JP7333543B2 - 細胞チップおよび三次元組織チップ、およびその製造方法 - Google Patents
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Description
細胞含有溶液を塗布針の先端に付着させる付着工程と、
細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端と塗布対象物とを近接させる移動工程と、
前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液が前記塗布対象物に接触して、または前記塗布対象物に既に塗布された細胞含有溶液に接触して、前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液を接触塗布する塗布工程と、
細胞含有溶液が接触塗布された後、前記塗布針の先端を塗布対象物から離反させる離反工程と、を含むものである。
細胞含有溶液を所定量貯留する塗布液溜りを有する塗布液容器と、
前記細胞含有溶液が貯留された前記塗布液溜りを貫通可能な塗布針と、を含む塗布ユニットを備えた微細塗布装置を用いた細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法であって、
前記塗布液溜りに充填された前記細胞含有溶液に前記塗布針の先端を浸漬させる待機工程、
前記塗布針の先端が前記塗布液溜りを貫通して、前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を下降させる下降工程、
前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を塗布対象物に接触させて、前記細胞含有溶液を前記塗布対象物に塗布して液滴スポットを形成する塗布工程、および
前記塗布針の先端を上昇させて、前記塗布針の先端を前記塗布液溜りに収容する収容工程、を含むものである。
細胞含有溶液を塗布針の先端に付着させる付着工程と、
細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端と塗布対象物とを近接させる移動工程と、
前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液が前記塗布対象物に接触して、または前記塗布対象物に既に塗布された細胞含有溶液に接触して、前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液を接触塗布する塗布工程と、
細胞含有溶液が接触塗布された後、前記塗布針の先端を塗布対象物から離反させる離反工程と、を含むことを特徴とする。
細胞含有溶液を所定量貯留する塗布液溜りを有する塗布液容器と、
前記細胞含有溶液が貯留された前記塗布液溜りを貫通可能な塗布針と、を含む塗布ユニットを備えた微細塗布装置を用いた細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法であって、
前記塗布液溜りに充填された前記細胞含有溶液に前記塗布針の先端を浸漬させる待機工程、
前記塗布針の先端が前記塗布液溜りを貫通して、前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を下降させる下降工程、
前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を塗布対象物に接触させて、前記細胞含有溶液を前記塗布対象物に塗布して液滴スポットを形成する塗布工程、および
前記塗布針の先端を上昇させて、前記塗布針の先端を前記塗布液溜りに収容する収容工程、を含むものである。
以下、具体的な第1実施形態について添付の図面を参照して説明する。図1は、第1実施形態において用いる微細塗布装置1を示す全体図である。図1に示すように、微細塗布装置1は、塗布装置本体2と、この塗布装置本体2に対する設定、制御、および表示を行う表示・制御部3とを備える。第1実施形態における微細塗布装置1の表示・制御部3としては、所謂パーソナルコンピュータ(PC)で構成される。
図2は、塗布ユニット6に装着される塗布針保持部13を示す図である。塗布針保持部13には、塗布針9が突設されている。図3は、塗布針9の先端部分を示す図である。第1実施形態の塗布針9においては、円錐状に形成された先端部分の先端9aが、XYテーブル4の水平面に対向するように平面(フラット)に形成されている(図3の(a)参照)。即ち、先端9aの平面は鉛直方向に直交する平面である。先端9aの直径dは、後述するように、製造される細胞チップまたは三次元組織チップの形状に大きく寄与する。第1実施形態においては、塗布針9の先端9aの直径dとして、50~330μmを用いた。第1実施形態においては、図3の(a)に示すように、塗布針9の先端部分が円錐状に形成されており、先端9aが水平面であるため、先端9aを水平面に研磨することにより先端9aの直径dを、例えば50~330μmの範囲の所望の値に容易に形成することが可能である。
次に、図4に模式的に示した、塗布ユニット6における細胞塗布動作について説明する。図4に示した細胞塗布動作においては、塗布針9が塗布液容器8の塗布液溜り8aを通り抜けて、塗布対象物である基板11に接触し、基板11上に細胞を含む塗布液10が塗布されて、液滴スポットSが形成される。この細胞塗布動作が所定回数繰り返されて、塗布液10が複数回塗布されることにより、基板11上に所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。なお、本発明に係る第1実施形態およびその他の実施形態においては、塗布対象物として基板11を用いて説明するが、塗布対象物としては基板に特定されるものではなく、例えば細胞培養に一般的に使用されるプラスチックディッシュ、ガラスシャーレ、ウェルプレート等の培養容器や、培養容器上の各種溶液が対象となる。
前述の第1実施形態において説明した微細塗布装置1を用いて、濃度および粘性が異なる塗布液10による塗布実験1を行った。この塗布実験1においては、5%、10%、および20%のゼラチンPBS(リン酸緩衝液)溶液の3種類の塗布液10を用いて液滴スポットの形状の確認を行った。
前述の第1実施形態において説明した微細塗布装置1を用いて、先端9aの直径(先端直径)が異なる塗布針9による塗布実験2を行った。この塗布実験2においては、塗布液10として5%のゼラチンPBS溶液を用いて、形成された液滴スポットの形状を確認した。この塗布実験2において用いた塗布液10には細胞は含まれていない。
塗布実験3においては、ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)を2×107cells/mLの濃度で10%ゼラチンPBS溶液に分散させた塗布液10を用いた。塗布実験3においては、微細塗布装置1を用いて、先端直径(先端直径)が100μm、150μm、200μmの3種類の塗布針9をスライドガラス上に点接触させて塗布液10を塗布した。スライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットの形状を位相差顕微鏡により観察した。
塗布実験4においては、前述の塗布実験3におけるヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)に換えて、肝がん細胞株(HepG2)を用いて同様の実験を行った。塗布実験4においては、HepG2を5×107cells/mLの濃度で10%ゼラチンPBS溶液に分散させた塗布液10を用いた。
塗布実験5においては、iPS由来心筋細胞(iPS-CM)を4×107cells/mLの濃度でPBS溶液に分散させた塗布液10を用いて、先端直径が70μm、100μm、150μm、200μm、330μmのそれぞれの塗布針9により液滴スポットを形成した。塗布実験5においては、塗布針9の先端直径と、形成された液滴スポットに含まれる塗布細胞数との関連性について検証した。
塗布実験6においては、微細塗布装置1を用いて細胞集合体20を製造した。塗布実験6においては、ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)を2×107cells/mLの濃度で2.5%アルギン酸PBS溶液に分散した塗布液10を用いた。この塗布液10を塗布ユニット6の塗布液容器8に充填して微細塗布装置1により細胞塗布動作を行った。
塗布実験7においては、微細塗布装置1を用いて塗布した形成された液滴スポットにおける塗布細胞の生存率を確認した。塗布実験7においては、ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)を8×107cells/mLの濃度でPBS溶液に分散させた塗布液10を用いた。また、塗布実験7においては、先端直径が330μmの塗布針9によりスライドガラス上に40回連続的に塗布液10を塗布し、塗布後の細胞15の生存率を生細胞/死細胞(Live/Dead)蛍光染色法(死細胞が赤色染色)により評価した。図11は、塗布実験7における生細胞/死細胞(Live/Dead)蛍光染色像を示した図である。
塗布実験8においては、微細塗布装置1を用いて、セルディスク上へiPS由来心筋細胞(iPS-CM)の三次元組織チップを構築し、その三次元組織チップにおける心筋組織体の拍動挙動を評価した。
次に、本発明の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法に係る第2実施形態について添付の図面を参照して説明する。第2実施形態における微細塗布装置は、前述の第1実施形態において用いた微細塗布装置1と同じ構成、機能を有する装置が用いられる。第2実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法においては、前述の第1実施形態における細胞塗布動作に関して、段落[0044]等において説明したように、1サイクルの細胞塗布動作毎に針先を所定距離だけ上昇させていく細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法の例示を説明するものである。即ち、第2実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、第1実施形態において説明した細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法の具体例を説明するものである。なお、第2実施形態の説明において、前述の第1実施形態と同様の作用、構成、および機能を有する要素には同じ参照符号を付して、重複する記載を避けるため説明を省略する場合がある。
次に、第2実施形態の微細塗布装置1による細胞塗布動作において、塗布針9の先端9aの最初のサイクルの接触塗布位置P3aとなる初期設定位置の決定方法について説明する。細胞塗布動作においては、各サイクル毎に塗布針9の先端9aの接触塗布位置P3aを徐々に上昇させている。細胞塗布動作が実行される前において、細胞塗布動作の最初のサイクルにおける接触塗布位置P3aである初期設定位置が決定される。初期設定位置が決定されると、各サイクル毎の接触塗布位置P3aとしては、決定された初期設定位置に基づいて、予め設定された所定距離(例えば、数μm)だけ上昇させて設定される。
第1実施形態および第2実施形態の微細塗布装置1においては、塗布針9が塗布液容器8の塗布液溜り8aを貫通して塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液10に接触塗布する構成であるが、本発明はこのような構成に限定されるものではない。例えば、塗布液溜りの塗布液に浸漬した塗布針を持ち上げ、塗布位置に移動させて接触塗布する構成としてもよい。このように構成された微細塗布装置においても前述の第1実施形態および第2実施形態の微細塗布装置1による効果と同様に高粘性の細胞含有ゲル化剤が材料であったとしても、所望の塗布量で形成された細胞チップおよび三次元組織チップを短時間(高速度)で確実に製造することが可能となる。
図23に模式的に示した、塗布ユニット60における細胞塗布動作について説明する。図23における(a)および(b)に示すように、細胞塗布動作においては、塗布針9の先端9aが細胞含有溶液である塗布液10の中に浸漬されて、塗布針9の先端9aに塗布液10が付着される。塗布液10が付着した先端9aが移動して、塗布対象物である基板11又は、基板11上の塗布液10に接触し、基板11上に液滴スポットSが形成されている(図23の(c)および(d)参照)。この細胞塗布動作が所定回数繰り返されて、塗布液10の複数回の接触塗布により、基板11上に所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。
第4実施形態の微細塗布装置においては、前述の第2実施形態および第3実施形態で説明した構成と同様に、塗布針が塗布液容器の塗布液溜りを貫通する構成ではなく、塗布針の先端に対して細胞含有溶液である塗布液を付着させる構成である。このように構成された第4実施形態の微細塗布装置においても、塗布針の先端による接触塗布を用いているため、高粘性の細胞含有ゲル化剤が材料であったとしても、塗布針の先端で目詰まりすることがなく、所望の塗布量で形成された細胞チップおよび三次元組織チップを確実に製造することが可能となる。
図24に模式的に示した、塗布ユニット61における細胞塗布動作について説明する。図24に示した細胞塗布動作においては、細胞含有溶液である塗布液10がノズル82により噴射されて、塗布針9の先端9aに所定量の塗布液10が付着される(図24の(a)および(b)参照)。塗布液10が付着した塗布針9の先端9aが移動して、塗布対象物である基板11又は、基板11上の塗布液10に接触し、基板11上に液滴スポットSが形成される図24の(c)および(d)参照)。この細胞塗布動作が所定回数繰り返されて、塗布液10の複数回の接触塗布により、基板11上に所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。
第5実施形態の微細塗布装置においては、前述の第2実施形態から第4実施形態で説明した構成と同様に、塗布針が塗布液容器の塗布液溜りを貫通する構成ではなく、塗布針の先端に対して細胞含有溶液である塗布液を付着させる構成である。このように構成された第5実施形態の微細塗布装置においても、塗布針の先端による接触塗布を用いているため、高粘性の細胞含有ゲル化剤が材料であったとしても、塗布針の先端で目詰まりすることがなく、所望の塗布量で形成された細胞チップおよび三次元組織チップを確実に製造することが可能となる。
図25に模式的に示した、塗布ユニット62における細胞塗布動作について説明する。図25に示した細胞塗布動作においては、細胞含有溶液である塗布液10がノズル84から吐出して、塗布針9の先端9aに所定量の塗布液10が付着される(図25の(a)および(b)参照)。塗布液10が付着した塗布針9の先端9aが移動して、塗布対象物である基板11又は、基板11上の塗布液10に接触し、基板11上に液滴スポットSが形成される(図25の(c)および(d)参照)。この細胞塗布動作が所定回数繰り返されて、塗布液10の複数回の接触塗布により、基板11上に所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。
2 塗布装置本体
3 表示・制御部
4 XYテーブル
5 Zテーブル
6 塗布ユニット
7 光学検出部(CCDカメラ)
8 塗布液容器
8a 塗布液溜り
9 塗布針
9a 先端
9b 突起
10 塗布液(細胞含有溶液)
11 基板
12 本体ベース
13 塗布針保持部
14a 上部孔
14b 下部孔
15 細胞
16 スライド機構部
17 駆動機構部
20 細胞集合体
Claims (2)
- 基板上に細胞が積層化して立体的に組織化した細胞集合体で構成された三次元組織チップにおいて、
前記細胞集合体は、前記細胞が生細胞と死細胞とを含み、
前記細胞集合体の前記細胞に対する前記生細胞の割合を細胞生存率としたとき、
前記細胞生存率が91%以上であり、
前記細胞集合体の径が136μm以上219μm以下であり、
前記細胞集合体は複数の前記細胞を含む液体を有し、
前記細胞集合体の粘度は、10mPa・s以上220mPa・s以下である三次元組織チップ。 - 前記基板に設けられたウェルの底面に前記細胞集合体が形成された、請求項1に記載の三次元組織チップ。
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