-12-03 2022-11-02 아주대학교산학협력단 바이오 프린팅용 광가교 히알루론산 바이오잉크, 이의 제조방법 및 이를 이용한 물성 조절이 가능한 생체구조체
KR102517914B1 (ko) * 2021-01-14 2023-04-04 포항공과대학교 산학협력단 개질된 세포외기질 기반 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이의 용도
JPWO2022176888A1 (ko) * 2021-02-16 2022-08-25
KR20240011724A (ko) * 2021-05-06 2024-01-26 렁 바이오테크놀로지 피비씨 세포 접착성 3d 인쇄된 물체를 생성하기 위한, 기능화 및 비-기능화된 ecm, ecm 단편, 펩티드 및 생물활성 구성요소의 용도
EP4333918A1 (en) 2021-05-06 2024-03-13 Lung Biotechnology PBC Modified 3d-printed objects and their uses
WO2023096401A1 (ko) * 2021-11-26 2023-06-01 주식회사 한국유니온 생명과학 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용하여 3차원 구조체를 제조하는 방법
CN115216180B (zh) * 2022-07-29 2023-07-18 南京水凝科技有限公司 一种荧光响应性水凝胶及其制备方法与应用
WO2024058485A1 (ko) * 2022-09-16 2024-03-21 포항공과대학교 산학협력단 가시광선 경화용 바이오잉크 조성물, 이것의 제조 방법 및 프린팅 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014110590A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Scripps Health Tissue array printing
CN104068945A (zh) * 2014-06-27 2014-10-01 深圳齐康医疗器械有限公司 一种人工皮肤及其制备方法
US20160074558A1 (en) 2010-10-21 2016-03-17 Organovo, Inc. Devices, systems, and methods for the fabrication of tissue

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5316942A (en) * 1993-06-16 1994-05-31 Battelle Memorial Institute Process for the production of low-cost soluble high-molecular weight collagen
US20140099709A1 (en) * 2012-06-19 2014-04-10 Organovo, Inc. Engineered three-dimensional connective tissue constructs and methods of making the same
US20150050686A1 (en) * 2013-08-13 2015-02-19 Lawrence Livermore National Security, Llc Omnidirectional, multiaxial bioprinted tissue system, techniques and applications
MY180106A (en) 2013-10-24 2020-11-23 Interhealth Nutraceuticals Incorporated Method of reducing exercise-induced joint pain in non-arthritic mammals
US9764515B2 (en) * 2014-05-01 2017-09-19 Musc Foundation For Research Development Multidispensor cartesian robotic printer
WO2016064648A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Wake Forest University Health Sciences Tissue-mimicking hydrogel compositions for biofabrication
US10532126B2 (en) 2014-12-11 2020-01-14 Eth Zurich Graft scaffold for cartilage repair and process for making same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160074558A1 (en) 2010-10-21 2016-03-17 Organovo, Inc. Devices, systems, and methods for the fabrication of tissue
WO2014110590A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Scripps Health Tissue array printing
JP2016513979A (ja) 2013-01-14 2016-05-19 スクリップス ヘルス 組織アレイプリンティング
CN104068945A (zh) * 2014-06-27 2014-10-01 深圳齐康医疗器械有限公司 一种人工皮肤及其制备方法

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