JP7340185B2 - 細胞組織作製方法および該作製方法により作製された細胞組織を含む培養容器 - Google Patents

Description

本発明は、生体外で細胞組織を作製する方法および該作製方法により作製された細胞組織を含む培養容器に関する。

生体外で細胞の三次元組織を構築する技術は、創薬研究および再生医療研究において重要であり、特にヒト生体組織に近い細胞組織の構築が求められている。

生体外で細胞を取り扱う場合、プラスチックディッシュやガラスシャーレ等の培養容器を用いて二次元的に細胞培養を行うのが一般的である。しかしながら、実際の生体内では細胞が三次元的に増殖して組織や臓器を形成しているため、生体内に近い培養環境を実現するためには三次元の細胞組織を構築し、その細胞組織に対して評価実験を行うことが創薬研究および再生医療研究の進展には重要である。

細胞同士が集合、凝集化した細胞組織（細胞集合体）を、例えばウェルプレートの整列した複数のウェル（凹部）のそれぞれに配置して、それぞれの細胞組織を評価するアッセイ法は、細胞機能の評価や、新規医薬品として有効な化合物を選択するスクリーニングにおいて広く用いられている。このような細胞組織に対してアッセイ法を行うことにより、少量の試料で多項目を短時間で評価することが可能であり、迅速性、簡便性、安全性、再現性および高い信頼性を確保する点において有利である。

細胞を基板上に精密パターニング配置する技術しては、フォトリソグラフィ技術で基板を加工して細胞接着を制御する方法と、細胞を直接プリントして配置および固定化する方法がある。近年では、細胞を三次元（３Ｄ）に配置および積層するための３Ｄプリンタ技術の進展に伴い、３Ｄプリンタを用いた細胞集合体の構築が検討されており、細胞組織から得られた組織モデルによる創薬研究および再生医療への応用が盛んに展開されている（特許文献１～８参照）。

特に、近年、ＲＦＩＤタグなどの微細な回路を印刷（塗布）方式で描画して形成するプリンテッドエレクトロニクス技術が急速に発展してきている。微細な回路のパターンや電極パターンを形成する方式としては、インクジェット方式、ディスペンサ方式などがあり、このようなプリンテッドエレクトロニクス技術は、回路や電極の形成への応用のみでなく、細胞組織の作成技術として応用するバイオプリンティング技術として研究されている（例えば、特許文献９）。

特開2008-126459号公報 特開2008-017798号公報 特開2010-022251号公報 特開2015-229148号公報 特開2016-087822号公報 特開2017-163931号公報 特開2017-169560号公報 特開2017-131144号公報 特開2016-526910号公報 特許4802027号公報

本発明は、上記のようなバイオプリンティング技術において、塗布工程を実行する前の塗布液容器内部でゲル化、それに伴う目詰まり等の不具合が生じないバイオプリンティング技術を提供する目的で行われた。驚いたことに、上記目的を達成できるバイオプリンティング技術を用いれば、細胞の生存率を維持した上で、高密度かつ保形性の高い細胞組織を作成できることが見出された。

本発明は、細胞の生存率を維持した上で、高密度かつ保形性の高い細胞組織を作製できると共に、複数の細胞組織および複数種類の細胞組織を一つの容器（培地）に作製することができる細胞組織作製方法および該作製方法により作製された細胞組織を含む培養容器を提供するものである。

前記目的を達成するために、本発明に係る一態様の細胞組織作製方法は、
第１の塗布液を塗布対象物に塗布する第１塗布工程、
前記第１塗布工程で塗布された前記第１の塗布液に、第２の塗布液を重ねて塗布する第２塗布工程、および
前記第１の塗布液を含む前記第２の塗布液が浸漬するように第３の塗布液を塗布する培地形成工程、を含み、
前記第１塗布工程と前記第２塗布工程の塗布動作を同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して実行し、前記培地形成工程を実行するものである。

また、前記目的を達成するために、本発明に係る培養容器は、同一容器内に複数の細胞組織を含むものである。

本発明によれば、細胞の生存率を維持した上で、高密度かつ保形性の高い細胞組織を作製でき、複数の細胞組織および複数種類の細胞組織を一つの容器（培地）に作製することが可能となる。このため、一度の評価実験により多くのサンプルに対する評価を行うことが可能となる優れた効果を奏する。

本発明に係る実施形態１において用いる微細塗布装置を示す全体図 微細塗布装置における塗布ユニットに装着される塗布針保持部を示す図 塗布針保持部に設けられる塗布針の先端部分を示す図 塗布ユニットにおける細胞塗布動作を模式的に示す図 塗布実験１において位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図 塗布実験２において位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図 塗布実験３における位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図 塗布実験４における位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図 塗布実験５の実験結果を示すグラフ 塗布実験６において製造した細胞集合体を示す画像の図 塗布実験７における生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示した図 塗布実験８において製造された心筋組織体の塗布直後の状態の画像を示す図 図１２に示した心筋組織体を６日間培養したときの状態の画像を示す図 ５日間培養した心筋組織体の１つを拡大した画像を示す図 図１４に示した５日間培養した心筋組織体における拍動動画の解析により得られた収縮・弛緩速度を示すグラフ 本発明に係る実施形態２の細胞組織作製方法として複数のウェルを有する多穴培養容器における１つのウェルを示しており、細胞組織を平底のウェルに細胞組織を作製した状態を模式的に示した図 実施形態２の細胞組織作製方法において、形状の異なるウェルに細胞組織を作製した例を模式的に示す平面図 本発明に係る実施形態３の細胞組織作製方法として塗布針を使用した塗布方法と塗布後の細胞の沈降沈殿を説明するための概略模式図。 実施形態３における微細塗布装置の例を示す図。 塗布装置本体の例を示す図。 ９６ウェルプレート内の４０ウェルに塗布を行った結果の塗布状態を示す写真。 細胞組織の位相差顕微鏡写真。 細胞組織のHE染色による厚さ測定結果を示す図。 細胞組織を蛍光染色により観察した位相差顕微鏡写真。 塗布液容器内に心筋細胞を包埋したゲル状物質の形成を示す写真。 従来手法を用いて得られた細胞組織の位相差顕微鏡写真。 本発明に係る実施形態４の細胞組織作製方法における各工程を模式的に示す図 実施形態４の細胞組織作製方法における第１塗布工程、第２塗布工程、および培地形成工程のタイムチャート 第１の塗布液に心筋細胞とトロンビンと分散させた場合の三次元細胞組織の画像を示す写真 作製された細胞組織の蛍光染色による厚さ測定結果の画像を示す写真 作製した細胞組織の蛍光染色による観察結果の画像を示す写真 本発明に係る実施形態５の細胞組織作製方法において用いられる微細塗布装置を示す正面図 微細塗布装置を用いて、培養容器内の複数の細胞組織を作製した例を模式的に示した平面図 図３３に示した複数の細胞組織を作製するためのフローチャート 微細塗布装置を用いて、培養容器内の複数の細胞組織を作製した変形例を模式的に示した平面図 図３５に示した複数の細胞組織を作製するためのフローチャート

先ず始めに、本発明に係る細胞組織作製方法、および該作製方法により作製された細胞組織を含む培養容器により作成された細胞組織における各種態様について記載する。
なお、本発明における細胞組織とは、基板上で細胞が集合、凝集、積層化して組織化し、機能している状態の細胞集合体のことをいう。

本発明に係る第１の態様の細胞組織作製方法は、
第１の塗布液を塗布対象物に塗布する第１塗布工程、
前記第１塗布工程で塗布された前記第１の塗布液に、第２の塗布液を重ねて塗布する第２塗布工程、および
前記第１の塗布液を含む前記第２の塗布液が浸漬するように第３の塗布液を塗布する培地形成工程、を含み、
前記第１塗布工程と前記第２塗布工程の塗布動作を同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して実行し、前記培地形成工程を実行するものである。

本発明に係る第２の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１の態様において、同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して前記第１塗布工程と前記第２塗布工程の塗布動作を実行した後、前記培地形成工程を実行してもよい。

本発明に係る第３の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１の態様において、同一培養容器のそれぞれの塗布対象位置に対して前記第１塗布工程と前記第２塗布工程の塗布動作を実行した後、当該塗布対象位置に対して前記培地形成工程を実行してもよい。

本発明に係る第４の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１の態様において、同一培養容器の複数の塗布対象位置に対する前記第１塗布工程の塗布動作が実行された後、当該同一培養容器の複数の塗布対象位置に対する前記第２塗布工程の塗布動作を実行し、その後当該同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して前記培地形成工程を実行してもよい。

本発明に係る第５の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第４の態様のいずれかにおいて、同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して、同じ種類の細胞を含む細胞組織を作製してもよい。

本発明に係る第６の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第４の態様のいずれかにおいて、同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して、種類の異なる細胞を含む細胞組織を作製してもよい。

本発明に係る第７の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第６の態様のいずれかにおいて、前記第１の塗布液を塗布対象物に塗布する第１塗布工程が塗布針を用いた接触塗布により実行されてもよい。

本発明に係る第８の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第７の態様のいずれかにおいて、前記第２の塗布液を前記第１の塗布液に重ねて塗布する第２塗布工程がインクジェット方式、またはディスペンサ方式が用いられてもよい。

本発明に係る第９の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第８の態様のいずれかにおいて、細胞組織形成時に２液式のゲル化溶液を塗布液として用いてもよい。

本発明に係る第１０の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第９の態様のいずれかにおいて、前記第２塗布工程が第１の塗布液の流動状態を維持しつつ、前記第１の塗布液と前記第２の塗布液との界面をゲル化してもよい。

本発明に係る第１１の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第１０の態様のいずれかにおいて、前記第１の塗布液が細胞およびゲル化開始剤を含み、前記第２の塗布液がゲル化剤を含むものでもよい。

本発明に係る第１２の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第１１の態様のいずれかにおいて、前記第１の塗布液を含む前記第２の塗布液が浸漬する培地となるように前記第３の塗布液が同一培養容器の複数の塗布対象位置に塗布されてもよい。

本発明に係る第１３の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第１２の態様のいずれかにおいて、前記第１の塗布液が増粘多糖類を含むものでもよい。

本発明に係る第１４の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１から第１２の態様のいずれかにおいて、前記第２の塗布液が増粘多糖類を含むものでもよい。

本発明に係る第１５の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１１の態様において、前記ゲル化開始剤がトロンビンでもよい。

本発明に係る第１６の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１１の態様において、前記ゲル化剤がフィブリノゲン、コラーゲン、ゼラチンまたはそれらの２種以上の混合物であってもよい。

本発明に係る第１７の態様の細胞組織作製方法は、前記の第１３または第１４の態様において、増粘多糖類が、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウムまたはそれらの混合物であってもよい。

本発明に係る第１８の態様の細胞組織作製方法は、前記の第５または第６の態様において、細胞が心筋細胞であってもよい。

本発明に係る第１９の態様の培養容器は、同一容器内に複数の細胞組織を含むものである。

本発明に係る第２０の態様の培養容器は、前記の第１９の態様において、同一容器内に同じ種類の複数の細胞組織を含むものでもよい。

本発明に係る第２１の態様の培養容器は、前記の第１９の態様において、同一容器内に種類の異なる複数の細胞組織を含むものでもよい。

本発明に係る第２２の態様の培養容器は、前記の第１９から第２１の態様のいずれかにおいて、同一容器内に複数の細胞組織を含み、該容器を複数有する

本発明に係る細胞組織作製方法においては、後述する実施形態において具体的な例示を用いて説明するように、塗布針の先端に付着させた数ｐＬ（ピコリットル）の微少な液滴を一回当たり極短時間で、例えば０．１秒で対象物の所定位置に高精度に塗布できる微細塗布装置を用いて、安全性および再現性が高く、自動化が可能であり、短時間で大量の信頼性の高い細胞組織（細胞集合体）の作製するものである。

本発明においては、高速の微細塗布装置を用いることにより従来のプリンタでは対応することができなかった高粘性を有する材料、例えば細胞とゲル化剤を含む高粘度溶液であっても、短時間で所定位置に確実に塗布して、複数の細胞組織（細胞集合体）を高精度に製造することが可能となる。この結果、本発明によれば、所望の細胞を二次元的および三次元的に任意に配置制御することが可能となり、様々な細胞組織を自動化して無菌状態で多量に製造することが可能となる。従って、本発明に係る細胞組織作製方法は、安全性および再現性が高く、信頼性を有する細胞組織を自動化により大量に製造することが可能となる。

次に、添付の図面を参照して本発明に係る細胞組織作製方法、および該作製方法により作成された細胞組織について実施形態を用いて説明する。なお、本発明に係る細胞組織作製方法は、以下に説明する実施形態の微細塗布装置を用いる構成に限定されるものではなく、微細塗布装置において実行される細胞塗布動作（細胞塗布方法）と同等の技術的思想による細胞塗布動作（細胞塗布方法）により達成されるものである。

（実施形態１）
以下、本発明に係る細胞組織作製方法、および該作製方法により作成された細胞組織に関する具体的な実施形態１について添付の図面を参照して説明する。図１は、実施形態１において用いる微細塗布装置１を示す全体図である。図１に示すように、微細塗布装置１は、塗布装置本体２と、この塗布装置本体２に対する設定、制御、および表示を行う表示・制御部３とを備える。実施形態１における微細塗布装置１の表示・制御部３としては、所謂パーソナルコンピュータ（ＰＣ）で構成される。

微細塗布装置１の塗布装置本体２は、本体ベース１２において水平方向に移動可能なＸＹテーブル４と、ＸＹテーブル４に対して上下方向（鉛直方向）に移動可能なＺテーブル５と、Ｚテーブル５と同様に上下方向に移動可能な駆動機構に固定された塗布ユニット６と、ＸＹテーブル４上の塗布対象物を観察するための光学検出部（例えば、ＣＣＤカメラ）７と、を備えている。ＸＹテーブル４上には、細胞含有溶液である塗布液１０が塗布されて、複数の細胞組織が形成される基板等が載置されて固定される。

上記のように構成された微細塗布装置１における塗布ユニット６は、ＸＹテーブル４上の基板等の上に複数の細胞組織を整列して形成する細胞塗布動作を行うよう構成されている。以下、塗布ユニット６の構成および塗布ユニット６による細胞塗布動作について説明する。

［塗布ユニットの構成］
図２は、塗布ユニット６に装着される塗布針保持部１３を示す図である。塗布針保持部１３には、塗布針９が突設されている。図３は、塗布針９の先端部分を示す図である。本実施形態の塗布針９においては、円錐状に形成された先端部分の先端９ａが、ＸＹテーブル４の水平面に対向するように平面（フラット）に形成されている（図３の（ａ）参照）。即ち、先端９ａの平面は鉛直方向に直交する平面である。先端９ａの直径ｄは、後述するように、作製される細胞組織の形状に大きく寄与する。実施形態１においては、塗布針９の先端９ａの直径ｄとして、５０～３３０μｍを用いた。実施形態１においては、図３の（ａ）に示すように、塗布針９の先端部分が円錐状に形成されており、先端９ａが水平面であるため、先端９ａを水平面に研磨することにより先端９ａの直径ｄを、例えば５０～３３０μｍの範囲の所望の値に容易に形成することが可能である。

なお、実施形態１においては、塗布針９の先端９ａを水平な平面で構成した例で説明するが（図３の（ａ）参照）、この先端９ａの面形状を所定直径、例えば３０μｍ以下の直径を有する凹面（半球面）に形成し、この凹面に細胞が保持され得るように細胞塗布動作を行う構成としてもよい（図３の（ｂ）参照）。このように塗布針９の先端９ａを凹面に形成することにより、塗布針９による細胞塗布動作により、所望の細胞密度や、細胞配列を有する細胞組織を作製することが可能な構成となる。また、図３の（ｃ）に示すように、塗布針９の先端９ａに段差を有する突起９ｂを設けた構成としてもよい。このような突起９ｂを有する構成とすることにより、例えば、基板上に連続的に複数回塗布し、一回の細胞塗布動作毎に針先を所定距離だけ上昇させていくことにより、例えば０．５μｍ上昇させていくことにより、基板上に上方に延びた細胞組織を作製することが可能となる。

図４は、塗布ユニット６における細胞塗布動作を模式的に示す図である。図４に示すように、塗布ユニット６は、細胞含有溶液である塗布液１０を所定量貯留する塗布液溜り８ａが形成された塗布液容器８と、塗布液溜り８ａを貫通する塗布針９を備えた塗布針保持部１３と、を有する。塗布針保持部１３は、塗布針９を上下方向（鉛直方向）に摺動可能に保持するスライド機構部１６を備える。塗布針保持部１３は、駆動機構部１７の所定位置において脱着可能に設けられており、例えば駆動機構部１７に対してマグネットの磁力により脱着可能な構成としてもよい。

塗布針保持部１３は、塗布装置本体２における駆動機構部１７に上記のように固定されており、上下方向（鉛直方向）に所定間隔を高速度で往復移動するよう構成されている。このような駆動機構部１７の駆動制御や、ＹＸテーブル４およびＺテーブル５の駆動制御の設定等は、表示・制御部３において行われる。塗布針保持部１３に設けたスライド機構部１６は、塗布針９を上下に往復可能に保持している。スライド機構部１６は、塗布針９の先端９ａの保持する塗布液１０が塗布対象物に接触した後に上昇する往復動作を行うように構成されている。なお、スライド機構部１６は、塗布針９の先端９ａが下降して、例えば基板１１に当接したときには、その当接位置から上昇するように、塗布針９がスライド機構部１６を鉛直方向に摺動する構成を有している。

上記のように、実施形態１の塗布ユニット６におけるスライド機構部１６は、塗布針９の先端９ａの保持する塗布液１０が塗布対象物に対して接触塗布する構成である。塗布針９の先端９ａは、塗布対象物に接触した位置で折り返して上昇する往復動作を行っている。なお、このときの塗布針９の上下方向の往復動作は高速であり、例えば１往復が、好ましくは０．５秒以下、さらに好ましくは０．１秒以下に設定される。

上記のように、塗布ユニット６における塗布針保持部１３は、塗布針９を保持して上下に摺動可能なスライド機構部１６を備えており、上下方向に移動する駆動機構部１７に対しては脱着可能に固定されている。また、塗布針保持部１３は、塗布針９が細胞含有溶液である塗布液１０を貯留する塗布液溜り８ａを上下方向（鉛直方向）に移動して貫通可能に構成されている。塗布液容器８の上部および下部には塗布針９が貫通する孔（上部孔１４ａ、下部孔１４ｂ）が形成されている。

［細胞塗布動作］
次に、図４に模式的に示した、塗布ユニット６における細胞塗布動作について説明する。図４に示した細胞塗布動作においては、塗布針９が塗布液容器８の塗布液溜り８ａを通り抜けて、塗布対象物である基板１１に接触し、基板１１上に細胞を含む塗布液１０が塗布されて、液滴スポットが形成される。この細胞塗布動作が所定回数繰り返されて、塗布液１０が複数回塗布されることにより、基板１１上に所望の細胞組織が作製される。

図４における(ａ)は、細胞塗布動作における待機状態を示している。この待機状態においては、塗布針９が上部孔１４ａから挿入されており、塗布針９の先端９ａが塗布液溜り８ａの塗布液１０に浸漬している。このように待機状態（待機工程）においては、塗布針９の先端９ａが塗布液１０に浸漬して、先端９ａに付着する塗布液１０が乾燥しない構成である。このとき、塗布液容器８の下部孔１４ｂの直径は微細（例えば、１ｍｍ以下）であるため、塗布液１０が塗布液溜り８ａから漏洩することはない。

図４における（ｂ）は、塗布針９の先端９ａが塗布液容器８の下部孔１４ｂから突出して、先端９ａが塗布液溜り８ａから基板１１に向かって下降している状態（下降工程）を示している。即ち、図４の（ｂ）は、塗布針９の先端９ａが塗布液容器８の塗布液溜り８ａを貫通して突出する下降状態を示している。この下降状態においては、塗布針９には塗布液１０が付着しているが、付着している塗布液１０の表面張力により、塗布針９の先端９ａには一定量の塗布液１０が保持されている。

図４における（ｃ）は、塗布針９の先端９ａの保持する塗布液１０が基板１１の表面に接触して、塗布液１０が基板１１の表面上に塗布された状態（塗布工程）を示している。このとき塗布される塗布液１０の液滴スポットは、塗布針９の先端９ａに保持された一定量の塗布液１０に対応する。実施形態１においては、塗布針９の先端９ａの保持する塗布液１０が塗布対象物に接触して塗布（接触塗布）する構成であるが、塗布針９の先端９ａが基板１１の表面に接触（当接）した場合でも、その接触瞬間の衝撃荷重を約０．０６Ｎ以下となるように構成されている。実施形態１においては、前述のように、塗布針９がスライド機構部１６により鉛直方向の衝撃を吸収するように摺動可能に保持されているため、当接時における衝撃荷重は極めて小さな値となっている。

図４における（ｄ）は、塗布針９が基板１１の表面上に塗布液１０を塗布した直後の状態を示しており、塗布針９が上昇している状態を示している。この上昇状態の後、塗布針９の先端９ａが塗布液溜り８ａの塗布液１０に浸漬する待機状態へ移行する（収容工程）。

上記のように、図４に示す（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ａ）の動作が１サイクルの細胞塗布動作である。実施形態１においては、１サイクルの細胞塗布動作を０．１秒で行っており、短時間で細胞塗布動作が実行されている。なお、実施形態１では細胞塗布動作を所定回数（例えば、１０サイクル）繰り返すことにより、所望の細胞組織が作製される。

本発明に係る実施形態１における微細塗布装置１の細胞塗布動作では、塗布針９の先端に付着した極微量な塗布液１０を塗布対象物に接触させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量の液滴スポットを高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布し形成することができる。また、塗布液１０の粘度としては、１×１０^５ｍＰａ・ｓ以下の材料を塗布することが可能であり、高粘度の細胞分散液の塗布が可能となる。実施形態１における微細塗布装置１の細胞塗布動作おいては、インクジェットプリンタ等のノズルを用いたプリンタでは目詰まり等の問題を有するため使用できなかった粘度１０ｍＰａ・ｓ以上、１×１０^５ｍＰａ・ｓ以下の材料を塗布材料として使用することが可能となる。また、塗布針９の先端に付着した極微量な塗布液１０を塗布対象物に接触させて塗布するため、塗布針９の鉛直方向位置のバラツキに影響されることなく、塗布液１０を所望の塗布量で安定して繰り返し塗布することができる。このように、実施形態１においては、高粘度の細胞分散液を基板１１等の表面における所定の位置に精密塗布することができるため、任意のパターニングを有する細胞を立体的に造形した細胞組織を作製することができる。このため、本発明に係る細胞組織作製方法は、作製された細胞組織が、薬剤の薬効、安全性の評価のスクリーニング等の創薬研究および再生医療の分野において利用されて、各分野における進展に効果を奏するものである。

（実験例１）
前述の実施形態１において説明した微細塗布装置１を用いて、濃度および粘性が異なる塗布液１０による塗布実験１を行った。この塗布実験１においては、５％、１０％、および２０％のゼラチンＰＢＳ（リン酸緩衝液）溶液の３種類の塗布液１０を用いて液滴スポットの形状の確認を行った。

塗布ユニット６における塗布液容器８を３個用意して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にゼラチンを５、１０、２０重量体積パーセント（％ｗ/ｖ）で溶解した３種類のゼラチンＰＢＳ溶液を塗布液１０として準備した。なお、この塗布実験１において用いた塗布液１０には細胞は含まれていない。

塗布実験１において、それぞれの塗布液容器８に対して、５％、１０％、２０％のゼラチンＰＢＳ溶液を２０μＬ充填した。塗布ユニット６における塗布針９としては先端９ａ（平面形状）の直径ｄが１００μｍを用いた。この塗布実験１においては、ＸＹテーブル４に固定されたスライドガラス上に５×５スポット（spot）を１５０μｍ間隔で塗布液１０を点接触して塗布した。スライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを位相差顕微鏡により観察した。

図５は、塗布実験１において位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図である。図５における（ａ）は、塗布液１０として５％のゼラチンＰＢＳ溶液（粘度３ｍＰａ・ｓ）を先端９ａの直径ｄ（先端直径）が１００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図５における（ｂ）は、塗布液１０として１０％のゼラチンＰＢＳ溶液（粘度３０ｍＰａ・ｓ）を塗布針９（先端直径１００μｍ）を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。また、図５における（ｃ）は、塗布液１０として２０％のゼラチンＰＢＳ溶液（粘度２２０ｍＰａ・ｓ）を塗布針９（先端直径１００μｍ）を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。

図５における（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）から明らかなように、微細塗布装置１の塗布ユニット６を用いることにより、濃度および粘性が異なる塗布液１０であっても形成された液滴スポットは同様の形状を有していた（５％ゼラチン液滴スポット直径１３６±３μｍ、１０％ゼラチン液滴スポット直径１４７±１μｍ、２０％ゼラチン液滴スポット直径１５１±１μｍ）。即ち、塗布実験１においては、ゼラチン濃度および粘性に大きく依存せず、常に安定した液滴スポットを確認することができた。発明者らの実験によれば、液滴スポット径は、塗布針９の先端直径に対して１．３～１．６倍の範囲内であり、少なくとも２倍以上の大きな液滴となることはなかった。別の実験例においては、塗布試験を行なっている塗布液として、更に高粘度化したものを用いており、塗布針９の先端９ａの直径に対して、１．０～１．２倍程度の範囲内で塗布している。また、更に別の実験例においては、ウェル中で細胞組織が重複しない範囲内において、塗布針９の先端９ａの直径に対して、２倍以上の大きな液滴となるような、低粘度の塗布液を用いて塗布試験を行っている。

（実験例２）
前述の実施形態において説明した微細塗布装置１を用いて、先端９ａの直径（先端直径）が異なる塗布針９による塗布実験２を行った。この塗布実験２においては、塗布液１０として５％のゼラチンＰＢＳ溶液を用いて、形成された液滴スポットの形状を確認した。この塗布実験２において用いた塗布液１０には細胞は含まれていない。

塗布実験２においては、先端直径が、５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍの３種類の塗布針９を用いた。塗布実験２においては、ＸＹテーブル４に固定されたスライドガラス上に５×５スポットを１５０μｍ間隔で塗布液１０を点接触して塗布した。スライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを位相差顕微鏡により観察した。

図６は、塗布実験２において位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図である。図６における（ａ）は、５％のゼラチンＰＢＳ溶液の塗布液１０を先端直径が５０μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図６における（ｂ）は、５％のゼラチンＰＢＳ溶液の塗布液１０を先端直径が１００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図６における（ｃ）は、５％のゼラチンＰＢＳ溶液の塗布液１０を先端直径が１５０μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。

図６における（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に示すように、形成された液滴スポットは、塗布針１０の直径（５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ）に略比例した液滴スポット径を有することが確認できた（５０μｍ塗布針：液滴スポット直径７５±２μｍ、１００μｍ塗布針：液滴スポット直径１３７±３μｍ、１５０μｍ塗布針：液滴スポット直径２１９±５μｍ）。

（実験例３）
塗布実験３においては、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を２×１０^７cells／ｍＬの濃度で１０％ゼラチンＰＢＳ溶液に分散させた塗布液１０を用いた。塗布実験３においては、微細塗布装置１を用いて、先端直径（先端直径）が１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍの３種類の塗布針９をスライドガラス上に点接触させて塗布液１０を塗布した。スライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットの形状を位相差顕微鏡により観察した。

図７は、塗布実験３における位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図である。図７における（ａ）は、ＮＨＤＦが分散された１０％ゼラチンＰＢＳ溶液を先端直径が１００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図７における（ｂ）は、ＮＨＤＦが分散された１０％ゼラチンＰＢＳ溶液を先端直径が１５０μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図７における（ｃ）は、ＮＨＤＦが分散された１０％ゼラチンＰＢＳ溶液を先端直径が２００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。

塗布実験３によれば、１００μｍの先端直径の塗布針９を用いた場合には、１つの液滴スポットにおいて０～３個の塗布細胞が確認された。先端直径が１５０μｍの塗布針９を用いた場合には、１つの液滴スポットにおいて２～６個の塗布細胞が確認された。また、先端直径が２００μｍの塗布針９を用いて形成された１つの液滴スポットにおいては、約１０個までの個数の塗布細胞を確認することができた。従って、塗布針９の先端直径を決定することにより、液滴スポットにおける塗布細胞の個数を１～１０個程度までの範囲で制御することが可能であることが確認された。

（実験例４）
塗布実験４においては、前述の塗布実験３における正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）に換えて、肝がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いて同様の実験を行った。塗布実験４においては、ＨｅｐＧ２を５×１０^７cells／ｍＬの濃度で１０％ゼラチンＰＢＳ溶液に分散させた塗布液１０を用いた。

図８は、ＨｅｐＧ２が分散された１０％ゼラチンＰＢＳ溶液を先端直径が１００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。塗布実験４においても、液滴スポット中に所定量の細胞が存在しており、細胞の種類によらず安定的な塗布が可能であることが確認された。以下に説明する塗布実験５においては、塗布針９の先端直径と、形成された液滴スポットに含まれる塗布細胞数との関連性について検証した。

（実験例５）
塗布実験５においては、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）を４×１０^７cells／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液に分散させた塗布液１０を用いて、先端直径が５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、３３０μｍのそれぞれの塗布針９により液滴スポットを形成した。塗布実験５においては、塗布針９の先端直径と、形成された液滴スポットに含まれる塗布細胞数との関連性について検証した。

塗布実験５においては、上記の塗布液１０をスライドガラス上に１回塗布し、塗布後の細胞数を蛍光顕微鏡（細胞は塗布前に蛍光色素のＤＡＰＩで核染色されたものを使用）および位相差顕微鏡観察により算出した。この塗布実験５において、先端直径が５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、３３０μｍの各塗布針９により形成された液滴スポットに関して、２０点以上について計測し、その平均値を求めた。

図９は、塗布実験５の実験結果を示すグラフである。図９において、縦軸が塗布細胞数［cells／spot］を示し、横軸が塗布針９の先端直径［μｍ］を示す。図９に示すように、ｉＰＳ－ＣＭを４×１０^７cells／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液に分散させた場合には、先端直径が５０μｍの塗布針９で塗布したとき液滴スポットには平均１．１個の塗布細胞が存在した。先端直径が１００μｍの塗布針９による液滴スポットには平均４．０個の塗布細胞が存在し、先端直径が１５０μｍの塗布針９による液滴スポットには平均４．５個の塗布細胞が存在し、先端直径が２００μｍの塗布針９による液滴スポットには平均１９．１個の塗布細胞が存在し、そして先端直径が３３０μｍの塗布針９による液滴スポットには平均８５．３個の塗布細胞が存在していた。なお、図９において各塗布針９における塗布細胞数の標準偏差（正方向）をエラーバーで示している。

上記のように、使用する塗布針９の先端直径と、形成される液滴スポットに存在する塗布細胞の個数が関連性を有しており、塗布針９の先端直径が大きくなるに従って液滴スポットに存在する塗布細胞の個数が増加することが確認された。このため、塗布針９の先端直径を決定することにより、液滴スポットにおける塗布細胞の個数をある程度の範囲で制御可能であることを検証することができた。

（実験例６）
塗布実験６においては、微細塗布装置１を用いて細胞集合体２０を製造した。塗布実験６においては、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を２×１０^７cells／ｍＬの濃度で２．５％アルギン酸ナトリウムＰＢＳ溶液に分散した塗布液１０を用いた。この塗布液１０を塗布ユニット６の塗布液容器８に充填して微細塗布装置１により細胞塗布動作を行った。

塗布実験６においては、アルギン酸ナトリウムを含む細胞分散液を先端直径が１００μｍであり、先端９ａに段差を有する突起９ｂを持つ塗布針９（図３の（ｃ）参照）を用いて、スライドガラス上に１６００回連続的に塗布した。このとき、一回の細胞塗布動作毎に針先を０．５μｍ上昇させることにより、細胞集合体２０を製造した。その結果、直径５０μｍ、高さ５００μｍの細胞集合体２０が製造された。図１０は、塗布実験６において製造した細胞集合体２０を示す画像である。

上記のように、基板１１における塗布すべき一定位置（一定点）に対して、細胞塗布動作における塗布工程時の塗布針９の先端９ａの停止位置（折り返し位置）を、１サイクル毎に上昇（例えば、０．５μｍ）させて、複数サイクルの細胞塗布動作を繰り返すことにより、所望形状の細胞集合体２０の作成が可能であることが確認できた。

（実験例７）
塗布実験７においては、微細塗布装置１を用いて塗布した形成された液滴スポットにおける塗布細胞の生存率を確認した。塗布実験７においては、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を８×１０^７cells／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液に分散させた塗布液１０を用いた。また、塗布実験７においては、先端直径が３３０μｍの塗布針９によりスライドガラス上に４０回連続的に塗布液１０を塗布し、塗布後の細胞１５の生存率を生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色法（死細胞が赤色染色）により評価した。図１１は、塗布実験７における生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示した図である。

図１１において、（ａ）が塗布前の塗布液１０における細胞１５の生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示しており、（ｂ）が塗布後の液滴スポットにおける細胞１５の生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示している。なお、塗布実験７における生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像では、生細胞が緑色であり、死細胞が赤色に染色された画像であるが、図１１の生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示す図においては、生細胞を○で示し、死細胞を●で示した。

塗布実験７において細胞１５の生存率を確認した結果、塗布前の細胞生存率が９６％に対して、塗布後においても９１％の高い細胞生存率を示していた。この確認結果により、微細塗布装置１を用いた細胞塗布動作においては、直接的に細胞１５にダメージを与えることが殆どないことが明らかとなった。なお、塗布前の細胞生存率が９６％から塗布後の細胞生存率が９１％に僅かに低下しているが、この低下は時間経過に伴う通常の低下であり、他の要因である。

（実験例８）
塗布実験８においては、微細塗布装置１を用いて、セルディスク上へｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）の細胞組織を構築し、その細胞組織における心筋組織体の拍動挙動を評価した。

塗布実験８においては、ｉＰＳ－ＣＭを４×１０^７cells／ｍＬの濃度で２０ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン溶液に分散させた塗布液１０（第１の塗布液）を用いた。塗布実験８においては、先端直径が３３０μｍの塗布針９によりセルディスク上に１０回連続的に塗布し、その後８００unit／ｍＬ（８．３ｍｇ／ｍＬ）のトロンビン溶液（第２の塗布液）に浸漬することにより、ゲル化による組織固定を行った。フィブリノゲンがトロンビンの作用によりフィブリン（血液凝固に関わる蛋白質）が形成され、そのゲル化反応を利用することで、組織を基板に固定化した。

その後、培地に浸して６日間培養を行い、経時的な拍動挙動を位相差顕微鏡により観察した。その結果、塗布直後は、直径約３００μｍの心筋組織が形成されており、６日間培養後においても等間隔の心筋組織の構造を確認することができた。

図１２は、塗布実験８において製造された心筋組織の塗布直後（０日間培養）の状態を示す画像である。図１３は、図１２に示した心筋組織を６日間培養したときの状態を示す画像である。図１４は、５日間培養した心筋組織の１つを拡大して示した画像である。図１３および図１４に示すように、心筋組織の構造が確認され、細胞組織が確実に構築されていることが確認できた。

製造された心筋組織においては、心筋細胞が２日間培養後から拍動を開始し、６日間培養後では６個のサンプル数において１分間あたり平均８２回の拍動が観察され、６個のサンプル数における標準偏差が１５であった。

また、高速度カメラで撮影した拍動動画の解析により、一定周期の収縮・弛緩速度が得られた。図１５は、図１４に示した５日間培養した心筋組織（細胞組織）における拍動動画の解析により得られた収縮・弛緩速度を示すグラフである。図１５において、縦軸が心筋組織の収縮・弛緩する移動速度［μｍ／ｓ］であり、横軸が時間［ｓ］である。

図１５に示すように、心筋組織（細胞組織）においては一定の拍動を示し、一定周期の収縮・弛緩速度が確認された。このときの拍動数は７８回／minであり、平均収縮速度は８．７μｍ／ｓであり、平均弛緩速度４．６μｍ／ｓであった。

上記の塗布実験８において得られた心筋組織を９６ウェルプレート等の各ウェルに製造することにより、ロボットを用いて無菌状態で自動評価するハイスループット化が可能な心毒性評価キットを製造することが可能である。

本発明で使用できる細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、線維芽細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、消化管細胞、神経細胞、肝細胞、腎細胞、膵細胞等の各種初代細胞、ES細胞およびｉＰＳ細胞等の幹細胞由来の分化細胞、並びに各種がん細胞等が使用できる。細胞としては、未修飾の細胞、またはタンパク質、糖鎖、核酸等で修飾された細胞、例えばフィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン等の既に知られているコーティング剤、コーティング方法でコーティングされた細胞を用いることができる。

なお、細胞含有溶液には、内包した細胞が安定して接着・増殖できる環境を与えるために、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、マトリゲル等の細胞外マトリックス成分、線維芽細胞増殖因子や血小板由来成長因子等の細胞増殖因子、その他、血管内皮細胞やリンパ管内皮細胞、各種幹細胞等の添加剤を含ませてもよい。また、ゲル化剤としてフィブリノゲンやアルギン酸、感熱応答性高分子等を含ませてもよい。

前述の実施形態１および各実験例を用いて説明したように、本発明は、細胞組織を作製する新たな作製方法を提供するものである。従来のノズルを用いたプリンタを用いて作製する場合と比較して、塗布針を用いてその先端表面に付着した溶液を塗布する構成であるため、溶液が目詰まりすることが抑制され、細胞組織の解像度および形成速度が向上し、より少ないサンプル量（試料）で信頼性の高い細胞組織を確実に作製することができる。また、従来のプリンタを用いた場合に比較して、高粘度の細胞分散液を対象物に対して塗布して、細胞組織を作製しているため、塗布後の細胞分散液における蒸発を抑えることができ、高い細胞生存率を維持することができる。

本発明における微細塗布装置においては、針（塗布針）の先端に付着した極微量な塗布液を塗布対象物に接触させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量となる液滴を高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布することができる。また、塗布液の粘度としては、１×１０^５ｍＰａ・ｓまでの材料を塗布することが可能であり、高粘度の細胞分散液の塗布が可能となる。このように、本発明によれば、高粘度の細胞分散液を対象物（基板等）に対して所定の位置に精密塗布することが可能となり、任意のパターニングを有し、細胞を立体的に造形した細胞組織を作製することができる。この結果、作製された細胞組織は、薬剤の薬効、安全性の評価のスクリーニング等の創薬研究および再生医療の分野において利用できる。

（実施形態２）
以下、本発明に係る細胞組織作製方法、および該作製方法により作成された細胞組織に関する実施形態２について説明する。なお、実施形態２の説明において、前述の実施形態１と同様の作用、構成、および機能を有する要素には同じ参照符号を付し、重複する記載を避けるため説明を省略する場合がある。

実施の形態１において説明したように、塗布針９の先端９ａの直径ｄとしては、５０～３３０μｍを用いることが可能であり、実験例２において説明したように、形成された液滴スポットは、塗布針１０の直径に略比例した液滴スポット径を有する。このように実施の形態１の細胞組織作製方法を用いることにより、極小の液滴スポットを形成することが可能である。細胞組織のために効率的に培養を行うためには、多数のウェル（有底穴）を有する培養容器が一般的に使用される。このような培養容器を用いる従来の細胞組織作製方法においては、１つのウェル（有底穴）に１つの細胞組織を作製し、評価していた。しかしながら、実施の形態１における微細塗布装置１を用いることにより、微細な液滴スポットを形成することができるため、１つのウェル（有底穴）に複数の細胞組織を作製することが可能となる。

図１６は、複数のウェル（例えば、９６ウェルプレート）を有する培養容器における１つのウェルｗを示しており、細胞組織ｃを直径が６．５ｍｍの平底のウェルｗに細胞組織ｃを作製した状態を模式的に示した図である。図１６の（ａ）は、１つのウェルｗの全体に細胞組織ｃが作製された状態を示しており、従来の細胞組織作製方法により作製された状態である。図１６の（ｂ）は、実施の形態１の細胞組織作製方法を用いて、１つのウェルｗに１つの細胞組織ｃを作製した状態を示している。図１６の（ｃ）は、実施の形態１の細胞組織作製方法を用いて、１つのウェルｗに複数（６つ）の細胞組織ｃを作製した状態を示している。図１６に示すように作製されたそれぞれの細胞組織ｃは培地に浸されて培養される。

図１６の（ｃ）に示すように、実施の形態１の細胞組織作製方法を用いることにより、例えば直径が６．５ｍｍの平底のウェルｗに６つの細胞組織ｃを作製することが可能となる。１つのウェルｗに作製できる細胞組織の数は、ウェルｗの大きさ、細胞組織の大きさにより異なる。

図１７は、形状の異なるウェルｗに細胞組織ｃを作製した例を模式的に示す平面図である。図１７において、（ａ）は、９６ウェルプレートにおいて、直径６．４５ｍｍの１つのウェルｗに円周上に８つの細胞組織ｃを作製し、その中央に１つの細胞組織ｃを作製することができることを示している。図１７の（ａ）に示す細胞組織ｃの直径は約１．０ｍｍである。図１７の（ｂ）は、３８４ウェルプレートにおいて、３．２４ｍｍ×３．２４ｍｍの正方形の平底のウェルｗに約１．０ｍｍ径の細胞組織ｃを４つ作製した場合の配置例である。図１７の（ｃ）は、３８４ウェルプレートにおいて、３．２４ｍｍ×３．２４ｍｍの正方形の平底のウェルｗに約０．１ｍｍ径の細胞組織ｃを８１（９×９）個を作製した場合の配置例である。図１７に示したそれぞれの細胞組織ｃの配置例において、ウェルｗの内壁面から細胞組織ｃまでの距離が２５０μｍである。

上記のように、実施の形態１の細胞組織作製方法を用いることにより、小さいウェルｗの内部に複数の細胞組織ｃを作製することが可能となる。実施の形態１の細胞組織作製方法によれば、７７１．４個／ｃｍ^２の配置密度で細胞組織ｃを作製することが可能であった。

上記のように、小さいウェルｗの１つに複数の細胞組織ｃを作製することにより、１つのウェルｗで複数のサンプル数に対する評価を行うことが可能となる。また、画像および動画の解析において、一回の撮影にて複数のサンプルを撮影することが可能となるため、撮影時間が短縮され、引いては解析時間が短縮されることになる。例えば、培養容器として９６ウェルｗを用いた場合、従来の細胞組織作製方法では、１つのウェルｗ内に１サンプルの作製しかできないが、実施形態１の細胞組織作製方法では、例えば、１つのウェルｗ内に直径が約１．０ｍｍの細胞組織ｃを９サンプル作製することが可能である。このため、実施の形態１の細胞組織作製方法によれば、９６ウェルｗの培養容器を用いて８６４個（９６×９）の細胞組織ｃのサンプルを作成することが可能となる。また、例えば、１つのウェルｗに対する動画解析に２０秒の撮影が必要とすると、従来の細胞組織作製方法では１つのウェルｗに１つのサンプルであるため、９サンプルの動画撮影には１８０秒が必要となる。一方、実施形態１の細胞組織作製方法では、１つのウェルｗの内部に９つのサンプルが作製されているため、動画撮影は２０秒と大幅に短縮されることになる。

（実施形態３）
以下、本発明に係る実施形態３の細胞組織作製方法、および該作製方法により作成された細胞組織に関して添付の図面を参照して説明する。なお、実施形態３の説明において、前述の実施形態１、２と同様の作用、構成、および機能を有する要素には同じ参照符号を付し、重複する記載を避けるため説明を省略する場合がある。

本発明に係る実施形態３の細胞組織作製方法においては、前述の実施形態１において詳細に説明した微細塗布装置１を用いて、塗布針９の先端９ａに付着した細胞を含む塗布液（第１の塗布液）を塗布する構成である。前述の実施形態１における実験例８では、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）をフィブリノゲン溶液に分散させた塗布液１０（第１の塗布液）を微細塗布装置１により塗布し、その後トロンビン溶液（第２の塗布液）に浸漬することにより、ゲル化による組織固定を行った。

上記のように、塗布針９による接触塗布により、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞をフィブリノゲン溶液に分散させて塗布した後、トロンビン溶液に浸漬することでゲル化による組織固定をした。この作製方法においては、フィブリノゲンを心筋細胞を塗布する際のゲル化剤として用いるにあたり、１液目としての第１の塗布液に心筋細胞とフィブリノゲンを分散させて塗布し、２液目としての第２の塗布液にゲル化開始剤として第１の塗布液を覆うようにトロンビンを添加することで塗布動作を行っている。しかしながら、塗布工程を実行する前に、第１の塗布液の内部の心筋細胞とフィブリノゲンの溶液において、意図しないゲル化が発生する現象が確認された。そのため、塗布液容器内部でゲル化した心筋細胞が塗布液容器内部に残り、塗布液容器内部の全ての塗布液を塗布できない場合が生じることがあった。

実施形態３の細胞組織作製方法は、塗布工程を実行する前の塗布液容器内部でゲル化の発生を防止するものである。実施形態３の細胞組織作製方法においては、細胞組織形成時に２液式のゲル化溶液を塗布液として用いている。

実施形態３においては、細胞とゲル化開始剤を含む第１の塗布液を塗布対象物に塗布する第１塗布工程、および
第１塗布工程で塗布された第１の塗布液に、ゲル化剤を含む第２の塗布液を重ねて塗布しゲル化反応を開始させる第２塗布工程、を含む細胞組織作製方法に関する。

また、実施形態３においては、細胞とゲル化開始剤を含む第１の塗布液を含む第１の容器、およびゲル化剤を含む第２の塗布液を含む第２の容器を含む、細胞組織作製セットに関する。

まず、本発明に係る実施形態３の細胞組織作製方法における、
細胞とゲル化開始剤を含む第１の塗布液を塗布対象物に塗布する第１塗布工程、および
前記第１塗布工程で塗布された第１の塗布液に、ゲル化剤を含む第２の塗布液を重ねて塗布しゲル化反応を開始させる第２塗布工程について説明する。

第１塗布工程
本発明の方法が適用できる細胞は、特に限定されるものではないが、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、正常ヒト心臓線維芽細胞、正常ヒト線維芽細胞、ヒト血管内皮細胞、ＨｅＰＧ２細胞等の細胞である。２種以上混合して使用してもよい。本発明は、これらの中でも、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、正常ヒト線維芽細胞、ＨｅｐＧ２細胞、特に、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞に適用することが好ましい。ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を使用する場合、より生体の心臓の形態に近づけ、正常ヒト心臓線維芽細胞から発される因子によりｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を成熟化させる理由で、通常、正常ヒト心臓線維芽細胞と混合して使用される。細胞としては、未修飾の細胞、またはタンパク質、糖鎖、核酸等で修飾された細胞、例えばフィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、マトリゲス等の既に知られているコーティング剤、コーティング方法でコーティングされた細胞を用いることができる。

第１の塗布液に含ませるゲル化開始剤としては、トロンビン、塩化カルシウム、アルコール類、例えば、エチルアルコール、グリセリン等）を使用すればよい。これらのゲル化開始剤は、通常、第２の塗布液に含ませるゲル化剤の種類に応じて使い分けられている。これらの使い分けは、当業者に公知であり、そのような公知の組合せで使用すればよい。例えば、ゲル化開始剤とゲル化剤の使用の組合せ（ゲル化開始剤：ゲル化剤）としては、トロンビン：フィブリノゲン（ゲル化開始剤：ゲル化剤）、塩化カルシウム：アルギン酸ナトリウム（ゲル化開始剤：ゲル化剤）、塩化カルシウム：カラギーナン（ゲル化開始剤：ゲル化剤）、アルコール類：タマリンドシードガム（ゲル化開始剤：ゲル化剤）等の組合せ使用が挙げられる。

細胞として、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を使用する場合は、トロンビン：フィブリノゲン（ゲル化開始剤：ゲル化剤）の組合せ使用が好ましい。

第１の塗布液は、上記細胞とゲル化開始剤が、水性溶液に含まれるものである。

水性溶液としては、水、各種の生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水等を使用するようにすればよい。他にも、細胞培養液として使用される培地、例えばDulbecco’s Modified Eagle Medium等を使用することができる。これらの水溶液は、通常、細胞の種類に応じて使い分けられている。これらの使い分けは、当業者に公知であり、そのような公知の組合せで使用すればよい。例えば、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞であれば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Dulbecco’s Modified Eagle Medium、各社専用培地、特に、リン酸緩衝生理食塩水を使用することが好ましい。

上記水性液に含ませる細胞の量は、特に、限定されるものではないが、1ｘ１０⁵個／ｍＬ～1ｘ１０⁹個／ｍＬ、好ましくは、1ｘ１０⁶個／ｍＬ～1ｘ１０⁸個／ｍＬ、より好ましくは、1ｘ１０⁷個／ｍＬ～1ｘ１０⁸個／ｍＬ程度の濃度で含有させるようにすればよい。多すぎると、溶液の調整が困難であり、少なすぎると、塗布量によっては細胞が含まれないものとなる。

ゲル化開始剤の含有量は、特に限定されるものではなく、通常、ゲル化の速さを考慮し、適宜その含有量を設定するようにすればよい。その量が、少なすぎると、ゲル化の速さが遅くなり、1液目である第１の塗布液の保形性が低下する。例えば、トロンビンを用いる場合、その濃度は、1 ｕｎｉｔ／ｍＬ～１０００ ｕｎｉｔ／ｍＬ、好ましくは１０ ｕｎｉｔ／ｍＬ～１０００ ｕｎｉｔ／ｍＬ、より好ましくは、１００ ｕｎｉｔ／ｍＬ～８００ ｕｎｉｔ／ｍＬ程度の濃度で含有させるようにすればよい。

第１の塗布液には、細胞が安定して接着・増殖できる環境を与えるために、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、マトリゲル等の細胞外マトリックス成分、線維芽細胞増殖因子や血小板由来成長因子等の細胞増殖因子、その他、血管内皮細胞やリンパ管内皮細胞、各種幹細胞等の添加剤を含ませてもよい。

第１の塗布液には、添加剤としてさらに増粘剤を添加してもよい。増粘剤としては、増粘多糖類、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウムを使用することができる。

増粘剤は、第１の塗布液に保形性を付与するために含ませるものであり、特に、増粘多糖類は、保形性の高い三次元細胞組織の作成に効果がある。

増粘剤を含ませる場合、その量は、第１の塗布液の保形性、使用する塗布装置の可能な粘度範囲、コスト、取り扱い性等を考慮し適宜設定するようにすればよい。例えば、実施形態１の微細塗布装置１を用いた塗布方法では、１ｍＰａ・ｓ～１×１０^５ｍＰａ・ｓ、好ましくは、３×１０^３ｍＰａ・ｓ～１×１０^５ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、１×１０^４ｍＰａ・ｓ～５×１０^４ｍＰａ・ｓの粘度になるように増粘剤を含ませるようにすればよい。その粘度が低すぎると第１の塗布液の保形性が低下する。なお、第１の塗布液の粘度は、回転粘度法により２５℃で測定された値を用いている。

細胞外マトリックスは、細胞の成長を促し、細胞と細胞、あるいは細胞と基質の接着を促すために含ませるものである。細胞外マトリックスを含ませる場合、その量は特に制限はない。作製したい組織に合わせてその種類、濃度を指定するようにすればよい。

実施形態３における細胞組織作製方法の第１塗布工程においては、第１の塗布液を塗布対象物に塗布する。使用される塗布対象物は、特に限定されず、細胞増殖のために通常使用されている培養容器が用いられる。本発明で使用する「同一培養容器」としては、６から３８４のウェルを有するウェルプレート、ディッシュ、シャーレ、マイクロウェルプレート（登録商標、Thermo Fisher Scientific Inc.）等である。ここで用いる「培養容器」は、底面が平面または曲面で形成され、側面を有する凹状の容器である。また、「培養容器」としては底面と側面が連続した曲面で形成された半球面でもよい。なお、「多穴培養容器」は、複数の凹状の容器（凹部：培養容器）を有する一体物の培養容器である。

第１の塗布液の塗布方法は、実施形態１において説明した微細塗布装置１が用いられる。微細塗布装置１を用いた塗布方法は、前述したように、極微量な塗布液を付着させた塗布針９の先端９ａを対象物（基板等）に接触させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）から数１００μL(マイクロリットル)の塗布量となる液滴を高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布することができる。また、第１の塗布液の粘度としては、１×１０^５ｍＰａ・ｓまでの材料を塗布することが可能であり、高粘度の細胞分散液の塗布が可能となる。このように、微細塗布装置１を用いた塗布方法によれば、高粘度の細胞分散液を塗布対象物（基板等）に対して所定の位置に精密塗布することが可能である。特に、粘度として、3×１０³ｍＰａ・ｓ程度以上の塗布液を使用することにより、塗布液を立体的に、詳しくは、立体的ドーム状に塗布することができ、次の第２塗布工程までの間にその立体的形状を保つことができる。本発明においてはこの特性を「保形性」という。

第１の塗布液の塗布量は、所望の量に応じて塗布方法の条件を適宜設定すればよい。微細塗布装置１を用いた塗布方法においては、塗布針９の先端９ａの直径、塗布回数等により調整可能である。

より具体的には、塗布針による塗布方法は、
第１の塗布液を所定量貯留する塗布液溜りを有する塗布液容器と、
前記第１の塗布液が貯留された前記塗布液溜りを貫通可能な塗布針と、を含む塗布ユニットを備えた微細塗布装置を用い、
前記塗布液溜りに充填された前記第１の塗布液に前記塗布針の先端を浸漬させる待機工程、
前記塗布針の先端が前記塗布液溜りを貫通して、前記第１の塗布液が付着された前記塗布針の先端を下降させる下降工程、
前記第１の塗布液が付着された前記塗布針の先端を塗布対象物に接触させて、前記第１の塗布液を前記塗布対象物に塗布して液滴スポットを形成する塗布工程、および
前記塗布針の先端を上昇させて、前記塗布針の先端を前記塗布液溜りに収容する収容工程、を含んで実行される。

第２塗布工程
第２塗布工程において使用される第２の塗布液は、ゲル化剤が、水性溶液に含まれるものである。

第２の塗布液に含ませるゲル化剤としては、フィブリノゲン、アルギン酸ナトリウム等を使用すればよい。これらのゲル化剤は、通常、第１の塗布液に含ませるゲル化開始剤の種類に応じて使い分けられている。これらの使い分け、組み合わせは、前述の第１の塗布液において説明した。

第２の塗布液に含ませるゲル化剤として、ゲル化開始剤なしで硬化するゲル化剤を使用してもよい。このようなゲル化剤を使用する場合は、第１の塗布液にゲル化開始剤を含ませる必要はない。このようなゲル化剤として、コラーゲン、ゼラチン、寒天（アガロース）等が挙げられる。例えば、コラーゲンは加熱することによりゲル化し、ゼラチンは冷却することによりゲル化する。このようなゲル化剤を含有する第２の塗布液を使用した場合には、第２の塗布液を塗布した後、コラーゲンを含む場合は加熱操作を行い、ゼラチンを含む場合は冷却操作を行い、ゲル化反応させる必要がある。

第２の塗布液に含まれる水性溶液は、前述の第１の塗布液で使用する同様の水性溶液を使用することができ、第１の塗布液で使用されている同一の水性溶液でもよいし、異なる種類の水性溶液を使用してもよい。

上記の水性溶液に含ませるゲル化剤の量は、特に限定されるものではなく、ゲル化の速さ、ゲル化剤の濃度、ゲルの硬さ等を考慮し、適宜その含有量を設定するようにすればよい。少なすぎると、ゲル化の速さが遅くなる。例えば、フィブリノゲンを用いる場合、その濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、１ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、１ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにすればよい。

第２の塗布液には、増粘剤等の成分（さらなる添加剤）が含まれてもよい。増粘剤は、塗布済の第１の塗布液の保形の観点から含ませるものであり、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等を使用することができる。増粘剤を含ませる場合、その量は、塗布済の第１の塗布液の保形性、使用する微細塗布装置１の可能な粘度範囲、コスト、取り扱い性等を考慮し適宜設定するようにすればよい。第２の塗布液としては、例えば、塗布針９を用いた塗布方法では、５×１０^２ｍＰａ・ｓ～１×１０^５ｍＰａ・ｓ、好ましくは、５×１０^２ｍＰａ・ｓ～１×１０^４ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、５×１０^２ｍＰａ・ｓ～５×１０^４ｍＰａ・ｓの粘度になるように増粘剤を含ませるようにすればよい。その量が少なく、粘度が低すぎると、塗布済の第１の塗布液の保形性が保てなくなる。なお、第２の塗布液の粘度は、回転粘度法により２５℃で測定された値を用いている。

第２の塗布液は、第１塗布工程で塗布された第１の塗布液に、第２の塗布液を重ねて塗布する。「重ねて」とは、第１塗布工程で塗布された第１の溶液の塗布対象物（基板等）を覆うように塗布することであり、第１の溶液の塗布対象物と接している面以外の面をも覆うようにという意味を含むものである。

上記のように、第２の塗布液を、第１の塗布液に重ねて塗布することにより、塗布された第１の溶液と第２の溶液との界面がゲル化する。この時、このゲル化した界面の下に存在する第１の塗布液の内部はゲル化せず、第１の溶液の溶液状態（粘度）を保っている。そのため、第１の塗布液の内部の細胞は、重力により沈降沈殿し、第１の塗布液の下部に凝集、堆積、積層する。

第１塗布工程終了から、第２塗布工程開始までの時間間隔は、できる限り短いことが望ましい。その、時間間隔が長すぎると、第１の塗布液が乾燥し、含有される細胞が死滅するという問題が生じる。

第２の塗布液の塗布量は、第１の塗布液の塗布量、ゲル化の速さ等を考慮して、第２の塗布液が第１の塗布液に重ねて塗布されるように適宜設定される。

第２の塗布液の塗布方法としては、実施形態１の微細塗布装置１を用いた塗布方法でもよいが、特に限定されるものではなく、例えば、手作業による塗布、例えば、注射器、スポイト等による液滴塗布、バイオプリンティング技術、例えば、インクジェット法、ディスペンサ法等を使用することができる。

第２の塗布液を塗布後、第１の塗布液と第２の塗布液の接触面（界面）のみがゲル化し、ゲル化した界面の下に存在する第１の塗布液の内部は硬化開始剤が液体として存在し、第１の塗布液の溶液状態（粘度）を保っており、時間の経過に従って、細胞が沈降沈殿し、第１の塗布液の下部に凝集、堆積、積層することにより、複雑な作製工程を介することなく高密度であり、かつ保形性の高い三次元細胞組織が作製される。
塗布直後の細胞組織の外周部である第１の塗布液と第２の塗布液の接触面がゲル化し、第１の塗布液の内部は液体の状態で保持されるため、細胞組織の乾燥も抑制できる。

細胞の培養は、第１塗布工程および第２塗布工程で塗布された塗布液を培地中に浸して行う。このとき、塗布対象物（基板）と共に培地に浸してもよい。培地としては、細胞との関係で、通常使用される培地を使用すればよく、例えば、細胞にｉＰＳ細胞由来心筋細胞を含む場合は、Dulbecco’s Modified Eagle Medium、各社市販専用培地が使用される。

図１８は、実施形態３で実施した細胞組織作製方法の概略を模式的に示した図であり、塗布工程後の細胞組織の三次元集積の形態を模式図で表している。
細胞とゲル化開始剤とを懸濁含有する第１の塗布液を用意し、該第１の塗布液を塗布液容器に充填する。塗布針９により塗布対象に第１の塗布液を塗布する（１液目）。この第１の塗布液を塗布する第１塗布工程においては、所望の回数の塗布動作が実行される。次に、ゲル化剤を含む第２の塗布液（２液目）が、第１塗布工程において塗布された第１の塗布液（１液目）を覆うように塗布される。第１の塗布液と第２の塗布液との接触面とその外周領域がゲル化した後、培地が添加される。１液目の第１の塗布液の内部は、流動性が保たれた液体状態が保持されてドーム構造となっているため、時間経過とともに細胞が沈降沈殿し、第１の塗布液の下部に凝集、堆積、積層する。その結果、高密度の三次元細胞組織を作製することができる。

本発明において、「高密度」とは、細胞間にフィブリンゲル等が存在せず、細胞が集積している状態を意味し、細胞密度として数値的に表すと、１×１０^８個／ｍＬ～１×１０⁹個／ｍＬ程度の密度を有する場合を意味している。

本発明に係る実施形態３における第２の側面としては、少なくとも、細胞とゲル化開始剤を含む第１の塗布液を含む第１の容器、およびゲル化剤を含む第２の塗布液を含む第２の容器を含む、細胞組織作製セットに関する。
該細胞組織作製セットは、実施形態３における細胞組織作製方法への使用に適している。細胞組織作製セットにおいて規定する第１の塗布液および第２の塗布液は、実施形態３の細胞組織作製方法で説明した第１の塗布液および第２の塗布液と同義である。

実施形態３における細胞組織作製方法に従えば、微細塗布装置１を用いた塗布工程において、塗布工程実行前の塗布液容器の内部でゲル化等が生じることがない。また、実施の形態３における細胞組織作製方法に従えば、細胞の生存率を維持した上で、高密度かつ保形性の高い細胞組織を作成できる。

以下、実施形態３における細胞組織作製方法について、具体的な実施例を用いて説明するが、本発明はそれらの実施例に限定的に解釈されるべきでなく、本発明の概念に接した当業者が想到し、実施可能であると観念するであろうあらゆる技術的思想、その具体的態様が本発明に含まれるものとして理解されるべきものである

実施例１
（１）塗布方法
（１－１）第１の塗布液（１液目）の塗布動作
実施例１で使用した第１の塗布液の微細塗布装置１００を図１９に示す。図１９は、微細塗布装置１００を示す斜視図である。実施例１で用いた微細塗布装置１００は、実施形態１において説明した微細塗布装置１と実質的に同じ塗布方法を実行する構成であり、塗布針９の先端９ａに付着した第１の塗布液を塗布対象物に接触塗布する構成である。図２０は、実施例１で用いた微細塗布装置１００における塗布装置本体１０１を示す斜視図である。

ＸＹＺステージ１０５に支持された塗布装置本体１０１においては、カム１０４の動作により、可動部１０５がＺ方向に往復動作を行い、塗布液容器８を貫通可能に支持された塗布針９が同様のＺ方向に往復動作する。この往復動作により、塗布針９の先端９ａに付着した第１の塗布液が塗布対象物に接触塗布される。

表示・制御部１０３は、モニター、制御用コンピュータ、操作パネルからなる。操作パネルから塗布速度指令値を入力し、制御用コンピュータの記憶装置に保管する。塗布動作時には塗布速度指令値を記憶装置から読み出して塗布装置本体１０１の制御プログラムに送出する。制御プログラムは塗布速度指令値に基づいて塗布装置本体１０１における駆動機構であるモータの回転速度を決定し、所定の速度で塗布針９を往復動作させて塗布動作を実行する。制御用コンピュータが上位の制御システム（図示せず）と通信している場合には、塗布速度指令値を上位の制御システムから受け取ってもよい。また、第１の塗布液の種類に応じたパラメータを記憶部に保管し、指定された第１の塗布液の種類と塗布量または塗布サイズに応じて塗布速度指令値を算出してもよい。

実施形態１の微細塗布装置１において説明したように、塗布針９の先端９ａは塗布液容器８の底面に設けられた下部孔１４ｂから突出して塗布動作を行う（図４参照）。塗布針９の先端９ａが塗布液容器８の下部孔１４ｂから突き出す時に、塗布針９の先端９ａに第１の塗布液が付着して塗布液容器８から突出する。この時、表面張力によって第１の塗布液が上方に引き上げられ、塗布針９の先端９ａにはほぼ一定量の第１の塗布液が残される。塗布針９の先端９ａに残された第１の塗布液を塗布対象に転写することにより、再現性のある塗布動作を実現することができる。

（１－２）第２の溶液の塗布動作
第２の溶液の塗布動作は、マイクロピペットを用いて手動で滴下することにより行った。

（２）塗布条件cells
・塗布針径： φ１０００μｍ
・塗布針形状： ストレート
・塗布回数： １０回
・第１の塗布液の塗布量： 数１００nＬ/１０回
・第２の塗布液の塗布量： １５μＬ/１回
・塗布液容器内の待機時間： １０２０ｍｓ
・塗布針降下後の待機時間： ０ｍｓ
・上昇時間： ５μｍ／１回
・第２の塗布液の添加までの所要時間： ５ｓ以内
・培地添加までの所要時間： ４個作成後まとめて、マイクロピペットにて手動で添加

（３）塗布液
（３－１）第１の塗布液（１液目）
・ｉＰＳ細胞由来心筋細胞： ヒト心臓線維芽細胞 ＝ ３：１
・細胞数： ８ｘ１０^７cells／ｍＬ
・ヒアルロン酸ナトリウム： １３ｍｇ／ｍＬ
・トロンビン： ８００ｕｎｉｔ／ｍＬ
・ＰＢＳ
・粘度： １.５×１０⁴ｍＰａ・ｓ）
（３－２）第２の塗布液（２液目）
・添加量： １５μＬ
・ヒアルロン酸ナトリウム： ０．５ ｍｇ／ｍＬ
・フィブリノゲン： １０ ｍｇ／ｍＬ
・ＰＢＳ
・粘度： 1×１０³ｍＰａ・ｓ

（４）結果考察
（４－１）作製方法
上記塗布条件で第１の塗布液を繰返し複数回の塗布動作を行い、１液目である第１の塗布液の塗布液容器内の心筋細胞とゲル化開始剤のトロンビンを残らず塗布できることを確認した。塗布終了後、塗布液容器の内部を目視したところ、第１の塗布液のゲルの発生は確認されなかった。２液目としてゲル化剤であるフィブリノゲンを含む第２塗布液を、１液目の第１の塗布液を覆うように添加する。

上記の条件にて９６ウェルプレート内の４０ウェルに塗布を行った結果の塗布状態を、ウェルプレート上方から撮影した写真を、図２１(倍率２倍）に示す。図２１に示されているように、多数回塗布しても、概ね細胞数にばらつきはなかった。

（４－２）組織観察
（４－２－１）密度
塗布１時間後に得られた細胞組織を、位相差顕微鏡を用いて顕微鏡観察した。該顕微鏡観察は、塗布液（図１８の右下に描いたゲルドームと記載された状態）を上から観察したものである。その写真を図２２に示す。
図２２からわかるように、細胞と細胞との間に細胞間マトリックスがほとんど存在せず、高密度の三次元細胞組織が作製されたことが解る。密度は３.５×１０^８個／ｍＬであった。
なお、培養は、温度 ３７℃、ＣＯ_２ ５％の環境下、７日間行った。

（４－２－２）厚さ
培養後に得られた細胞組織の厚さを、細胞核および細胞質をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により測定した。ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色測定結果を図２３に示す。図２３より、この組織の厚さは、５０μｍ程度の厚さであった。

（４－２－３）細胞組織
細胞核、アクチン、トロポニン染色を行った。
その蛍光染色の結果を図２４に示す。
この写真は、本来カラー写真であり、細胞核が青で、アクチンが赤で、心筋トロポニンＴが緑で写し出されている。図２４より、心筋細胞に特徴的な心筋トロポニンＴの横紋構造の発現を確認した。また拍動数は成人の心臓に近い５０～６０拍動/分であった。

（４－３）考察
１液目として心筋細胞とゲル化開始剤のトロンビンを分散させた第１の塗布液を複数回塗布し、２液目としてゲル化剤であるフィブリノゲンを含む第２塗布液を、１液目の第１の塗布液を覆うように添加する塗布方法により、高密度かつ保形性の高い三次元細胞組織を、複雑な作製工程を介することなく、細胞生存率を維持し、簡易に作成することができた。

比較例１
（１）実施例１で使用した同じ微細塗布装置１００を使用して、下記塗布条件で、塗布液を塗布した。
比較例においては、ゲル化剤（フィブリノゲン）が第１の溶液に、ゲル化開始剤（トロンビン）が第２の溶液に入っている点が、実施例１と大きく異なる点である。

（２）塗布条件
・塗布針径： φ１０００μｍ
・塗布針形状： ストレート
・塗布回数： １０回
・第１の塗布液の塗布量： 数nＬ/10回
・第２の塗布液の塗布量： １５ μＬ/1回
・塗布液容器内の待機時間： １０２０ ｍｓ
・塗布針降下後の待機時間： ０ｍｓ
・上昇時間： ５μｍ／１回
・第２の塗布液の添加までの所要時間： ５ｓ以内
・培地添加までの所要時間： ４個作成後まとめて、マイクロピペットにて手動で添加

（３）塗布液
（３－１）第１の塗布液（１液目）
・ｉＰＳ細胞由来心筋細胞： ヒト心臓線維芽細胞 ＝ ３：１
・細胞数： ８ｘ１０^７cells／ｍＬ
・ヒアルロン酸ナトリウム： １３ｍｇ／ｍＬ
・フィブリノゲン： １０ ｍｇ／ｍＬ
・ＰＢＳ
・粘度：１.５×１０⁴ｍＰａ・ｓ）
（３－２）第２の塗布液（２液目）
・添加量 １５μＬ
・ヒアルロン酸ナトリウム ０．５ ｍｇ／ｍＬ
・トロンビン： ８００ｕｎｉｔ／ｍＬ
・ＰＢＳ
・粘度： １×１０³ｍＰａ・ｓ

（４）結果考察
（４－１）組織観察
（４－１－１）密度
塗布直後に得られた細胞組織を、位相差顕微鏡を用いて顕微鏡観察を行った。その、写真を図２６に示す。
図２６においては、略球状の細胞と細胞の間に、細胞間マトリックスが存在していることが解る。塗布直後の細胞が沈殿する前の状態において、図２２と比較すると図２６では細胞密度が低いことが分かる。これは、１液目にゲル化剤を混合することにより細胞は疎の状態で固定化されてしまい、沈殿が起こらないためと考えている。

（４－２）作製方法
１液目としての第１の塗布液に心筋細胞とフィブリノゲンを分散させた場合、１５分経過した後、塗布液容器内に心筋細胞を包埋したゲル状物質を確認した（図２５）。

図２５の（ａ）は、貫通可能に支持された具体的な塗布針９と塗布液容器８を示しており、図２５の（ｂ）は、塗布液容器８の下部孔１４ｂの周囲に形成された細胞包埋フィブリルゲルを示している。図２５の（ｃ）は、塗布液容器８から取り出した細胞包埋フィブリルゲルをしめしている。図２５の（ｄ）は、図２５の（ｃ）の拡大図である。
本比較例の作製方法においては、塗布液容器内に細胞が残留し、第１の塗布液内の細胞数のバラツキが発生した。

（４－３）考察
１液目として心筋細胞とフィブリノゲンを分散させた第１の塗布液を塗布し、２液目としてゲル化開始剤として１液目の塗布液を覆うようにトロンビンを含む第２の塗布液を塗布する本比較例においては、心筋細胞を包埋する形でフィブリノゲンがゲル化するため、心筋細胞がゲル内で疎に分散し、高密度かつ保形性の高い三次元心筋細胞組織を、細胞生存率を維持し、簡易に作成することが困難となる不具合が生じた。
また、１液目に心筋細胞とフィブリノゲンを分散させた第１の塗布液を、繰り返し塗布を繰り返すか、塗布液容器内に第１の塗布液を長時間保持ししていると、塗布液容器内で第１の塗布液のゲル化が生じ、そのため、塗布液容器内部でゲル化した心筋細胞塊が塗布液容器に残り塗布できない場合があるという不具合が生じた。

以上開示事項から、本発明に係る実施形態３における第１の側面のより具体的な態様として、例えば、下記のものが提供される。
（１）第１の塗布液を塗布対象物に塗布する第１塗布工程、および
前記第１塗布工程で塗布された第１の塗布液に、第２の塗布液を重ねて塗布し、第１溶液の塗布液の流動状態を維持しつつ、第１の塗布液と第２の塗布液の界面をゲル化する第２塗布工程、
を含むことを特徴とする細胞の組織作製方法。
（２）第１の塗布液が細胞およびゲル化開始剤を含む、上記（１）に記載の細胞組織の作製方法。
（３）第２の塗布液がゲル化剤を含む、上記（１）または上記（２）に記載の細胞組織の作製方法。
（４）細胞とゲル化開始剤を含む第１の塗布液を塗布対象物に塗布する第１塗布工程、および
前記第１塗布工程で塗布された第１の塗布液に、ゲル化剤を含む第２の塗布液を重ねて塗布し、第１の塗布液と第２の塗布液の界面でゲル化反応を開始させる第２塗布工程、
を含むことを特徴とする細胞組織の作製方法。
（５）第１の塗布液および第２の塗布液が塗布された塗布対象物を培地中に浸漬し、細胞を培養する工程を含む、上記（１）～上記（４）いずれかに記載の細胞組織の作製方法。
（６）第１の塗布液が増粘多糖類を含む、上記（１）～（５）いずれかに記載の細胞組織の作製方法。
（７）第２の塗布液が増粘多糖類を含む、上記（１）～（６）いずれかに記載の細胞組織の作製方法。
（８）ゲル化開始剤がトロンビンである、上記（２）～（７）いずれかに記載の細胞組織の作製方法。
（９）ゲル化剤がフィブリノゲン、コラーゲン、ゼラチンまたはそれらの２種以上の混合物である、上記（３）～（８）いずれかに記載の細胞組織の作製方法。
（１０）増粘多糖類が、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウムまたはそれらの混合物であり、上記（６）～（９）いずれかに記載の細胞組織の作製方法。
（１１）細胞が心筋細胞である、上記（２）～（１０）いずれかに記載の細胞組織の作製方法。

また、本発明に係る実施形態３における第２の側面のより具体的な態様として、例えば、下記のものが提供される。
（１２）少なくとも、細胞とゲル化開始剤を含む第１の塗布液を含む第１の容器、およびゲル化剤を含む第２の塗布液を含む第２の容器を含む、細胞組織形成セット。
（１３）第１の塗布液が増粘多糖類を含む、上記（１２）に記載の細胞組織形成セット。
（１４）第２の塗布液が増粘多糖類を含む、上記（１２）～（１３）いずれかに記載の細胞組織形成セット。
（１５）ゲル化開始剤がトロンビンである、上記（１２）～（１４）いずれかに記載の細胞組織形成セット。
（１６）ゲル化剤がフィブリノゲン、コラーゲン、ゼラチンまたはそれらの２種以上の混合物である、上記（１２）～（１５）いずれかに記載の細胞組織形成セット。
（１７）増粘多糖類が、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウムまたはそれらの混合物であり、上記（１３）～（１６）いずれかに記載の細胞組織形成セット。
（１８）細胞が心筋細胞である、上記（１２）～（１７）いずれかに記載の細胞組織形成セット。
（１９）上記（１）～上記（１１）いずれかに記載の細胞組織の作製方法により作製された細胞組織。
（２０）第１塗布工程を塗布針による接触塗布を用いて行う、上記（１）～（１１）いずれかに記載の細胞組織の作製方法。

（実施形態４）
以下、本発明に係る実施形態４の細胞組織作製方法、および該作製方法により作成された細胞組織に関して説明する。なお、実施形態４の説明において、前述の実施形態１、２、３と同様の作用、構成、および機能を有する要素には同じ参照符号を付し、重複する記載を避けるため説明を省略する場合がある。

本発明に係る実施形態４の細胞組織作製方法においては、前述の実施形態１および３において詳細に説明した塗布方法を用いて、塗布針９の先端９ａに付着した細胞を含む塗布液（第１の塗布液）を塗布対象物に塗布する。第１の塗布液を塗布した後、第１の塗布液に重なるように第２の塗布液を塗布する構成である。第２の塗布液の塗布方法は、特に限定されるものではなく、例えば、手作業による塗布、例えば、注射器、スポイト等による液滴塗布、バイオプリンティング技術、例えば、インクジェット法、ディスペンサ法等を使用することができる。

実施形態４の細胞組織作製方法においては、前述の実施形態３において説明した塗布方法を用いることにより、微細な液滴スポットを形成することができるため、小さな培養容器である１つのウェル（有底穴）に複数の細胞組織を作製している（図１６の（ｃ）参照）。

実施形態４の細胞組織作製方法は、前述の実施形態３の細胞組織作製方法における工程と同じである。即ち、実施形態４の細胞組織作製方法は、図１８の模式図に示したように、塗布針９により塗布対象に第１の塗布液を塗布する（１液目）。この第１の塗布液を塗布する第１塗布工程においては、所望の回数の塗布動作が実行される。次に、ゲル化剤を含む第２の塗布液（２液目）が、第１塗布工程において塗布された第１の塗布液（１液目）を覆うように塗布される。第１の塗布液と第２の塗布液との接触面とその外周領域がゲル化した後、第３の塗布液（３液目）としての培地が添加される。１液目の第１の塗布液の内部は、流動性が保たれた液体状態が保持されてドーム構造となっているため、時間経過とともに細胞が沈降沈殿し、第１の塗布液の下部に凝集、堆積、積層する。その結果、高密度の三次元細胞組織を作製することができる。図１８における右下に示した図には、ゲルドームにおいて細胞が沈殿する状態を模式的に示している。

図２７は、実施形態４の細胞組織作製方法における各工程を模式的に示す図である。図２７の（ａ）は、塗布針９が塗布液容器８に充填された第１の塗布液（１液目）３０の内部に浸漬された状態である（塗布針浸漬工程）。図２７の（ｂ）は、塗布針９により第１の塗布液３０を塗布する第１塗布工程Ａを示している。第１塗布工程Ａにおいては、第１の塗布液３０が所望の回数だけ塗布対象に対して塗布される。図２７の（ｃ）は、第１塗布工程Ａにおいて塗布された第１の塗布液３０に覆い重なるように第２の塗布液４０が塗布される第２塗布工程Ｂを示している。実施形態４においては第２塗布工程Ｂがマイクロピペット１１０による塗布動作により実行される。次に、第２の塗布液４０の全体が浸漬するように第３の塗布液５０が塗布（添加）され培地が形成される（培地形成工程Ｃ）。図２７の（ｄ）は、培地形成工程Ｃにより基板上の第１の塗布液３０を覆うように重なった第２塗布液４０が培地（５０）中に浸漬された状態を示している。

上記のように、実施形態４の細胞組織作製方法においては、前述の実施形態３の細胞組織作製方法と同様に、細胞とゲル化開始剤を含む第１の塗布液３０を塗布対象物に塗布する第１塗布工程Ａ、および第１塗布工程Ａで塗布された第１の塗布液３０に対して覆うように、ゲル化剤を含む第２の塗布液４０を重ねて塗布し、ゲル化反応を開始させる第２塗布工程Ｂとを有している。その後、第１の塗布液３０を覆うように重なる第２の塗布液４０が浸漬されるように培地が形成される（培地形成工程Ｃ）。

実施形態４の細胞組織作製方法は、例えば基板上の複数の塗布対象位置のそれぞれの位置に細胞組織を効率的に作製するものである。複数の塗布対象位置としては、培養容器の複数のウェルのそれぞれの位置でもよく、または１つのウェルの中に複数の細胞組織を作製するように１つのウェルの中に複数の塗布対象位置があってもよい（図１６の（ｃ）参照）。

実施形態４の細胞組織作製方法においては、複数の塗布対象位置における第１の塗布対象位置に対して、図２７の（ｂ）に示す第１塗布工程Ａが実行され、次に図２７の（ｃ）に示す第２塗布工程Ｂが実行される。次に、位置を移動して第２の塗布対象位置に対して、第１塗布工程Ａが実行され、次に第２塗布工程Ｂが実行される。このように、複数の塗布対象位置のそれぞれに対して、第１塗布工程Ａおよび第２塗布工程Ｂが順次実行される。全ての塗布対象位置に対して第１塗布工程Ａおよび第２塗布工程Ｂが実行された後、それぞれの塗布対象位置に対する培地形成工程Ｃが実行される。この培地形成工程Ｃにおいては、それぞれのウェル（培養容器）に培地が形成される。

実施形態４の細胞組織作製方法における第１塗布工程Ａおよび第２塗布工程Ｂは、前述の実施例１において説明して塗布方法を用いた。第１塗布工程Ａにおける第１の塗布液３０の塗布動作は微細塗布装置１００を用いた。第２塗布工程Ｂにおける第２の塗布液４０の塗布動作はマイクロピペットを用いて手動で滴下することにより行った。

（１）第１の塗布液（１液目）３０は以下の通り。
・ｉＰＳ細胞由来心筋細胞： ヒト心臓線維芽細胞 ＝ ３：１
・細胞数： ８ｘ１０^７cells／ｍＬ
・ヒアルロン酸ナトリウム： １３ｍｇ／ｍＬ
・トロンビン： ８００ｕｎｉｔ／ｍＬ
・ＰＢＳ
・粘度： １.５×１０⁴ｍＰａ・ｓ）
・塗布直径：約１．０ｍｍ（塗布針による接触塗布）

（２）第２の塗布液（２液目）４０
・添加量： １５μＬ
・ヒアルロン酸ナトリウム： ０．５ｍｇ／ｍＬ
・フィブリノゲン： １０ｍｇ／ｍＬ
・ＰＢＳ
・粘度： 1×１０³ｍＰａ・ｓ
・マイクロピペットによる手動による塗布（添加）
・第１の塗布液３０の塗布後、５秒（sec）以内に添加する。

（３）培地（３液目）５０
・複数の塗布対象位置に対する第１塗布工程Ａおよび第２塗布工程Ｂの塗布が終了した後、培養容器の全体に対してマイクロピペットによる手動で添加する。

図２８は、実施形態４の細胞組織作製方法における第１塗布工程Ａ、第２塗布工程Ｂ、および培地形成工程Ｃの具体的な塗布時間と、工程間の間隔時間の一例を示すタイムチャートである。図２８に示すように、１つの塗布対象位置に対して第１塗布工程Ａが４秒（sec）実行され、第２塗布工程Ｂが０．５秒（sec）実行される。第１塗布工程Ａにおいては１０回の塗布動作が実行されている。第２塗布工程Ｂにおいてはマイクロピペットにて第２の塗布液４０を手動で添加している。

図２８のタイムチャートに示すように、最初にそれぞれの塗布対象位置に対する第１塗布工程Ａと第２塗布工程Ｂを実行し、その後にそれぞれの塗布対象位置に対して培地形成工程Ｃが実行（１秒（sec））される。なお、第１塗布工程Ａと第２塗布工程Ｂと培地形成工程Ｃとが実行される各工程間の間隔時間は１秒（sec）である。これらの塗布時間および間隔時間は、第１の塗布液３０および第２塗布液の組成内容、塗布量、および作製する細胞組織の数などの塗布条件により適宜変更される。

実施形態４の細胞組織作製方法においては、前述の実施形態３において図１８の模式図に示したように、第１の塗布液３０に細胞を懸濁し、その第１の塗布液３０を塗布液容器８に充填する。第１の塗布液３０を塗布液容器８に充填した後、塗布針９により塗布対象に細胞を含む第１の塗布液３０を塗布する。次に第２の塗布液４０を、第１の塗布液３０を覆うように添加する。その結果、第１の塗布液３０と第２の塗布液４０との接触面から外周までがゲル化する。このようにゲル化した後、培地を添加する。

図１８の右下に示したように、培地中の塗布液内部においては、第１の塗布液３０が液体のまま保持されるドーム構造となっている。このため、第１の塗布液３０の内部において時間経過とともに細胞が沈殿する。その結果、高密度の三次元細胞組織を作製することができた。

また塗布直後の細胞組織の外周部であるフィブリノゲンとトロンビンの接触面がゲル化して、その内部は液体の状態で保持されるため、細胞組織の乾燥も抑制できる構成となっている。

図２９は、第１の塗布液３０に心筋細胞とトロンビンと分散させた場合の三次元細胞組織の画像を示す写真である。図２９に示す状態は、まだ細胞が沈殿する前の状態であり、図２９に示す状態から細胞と細胞の間に隙間があることが分かる。図２９に示した細胞組織の厚さを測定した結果、５０μｍ程度の厚さを有しており、かつ高密度に積層されていることを確認した。図３０は、作製された細胞組織の蛍光色による厚さ測定結果の画像を示す写真である。さらに、細胞核、アクチン、トロポニン染色の結果、細胞が生存していることを確認し、心筋細胞に特徴的なアクチンとトロポニンの発現を確認した。図３１は、作製した細胞組織の蛍光染色による観察結果の画像を示す写真である。図３１において、略丸形状が細胞核６０であり、黒っぽい線状のタンパク質がアクチン７０であり、白っぽい線状のタンパク質がトロンポ二ン８０である。

なお、第１の塗布液３０に懸濁する細胞の膜表面に細胞接着因子であるタンパク質をコーティングすることによって、細胞同士の接着を促進し、高い細胞密度を有する三次元構造を構築する細胞積層法や細胞集積法を用いてもよい。

［多穴培養容器に対する塗布動作］
前述のように第１塗布工程Ａ、第２塗布工程Ｂ、および培地形成工程Ｃを複数のウェルを有する多穴培養容器の各ウェルに対して行うことにより、複数の細胞組織を、乾燥による細胞死を抑制し、高速、高精度かつ高い形状安定性で作製することができる。即ち、第１塗布工程Ａの初期段階において塗布された第１の塗布液３０に対する待ち時間を低減して細胞死を抑制しつつ、各塗布液の塗布動作のための塗布機構の切り替えや、培養容器を載置したステージの移動の頻度を低減することが可能となり、工程全体の所要時間が長くなることを抑制することができるものとなる、このように、実施形態４の細胞組織作製方法を行うことにより、多穴培養容器において複数の三次元細胞組織を作製することができる。

なお、ゲル化開始剤と細胞とを混合した第１塗布液３０と、ゲル化剤である第２塗布液４０を混合して、ゲルに包埋した細胞組織を作製する際には、約１０秒から数分程度のゲル化時間が必要となる。このゲル化時間と、培地を形成するための第３塗布液の塗布（添加）までの待ち時間とを同じ工程に組み込むことにより、細胞死と所要時間の抑制のみならず、所定の塗布位置に安定した形状のゲルに包埋した細胞組織を作製することができる。

９６ウェルプレートなどの多穴培養容器に細胞組織を作製する場合、図２８に示したタイムチャートに従って塗布動作が行われる。この塗布動作において、第２の塗布液４０の塗布後、第３塗布液（培地）５０の塗布までに待ち時間が発生する。しかし、フィブリノゲンとトロンビンの接触面近傍の外周を覆うフィブリノゲンがゲル化し、第１塗布液３０の内部はトロンビンが液体として存在するため、この待ち時間の間に細胞が沈殿することにより細胞が積層し、高密度な三次元細胞組織が作成できる。さらに、第３塗布液として培地を塗布することにより、細胞死することなく長期での三次元細胞組織の培養が可能となる。

第１塗布液３０の塗布動作（第１塗布工程Ａ）と、第２塗布液４０の塗布動作（第２塗布工程Ｂ）との繰り返し回数、即ち第３塗布液５０を塗布（培地形成工程Ｃ）するまでの第１塗布工程Ａと第２塗布工程Ｂとの繰り返し回数については、４回、６回、８回、１２回、２４回、３６回、４８回、９６回、３８４回などの回数が設定可能である。この繰り返し回数は、第１の塗布液３０と第２の塗布液４０の塗布量、フィブリノゲンとトロンビンなどのゲル化剤のゲル化時間などの各種条件に応じて設定すればよい。

なお、図２８に示したタイムチャートにおいては、第１塗布工程Ａで複数回の第１の塗布液３０の塗布動作を行い、第２塗布工程Ｂで１回の第２の塗布液４０の塗布動作を行う構成で説明したが、本発明はこのような構成に限定されるものではなく、それぞれの塗布工程における塗布動作の回数は適宜設定される。例えば、第１塗布工程Ａと第２塗布工程Ｂにおいて１回ずつ交互に塗布動作を行い、複数の塗布対象位置に連続的に塗布してもよく、第１塗布液３０または第２塗布液４０をそれぞれ複数回塗布動作を行ってもよい。このように複数回の塗布動作を行った場合には、塗布対象位置における塗布液の塗布量が増加する。特に。細胞を懸濁している第１の塗布液３０に関しては、複数回塗布動作を行うことにより、塗布された第１の塗布液３０の内部の細胞数が増加し、細胞の積層厚さが増加する。

なお、実施形態４の細胞組織作製方法においては、第１の塗布液３０と第２の塗布液４０に増粘剤としてヒアルロン酸ナトリウムを混合しているが、アルギン酸ナトリウムなどの他の増粘多糖類を用いてもよい。増粘剤は塗布液が塗布された後の保形性の向上に効果を有する。即ち、増粘剤は塗布液が塗布された後に流れ出て形が崩れることを抑制する効果を有する。特に、ヒアルロン酸ナトリウムは接着性が高く、培養容器や細胞と良好に接着し、塗布液の保形性の向上に至適である。さらに、ヒアルロン酸ナトリウムは生体由来であり、細胞増殖の適合性が高いという利点も有する。

実施形態４の細胞組織作製方法においては、第１の塗布液（ゲル化開始剤を含む）３０と第２の塗布液（ゲル化剤を含む）４０として、トロンビンとフィブリノゲンの組合せの他に、塩化カルシウムとアルギン酸ナトリウム、塩化カルシウムとカラギーナン、アルコール類とタマリンドシードガムなどを用いてもよい。

また、実施形態４の細胞組織作製方法においては、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞とヒト心臓線維芽細胞について示したが、正常ヒト線維芽細胞、ヒト血管内皮細胞、ＨｅＰＧ２細胞等の細胞、あるいはこれらを２種以上混合した細胞についても、高速、高精度かつ形状安定性が高く、乾燥による細胞死を抑制した細胞組織を作製することができる。

なお、実施形態４の細胞組織作製方法においては、第１の塗布液３０の塗布動作を塗布針９を用いた接触塗布により実行しているため、インクジェット装置やディスぺンサ装置を用いて細胞組織を作製したときに生じるおそれのあるノズル詰まりの心配がなく、さらに広範囲な液体に対応可能であり、かつ微細塗布が可能である。また、第２の塗布液４０および第３の塗布液（培地）５０の塗布に関しては、インクジェット装置やディスぺンサ装置を用いて実行している。インクジェット装置は微細塗布が可能であり、高速性に優れている。ディスペンサ装置はインクジェットよりも広範囲な液体に対応することが可能であり、比較的量の多い塗布に適している。

また、実施形態４の細胞組織作製方法においては、第１の塗布液３０に細胞とゲル化開始剤を含み、第２の塗布液４０にゲル化剤を含む例を示したが、心筋細胞を除いては第１の塗布液３０に細胞とゲル化剤、第２の塗布液４０にゲル化開始剤を含む組合せでもよい。この場合、短時間で細胞を包埋したゲルが形成されるため形状安定性が高く、より目的の形状、特に目的の平面形状に沿った細胞組織を作製することができる。

［１つのウェル（培養容器）に対する複数の細胞組織の作製］
実施形態４の細胞組織作製方法における第１塗布液３０の塗布動作（第１塗布工程Ａ）、第２塗布液４０の塗布動作（第２塗布工程Ｂ）、および第３塗布液５０の塗布動作（培地形成工程Ｃ）を、１つのウェル（培養容器）に対して実行して、複数の細胞組織を作製することも可能である。実施形態４の細胞組織作製方法における各工程を、それぞれのウェル（培養容器）内の複数位置に対して行うことにより、独立した複数の細胞組織を１つのウェル（培養容器）内に作製することができる。

例えば、９６ウェルプレートに細胞組織を作製する場合、従来のマイクロピペットを用いた細胞播種方法では、９６ウェルプレートのそれぞれのウェル（培養容器）の培養面全体に細胞が広がり、その直径が６．５ｍｍ（ウェルの直径）となってしまう（図１６の（ａ）参照）。しかしながら、実施形態４の細胞組織作製方法を用いることにより、第１の塗布液３０および第２塗布液４０を直径が１．０ｍｍ以内となるように塗布することが可能であり、１つのウェルの内部に微細な細胞組織を作製することができる（図１６の（ｂ）参照）。

さらに、９６ウェルプレートのそれぞれのウェル（培養容器）の培養面において、複数の位置のそれぞれに対して、第１の塗布液３０の第１塗布工程Ａ、および第２の塗布液４０の第２塗布工程Ｂを行うことにより、同一ウェル（培養容器）内の複数個所に独立して存在する細胞組織を作製することができる（図１６の（ｃ）参照）。

なお、同一ウェル（培養容器）内の複数個所に独立した細胞組織を作製するために、塗布針９の先端径９ａを１．０ｍｍとすることにより、直径が約１．０ｍｍの細胞組織を作製することができた。また、塗布針９の先端径９ａを変更することにより、異なる直径の細胞組織を作製することができる。例えば、先端径９ａが３３０μｍの塗布針９を用いて細胞組織を作製した場合には、直径が約３３０μｍの細胞組織を、同一の培養容器内の６個所に独立して作製することができた（図１２参照）。

上記のように、１つのウェル（培養容器）内の複数個所に独立して細胞組織を作製することにより、創薬プロセスでの薬効薬理評価や安全性評価における薬剤評価を効率的に行うことができる。従来の細胞組織作製方法では、１つのウェル（培養容器）には１つの細胞組織しか作製できないため、１つのウェル（培養容器）から１個の解析結果しか取得できなかった。しかし、本発明に係る実施形態４の細胞組織作製方法によれば、１つのウェル（培養容器）内において複数の細胞組織を作製することができるため、１つのウェル（培養容器）から複数の解析結果を取得することができ、ハイスループットで評価効率の高い細胞組織が得られる。

以上のように、実施形態４の細胞組織作製方法によれば、ゲル化開始剤と細胞を混合した第１の塗布液３０と、ゲル化剤である第２の塗布液４０とを、多穴培養容器の複数のウェル（有底穴：培養容器）のそれぞれに対して連続して塗布した後、最後にそれぞれのウェルに対して培地である第３の塗布液５０を塗布することにより、乾燥による細胞死を抑制し、高速、高精度、かつ高い形状安定性で多穴培養容器に三次元の細胞組織を作成することができた。

また、微細塗布装置を用いて、ゲル化剤と細胞を混合した第１の塗布液３０を個別のウェル（培養容器）の平坦な培養面の複数個所に塗布することにより、全体の細胞数を低減しつつ、独立して存在し、大きさのばらつきの少ない多数の細胞組織を簡易な工程で作製することができる。

（実施形態５）
以下、本発明に係る実施形態５の細胞組織作製方法、および該作製方法により作成された細胞組織に関して添付の図面を参照して説明する。なお、実施形態５の説明において、前述の実施形態１、２、３、４と同様の作用、構成、および機能を有する要素には同じ参照符号を付し、重複する記載を避けるため説明を省略する場合がある。

本発明に係る実施形態５の細胞組織作製方法においては、前述の実施形態１において詳細に説明した塗布方法を用いて、塗布針９の先端９ａに付着した細胞を含む第１の塗布液３０を塗布対象物に塗布する。第１の塗布液３０を塗布した後、第１の塗布液３０に覆い重なるように第２の塗布液４０を塗布する構成である。第２の塗布液４０の塗布方法は、特に限定されるものではなく、例えば、手作業による塗布、例えば、注射器、スポイト等による液滴塗布、バイオプリンティング技術、例えば、インクジェット法、ディスペンサ法等を使用することができる。

実施形態５の細胞組織作製方法において、前述の実施形態１、２、３、４と異なる点は、種類の異なる細胞を含むそれぞれの細胞組織を１つの培養容器に一連の塗布工程を用いて作製する点である。

図３２は、実施形態５の細胞組織作製方法において用いられる微細塗布装置２００を示す正面図である。微細塗布装置２００には、３つの塗布ユニット２０１、２０２、２０３が設けられており、それぞれには種類の異なる細胞を含む溶液（第１の塗布液３０Ｘ、３０Ｙ、３０Ｚ）が充填された塗布液容器が設けられている。これらの塗布ユニット２０１、２０２、２０３の構成としては、実施形態１において説明した微細塗布装置１における塗布ユニット６と同様の構成を有しており、同様に塗布針９を用いて塗布対象に対して接触塗布する構成である。

また、微細塗布装置２００には、２つのディスペンサ２０４、２０５が設けられている。２つのディスペンサ２０４、２０５は、３つの塗布ユニット２０１、２０２、２０３と並設されている。第１のディスペンサ２０４は、第２の塗布液４０を塗布済みの第１の塗布液３０（３０Ｘ、３０Ｙ、３０Ｚ）に覆い重なるように塗布するように構成されている。第２のディスペンサ２０５は、塗布済みの第１の塗布液３０（３０Ｘ、３０Ｙ、３０Ｚ）に覆い重なる第２の塗布液４０が浸漬状態となるように塗布して培地が形成されるように塗布する構成である。

実施形態５における微細塗布装置２００は、細胞（Ｘ細胞、Ｙ細胞、Ｚ細胞）が異なる３種類の第１の塗布液３０（３０Ｘ、３０Ｙ、３０Ｚ）が３つの塗布ユニット２０１、２０２、２０３のそれぞれにより塗布される構成である。即ち、微細塗布装置２００において、第１の塗布ユニット２０１はゲル化開始剤と細胞Ｘとを混合した第１の塗布液３０Ｘによる第１塗布工程を実行し、第２の塗布ユニット２０２はゲル化開始剤と細胞Ｙとを混合した第１の塗布液３０Ｙによる第１塗布工程を実行し、そして、第３の塗布ユニット２０３はゲル化開始剤と細胞Ｚとを混合した第１の塗布液３０Ｚによる第１塗布工程を実行する。

図３３は、微細塗布装置２００を用いて、１つのウェル（培養容器）内の３カ所に独立した細胞組織を作製した例を模式的に示した平面図である。図３４は、図３３に示した３種類の細胞組織を作製するためのフローチャートである。微細塗布装置２００において所定の位置に多穴培養容器が固定された後、実施形態５における細胞組織作製動作が開始される。

実施形態５における細胞組織作製動作が開始されると、多穴培養容器における特定されたウェルにおける指定された第１の位置が第１の塗布ユニット２０１による細胞Ｘの塗布対象位置となるようにセットされる。セットされた第１の塗布ユニット２０１による第１塗布工程が実行されて、１液目としてゲル化開始剤と細胞Ｘとを混合した第１の塗布液３０Ｘが第１の位置に塗布される（ステップ１）。ステップ２においては、２液目としてゲル化剤である第２の塗布液４０が第１の塗布液３０Ｘに重なるように第１のディスペンサ２０４により塗布される第２塗布工程が実行される。第２の塗布液４０が塗布された後、特定されたウェル内の第２の位置を細胞Ｙの塗布対象位置としてステージを移動する（ステップ３）。

第２の位置を塗布対象位置として、第２の塗布ユニット２０２による第１塗布工程が実行されて、１液目としてゲル化開始剤と細胞Ｙとを混合した第１の塗布液３０Ｙが第２の位置に塗布される（ステップ４）。ステップ５においては、２液目としてゲル化剤である第２の塗布液４０が第１の塗布液３０Ｙに重なるように第１のディスペンサ２０４により塗布される（第２塗布工程）。第２の塗布液４０が塗布された後、特定されたウェル内の第３の位置を細胞Ｚの塗布対象位置としてステージを移動する（ステップ６）。

第３の位置を塗布対象位置として、第３の塗布ユニット２０３による第１塗布工程が実行されて、１液目としてゲル化開始剤と細胞Ｚとを混合した第１の塗布液３０Ｚが第３の位置に塗布される（ステップ７）。ステップ８においては、２液目としてゲル化剤である第２の塗布液４０が第１の塗布液３０Ｚに重なるように第１のディスペンサ２０４により第２塗布工程が実行される。第２の塗布液４０が塗布された後、特定されたウェル内が塗布対象となるようにステージを移動して（ステップ９）、第２のディスペンサ２０５により培地となる第３の塗布液５０がウェル内に塗布（添加）される培地形成工程が実行される。

上記のように多穴培養容器において特定されたウェルに対する第１塗布工程、第２塗布工程および培地形成工程が実行されると、次のウェルに対する第１塗布工程、第２塗布工程および培地形成工程が実行される。このように、多穴培養容器におけるそれぞれのウェルに対して第１塗布工程、第２塗布工程および培地形成工程が順次実行されて、それぞれのウェルにおいて種類の異なる細胞組織が作製される。

なお、実施の形態５においては、１つのウェル（同一培養容器）に３種類の細胞組織を複数作製する場合について説明したが、本発明はこのような作製方法に限定されるものではなく、例えば、同一の培養容器に同じ種類の複数の細胞組織と、種類の異なる細胞組織とを作製する場合や、異なる種類としても２種類以上の細胞組織を作製する場合などの各種組み合わせが含まれる。
また、種類の異なる複数の細胞を１つのウェルに塗布する場合の組み合わせの具体例としては、例えば、
（１）Ｘ細胞：ｉＰＳ細胞由来心筋細胞、Ｙ細胞：ｉＰＳ細胞由来神経細胞、Ｚ細胞：初代肝細胞の組み合わせ、
（２）Ｘ細胞：ｉＰＳ細胞由来心筋細胞、Ｙ細胞：ｉＰＳ細胞由来神経細胞、Ｚ細胞：ＨｅｐＧ２の組み合わせ、
（３）Ｘ細胞：ｉＰＳ細胞由来心筋細胞、Ｙ細胞：ｉＰＳ細胞由来神経細胞、Ｚ細胞：ＨｅＬａ細胞の組み合わせ、
（４）Ｘ細胞：ｉＰＳ細胞由来心筋細胞、Ｙ細胞：ヒト心臓線維芽細胞、Ｚ細胞：ヒト心臓血管内皮細胞の組み合わせ、などがある。

図３５は、１つのウェル（培養容器）内の３カ所に独立した細胞組織を作製した例を模式的に示した平面図であり、前述の図３３に示した細胞組織の作製例の変形例である。図３６は、図３５に示した３種類の細胞組織を作製するためのフローチャートである。

図３５および図３６に示した細胞組織作製方法において、所定の位置に多穴培養容器が固定された後、細胞組織作製動作が開始される。細胞組織作製動作が開始されると、多穴培養容器における特定されたウェルにおける指定された第１の位置が第１の塗布ユニット２０１による細胞Ｘの塗布対象位置となるようにセットされる。セットされた第１の塗布ユニット２０１による第１塗布工程が実行されて、１液目としてゲル化開始剤と細胞Ｘとを混合した第１の塗布液３０Ｘが第１の位置に塗布される（ステップ１）。

第１の塗布液３０Ｘが塗布された後、特定されたウェル内の第２の位置を細胞Ｙの塗布対象位置としてステージを移動する（ステップ２）。第２の位置を塗布対象位置として、第２の塗布ユニット２０２による第１塗布工程が実行されて、１液目としてゲル化開始剤と細胞Ｙとを混合した第１の塗布液３０Ｙが第２の位置に塗布される（ステップ３）。

第１の塗布液３０Ｙが塗布された後、特定されたウェル内の第３の位置を細胞Ｚの塗布対象位置としてステージを移動する（ステップ４）。第３の位置を塗布対象位置として、第３の塗布ユニット２０３による第１塗布工程が実行されて、１液目としてゲル化開始剤と細胞Ｚとを混合した第１の塗布液３０Ｚが第３の位置に塗布される（ステップ５）。

ステップ６においては、２液目としてゲル化剤である第２の塗布液４０が第１の塗布液３０Ｘ、３０Ｙ、３０Ｚに重なるように第１のディスペンサ２０４により第２塗布工程が実行される。第２の塗布液４０が塗布された後、特定されたウェル内が塗布対象となるようにステージを移動して（ステップ７）、第２のディスペンサ２０５により培地となる第３の塗布液５０がウェル内に塗布（添加）される培地形成工程が実行される。

上記のように、図３６に示した細胞組織作製方法は、多穴培養容器におけるウェルに対して、第１塗布工程が順次実行され、その後第２塗布工程および培地形成工程が実行される構成である。このように、多穴培養容器に対して細胞組織作製方法が実行されて、それぞれのウェルにおいて種類の異なる細胞組織が作製される。

なお、実施形態５においては、微細塗布装置２００が３種類の細胞組織を作製する構成を有するものであるが、本発明はこのような構成に限定されるものではなく、作製すべき細胞の種類に応じて塗布ユニットを設けることにより、複数種類の細胞組織を作製することが可能となる。

上記のように、本発明に係る実施形態５の微細塗布装置２００の構成によれば、複数種類の細胞組織を１つのウェル(培養容器)に作製することが可能となる。このように１つのウェル(培養容器)内に複数種類の細胞組織を作製することの利点としては以下の事項が挙げられる。

（１）例えば、細胞Ｘと細胞Ｙに異なった作用を与える薬剤が存在する場合、細胞Ｘと細胞Ｙのそれぞれを含むそれぞれの細胞組織が１つのウェル内に作製されていると、該ウェルに薬剤を添加することにより、該ウェル内でそれぞれの細胞（Ｘ、Ｙ）に対する作用を同時に確認することができる。例えば、アントラサイクリン系の抗がん剤は心毒性を発生させることが多い薬剤である。がん細胞とｉＰＳ細胞由来心筋細胞を１つのウェルに共存させることで、そこに抗がん剤を添加することにより、がん細胞には抗がん剤本来の効果が、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞には心毒性の効果が同時に観測することができる。

（２）異なる種類の細胞組織が培地を共有することにより、細胞から生成されるサイトカインや添加した薬剤を代謝した物質を共有することができる。例えば、細胞Ｘで代謝された薬剤が細胞Ｙに作用するといったことを観測することができる。

実施形態５の微細塗布装置２００においては、多穴培養容器におけるそれぞれのウェルに対して複数種類の細胞組織を作製する方法を説明したが、微細塗布装置２００は、多穴培養容器のそれぞれのウェルに対して同じ種類の細胞を含む複数の細胞組織を作製することも可能である。このように、ウェルの１つに複数の細胞組織を作製することにより、１つのウェルで複数のサンプル数に対する評価を行うことが可能となる。また、画像および動画の解析において、一回の撮影にて複数のサンプルを撮影することが可能となるため、撮影時間が短縮され、引いては解析時間が短縮されることになる。例えば、培養容器として９６ウェルを用いた場合、従来の細胞組織作製方法では、１つのウェル内に１サンプルの作製しかできないが、実施形態５の細胞組織作製方法では、例えば、１つのウェル内に直径が約１．０ｍｍの細胞組織ｃを４サンプル作製することが可能である。このため、実施の形態５の細胞組織作製方法によれば、９６ウェルｗの培養容器を用いて３８４個（９６×４）の細胞組織のサンプルを作成することが可能となる。また、例えば、１つのウェルに対する動画解析に２０秒の撮影が必要とすると、従来の細胞組織作製方法では１つのウェルに１つのサンプルであるため、４サンプルの動画撮影には８０秒が必要となる。一方、実施形態５の細胞組織作製方法では、１つのウェルの内部に４つのサンプルが作製されているため、動画撮影は２０秒と大幅に短縮されることになる。

以上のように、実施形態５の細胞組織作製方法によれば、ゲル化開始剤と細胞を混合した第１の塗布液３０と、ゲル化剤である第２の塗布液４０とを、多穴培養容器の複数のウェル（有底穴：培養容器）のそれぞれに対して連続して塗布した後、最後にそれぞれのウェルに対して培地である第３の塗布液５０を塗布することにより、乾燥による細胞死を抑制し、高速、高精度、かつ高い形状安定性で多穴培養容器に三次元の細胞組織を作成することができる。

また、微細塗布装置を用いて、ゲル化剤と細胞を混合した第１の塗布液３０を個別のウェル（培養容器）の平坦な培養面の複数個所に塗布することにより、全体の細胞数を低減しつつ、独立して存在し、大きさのばらつきの少ない多数の細胞組織を簡易な工程で作製することができる。

本発明をある程度の詳細さをもって実施形態において説明したが、この構成は例示であり、この実施形態の開示内容は構成の細部において変化してしかるべきものである。本発明においては、実施形態における要素を他の要素との置換、組合せ、および順序の変更は請求された本発明の範囲及び思想を逸脱することなく実現し得るものである。

本発明に係る細胞組織作製方法は、信頼性の高い様々な細胞組織を大量に製造することができるため、創薬研究および再生医療を研究する上でも重要な技術であり、産業上の利用可能性が高い発明である。

１ 微細塗布装置
２ 塗布装置本体
３ 表示・制御部
４ ＸＹテーブル
５ Ｚテーブル
６ 塗布ユニット
７ 光学検出部（ＣＣＤカメラ）
８ 塗布液容器
８ａ 塗布液溜り
９ 塗布針
９ａ 先端
９ｂ 突起
１０ 塗布液（細胞含有溶液）
１１ 基板
１２ 本体ベース
１３ 塗布針保持部
１４ａ 上部孔
１４ｂ 下部孔
１５ 細胞
１６ スライド機構部
１７ 駆動機構部

Claims (14)

1. 細胞およびゲル化開始剤を含む第１の塗布液を塗布対象物に塗布する第１塗布工程、
   前記第１塗布工程で塗布された前記第１の塗布液に、ゲル化剤を含む第２の塗布液を重ねて塗布し、前記第１の塗布液の流動状態を維持しつつ、前記第１の塗布液と前記第２の塗布液との界面をゲル化する第２塗布工程、および
   前記第１の塗布液を含む前記第２の塗布液が浸漬するように第３の塗布液を塗布する培地形成工程、を含み、
   前記ゲル化開始剤がトロンビンであり、前記ゲル化剤がフィブリノゲンであり、
   前記第１塗布工程と前記第２塗布工程の塗布動作を同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して実行し、前記培地形成工程を実行する細胞組織作製方法。
2. 同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して前記第１塗布工程と前記第２塗布工程の塗布動作を実行した後、前記培地形成工程を実行する、請求項１に記載の細胞組織作製方法。
3. 同一培養容器のそれぞれの塗布対象位置に対して前記第１塗布工程と前記第２塗布工程の塗布動作を実行した後、当該塗布対象位置に対して前記培地形成工程を実行していく、請求項１に記載の細胞組織作製方法。
4. 同一培養容器の複数の塗布対象位置に対する前記第１塗布工程の塗布動作が実行された後、当該同一培養容器の複数の塗布対象位置に対する前記第２塗布工程の塗布動作を実行し、その後当該同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して前記培地形成工程を実行していく、請求項１に記載の細胞組織作製方法。
5. 同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して、同じ種類の細胞を含む細胞組織を作製する、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞組織作製方法。
6. 同一培養容器の複数の塗布対象位置に対して、種類の異なる細胞を含む細胞組織を作製する、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞組織作製方法。
7. 前記第１の塗布液を塗布対象物に塗布する第１塗布工程が塗布針を用いた接触塗布により実行される、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞組織作製方法。
8. 前記第２の塗布液を前記第１の塗布液に重ねて塗布する第２塗布工程がインクジェット方式、またはディスペンサ方式が用いられる、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞組織作製方法。
9. 細胞組織形成時に２液式のゲル化溶液を塗布液として用いた、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞組織作製方法。
10. 前記第１の塗布液を含む前記第２の塗布液が浸漬する培地となるように前記第３の塗布液が同一培養容器の複数の塗布対象位置に塗布される、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞組織作製方法。
11. 前記第１の塗布液が増粘多糖類を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞組織作製方法。
12. 前記第２の塗布液が増粘多糖類を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞組織作製方法。
13. 増粘多糖類が、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウムまたはそれらの混合物である、請求項１１または１２に記載の細胞組織作製方法。
14. 細胞が心筋細胞である、請求項５または６に記載の細胞組織作製方法。

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