JP2015229148A

JP2015229148A - 吐出方法

Info

Publication number: JP2015229148A
Application number: JP2014117252A
Authority: JP
Inventors: 雅登鈴木; Masato Suzuki; 達夫小林; Tatsuo Kobayashi; 隆雄梶間; Takao Kajima
Original assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Current assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2015-12-21

Abstract

【課題】従来の技術では、安定的に細胞を吐出することができない。【解決手段】インクジェットヘッドを備えた吐出装置とコラーゲンゲル溶液とを用いて、細胞をインクジェット方式で吐出させる吐出方法であって、前記コラーゲンゲル溶液は、所定温度において、ゲル状態から溶液状態となり、前記細胞を前記コラーゲンゲル溶液中に分散させた細胞インク溶液を、前記インクジェットヘッドに導入する導入工程と、前記インクジェットヘッドを冷却し、前記インクジェットヘッドに導入された前記細胞インク溶液を前記所定温度にまで冷却することで、前記細胞インク溶液を溶液状態とする冷却工程と、溶液状態である前記細胞インク溶液を前記インクジェットヘッドから吐出する吐出工程と、を包含する、吐出方法。【選択図】図８

Description

本発明は細胞をインクジェット方式で吐出する方法に関するものである。

従来の細胞をインクジェット方式で長時間安定して吐出する方法としては、細胞を含む緩衝液に密度調製剤を添加した溶液をインクとしてインクジェット方式で細胞を吐出させる方法があった（例えば、非特許文献１、２参照）。

また、他にも細胞をインクジェット方式で吐出する方法としては、細胞が懸濁された緩衝液をヘッド部分に灌流させながらインクジェット方式によって細胞を吐出する方法が開示されている（例えば非特許文献３参照）。

ＤａｌｊｅｅｔＣｈａｈａｌ，ＡｌｉＡｈｍａｄｉ，ＫａｒｅｎＣ．Ｃｈｅｕｎｇ，（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０９，２９３２ＣａｍｅｒｏｎＪ．Ｆｅｒｒｉｓ，ＫｅｒｒｙＪ．Ｇｉｌｍｏｒｅ，ＳｔｅｐｈｅｎＢｅｉｒｎｅ，ＤｏｎａｌｄＭｃＣａｌｌｕｍ，ＧｏｒｄｏｎＧ．Ｗａｌｌａｃｅ，ＭａｒｃｉｎｈｅｔＰａｎｈｕｉｓ，（２０１３）Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．，１，２２４ＳｈａｂｎａｍＰａｒｓａ，ＭａｄｈｕｊａＧｕｐｔａ，ＦｒeｄeｒｉｃＬｏｉｚｅａｕ，ＫａｒｅｎＣＣｈｅｕｎｇ（２０１０）Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，２，０２５００３

従来の技術では、安定的に細胞を吐出することができない。

インクジェットヘッドを備えた吐出装置とコラーゲンゲル溶液とを用いて、細胞をインクジェット方式で吐出させる吐出方法であって、前記コラーゲンゲル溶液は、所定温度において、ゲル状態から溶液状態となり、前記細胞を前記コラーゲンゲル溶液中に分散させた細胞インク溶液を、前記インクジェットヘッドに導入する導入工程と、前記インクジェットヘッドを冷却し、前記インクジェットヘッドに導入された前記細胞インク溶液を前記所定温度にまで冷却することで、前記細胞インク溶液を溶液状態とする冷却工程と、溶液状態である前記細胞インク溶液を前記インクジェットヘッドから吐出する吐出工程と、を包含する、吐出方法。

本発明によれば、安定的に細胞を吐出することができる。

実施形態１における吐出方法の概略図。従来のインクジェット方式で細胞を吐出する方法の概略図。従来のインクジェット方式で細胞を吐出する方法の概略図。インクジェットヘッドから細胞を含む液滴が吐出される連続写真を示す図。インクジェットヘッドから吐出された液滴の拡大写真を示す図。実施例と比較例における吐出された基板上の細胞の蛍光顕微鏡写真を示す図。実施例と比較例における吐出された基板上の細胞の個数を示す図。実施形態における吐出方法を示す図。

以下本発明の実施の形態について、図面を用いながら説明する。

まず、本発明の発明者の着眼点について説明する。

図２は、前記非特許文献１に記載されているような、細胞をインクジェット方式で吐出する方法を図示したものである。細胞懸濁液２０１と密度調整剤２０２が混合された細胞インク溶液２０３がインクジェットヘッド２０４へ導入される。密度調整剤２０２の作用によってインクジェットヘッド２０４内で細胞が沈降せずに、細胞を含む液滴２０５の吐出が達成されてきた。

しかしながら、前記非特許文献１、２のような構成では、細胞をヘッド内で分散状態に存在させるために、細胞の遠心分離の際などに用いられる密度調整剤を細胞懸濁液へ添加させる。ヘッド部から吐出された液滴内には細胞と高濃度の密度調整剤が存在することになり、吐出後の細胞の成長を阻害させる可能性があるという課題を有していた。

図３は、前記非特許文献３に記載されているような、細胞をインクジェット方式で吐出する方法を図示したものである。細胞懸濁液３０１を有する容器３０２内において、回転子３０３の作用によって細胞懸濁液が穏やかに攪拌され細胞の沈降が抑制される。この細胞懸濁液が送液用のチューブ３０４を伝ってインクジェットヘッド３０５へ充填される。穏やかに攪拌された細胞懸濁液３０１がインクジェットヘッド３０５に供給されるため、細胞は沈降することなく、細胞を含む液滴３０６の吐出が達成されてきた。

しかしながら、前記非特許文献３に記載のような構成では、細胞懸濁液を攪拌させながらヘッド部に細胞懸濁液を供給させる構成であり、攪拌時に細胞が損傷してしまい、吐出後の細胞が死んでしまう可能性があるという課題を有していた。

実施の形態のある一様態の吐出方法は、上述の課題を解決するもので、細胞へダメージを与えることなく長時間吐出液中に含まれる細胞量を変化させずに安定的な細胞の吐出を可能とした方法を提供する。

すなわち、実施の形態のある一様態の吐出方法は、インクジェットヘッドを備えた吐出装置とコラーゲンゲル溶液とを用いて、細胞をインクジェット方式で吐出させる吐出方法である。

ここで、コラーゲンゲル溶液は、所定温度において、ゲル状態から溶液状態となる。

図８に示されるように、実施の形態のある一様態の吐出方法は、導入工程と、冷却工程と、吐出工程と、を包含する。

導入工程は、細胞をコラーゲンゲル溶液中に分散させた細胞インク溶液を、インクジェットヘッドに導入する工程である。

冷却工程は、インクジェットヘッドを冷却し、インクジェットヘッドに導入された細胞インク溶液を所定温度にまで冷却することで、細胞インク溶液を溶液状態とする工程である。

吐出工程は、溶液状態である細胞インク溶液をインクジェットヘッドから吐出する工程である。

本発明の発明者は、冷却されたコラーゲンゲル溶液に分散された細胞は、緩衝液や細胞培養用の培地に分散された細胞と比較して、１０分程度の静置ではほとんど沈降しないことを見出した。すわなち、細胞をコラーゲンゲル溶液に分散させ、冷却機能を有するインクジェットヘッドを用いて、溶液状態のまま細胞を吐出させることにより、細胞が沈降しにくくなり、コラーゲンゲルも溶液状態のままなので、インクジェットヘッド内で細胞が沈降することなく長時間吐出することが可能となる。これにより、長時間、吐出液に含まれる細胞数を変化させることなく安定的な細胞の吐出が達成される。すなわち、吐出液に含まれる細胞数を変動させることなく、細胞の吐出を行うことができる。

ここで、コラーゲンは細胞の成長に必須な細胞外マトリクスであり、吐出後の細胞は一緒に吐出されたコラーゲンゲルを足場にして成長することができる。

（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態におけるインクジェット方式によって細胞を吐出させる方法を示す。

まず、細胞１０１が懸濁された溶液が準備される。

細胞が接着性の細胞の場合、細胞を培養基材から剥離させ細胞を分散状態にさせる。細胞を剥離させる方法に特に制限は無く、周知されているトリプシン、パパイン、コラゲナーゼなど酵素的な方法、セルスクレイパーを用いた物理的に剥離させる方法などが用いられる。

本発明において細胞種は特に限定されず、どのような細胞を用いてもよい。哺乳細胞であれば株化された細胞、初代培養細胞、種々の組織から単離された細胞、人為的に作られた細胞（ｉＰＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞）などがある。また、哺乳細胞以外の昆虫細胞、酵母細胞なども用いることができる。

次いでコラーゲンゲル溶液が準備される。コラーゲンゲル溶液は４℃で溶液状態、室温（２５℃）以上でゲル化するコラーゲンゲル溶液が用いられる。

上記の細胞懸濁液とコラーゲンゲル溶液を混合させることにより細胞インク溶液１０２が調製される。

細胞インク溶液は室温以上でゲル化してしまうため、４℃に保持可能な装置１０３で保存されることが望ましい。

調製された細胞インク溶液１０２がインクジェットヘッド１０４へ導入され基板へ吐出される。

インクジェットヘッド１０４内で細胞インク溶液１０２のゲル化を防ぐためにインクジェットヘッド１０４は恒常的に冷却される必要がある。

吐出された細胞インク溶液１０２は吐出後に速やかにゲル化するほうが細胞の培養上好ましく、そのため細胞が吐出される基板の周囲は室温以上であることが好ましい。そのため、細胞吐出装置全体を冷却することは好ましくなく、インクジェットヘッド１０４のみを冷却することが好ましい。

インクジェットヘッド１０４のみを恒常的に冷却することができればその方法は限定されない。例えば、インクジェットヘッド１０４を取り囲むように冷媒を循環させ冷却する方法やインクジェットヘッド１０４にペルチェ素子を取り付けて冷却させる方法などがある。

図１は冷却水が潅流可能なアルミブロック１０５を用いてインクジェットヘッド１０４を冷却する方法を示している。

サーキュレーター１０６（冷却水循環装置）を用いてシリコーンチューブ１０７を介して冷却水をアルミブロック１０５へ潅流させることによりインクジェットヘッド１０４が冷却される。

インクジェットヘッドを被覆する材料は熱伝導率が高ければアルミニウムではなくてもよいが、材料コストと加工の容易性よりアルミニウムを使用することが最も好ましい。

インクジェットヘッド１０４から細胞インク１０２を吐出させる方法は、細胞を含む液滴１０８を吐出させることができればその方式は限定されない。しかしサーマル方式の場合、インクジェットヘッド内を加熱する必要があり、インクジェットヘッド１０４の冷却と相容れないため採用することができない。そのためピエゾ方式、静電誘引方式などの吐出方法が考えられる。

インクジェットヘッド１０４のノズル１０９の直径は細胞の直径より大きければ吐出することができ、直径４０μｍ以上であることが好ましい。

本発明では細胞インク溶液が吐出される基板は特に制限されない。

以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。

（細胞インクの調製）
吐出させる細胞としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養は１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）、ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より入手）培養液を用い、５％ＣＯ_２、３７℃の環境下でφ１００ｍｍの培養ディッシュ（ＢＤＦａｌｃｏｎ社より入手）を用いてコンフルエントの状態まで培養した。吐出後の細胞の観察を容易にするために、蛍光試薬Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学社より入手）で細胞の染色を行った。コンフルエントまで培養されたディッシュから培養液を除去しＰＢＳ（−）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より入手）で２回洗浄した。洗浄後、１μＭＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含むＰＢＳ（−）溶液に置換し、５％ＣＯ_２、３７℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、染色液を除去しＰＢＳ（−）で２回洗浄後、３ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より入手）を加え５％ＣＯ_２、３７℃で５分インキュベートし細胞を浮遊化させた。この溶液に７ｍＬの培養液を加えた後１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離を行い、上清を除去し新たに１ｍＬの培養液を加え、全量をセルストレーナー（ＢＤファルコン社から入手、３５マイクロメートルメッシュ）に通し細胞を分散化させた。この溶液の細胞濃度をセルカウンター（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より入手、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ）によって計測し、２〜４×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度であることを確認し、この溶液を細胞懸濁液とした。この濃度域より上回る場合は培地を添加しこの濃度内に収まるように調整し、この濃度域より下回った場合は再度遠心分離を行い濃縮した。細胞懸濁液は使用する直前まで氷上で保存した。

一方、コラーゲンゲルＴｙｐｅＩ溶液は新田ゼラチンより購入し、同社記載のマニュアルに従いコラーゲンゲル溶液を調製した。１．６ｍＬのコラーゲン溶液（３．０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ３、ＴｙｐｅＩ−ＡもしくはＴｙｐｅＩ−Ｐいずれも使用可能）と０．２ｍＬの１０倍濃縮培地（新田ゼラチン社より入手）を氷上で十分混合させ、次いで０．２ｍＬの濃縮緩衝液（２６０ｍＭＮａＨＣＯ_３、２００ｍＭＨＥＰＥＳ、５０ｍＭＮａＯＨ）を上記の混合溶液に加え、溶液が均一になるように氷上で攪拌し、この溶液をコラーゲンゲル溶液とした。

細胞懸濁液とコラーゲンゲル溶液を１：１の割合で氷上で混合させ、細胞の終濃度が１〜２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、コラーゲンの終濃度が１．３５ｍｇ／ｍＬで構成される溶液を細胞インク溶液とした。細胞インク溶液はインクジェットのヘッドに充填される直前まで氷上で保管された。

細胞が吐出される培養基板は、液滴の蒸発を抑制させるためにコラーゲンゲルで被覆させた。コラーゲンゲルでコートされた培養基板（４ウエルタイプ、ラブテックチェンバースライドシステム、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手）は、前述の方法で調製したコラーゲンゲル溶液を１ウエルあたり２５０μＬ加え、５％ＣＯ_２、３７℃で３０分間静置することで調製した。

（インクジェット方式による細胞の吐出）
ピエゾ駆動によるインクジェットヘッド（クラスターテクノロジー社より入手、ヘッドのノズル直径：４０μｍ）に冷却水の導入が可能なアルミブロックをとりつけ、冷却水の潅流によって冷却されたアルミブロックによりインクジェットヘッド全体が冷却されるようにした。この冷却機能つきのインクジェットヘッドをＸＹ電動マニピュレータに取り付け、ＸＹ座標をパソコンで制御することでインクジェットヘッドの位置を任意な場所に配置できるようにした。サーキュレーターを用いて、４℃に冷却した７０％エタノール溶液を潅流させ、インクジェットヘッドが十分に冷却されたことを確認した後に、細胞インク溶液が充填されたシリンジを用いて、細胞インク溶液を１ｍＬインクジェットヘッドへ導入させた。吐出方向に対して垂直の位置に配置させたＣＣＤカメラを用いてインクジェットヘッドから吐出される液滴の形状をモニターした。ＣＣＤカメラの画像からピエゾ素子へ印加させる電圧パターンをパソコン上で制御し、１滴当たり２００ｐＬで安定的に吐出される電圧印加パターンを設定した。

コラーゲンゲルでコートされた培養基板を手動Ｚ軸マニピュレータ上に設置し、インクジェットヘッドから１ｍｍ下方に配置させた。この状態でＹ軸方向に５００μｍ間隔で３箇所に５００滴ずつ細胞インク溶液を吐出させた。その後１０分間静置させた後、初めの吐出位置から１ｍｍＸ軸方向にインクジェットヘッドを動かし再度Ｙ軸方向に５００μｍ間隔で３箇所に５００滴ずつ細胞インクを吐出させた。細胞が吐出された培養基板に培養液を加え、基板上に存在する細胞数を倒立型蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社より入手、商品名：ＩＸ−８１）によって観察した。

（比較例の説明）
比較例として、細胞懸濁液とＰＢＳ（−）を等量混合させた溶液を細胞インク溶液として同様の実験を行った。インクジェットヘッドに充填されるインク溶液がコラーゲンゲル溶液からＰＢＳ溶液に変更した以外は上記の実施例と同様の実験が行われた。

（比較例との比較）
図４は実施例におけるＣＣＤカメラによって撮影されたインクジェットヘッドから吐出された細胞インク溶液の連続写真を示す。インクジェットヘッドより１つの液滴が吐出される様子が確認された。インクジェットヘッドを冷却させながら吐出させても、細胞インクが吐出されることが確認された。

図５は実施例におけるＣＣＤカメラによって撮影されたインクジェットヘッドから吐出された細胞インク溶液の液滴の拡大写真である。矢印の領域に細胞の存在を確認することができ、吐出された液滴中に細胞が含まれることが観察された。

表１はＣＣＤカメラによって観察した２０個の液滴中に含まれる平均細胞数を示す。実施例の場合、インクジェットヘッドに充填した直後と１０分後で液滴に含まれる細胞数の割合にほとんど変化がなかったのに対して、比較例では１０分後にはほとんどの液滴に細胞が含まれないことが判明した。

図６は実施例と比較例における、細胞吐出後のコラーゲンゲル基板上の細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。実施例では充填直後、１０分後でほぼ同数の細胞が配置されている。一方、比較例では１０分後ではほとんど基板に細胞が観察されず、ＣＣＤカメラでの観察結果とあわせると、比較例では１０分静置しただけでインクジェットヘッド内においてほとんどの細胞が沈殿してしまい細胞が吐出できなくなることが明らかとなった。

表２は図６の細胞数を計測した結果を示し、図７は表２を基に作成したグラフを示す。実施例では１０分後においても充填直後と比較して吐出された細胞数が１５％程度しか減少していないのに対して、比較例では９４％減少し、ほとんど細胞が吐出されていないことが明確になった。

以上の実施例と比較例の比較から本発明の構成、すなわちコラーゲンゲル溶液に分散された細胞インクを用いた場合にのみ、時間に依存しない安定した細胞吐出が実現されることを表している。

本発明は、インクジェット方式によって長時間細胞を吐出させることに有用である。本発明によって、多種類の細胞の２次元、３次元的な任意な配置が実現され、このような細胞構造物を利用した、薬効スクリーニング、毒性スクリーニング、細胞間コミュニケーションの解明、等の用途にも応用できる。

１０１細胞
１０２細胞インク溶液
１０３冷却装置
１０４インクジェットヘッド
１０５冷却用アルミブロック
１０６サーキュレーター
１０７シリコーンチューブ
１０８細胞を含む液滴
２０１細胞懸濁液
２０２密度調整剤
２０３細胞インク溶液
２０４インクジェットヘッド
２０５細胞を含む液滴
３０１細胞懸濁液
３０２攪拌容器
３０３回転子
３０４送液チューブ
３０５インクジェットヘッド
３０６細胞を含む液滴

Claims

インクジェットヘッドを備えた吐出装置とコラーゲンゲル溶液とを用いて、細胞をインクジェット方式で吐出させる吐出方法であって、
前記コラーゲンゲル溶液は、所定温度において、ゲル状態から溶液状態となり、
前記細胞を前記コラーゲンゲル溶液中に分散させた細胞インク溶液を、前記インクジェットヘッドに導入する導入工程と、
前記インクジェットヘッドを冷却し、前記インクジェットヘッドに導入された前記細胞インク溶液を前記所定温度にまで冷却することで、前記細胞インク溶液を溶液状態とする冷却工程と、
溶液状態である前記細胞インク溶液を前記インクジェットヘッドから吐出する吐出工程と、
を包含する、
吐出方法。