JP6647616B2 - 細胞チップおよび三次元組織チップ、およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体外で細胞チップおよび三次元組織チップ、およびその製造方法に関する。

生体外で細胞の三次元組織を構築する技術は、創薬研究および再生医療研究において重要であり、特にヒト生体組織に近い細胞組織の構築が求められている。

生体外で細胞を取り扱う場合、プラスチックディッシュやガラスシャーレ等の培養容器を用いて二次元的に細胞培養を行うのが一般的である。しかしながら、実際の生体内では細胞が三次元的に増殖して組織や臓器を形成しているため、生体内に近い培養環境を実現するためには三次元の細胞組織チップを構築し、その三次元組織チップに対して評価実験を行うことが創薬研究および再生医療研究の進展には重要である。

細胞同士が集合、凝集化した三次元組織チップ（細胞集合体）を、例えばウェルプレートの整列した複数のウェル（凹部）のそれぞれに配置して、それぞれの細胞集合体を評価するアッセイ法は、細胞機能の評価や、新規医薬品として有効な化合物を選択するスクリーニングにおいて広く用いられている。このような細胞集合体に対してアッセイ法を行うことにより、少量の試料で多項目を短時間で評価することが可能であり、迅速性、簡便性、安全性、再現性および高い信頼性を確保する点において有利である。

細胞を基板上に精密パターニング配置する技術としては、フォトリソグラフィ技術で基板を加工して細胞接着を制御する方法と、細胞を直接プリントして配置および固定化する方法がある。近年では、細胞を三次元（３Ｄ）に配置および積層するための３Ｄプリンタ技術の進展に伴い、３Ｄプリンタを用いた細胞集合体の構築が検討されており、細胞集合体から得られた組織モデルによる創薬研究および再生医療への応用が盛んに展開されている。

特開2008-126459号公報 特開2008-017798号公報 特開2010-022251号公報 特開2015-229148号公報 特開2016-087822号公報 特開2017-163931号公報 特開2017-169560号公報 特開2017-131144号公報

細胞集合体の構築のための３Ｄプリンタとしては、インクジェットプリンタ（inkjet printer：インクジェット方式サーマルタイプ、ピエゾタイプ）、マイクロ押出プリンタ（microextrusion printer：ディスペンサ方式）、レーザアシストプリンタ（laser-assisted printer：パルスレーザ方式）が存在する。しかしながら、これらのプリンタにおいては、吐出できる材料が制限されており、またプリント速度（作製速度）および解像度（吐出量）においても制約を受けるものであった。さらに、従来の３Ｄプリンタにおいては、吐出する材料が細胞を含む細胞含有溶液の場合には、吐出後の状態における細胞生存率および細胞密度等に関して製造すべき細胞集合体においても問題を有するものであった。特に、高い粘性を有する細胞含有溶液から細胞集合体を製造する場合には、プリンタのノズルにおいて高粘性の溶液が目詰まりするおそれがあるため、高い解像度、即ち微細な細胞集合体を大量に製造することができず問題を有するものであった。

本発明は、高粘性の細胞含有溶液が材料であったとしても、所望の塗布量を有する細胞チップおよび三次元組織チップを短時間（高速度）で大量に製造することができ、製造された細胞チップおよび三次元組織チップにおいて所望の細胞密度を有して高い細胞生存率を示す細胞チップおよび三次元組織チップ、およびその製造方法の提供を目的とするものである。

前記目的を達成するために、本発明に係る一態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、
細胞含有溶液を塗布針の先端に付着させる付着工程と、
細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端と塗布対象物とを近接させる移動工程と、
前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液が前記塗布対象物に接触して、または前記塗布対象物に既に塗布された細胞含有溶液に接触して、前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液を接触塗布する塗布工程と、
細胞含有溶液が接触塗布された後、前記塗布針の先端を塗布対象物から離反させる離反工程と、を含むものである。

また、前記目的を達成するために、本発明に係る一態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、
細胞含有溶液を所定量貯留する塗布液溜りを有する塗布液容器と、
前記細胞含有溶液が貯留された前記塗布液溜りを貫通可能な塗布針と、を含む塗布ユニットを備えた微細塗布装置を用いた細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法であって、
前記塗布液溜りに充填された前記細胞含有溶液に前記塗布針の先端を浸漬させる待機工程、
前記塗布針の先端が前記塗布液溜りを貫通して、前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を下降させる下降工程、
前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を塗布対象物に接触させて、前記細胞含有溶液を前記塗布対象物に塗布して液滴スポットを形成する塗布工程、および
前記塗布針の先端を上昇させて、前記塗布針の先端を前記塗布液溜りに収容する収容工程、を含むものである。

さらに、前記目的を達成するために、本発明に係る一態様の細胞チップおよび三次元組織チップは、少なくとも前記の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法により製造される。

本発明によれば、高粘性の細胞含有溶液が材料であっても、所望の塗布量を有する細胞チップおよび三次元組織チップを短時間で大量に製造することができ、製造された細胞チップおよび三次元組織チップにおいては、所望の細胞密度を有し、高い細胞生存率を示している。

本発明に係る第１実施形態において用いる微細塗布装置を示す全体図 微細塗布装置における塗布ユニットに装着される塗布針保持部を示す図 塗布針保持部に設けられる塗布針の先端部分を示す図 塗布ユニットにおける細胞塗布動作を模式的に示す図 塗布実験１において位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図 塗布実験２において位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図 塗布実験３における位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図 塗布実験４における位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図 塗布実験５の実験結果を示すグラフ 塗布実験６において製造した細胞集合体を示す画像の図 塗布実験７における生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示した図 塗布実験８において製造された心筋組織体の塗布直後の状態の画像を示す図 図１２に示した心筋組織体を６日間培養したときの状態の画像を示す図 ５日間培養した心筋組織体の１つを拡大した画像を示す図 図１４に示した５日間培養した心筋組織体における拍動動画の解析により得られた収縮・弛緩速度を示すグラフ 本発明に係る第２実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法の細胞塗布動作を模式的に示す図 第２実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法における塗布針の細胞塗布動作の動きを模式的に示した図 第２実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法における塗布針の細胞塗布動作の動きを示す動作図 第２実施形態の微細塗布装置における複数サイクルの細胞塗布動作を示す動作図 第２実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法における塗布針の細胞塗布動作の動きの変形例を示す動作図 第２実施形態の微細塗布装置における複数サイクルの細胞塗布動作の変形例を示す動作図 第２実施形態の微細塗布装置における接触塗布位置における初期設定位置の決定方法を示すフローチャート 本発明に係る第３実施形態の微細塗布装置における塗布ユニットの細胞塗布動作を模式的に示す図 本発明に係る第４実施形態の微細塗布装置における塗布ユニットの細胞塗布動作を模式的に示す図 本発明に係る第５実施形態の微細塗布装置における塗布ユニットの細胞塗布動作を模式的に示す図

先ず始めに、本発明に係る細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法における各種態様について記載する。なお、本発明における細胞チップとは、例えば基板上で実質的に個々の細胞が分散して接着している状態のチップであり、三次元組織チップとは、基板上で細胞が集合、凝集、積層化して立体的に組織化し、機能している状態の細胞集合体であり、球状、平板状など細胞集合体の形状は問わない。

本発明に係る第１の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、
細胞含有溶液を塗布針の先端に付着させる付着工程と、
細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端と塗布対象物とを近接させる移動工程と、
前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液が前記塗布対象物に接触して、または前記塗布対象物に既に塗布された細胞含有溶液に接触して、前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液を接触塗布する塗布工程と、
細胞含有溶液が接触塗布された後、前記塗布針の先端を塗布対象物から離反させる離反工程と、を含むことを特徴とする。

本発明に係る第２の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第１の態様において、前記付着工程、前記移動工程、前記塗布工程、および前記離反工程を１サイクルの細胞塗布動作として複数サイクルの細胞塗布動作を繰り返し実行してもよい。

本発明に係る第３の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、
細胞含有溶液を所定量貯留する塗布液溜りを有する塗布液容器と、
前記細胞含有溶液が貯留された前記塗布液溜りを貫通可能な塗布針と、を含む塗布ユニットを備えた微細塗布装置を用いた細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法であって、
前記塗布液溜りに充填された前記細胞含有溶液に前記塗布針の先端を浸漬させる待機工程、
前記塗布針の先端が前記塗布液溜りを貫通して、前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を下降させる下降工程、
前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を塗布対象物に接触させて、前記細胞含有溶液を前記塗布対象物に塗布して液滴スポットを形成する塗布工程、および
前記塗布針の先端を上昇させて、前記塗布針の先端を前記塗布液溜りに収容する収容工程、を含むものである。

本発明に係る第４の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第３の態様において、塗布対象物の一定位置に対して、前記待機工程、前記下降工程、前記塗布工程、および前記収容工程を１サイクルの細胞塗布動作として複数サイクルの細胞塗布動作を繰り返し実行してもよい。

本発明に係る第５の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第２の態様または第４の態様において、前記１サイクルの細胞塗布動作を０．５秒以下としてもよい。

本発明に係る第６の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第２の態様、第４の態様、第５の態様のいずれかの態様において、前記細胞含有溶液の粘度が、１×１０^５ｍＰａ・ｓ以下、好ましくは１〜１×１０^４ｍＰａ・ｓの材料により、前記細胞塗布動作を実行してもよい。

本発明に係る第７の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第２の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様のいずれかの態様において、前記１サイクルの細胞塗布動作による液滴スポットを塗布対象物に対して±１５μｍ以下の配置精度で形成してもよい。

本発明に係る第８の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第２の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様のいずれかの態様において、前記１サイクルの細胞塗布動作による液滴スポットを塗布対象物に対して±３μｍ以下の配置精度で形成してもよい。

本発明に係る第９の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第２の態様、第４の態様、第５の態様、第６の態様、第７の態様、第８の態様のいずれかの態様において、塗布対象物における一定位置に対して、前記塗布工程における前記塗布針の先端の停止位置を１サイクルの細胞塗布動作毎に所定距離だけ上昇させて、複数サイクルの細胞塗布動作を繰り返してもよい。

本発明に係る第１０の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第３の態様または第４の態様において、前記塗布ユニットが、前記塗布針を摺動可能に保持するスライド機構部を、を含むものとしてもよい。

本発明に係る第１１の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第１０の態様において、前記スライド機構部が、前記塗布針の先端が塗布対象物に接触したときの衝撃を吸収する機構を有してもよい。

本発明に係る第１２の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第１１の態様のいずれかの態様の前記塗布工程において、前記塗布針の先端が鉛直方向に移動するように構成されてもよい。

本発明に係る第１３の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第１２の態様のいずれかの態様における前記塗布針の先端が、前記塗布工程の前記塗布針の移動方向に直交する平面を含むものとしてもよい。

本発明に係る第１４の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第１３の態様のいずれかの態様における前記塗布針の先端が、凹面を含むものとしてもよい。

本発明に係る第１５の態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、前記の第１の態様から第１４の態様のいずれかの態様において、前記細胞含有溶液における細胞としては、細胞間接着を高めるため、細胞外マトリックス蛋白質、糖鎖、天然および合成高分子などで細胞表面がコーティングされた細胞を用いてもよい。

本発明に係る第１６の態様の細胞チップおよび三次元組織チップは、第１の態様から第１５の態様のいずれかの態様の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法により製造された細胞チップおよび三次元組織チップ。

本発明に係る細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、後述する実施形態において具体的な例示を用いて説明するように、塗布針の先端に付着させた数ｐＬ（ピコリットル）の微少な液滴を一回当たり極短時間で、例えば０．１秒で対象物の所定位置に高精度に塗布できる微細塗布装置を用いて、安全性および再現性が高く、自動化が可能であり、短時間で大量の信頼性の高い細胞チップおよび三次元組織チップ（細胞集合体）の製造を提案するものである。

本発明においては、高速の微細塗布装置を用いることにより従来のプリンタでは対応することができなかった高粘性（５０ｍＰａ・ｓ以上）を有する材料、例えば細胞とゲル化剤を含む高粘度溶液であっても、短時間で所定位置に確実に塗布して、複数の三次元組織チップ（細胞集合体）を高精度に製造することが可能となる。この結果、本発明によれば、所望の細胞を二次元的および三次元的に任意に配置制御することが可能となり、様々な三次元組織チップを自動化して無菌状態で多量に製造することが可能となる。従って、本発明に係る細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、安全性および再現性が高く、信頼性を有する細胞チップおよび三次元組織チップを自動化により大量に製造することが可能となる。

次に、添付の図面を参照して本発明に係る細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法について具体的な構成例を示す実施形態を用いて説明する。なお、本発明に係る細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、以下に説明する実施形態の微細塗布装置を用いる構成に限定されるものではなく、微細塗布装置において実行される細胞塗布動作（細胞塗布方法）と同等の技術的思想による細胞塗布動作（細胞塗布方法）により達成されるものである。

（第１実施形態）
以下、具体的な第１実施形態について添付の図面を参照して説明する。図１は、第１実施形態において用いる微細塗布装置１を示す全体図である。図１に示すように、微細塗布装置１は、塗布装置本体２と、この塗布装置本体２に対する設定、制御、および表示を行う表示・制御部３とを備える。第１実施形態における微細塗布装置１の表示・制御部３としては、所謂パーソナルコンピュータ（ＰＣ）で構成される。

微細塗布装置１の塗布装置本体２は、本体ベース１２において水平方向に移動可能なＸＹテーブル４と、ＸＹテーブル４に対して上下方向（鉛直方向）に移動可能なＺテーブル５と、Ｚテーブル５と同様に上下方向に移動可能な駆動機構に固定された塗布ユニット６と、ＸＹテーブル４上の塗布対象物を観察するための光学検出部（例えば、ＣＣＤカメラ）７と、を備えている。ＸＹテーブル４上には、細胞含有溶液である塗布液１０が塗布されて、複数の細胞チップまたは三次元組織チップが形成される基板等が載置されて固定される。

上記のように構成された微細塗布装置１における塗布ユニット６は、ＸＹテーブル４上の基板等の上に複数の細胞チップまたは三次元組織チップを整列して形成する細胞塗布動作を行うよう構成されている。以下、塗布ユニット６の構成および塗布ユニット６による細胞塗布動作について説明する。

［塗布ユニットの構成］
図２は、塗布ユニット６に装着される塗布針保持部１３を示す図である。塗布針保持部１３には、塗布針９が突設されている。図３は、塗布針９の先端部分を示す図である。第１実施形態の塗布針９においては、円錐状に形成された先端部分の先端９ａが、ＸＹテーブル４の水平面に対向するように平面（フラット）に形成されている（図３の（ａ）参照）。即ち、先端９ａの平面は鉛直方向に直交する平面である。先端９ａの直径ｄは、後述するように、製造される細胞チップまたは三次元組織チップの形状に大きく寄与する。第１実施形態においては、塗布針９の先端９ａの直径ｄとして、５０〜３３０μｍを用いた。第１実施形態においては、図３の（ａ）に示すように、塗布針９の先端部分が円錐状に形成されており、先端９ａが水平面であるため、先端９ａを水平面に研磨することにより先端９ａの直径ｄを、例えば５０〜３３０μｍの範囲の所望の値に容易に形成することが可能である。

なお、第１実施形態においては、塗布針９の先端９ａを水平な平面で構成した例で説明するが（図３の（ａ）参照）、この先端９ａの面形状を所定直径、例えば３０μｍ以下の直径を有する凹面（半球面）に形成し、この凹面に細胞が保持され得るように細胞塗布動作を行う構成としてもよい（図３の（ｂ）参照）。このように塗布針９の先端９ａを凹面に形成することにより、塗布針９による細胞塗布動作により、所望の細胞密度や、細胞配列を有する細胞チップおよび三次元組織チップを製造することが可能な構成となる。また、図３の（ｃ）に示すように、塗布針９の先端９ａに段差を有する突起９ｂを設けた構成としてもよい。このような突起９ｂを有する構成とすることにより、例えば、基板上に連続的に複数回塗布し、一回の細胞塗布動作毎に針先を所定距離だけ上昇させていくことにより、例えば０．５μｍ上昇させていくことにより、基板上に上方に延びた細胞集合体を製造することが可能となる。

図４は、塗布ユニット６における細胞塗布動作を模式的に示す図である。図４に示すように、塗布ユニット６は、細胞含有溶液である塗布液１０を所定量貯留する塗布液溜り８ａが形成された塗布液容器８と、塗布液溜り８ａを貫通する塗布針９を備えた塗布針保持部１３と、を有する。塗布針保持部１３は、塗布針９を上下方向（鉛直方向）に摺動可能に保持するスライド機構部１６を備える。塗布針保持部１３は、駆動機構部１７の所定位置において脱着可能に設けられており、例えば駆動機構部１７に対してマグネットの磁力により脱着可能な構成としてもよい。

塗布針保持部１３は、塗布装置本体２における駆動機構部１７に上記のように固定されており、上下方向（鉛直方向）に所定間隔を高速度で往復移動するよう構成されている。このような駆動機構部１７の駆動制御や、ＹＸテーブル４およびＺテーブル５の駆動制御の設定等は、表示・制御部３において行われる。塗布針保持部１３に設けたスライド機構部１６は、塗布針９を上下に往復可能に保持しているが、塗布針９の先端９ａが対象物、例えば基板１１に当接したとき、その当接位置で停止するように、塗布針９がスライド機構部１６を鉛直方向に摺動する構成である。即ち、スライド機構部１６は、塗布針９の当接時の衝撃を吸収する機構を有している。このため、塗布針９の先端９ａは、塗布対象物に接触した位置で停止し、その後の駆動機構部１７の上方向への移動に応じて塗布対象物から離れる構成である。なお、このときの塗布針９の上下方向の往復動作は超高速度であり、例えば１往復が、好ましくは０．５秒以下、さらに好ましくは０．１秒以下に設定される。

上記のように、塗布ユニット６における塗布針保持部１３は、塗布針９を保持して上下に摺動可能なスライド機構部１６を備えており、上下方向に移動する駆動機構部１７に対しては脱着可能に固定されている。また、塗布針保持部１３は、塗布針９が細胞含有溶液である塗布液１０を貯留する塗布液溜り８ａを上下方向（鉛直方向）に移動して貫通可能に構成されている。塗布液容器８の上部および下部には塗布針９が貫通する孔（上部孔１４ａ、下部孔１４ｂ）が形成されている。

［細胞塗布動作］
次に、図４に模式的に示した、塗布ユニット６における細胞塗布動作について説明する。図４に示した細胞塗布動作においては、塗布針９が塗布液容器８の塗布液溜り８ａを通り抜けて、塗布対象物である基板１１に接触し、基板１１上に細胞を含む塗布液１０が塗布されて、液滴スポットＳが形成される。この細胞塗布動作が所定回数繰り返されて、塗布液１０が複数回塗布されることにより、基板１１上に所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。なお、本発明に係る第１実施形態およびその他の実施形態においては、塗布対象物として基板１１を用いて説明するが、塗布対象物としては基板に特定されるものではなく、例えば細胞培養に一般的に使用されるプラスチックディッシュ、ガラスシャーレ、ウェルプレート等の培養容器や、培養容器上の各種溶液が対象となる。

図４における（ａ）は、細胞塗布動作における待機状態を示している。この待機状態においては、塗布針９が上部孔１４ａから挿入されており、塗布針９の先端９ａが塗布液溜り８ａの塗布液１０に浸漬している。このように待機状態（待機工程）においては、塗布針９の先端９ａが塗布液１０に浸漬して、先端９ａに付着する塗布液１０が乾燥しない構成である。このとき、塗布液容器８の下部孔１４ｂの直径は微細（例えば、１ｍｍ以下）であるため、塗布液１０が塗布液溜り８ａから漏洩することはない。

図４における（ｂ）は、塗布針９の先端９ａが塗布液容器８の下部孔１４ｂから突出して、先端９ａが塗布液溜り８ａから基板１１に向かって下降している状態（下降工程）を示している。即ち、図４の（ｂ）は、塗布針９の先端９ａが塗布液容器８の塗布液溜り８ａを貫通して突出する下降状態を示している。この下降状態においては、塗布針９には塗布液１０が付着しているが、付着している塗布液１０の表面張力により、塗布針９の先端９ａには一定量の塗布液１０が保持されている。

図４における（ｃ）は、塗布針９の先端９ａが基板１１の表面に接触して、塗布液１０が基板１１の表面上に塗布された状態（塗布工程）を示している。このとき塗布される塗布液１０の液滴スポットＳは、塗布針９の先端９ａに保持された一定量の塗布液１０に対応する。第１実施形態において、塗布針９の先端９ａが基板１１の表面に接触（当接）する瞬間の衝撃荷重を約０．０６Ｎ以下となるように構成されている。第１実施形態においては、前述のように、塗布針９がスライド機構部１６により鉛直方向の衝撃を吸収するように摺動可能に保持されているため、当接時における衝撃荷重は極めて小さな値となっている。

図４における（ｄ）は、塗布針９が基板１１の表面上に塗布液１０を塗布した直後の状態を示しており、塗布針９が上昇している状態を示している。この上昇状態の後、塗布針９の先端９ａが塗布液溜り８ａの塗布液１０に浸漬する待機状態へ移行する（収容工程）。

上記のように、図４に示す（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ａ）の動作が１サイクルの細胞塗布動作である。第１実施形態においては、１サイクルの細胞塗布動作を０．１秒で行っており、超短時間で細胞塗布動作が実行されている。なお、第１実施形態では細胞塗布動作を所定回数（例えば、１０サイクル）繰り返すことにより、所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。１０サイクルの塗布作動で１スポットの三次元組織を製造するのに要す時間は１秒となる。

本発明に係る第１実施形態における微細塗布装置１の細胞塗布動作では、先端に極微量な塗布液１０を付着させた塗布針９を塗布対象物（基板１１等）に接触させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量の液滴スポットＳを高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布し形成することができる。また、塗布液１０の粘度としては、１×１０^５ｍＰａ・ｓ以下の材料、好ましくは１〜１×１０^４ｍＰａ・ｓの材料を塗布することが可能であり、高粘度の細胞分散液の塗布が可能となる。第１実施形態における微細塗布装置１の細胞塗布動作おいては、インクジェットプリンタ等のノズルを用いたプリンタでは目詰まり等の問題を有するため使用できなかった粘度１０ｍＰａ・ｓ以上、１×１０^５ｍＰａ・ｓ以下の材料を塗布材料として使用することが可能となる。また、先端に極微量な塗布液１０を付着させた塗布針９を塗布対象物に接触させて塗布するため、塗布針９の鉛直方向位置のバラツキに影響されることなく、塗布液１０を所望の塗布量で安定して繰り返し塗布することができる。このように、本発明に係る第１実施形態においては、高粘度の細胞分散液を基板１１等に対して所定の位置に精密塗布することができるため、任意のパターニングを有する細胞チップ、細胞を立体的に造形した三次元組織チップを製造することができる。このため、本発明に係る細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、製造された細胞チップおよび三次元組織チップが、薬剤の薬効、安全性の評価のスクリーニング等の創薬研究および再生医療の分野において利用されて、各分野における進展に効果を奏するものである。

（実験例１）
前述の第１実施形態において説明した微細塗布装置１を用いて、濃度および粘性が異なる塗布液１０による塗布実験１を行った。この塗布実験１においては、５％、１０％、および２０％のゼラチンＰＢＳ（リン酸緩衝液）溶液の３種類の塗布液１０を用いて液滴スポットの形状の確認を行った。

塗布ユニット６における塗布液容器８を３個用意して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にゼラチンを５、１０、２０重量体積パーセント（％ｗ/ｖ）で溶解した３種類のゼラチンＰＢＳ溶液を塗布液１０として準備した。なお、この塗布実験１において用いた塗布液１０には細胞は含まれていない。

塗布実験１において、それぞれの塗布液容器８に対して、５％、１０％、２０％のゼラチンＰＢＳ溶液を２０μＬ充填した。塗布ユニット６における塗布針９としては先端９ａ（平面形状）の直径ｄが１００μｍを用いた。この塗布実験１においては、ＸＹテーブル４に固定されたスライドガラス上に５×５スポット（spot）を１５０μｍ間隔で塗布液１０を点接触して塗布した。スライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを位相差顕微鏡により観察した。

図５は、塗布実験１において位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図である。図５における（ａ）は、塗布液１０として５％のゼラチンＰＢＳ溶液（粘度３ｍＰａ・ｓ）を先端９ａの直径ｄ（先端直径）が１００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図５における（ｂ）は、塗布液１０として１０％のゼラチンＰＢＳ溶液（粘度３０ｍＰａ・ｓ）を、塗布針９（先端直径１００μｍ）を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。また、図５における（ｃ）は、塗布液１０として２０％のゼラチンＰＢＳ溶液（粘度２２０ｍＰａ・ｓ）を、塗布針９（先端直径１００μｍ）を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。

図５における（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）から明らかなように、微細塗布装置１の塗布ユニット６を用いることにより、濃度および粘性が異なる塗布液１０であっても形成された液滴スポットは同様の形状を有していた（５％ゼラチン液滴スポット直径１３６±３μｍ、１０％ゼラチン液滴スポット直径１４７±１μｍ、２０％ゼラチン液滴スポット直径１５１±１μｍ）。即ち、塗布実験１においては、ゼラチン濃度および粘性に大きく依存せず、常に安定した液滴スポットを確認することができた。発明者らの実験によれば、液滴スポット径は、塗布針９の先端直径に対して１．３〜１．６倍の範囲内であり、少なくとも２倍以上の大きな液滴となることはなかった。

（実験例２）
前述の第１実施形態において説明した微細塗布装置１を用いて、先端９ａの直径（先端直径）が異なる塗布針９による塗布実験２を行った。この塗布実験２においては、塗布液１０として５％のゼラチンＰＢＳ溶液を用いて、形成された液滴スポットの形状を確認した。この塗布実験２において用いた塗布液１０には細胞は含まれていない。

塗布実験２においては、先端直径が、５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍの３種類の塗布針９を用いた。塗布実験２においては、ＸＹテーブル４に固定されたスライドガラス上に５×５スポットを１５０μｍ間隔で塗布液１０を点接触して塗布した。スライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを位相差顕微鏡により観察した。

図６は、塗布実験２において位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図である。図６における（ａ）は、５％のゼラチンＰＢＳ溶液の塗布液１０を先端直径が５０μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図６における（ｂ）は、５％のゼラチンＰＢＳ溶液の塗布液１０を先端直径が１００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図６における（ｃ）は、５％のゼラチンＰＢＳ溶液の塗布液１０を先端直径が１５０μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。

図６における（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に示すように、形成された液滴スポットは、塗布針１０の直径（５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ）に略比例した液滴スポット径を有することが確認できた（５０μｍ塗布針：液滴スポット直径７５±２μｍ、１００μｍ塗布針：液滴スポット直径１３７±３μｍ、１５０μｍ塗布針：液滴スポット直径２１９±５μｍ）。

（実験例３）
塗布実験３においては、ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を２×１０^７cells／ｍＬの濃度で１０％ゼラチンＰＢＳ溶液に分散させた塗布液１０を用いた。塗布実験３においては、微細塗布装置１を用いて、先端直径（先端直径）が１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍの３種類の塗布針９をスライドガラス上に点接触させて塗布液１０を塗布した。スライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットの形状を位相差顕微鏡により観察した。

図７は、塗布実験３における位相差顕微鏡により観察した液滴スポットの画像を示す図である。図７における（ａ）は、ＮＨＤＦが分散された１０％ゼラチンＰＢＳ溶液を先端直径が１００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図７における（ｂ）は、ＮＨＤＦが分散された１０％ゼラチンＰＢＳ溶液を先端直径が１５０μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。図７における（ｃ）は、ＮＨＤＦが分散された１０％ゼラチンＰＢＳ溶液を先端直径が２００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。

塗布実験３によれば、１００μｍの先端直径の塗布針９を用いた場合には、１つの液滴スポットにおいて０〜３個の塗布細胞が確認された。先端直径が１５０μｍの塗布針９を用いた場合には、１つの液滴スポットにおいて２〜６個の塗布細胞が確認された。また、先端直径が２００μｍの塗布針９を用いて形成された１つの液滴スポットにおいては、約１０個までの個数の塗布細胞を確認することができた。従って、塗布針９の先端直径を決定することにより、液滴スポットにおける塗布細胞の個数を１〜１０個程度までの範囲で制御することが可能であることが確認された。

（実験例４）
塗布実験４においては、前述の塗布実験３におけるヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）に換えて、肝がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を用いて同様の実験を行った。塗布実験４においては、ＨｅｐＧ２を５×１０^７cells／ｍＬの濃度で１０％ゼラチンＰＢＳ溶液に分散させた塗布液１０を用いた。

図８は、ＨｅｐＧ２が分散された１０％ゼラチンＰＢＳ溶液を先端直径が１００μｍの塗布針９を用いてスライドガラス上に塗布して形成された液滴スポットを示す画像である。塗布実験４においても、液滴スポット中に所定量の細胞が存在しており、細胞の種類によらず安定的な塗布が可能であることが確認された。以下に説明する塗布実験５においては、塗布針９の先端直径と、形成された液滴スポットに含まれる塗布細胞数との関連性について検証した。

（実験例５）
塗布実験５においては、ｉＰＳ由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ）を４×１０^７cells／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液に分散させた塗布液１０を用いて、先端直径が７０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、３３０μｍのそれぞれの塗布針９により液滴スポットを形成した。塗布実験５においては、塗布針９の先端直径と、形成された液滴スポットに含まれる塗布細胞数との関連性について検証した。

塗布実験５においては、上記の塗布液１０をスライドガラス上に１回塗布し、塗布後の細胞数を蛍光顕微鏡（細胞は塗布前に蛍光色素のＤＡＰＩで核染色されたものを使用）および位相差顕微鏡観察により算出した。この塗布実験５において、先端直径が５０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、３３０μｍの各塗布針９により形成された液滴スポットに関して、２０点以上について計測し、その平均値を求めた。

図９は、塗布実験５の実験結果を示すグラフである。図９において、縦軸が塗布細胞数［cells／spot］を示し、横軸が塗布針９の先端直径［μｍ］を示す。図９に示すように、ｉＰＳ−ＣＭを４×１０^７cells／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液に分散させた場合には、先端直径が５０μｍの塗布針９で塗布したとき液滴スポットには平均１．１個の塗布細胞が存在した。先端直径が１００μｍの塗布針９による液滴スポットには平均４．０個の塗布細胞が存在し、先端直径が１５０μｍの塗布針９による液滴スポットには平均４．５個の塗布細胞が存在し、先端直径が２００μｍの塗布針９による液滴スポットには平均１９．１個の塗布細胞が存在し、そして先端直径が３３０μｍの塗布針９による液滴スポットには平均８５．３個の塗布細胞が存在していた。なお、図９において各塗布針９における塗布細胞数の標準偏差（正方向）をエラーバーで示している。

上記のように、使用する塗布針９の先端直径と、形成される液滴スポットに存在する塗布細胞の個数が関連性を有しており、塗布針９の先端直径が大きくなるに従って液滴スポットに存在する塗布細胞の個数が増加することが確認された。このため、塗布針９の先端直径を決定することにより、液滴スポットにおける塗布細胞の個数をある程度の範囲で制御可能であることを検証することができた。

（実験例６）
塗布実験６においては、微細塗布装置１を用いて細胞集合体２０を製造した。塗布実験６においては、ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を２×１０^７cells／ｍＬの濃度で２．５％アルギン酸ＰＢＳ溶液に分散した塗布液１０を用いた。この塗布液１０を塗布ユニット６の塗布液容器８に充填して微細塗布装置１により細胞塗布動作を行った。

塗布実験６においては、アルギン酸を含む細胞分散液を先端直径が１００μｍであり、先端９ａに段差を有する突起９ｂを持つ塗布針９（図３の（ｃ）参照）を用いて、スライドガラス上に１６００回連続的に塗布した。このとき、一回の細胞塗布動作毎に針先を０．５μｍ上昇させることにより、細胞集合体２０を製造した。その結果、直径５０μｍ、高さ５００μｍの細胞集合体２０が製造された。図１０は、塗布実験６において製造した細胞集合体２０を示す画像である。

上記のように、基板１１における塗布すべき一定位置（一定点）に対して、細胞塗布動作における塗布工程時の塗布針９の先端９ａの停止位置を、１サイクル毎に上昇（例えば、０．５μｍ）させて、複数サイクルの細胞塗布動作を繰り返すことにより、所望形状の細胞集合体２０の作成が可能であることが確認できた。

（実験例７）
塗布実験７においては、微細塗布装置１を用いて塗布した形成された液滴スポットにおける塗布細胞の生存率を確認した。塗布実験７においては、ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を８×１０^７cells／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液に分散させた塗布液１０を用いた。また、塗布実験７においては、先端直径が３３０μｍの塗布針９によりスライドガラス上に４０回連続的に塗布液１０を塗布し、塗布後の細胞１５の生存率を生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色法（死細胞が赤色染色）により評価した。図１１は、塗布実験７における生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示した図である。

図１１において、（ａ）が塗布前の塗布液１０における細胞１５の生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示しており、（ｂ）が塗布後の液滴スポットにおける細胞１５の生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示している。なお、塗布実験７における生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像では、生細胞が緑色であり、死細胞が赤色に染色された画像であるが、図１１の生細胞／死細胞（Live/Dead）蛍光染色像を示す図においては、生細胞を○で示し、死細胞を●で示した。

塗布実験７において細胞１５の生存率を確認した結果、塗布前の細胞生存率が９６％に対して、塗布後においても９１％の高い細胞生存率を示していた。この確認結果により、微細塗布装置１を用いた細胞塗布動作においては、直接的に細胞１５にダメージを与えることが殆どないことが明らかとなった。なお、塗布前の細胞生存率が９６％から塗布後の細胞生存率が９１％に僅かに低下しているが、この低下は時間経過に伴う通常の低下であり、他の要因である。

（実験例８）
塗布実験８においては、微細塗布装置１を用いて、セルディスク上へｉＰＳ由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ）の三次元組織チップを構築し、その三次元組織チップにおける心筋組織体の拍動挙動を評価した。

塗布実験８においては、ｉＰＳ−ＣＭを４×１０^７cells／ｍＬの濃度で２０ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン溶液に分散させた塗布液１０を用いた。塗布実験８においては、先端直径が３３０μｍの塗布針９によりセルディスク上に１０回連続的に塗布し、その後８００unit／ｍＬ（８．３ｍｇ／ｍＬ）のトロンビン溶液に浸漬することにより、ゲル化による組織固定を行った。フィブリノゲンがトロンビンの作用によりフィブリン（血液凝固に関わる蛋白質）が形成され、そのゲル化反応を利用することで、組織を基板に固定化した。

その後、６日間培養を行い、経時的な拍動挙動を位相差顕微鏡により観察した。その結果、塗布直後は、直径約３００μｍの心筋組織体が形成されており、６日間培養後においても等間隔の心筋組織体の構造を確認することができた。

図１２は、塗布実験８において製造された心筋組織体の塗布直後（０日間培養）の状態を示す画像である。図１３は、図１２に示した心筋組織体を６日間培養したときの状態を示す画像である。図１４は、５日間培養した心筋組織体の１つを拡大して示した画像である。図１３および図１４に示すように、心筋組織体の構造が確認され、三次元組織チップが確実に構築されていることが確認できた。

製造された心筋組織体においては、心筋細胞が２日間培養後から拍動を開始し、６日間培養後では６個のサンプル数において１分間あたり平均８２回の拍動が観察され、６個のサンプル数における標準偏差が１５であった。

また、高速度カメラで撮影した拍動動画の解析により、一定周期の収縮・弛緩速度が得られた。図１５は、図１４に示した５日間培養した心筋組織体（三次元組織チップ）における拍動動画の解析により得られた収縮・弛緩速度を示すグラフである。図１５において、縦軸が心筋組織体の収縮・弛緩する移動速度［μｍ／ｓ］であり、横軸が時間［ｓ］である。

図１５に示すように、心筋組織体（三次元組織チップ）においては一定の拍動を示し、一定周期の収縮・弛緩速度が確認された。このときの拍動数は７８回／minであり、平均収縮速度は８．７μｍ／ｓであり、平均弛緩速度４．６μｍ／ｓであった。

上記の塗布実験８において得られた心筋組織体を９６ウェルプレート等の各ウェルに製造することにより、ロボットを用いて無菌状態で自動評価するハイスループット化が可能な心毒性評価キットを製造することが可能である。

（第２実施形態）
次に、本発明の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法に係る第２実施形態について添付の図面を参照して説明する。第２実施形態における微細塗布装置は、前述の第１実施形態において用いた微細塗布装置１と同じ構成、機能を有する装置が用いられる。第２実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法においては、前述の第１実施形態における細胞塗布動作に関して、段落［００４４］等において説明したように、１サイクルの細胞塗布動作毎に針先を所定距離だけ上昇させていく細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法の例示を説明するものである。即ち、第２実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、第１実施形態において説明した細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法の具体例を説明するものである。なお、第２実施形態の説明において、前述の第１実施形態と同様の作用、構成、および機能を有する要素には同じ参照符号を付して、重複する記載を避けるため説明を省略する場合がある。

図１６は、第２実施形態における細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法の細胞塗布動作を模式的に示す図である。図１６に示す細胞塗布動作は、１サイクルの細胞塗布動作を示している。図１６に示す細胞塗布動作においては、塗布針９の先端９ａが塗布対象物である基板１１に接触塗布して、細胞含有溶液である塗布液１０の液滴スポットＳ（細胞集合体２０）が基板１１上に既に形成された状態を示している。即ち、図１６の細胞塗布動作は、最初のサイクルの細胞塗布動作が実行された後の少なくとも２回目以降のサイクルの細胞塗布動作を示している。

図１６における（ａ）は、塗布針９の先端９ａが塗布液溜り８ａの塗布液１０に浸漬して、塗布液１０を塗布針９の先端９ａに付着させる付着状態（付着工程）を示しており、第１実施形態における細胞塗布動作の待機状態に対応する。

図１６における（ｂ）は、塗布針９の先端９ａが塗布液容器８の下部孔１４ｂから突出して、先端９ａが塗布液溜り８ａから基板１１に向かって下降している移動状態（移動工程）を示している。即ち、図１６の（ｂ）は、第１実施形態における細胞塗布動作の下降状態に対応する。

図１６における（ｃ）は、塗布針９の先端９ａが基板１１上の液滴スポットＳに接触して、接触塗布状態（塗布工程）を示している。このとき塗布される塗布液１０の液滴スポットＳは、塗布針９の先端９ａに付着された一定量の塗布液１０に対応する。

図１６における（ｄ）は、塗布針９が基板１１の表面上に塗布液１０を塗布した後の状態を示しており、塗布針９が基板１から離反して上昇している離反状態（離反工程）を示している。即ち、図１６の（ｄ）は、第１実施形態における細胞塗布動作の収容状態に対応する。

上記のように、第２実施形態においては、図１６に示す（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ａ）の動作が１サイクルの細胞塗布動作である。第２実施形態においては、１サイクルの細胞塗布動作を０．１秒で行っており、超短時間で細胞塗布動作が実行されている。第２実施形態における細胞塗布動作では、２回目以降のサイクルの細胞塗布動作において、接触塗布するときの塗布針９の先端９ａの停止位置が徐々に上昇するよう制御されている。

図１７に示す（１）〜（４）の図は、塗布針９の先端９ａにおける細胞塗布動作の接触塗布時の動きを模式的に示した図である。図１７においては、塗布針９の先端９ａに極微量の細胞含有溶液である塗布液１０が付着した状態（１）と、塗布対象物である基板１１上に既に塗布された塗布液１０の液滴スポットＳに対して、塗布針９の先端９ａに付着した塗布液１０が接触したときの状態（２）と、塗布針９の先端９ａが基板１１上の塗布液１０に接触した直後に上昇したときの状態（３）と、塗布針９の先端９ａが基板１１から上昇して離反し、基板１１上に新たな液滴スポットＳが形成された状態（４）と、を模式的に示している。

上記のように、第２実施形態における２回目以降のサイクルの細胞塗布動作においては、塗布針９の先端９ａが基板１１には接触せず、基板１１上の塗布液１０に接触する接触塗布が行われて、所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。

図１８は細胞塗布動作における塗布針９の先端９ａの動きを示す動作図である。図１８の動作図において、縦軸が塗布針先端位置を示し、横軸が時間を示している。

図１８に示すように、塗布針９の細胞塗布動作においては、その先端９ａが上限位置Ｐ１ａから第１塗布速度Ｖ１ａで下降し、予め設定された塗布直前の速度変更位置Ｐ２ａに達したとき、第１塗布速度Ｖ１ａより遅い第２塗布速度Ｖ２ａで低速下降する。塗布針９の先端９ａが第２塗布速度Ｖ２ａで下降して、接触塗布位置Ｐ３ａで先端９ａに付着した塗布液１０が接触塗布される。接触塗布位置Ｐ３ａに関しては、塗布対象物である基板１１上の位置および高さを評価系装置に設けられている位置計測機器等による検出データに基づいて算出して、予め設定してもよい。なお、微細塗布装置１には、水平方向に移動可能なＸＹテーブル４と、ＸＹテーブル４に対して上下方向（鉛直方向）に移動する微調整可能な塗布ユニット６と、ＸＹテーブル４上の塗布物（細胞等）を目視観察等を行うための光学検出部７などの観察光学系ユニット（例えば、ＣＣＤカメラ等）と、作製された塗布物の計測等を行う計測機器を含む評価系装置（例えば、レーザー変位計、白色干渉計等）と、が備えられている。

接触塗布位置Ｐ３ａに関しては、最初のサイクルの細胞塗布動作における塗布最初の原点位置を予め検出して設定し、その原点位置に基づいて塗布動作における２回目以降の接触塗布位置Ｐ３ａを設定してもよい。即ち、塗布針９による複数サイクルの細胞塗布動作においては、細胞塗布動作を１回行う毎に接触塗布が可能な範囲で接触塗布位置Ｐ３ａを徐々に上昇させるように設定してもよい。

細胞塗布動作において、接触塗布位置Ｐ３ａで接触塗布した後は、初期動作位置である上限位置Ｐ１ａに復帰速度Ｖ３で戻り、次の細胞塗布動作を繰り返す。図１８に示すように、１回の細胞塗布動作において、上限位置Ｐ１ａ（時間Ｔ１ａ）から速度変更位置Ｐ２ａ（時間Ｔ２ａ）までを第１塗布速度Ｖ１ａで下降し、速度変更位置Ｐ２ａ（時間Ｔ２ａ）から接触塗布位置Ｐ３ａ（時間Ｔ３ａ）までを第２塗布速度Ｖ２ａ（＜Ｖ１ａ）で下降して接触塗布する。接触塗布後は、上限位置Ｐ１ａ（時間Ｔ４ａ）まで所定の復帰速度Ｖ３で上昇する。

第２実施形態の微細塗布装置１においては、接触塗布位置Ｐ３ａに到達するときの塗布針９の第２塗布速度Ｖ２ａは第１塗布速度Ｖ１ａに比して低速度であるため、塗布針９の先端９ａは設定された接触塗布位置Ｐ３ａに対して精度高く配置することができ、微細な細胞塗布動作を行うことができる。なお、塗布針９の先端９ａが塗布対象物である基板表面に接触したとしても、接触衝撃は小さいものとなり、細胞に対する影響を小さいものとすることができる。

図１９は、第２実施形態の微細塗布装置１における複数サイクルの細胞塗布動作を示す動作図である。図１９に示す細胞塗布動作においては、塗布針９により塗布液１０が塗布対象物である基板１１に対して１０回の細胞接触塗布が実行されている。

図１９に示すように、細胞塗布動作における１０回の接触塗布においては、塗布針９の最下点位置である接触塗布位置Ｐ３ａが、１回の接触塗布が終了する毎に徐々に上方へ移動するように設定されている。第２実施形態の微細塗布装置１における細胞塗布動作では、例えば、接触塗布位置Ｐ３ａを各サイクル毎に数μｍだけ上方に移動させている。

第２実施形態の微細塗布装置１においては、細胞塗布動作における塗布針９の先端９ａの動きとしては、図１８に示した動きの変形例として、図２０に示した動きを行うことも可能である。

図２０は、塗布針９を塗布対象物の直前の速度変更位置Ｐ２ａで一旦所定時間停止させる細胞塗布動作を示す塗布針９の先端９ａの動作図である。図２０に示すように、塗布針９の先端９ａは、第１塗布速度Ｖ１ａで下降して速度変更位置Ｐ２ａに達した時（Ｔ２ａ）、微少な所定時間（Ｔ２ａ→Ｔ２’ａ）だけ停止しており、この所定時間経過後に再び第２塗布速度Ｖ２ａで塗布対象物に向かって下降して接触塗布している。このように塗布針９の先端９ａを塗布対象物の直前位置で微少な所定時間だけ停止させることにより、先端９ａによる塗布液１０の塗布量を均一化することができる。このため、微細塗布装置１において塗布針９が図２０に示した細胞塗布動作を行うことにより、塗布対象物に対して、塗布液の特性に応じて一定の塗布量をより安定して塗布することが可能となる。

上記のように、図２０に示した細胞塗布動作においては、速度変更位置Ｐ２ａで一旦停止し、所定時間（Ｘ）経過後に停止前の第１塗布速度Ｖ１ａより遅い第２塗布速度Ｖ２ａで接触塗布位置Ｐ３ａに下降する。接触塗布位置Ｐ３ａで接触塗布した後は、初期動作位置である上限位置Ｐ１ａに復帰速度Ｖ３で戻り、次のサイクルの細胞塗布動作を繰り返す。図２０に示すように、１回のサイクルの塗布動作において、上限位置Ｐ１ａ（時間Ｔ１ａ）から速度変更位置Ｐ２ａ（時間Ｔ２ａ）までを第１塗布速度Ｖ１ａで下降し、所定時間（Ｘ）経過後に速度変更位置Ｐ２ａ（時間Ｔ２’ａ）から接触塗布位置Ｐ３ａ（時間Ｔ３ｂ）までを第２塗布速度Ｖ２ａ（＜Ｖ１ａ）で下降して接触塗布する。接触塗布後は、上限位置Ｐ１ａ（時間Ｔ４ｂ）まで所定の復帰速度Ｖ３で上昇する。

図２１は、図２０に示した塗布針９による複数回の細胞塗布動作を示す動作図である。図２１に示す塗布針９による細胞塗布動作においては、塗布針９により塗布液１０が塗布対象物である基板１１に対して１０回の接触塗布が行われている。

図２１に示す細胞塗布動作においては、図１９に示した細胞塗布動作と同様に、塗布針９の最下点位置である接触塗布位置Ｐ３ａが、１回の塗布が終了する度に徐々に上方へ移動するように設定されている。

［接触塗布位置Ｐ３の初期設定位置の決定方法］
次に、第２実施形態の微細塗布装置１による細胞塗布動作において、塗布針９の先端９ａの最初のサイクルの接触塗布位置Ｐ３ａとなる初期設定位置の決定方法について説明する。細胞塗布動作においては、各サイクル毎に塗布針９の先端９ａの接触塗布位置Ｐ３ａを徐々に上昇させている。細胞塗布動作が実行される前において、細胞塗布動作の最初のサイクルにおける接触塗布位置Ｐ３ａである初期設定位置が決定される。初期設定位置が決定されると、各サイクル毎の接触塗布位置Ｐ３ａとしては、決定された初期設定位置に基づいて、予め設定された所定距離（例えば、数μｍ）だけ上昇させて設定される。

図２２は、第２実施形態の微細塗布装置１における接触塗布位置Ｐ３ａにおける初期設定位置の決定方法を示すフローチャートである。ステップＳ１０１において、微細塗布装置１に設けた光学検出部７などの観察光学系ユニット（例えば、ＣＣＤカメラ等）により塗布対象物（例えば、基板１１）の塗布面となる塗布点に焦点を合わせる。

ステップ１０２においては、塗布対象物の塗布点に対して微細塗布装置１により細胞塗布動作を試行する。この試行動作においては、焦点を合わせた塗布点に基づく基準位置を仮の接触塗布位置Ｐ３ａとして実際の細胞塗布動作と同様の塗布動作が実行してもよい。なお、試行動作において最初に設定される仮の接触塗布位置Ｐ３ａとしては、観察光学系ユニットによる目視により決定してもよく、若しくは、上記のように観察光学系ユニットにより焦点を合わせた位置に基づいて決定してもよい。

ステップ１０３においては、観察光学系ユニットにより塗布対象物の塗布点に液滴スポットＳが形成されているか否かが観察される。塗布対象物の塗布点に液滴スポットＳの形成が観察された場合には、初期設定位置を予め設定した１段階上の位置（例えば、数μｍの上方位置）に上昇させる（ステップ１０４）。ステップ１０５においては、塗布対象物の塗布点の液滴スポットＳを除去した後、再度、細胞塗布動作を試行する。

ステップ１０６においては、観察光学系ユニットにより塗布対象物の塗布点に液滴スポットＳが新たに形成されているか否かが観察される。塗布点に液滴スポットＳが新たに形成されていれば、ステップ１０４に戻り、初期設定位置を更に１段階上の位置に上昇させて、再度、細胞塗布動作を試行する。

ステップ１０６において、塗布点に液滴スポットＳが形成されていなければ、ステップ１０７へ移行する。ステップ１０７においては、初期設定位置を予め設定した１段階下の位置に下降させる。このように下降させた位置が細胞塗布動作における最初のサイクルの接触塗布位置Ｐ３ａとなる初期設定位置として決定され、設定される（ステップ１１１）。

一方、ステップ１０３において、観察光学系ユニットにより塗布対象物の塗布点に液滴スポットＳの形成が観察されなかった場合には、細胞塗布動作における最初のサイクルの接触塗布位置Ｐ３ａとなる初期設定位置を予め設定した１段階下の位置（例えば、数μｍの下方位置）に下降させる（ステップ１０８）。ステップ１０９においては、塗布対象物の塗布点に対して、再度、細胞塗布動作が試行される。

ステップ１１０においては、観察光学系ユニットにより塗布対象物の塗布点に液滴スポットＳが形成されていなければ、ステップ１０８に戻り、初期設定位置を更に１段階下の位置に下降させて、再度、細胞塗布動作を試行する。

ステップ１１０において、塗布点に液滴スポットＳの形成が観察された場合には、このときの位置が細胞塗布動作における最初のサイクルの接触塗布位置Ｐ３ａとなる初期設定位置として決定され、設定される（ステップ１１１）。

なお、図２２に示すフローチャートにおける各ステップは、微細塗布装置１に備えて表示・制御部３におけるＲＯＭ等のメモリに格納された制御プログラムを実行することによって行われる。

上記のように、細胞塗布動作における最初のサイクルの接触塗布位置Ｐ３ａが決定されることにより、細胞塗布動作における各サイクルの接触塗布位置Ｐ３ａが決定される。各サイクル毎の接触塗布位置Ｐ３ａは、決定された初期設定位置に予め設定された所定距離（例えば、数μｍ）を付加して設定される。このとき付加される所定距離としては、確実に接触塗布される距離に設定されている。

上記のように、第２実施形態の微細塗布装置１においては、細胞塗布動作における複数回（例えば、１０回）の接触塗布においては、塗布針９の先端９ａの最下点位置である接触塗布位置Ｐ３ａが、１回の接触塗布が終了する毎に徐々に上方へ移動するように設定されており、例えば、接触塗布位置Ｐ３ａを各接触塗布毎に数μｍだけ上方に移動させている。

第２実施形態における微細塗布装置１の細胞塗布動作による細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、塗布針９の先端９ａに極微量な塗布液１０を付着させて塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液１０に対して複数回の接触塗布において、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量の液滴スポットＳを高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布し形成することができる。また、第２実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法においては、塗布液１０の粘度としては、１×１０^５ｍＰａ・ｓ以下の材料、好ましくは１〜１×１０^４ｍＰａ・ｓの材料を塗布することが可能であり、高粘度の細胞分散液の塗布が可能となる。第２実施形態における微細塗布装置１の細胞塗布動作おいては、塗布針９の先端９ａに付着した極微量な塗布液１０を塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液に対して高精度に接触塗布するため、塗布液１０を安定して繰り返し塗布することができる。このように、第２実施形態の微細塗布装置１の細胞塗布動作によれば、高粘度の細胞分散液を塗布対象物に対して所定の位置に精密塗布することができるため、任意のパターニングを有する細胞チップ、細胞を立体的に造形した三次元組織チップを製造することができる。このため、本発明に係る第２実施形態の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法は、製造された細胞チップおよび三次元組織チップが、薬剤の薬効、安全性の評価のスクリーニング等の創薬研究および再生医療の分野において利用されて、各分野における進展に効果を奏するものである。

（第３実施形態）
第１実施形態および第２実施形態の微細塗布装置１においては、塗布針９が塗布液容器８の塗布液溜り８ａを貫通して塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液１０に接触塗布する構成であるが、本発明はこのような構成に限定されるものではない。例えば、塗布液溜りの塗布液に浸漬した塗布針を持ち上げ、塗布位置に移動させて接触塗布する構成としてもよい。このように構成された微細塗布装置においても前述の第１実施形態および第２実施形態の微細塗布装置１による効果と同様に高粘性の細胞含有ゲル化剤が材料であったとしても、所望の塗布量で形成された細胞チップおよび三次元組織チップを短時間（高速度）で確実に製造することが可能となる。

図２３は、第３実施形態の微細塗布装置における塗布ユニット６０の細胞塗布動作を模式的に示す図である。図２３に示すように、塗布ユニット６０は、細胞含有溶液である塗布液１０を所定量貯留する塗布液溜り８０ａが形成された塗布液容器８０と、塗布液溜り８０ａの塗布液１０に塗布針９を浸漬させて、先端９ａに塗布液１０が付着した塗布針９を保持する塗布針保持部１３０と、を有する。塗布針保持部１３０は、塗布針９を上下方向（鉛直方向）に摺動可能に保持するスライド機構部１６０を備える。塗布針保持部１３０は、駆動機構部１７０の所定位置において脱着可能に設けられており、例えば駆動機構部１７０に対してマグネットの磁力により脱着可能な構成である。駆動機構部１７０は、装着された塗布針保持部１３０に保持された塗布針９を塗布対象物（例えば、基板１１）の塗布位置に移動させて接触塗布させる構成を有している。

［細胞塗布動作］
図２３に模式的に示した、塗布ユニット６０における細胞塗布動作について説明する。図２３における（ａ）および（ｂ）に示すように、細胞塗布動作においては、塗布針９の先端９ａが細胞含有溶液である塗布液１０の中に浸漬されて、塗布針９の先端９ａに塗布液１０が付着される。塗布液１０が付着した先端９ａが移動して、塗布対象物である基板１１又は、基板１１上の塗布液１０に接触し、基板１１上に液滴スポットＳが形成されている（図２３の（ｃ）および（ｄ）参照）。この細胞塗布動作が所定回数繰り返されて、塗布液１０の複数回の接触塗布により、基板１１上に所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。

図２３における（ａ）は、細胞塗布動作における付着工程を示している。この付着工程においては、塗布液容器８０の塗布液溜り８０ａに貯留されている細胞含有溶液である塗布液１０の中に塗布針９の先端９ａが浸漬（収容）されている。

図２３における（ｂ）は、塗布針９の先端９ａが上昇して、先端９ａが塗布液溜り８０ａから基板１１に向かって移動している移動工程を示している。この移動工程においては、塗布針９の先端９ａには塗布液１０が付着しているが、付着している塗布液１０の表面張力により、塗布針９の先端９ａには一定量の塗布液１０が確実に保持されている。なお、この移動工程の最終段階においては、少なくとも塗布対象物に向かう下降動作が含まれる。

図２３における（ｃ）は、塗布針９の先端９ａが塗布対象物である基板１１又は、基板１１上の塗布液１０に接触して、基板１１上に液滴スポットＳを形成する塗布工程を示している。このとき接触塗布される塗布液１０の液滴スポットＳは、塗布針９の先端９ａに付着された塗布液１０の量に対応するものとなる。

図２３における（ｄ）は、塗布針９が基板１１の表面上に塗布液１０を塗布した直後の状態を示しており、塗布針９が基板１１から上昇して、塗布液容器８０の塗布液溜り８０ａに向かっている離反工程を示している。即ち、離反工程は、細胞含有溶液である塗布液１０が接触塗布された後、塗布針９の先端９ａを塗布対象物から離反している状態である。この離反工程の後、塗布針９の先端９ａが塗布液溜り８ａの塗布液１０に浸漬（収容）する付着工程へ移行する。

上記のように、図２３に示す（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ａ）の動作が１サイクルの細胞塗布動作である。第３実施形態においては、細胞塗布動作を所定回数（例えば、１０サイクル）繰り返すことにより、所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。なお、第３実施形態の派生形態として、（ｂ）→（ｃ）の行程において、塗布ユニット６０は上下方向の移動のみであり、塗布液容器８０と基板１１が左右方向に連動して移動して、塗布対象物又は、塗布対象物上の塗布液に接触して、その塗布対象物上に液滴スポットＳを形成する構成とすることもできる。

第３実施形態における細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法おいては、前述の第１実施形態および第２実施形態と同様に、塗布針９の先端９ａに極微量な塗布液１０を付着させて塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液に対して接触塗布させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量の液滴スポットＳを高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布し形成することができる。第３実施形態における微細塗布装置１の細胞塗布動作おいては、塗布針９の先端９ａに付着した極微量な塗布液１０が塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液に高精度に接触塗布できるため、塗布液１０を安定して繰り返し塗布することができる。

（第４実施形態）
第４実施形態の微細塗布装置においては、前述の第２実施形態および第３実施形態で説明した構成と同様に、塗布針が塗布液容器の塗布液溜りを貫通する構成ではなく、塗布針の先端に対して細胞含有溶液である塗布液を付着させる構成である。このように構成された第４実施形態の微細塗布装置においても、塗布針の先端による接触塗布を用いているため、高粘性の細胞含有ゲル化剤が材料であったとしても、塗布針の先端で目詰まりすることがなく、所望の塗布量で形成された細胞チップおよび三次元組織チップを確実に製造することが可能となる。

図２４は、第４実施形態の微細塗布装置における塗布ユニット６１の細胞塗布動作を模式的に示す図である。図２４に示すように、塗布ユニット６１は、細胞含有溶液である塗布液１０を所定量貯留する塗布液溜り８１ａが形成された塗布液容器８１と、塗布液溜り８１ａの塗布液１０を塗布針９の先端９ａに向けて噴射するノズル８２と、塗布液１０が付着した塗布針９を保持する塗布針保持部１３０と、を有する。即ち、第４実施形態の微細塗布装置において、塗布ユニット６１はインクジェット式バイオプリンタで構成されており、ノズル８２からの噴射により塗布針９の先端９ａに細胞含有溶液である塗布液１０を所望量付着させる構成である。

塗布針保持部１３０は、塗布針９を上下方向（鉛直方向）に摺動可能に保持するスライド機構部１６０を備えている。塗布針保持部１３０は、駆動機構部１７０の所定位置において脱着可能に設けられており、例えば駆動機構部１７０に対してマグネットの磁力により脱着可能な構成である。駆動機構部１７０は、装着された塗布針保持部１３０に保持された塗布針９を塗布対象物（例えば、基板１１）の塗布位置に移動して接触塗布させている。

［細胞塗布動作］
図２４に模式的に示した、塗布ユニット６１における細胞塗布動作について説明する。図２４に示した細胞塗布動作においては、細胞含有溶液である塗布液１０がノズル８２により噴射されて、塗布針９の先端９ａに所定量の塗布液１０が付着される（図２４の（ａ）および（ｂ）参照）。塗布液１０が付着した塗布針９の先端９ａが移動して、塗布対象物である基板１１又は、基板１１上の塗布液１０に接触し、基板１１上に液滴スポットＳが形成される図２４の（ｃ）および（ｄ）参照）。この細胞塗布動作が所定回数繰り返されて、塗布液１０の複数回の接触塗布により、基板１１上に所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。

図２４における（ａ）は、細胞塗布動作における付着工程を示している。この付着工程においては、塗布液容器８１の塗布液溜り８１ａに貯留されている細胞含有溶液である塗布液１０がノズル８２から噴射されて塗布針９の先端９ａに付着されている。

図２４における（ｂ）は、塗布針９の先端９ａが塗布対象物（例えば、基板１１）に向かって移動している移動工程を示している。この移動工程においては、塗布針９の先端９ａには塗布液１０が付着しているが、付着している塗布液１０の表面張力により、塗布針９の先端９ａには一定量の塗布液１０が確実に保持されている。

図２４における（ｃ）は、塗布針９の先端９ａが塗布対象物（基板１１）又は、塗布対象物上の塗布液１０に接触して、塗布対象物上に新たな液滴スポットＳを形成する塗布工程を示している。このとき接触塗布される塗布液１０の液滴スポットＳは、塗布針９の先端９ａに付着された塗布液１０の量に対応するものとなる。

図２４における（ｄ）は、塗布針９が塗布対象物（基板１１）の表面上に塗布液１０を塗布した直後の状態を示しており、塗布針９が塗布対象物から上昇して、ノズル８２による噴射領域に向かって移動する離反工程を示している。即ち、離反工程は、細胞含有溶液である塗布液１０が接触塗布された後、塗布針９の先端９ａを塗布対象物から離反している状態である。この離反工程の後、塗布針９の先端９ａに対してノズル８２から塗布液１０が噴射されて、塗布針９の先端９ａに塗布液１０が付着する付着工程へ移行する。

上記のように、図２４に示す（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ａ）の動作が１サイクルの細胞塗布動作である。第４実施形態においては、細胞塗布動作を所定回数（例えば、１０サイクル）繰り返すことにより、所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。

第４実施形態における細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法おいては、前述の第１実施形態から第３実施形態で述べたように、塗布針９の先端９ａに極微量な塗布液１０を付着させて塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液に対して接触塗布させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量の液滴スポットＳを高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布し形成することができる。第４実施形態における微細塗布装置の細胞塗布動作おいては、塗布針９の先端９ａに付着した極微量な塗布液１０を塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液に高精度に接触塗布できるため、塗布液１０を安定して繰り返し塗布することができる。

（第５実施形態）
第５実施形態の微細塗布装置においては、前述の第２実施形態から第４実施形態で説明した構成と同様に、塗布針が塗布液容器の塗布液溜りを貫通する構成ではなく、塗布針の先端に対して細胞含有溶液である塗布液を付着させる構成である。このように構成された第５実施形態の微細塗布装置においても、塗布針の先端による接触塗布を用いているため、高粘性の細胞含有ゲル化剤が材料であったとしても、塗布針の先端で目詰まりすることがなく、所望の塗布量で形成された細胞チップおよび三次元組織チップを確実に製造することが可能となる。

図２５は、第５実施形態の微細塗布装置における塗布ユニット６２の細胞塗布動作を模式的に示す図である。図２５に示すように、塗布ユニット６２は、細胞含有溶液である塗布液１０を所定量貯留する塗布液溜り８３ａが形成された塗布液容器８３と、塗布液溜り８３ａの塗布液１０を塗布針９の先端９ａに付着させるノズル８４と、塗布液１０が付着した塗布針９を保持する塗布針保持部１３０と、を有する。即ち、第５実施形態の微細塗布装置において、塗布ユニット６２は、ディスペンサ式バイオプリンタで構成されており、ノズル８４から塗布液１０を所定量吐出することにより、塗布針９の先端９ａに細胞含有溶液である塗布液１０が所望量付着される構成である。

塗布針保持部１３０は、塗布針９を上下方向（鉛直方向）に摺動可能に保持するスライド機構部１６０を備えている。塗布針保持部１３０は、駆動機構部１７０の所定位置において脱着可能に設けられており、例えば駆動機構部１７０に対してマグネットの磁力により脱着可能な構成である。駆動機構部１７０は、装着された塗布針保持部１３０に保持された塗布針９を塗布対象物（例えば、基板１１）の塗布位置に移動させて接触塗布させる。

［細胞塗布動作］
図２５に模式的に示した、塗布ユニット６２における細胞塗布動作について説明する。図２５に示した細胞塗布動作においては、細胞含有溶液である塗布液１０がノズル８４から吐出して、塗布針９の先端９ａに所定量の塗布液１０が付着される（図２５の（ａ）および（ｂ）参照）。塗布液１０が付着した塗布針９の先端９ａが移動して、塗布対象物である基板１１又は、基板１１上の塗布液１０に接触し、基板１１上に液滴スポットＳが形成される（図２５の（ｃ）および（ｄ）参照）。この細胞塗布動作が所定回数繰り返されて、塗布液１０の複数回の接触塗布により、基板１１上に所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。

図２５における（ａ）は、細胞塗布動作における付着工程を示している。この付着工程においては、塗布液容器８３の塗布液溜り８３ａに貯留されている細胞含有溶液である塗布液１０がノズル８４から所定量が吐出されて塗布針９の先端９ａに付着される。

図２５における（ｂ）は、塗布針９の先端９ａが塗布対象物（例えば、基板１１）に向かって移動している移動工程を示している。この移動工程においては、塗布針９の先端９ａには塗布液１０が付着しているが、付着している塗布液１０の表面張力により、塗布針９の先端９ａには一定量の塗布液１０が確実に保持されている。

図２５における（ｃ）は、塗布針９の先端９ａが塗布対象物又は、塗布対象物上の塗布液１０に接触して、塗布対象物上に新たな液滴スポットＳを形成する塗布工程を示している。このとき接触塗布される塗布液１０の液滴スポットＳは、塗布針９の先端９ａに付着された塗布液１０の量に対応する。

図２５における（ｄ）は、塗布針９が塗布対象物の表面上に塗布液１０を塗布した直後の状態を示しており、塗布針９が塗布対象物から上昇して、ノズル８４の吐出領域に向かって移動する離反工程を示している。即ち、離反工程は、細胞含有溶液である塗布液１０が接触塗布された後、塗布針９の先端９ａを塗布対象物から離反している状態である。この離反工程の後、塗布針９の先端９ａに対してノズル８４から塗布液１０が吐出されて、塗布針９の先端９ａに塗布液１０が付着される付着工程へ移行する。

上記のように、図２５に示す（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ａ）の動作が１サイクルの細胞塗布動作である。第５実施形態においては、細胞塗布動作を所定回数（例えば、１０サイクル）繰り返すことにより、所望の細胞チップまたは三次元組織チップが製造される。

第５実施形態における細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法おいては、前述の第１実施形態から第４実施形態で述べたように、塗布針９の先端９ａに極微量な塗布液１０を付着させて塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液に対して接触塗布させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量の液滴スポットＳを高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布し形成することができる。第５実施形態における微細塗布装置の細胞塗布動作おいては、塗布針９の先端９ａに付着した極微量な塗布液１０を塗布対象物又は塗布対象物上の塗布液に高精度に接触塗布できるため、塗布液１０を安定して繰り返し塗布することができる。

本発明で使用できる細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、線維芽細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、消化管細胞、神経細胞、肝細胞、腎細胞、膵細胞等の各種初代細胞、ｉＰＳ細胞由来の分化細胞、並びに各種がん細胞等が使用できる。細胞としては、タンパク質、糖鎖、核酸、天然高分子、合成高分子等でコーティングされた細胞、例えばフィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、ポリアミノ酸、ペプチド等の既に知られているコーティング剤、コーティング方法でコーティングされた細胞を用いることができる。

なお、細胞含有溶液には、内包した細胞が安定して接着・増殖できる環境を与えるために、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、マトリゲル等の細胞外マトリックス成分、線維芽細胞増殖因子や血小板由来成長因子等の細胞増殖因子、その他、血管内皮細胞やリンパ管内皮細胞、各種幹細胞等の添加剤を含ませてもよい。また、ゲル化剤としてタンパク質、糖鎖、天然高分子、合成高分子、ペプチド等、例えばフィブリノゲン、アルギン酸、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコール、感熱応答性高分子等をふくませてもよい。

前述の実施形態および各実験例を用いて説明したように、本発明は、細胞チップおよび三次元組織チップを製造する新たな製造方法を提供するものである。従来のノズルを用いたプリンタを用いて製造する場合と比較して、塗布針を用いてその先端表面に付着した溶液を塗布する構成であるため、溶液が目詰まりすることがなく、細胞集合体の解像度および形成速度が向上し、より少ないサンプル量（試料）で信頼性の高い細胞チップおよび三次元組織チップを確実に製造することができる。また、従来のプリンタを用いた場合に比較して、高粘度の細胞分散液を対象物に対して塗布して、細胞チップおよび三次元組織チップを製造しているため、塗布後の細胞分散液における蒸発を抑えることができ、高い細胞生存率を維持することができる。

本発明における微細塗布装置においては、先端に極微量な塗布液を付着させた針（塗布針）を対象物（基板等）に接触させることにより、数ｐＬ（ピコリットル）の塗布量となる液滴を高い配置精度、例えば±１５μｍ以下、好ましくは±３μｍ以下の配置精度で塗布することができる。また、塗布液の粘度としては、１×１０^５ｍＰａ・ｓ以下の材料、好ましくは１〜１×１０^４ｍＰａ・ｓの材料の材料を塗布することが可能であり、高粘度の細胞分散液の塗布が可能となる。このように、本発明によれば、高粘度の細胞分散液を対象物（基板等）に対して所定の位置に精密塗布することが可能となり、任意のパターニングを有する細胞チップ、細胞を立体的に造形した三次元組織チップを製造することができる。この結果、製造された細胞チップおよび三次元組織チップは、薬剤の薬効、安全性の評価のスクリーニング等の創薬研究および再生医療の分野において利用できる。

本発明をある程度の詳細さをもって実施形態において説明したが、これらの構成は例示であり、これらの実施形態の開示内容は構成の細部において変化してしかるべきものである。本発明においては、実施形態における要素を他の要素との置換、組合せ、および順序の変更は請求された本発明の範囲及び思想を逸脱することなく実現し得るものである。

本発明に係る細胞チップおよび三次元組織チップ、およびその製造方法は、信頼性の高い様々な細胞チップおよび三次元組織チップを大量に製造することができるため、創薬研究および再生医療を研究する上でも重要な技術であり、産業上の利用可能性が高い発明である。

１ 微細塗布装置
２ 塗布装置本体
３ 表示・制御部
４ ＸＹテーブル
５ Ｚテーブル
６ 塗布ユニット
７ 光学検出部（ＣＣＤカメラ）
８ 塗布液容器
８ａ 塗布液溜り
９ 塗布針
９ａ 先端
９ｂ 突起
１０ 塗布液（細胞含有溶液）
１１ 基板
１２ 本体ベース
１３ 塗布針保持部
１４ａ 上部孔
１４ｂ 下部孔
１５ 細胞
１６ スライド機構部
１７ 駆動機構部
２０ 細胞集合体

Claims (15)

1. 塗布針の先端を細胞含有溶液に浸漬させることにより、細胞含有溶液を塗布針の先端に付着させる付着工程と、
   細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端と塗布対象物とを近接させる移動工程と、
   前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液が前記塗布対象物に接触して、または前記塗布対象物に既に塗布された細胞含有溶液に接触して、前記塗布針の先端に付着された細胞含有溶液を接触塗布する塗布工程と、
   細胞含有溶液が接触塗布された後、前記塗布針の先端と塗布対象物を離反させる離反工程と、を含むことを特徴とする、細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
2. 前記付着工程、前記移動工程、前記塗布工程、および前記離反工程を１サイクルの細胞塗布動作として複数サイクルの細胞塗布動作を繰り返す、請求項１に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
3. 細胞含有溶液を所定量貯留する塗布液溜りを有する塗布液容器と、
   前記細胞含有溶液が貯留された前記塗布液溜りを貫通可能な塗布針と、を含む塗布ユニットを備えた微細塗布装置を用いた細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法であって、
   前記塗布液溜りに充填された前記細胞含有溶液に前記塗布針の先端を浸漬させる待機工程、
   前記塗布針の先端が前記塗布液溜りを貫通して、前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を下降させる下降工程、
   前記細胞含有溶液が付着された前記塗布針の先端を塗布対象物に接触させて、前記細胞含有溶液を前記塗布対象物に塗布して液滴スポットを形成する塗布工程、および
   前記塗布針の先端を上昇させて、前記塗布針の先端を前記塗布液溜りに収容する収容工程、
   を含むことを特徴とする、細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
4. 塗布対象物の一定位置に対して、前記待機工程、前記下降工程、前記塗布工程、および前記収容工程を１サイクルの細胞塗布動作として複数サイクルの細胞塗布動作を繰り返す、請求項３に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
5. 前記１サイクルの細胞塗布動作が０．５秒以下である、請求項２または４に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
6. 前記細胞含有溶液の粘度が、１〜１×１０ ^４ ｍＰａ・ｓの材料により、前記細胞塗布動作が実行される、請求項２、４、５のいずれか一項に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
7. 前記１サイクルの細胞塗布動作による液滴スポットを塗布対象物に対して±１５μｍ以下の配置精度で形成する、請求項２、４、５、６のいずれか一項に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
8. 前記１サイクルの細胞塗布動作による液滴スポットを塗布対象物に対して±３μｍ以下の配置精度で形成する、請求項２、４、５、６のいずれか一項に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
9. 塗布対象物における一定位置に対して、前記塗布工程における前記塗布針の先端の停止位置を１サイクルの細胞塗布動作毎に所定距離だけ上昇させて、複数サイクルの細胞塗布動作を繰り返す、請求項２、４、５、６、７、８のいずれか一項に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
10. 前記塗布ユニットは、前記塗布針を摺動可能に保持するスライド機構部を含む、請求項３または４に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
11. 前記スライド機構部は、前記塗布針の先端が塗布対象物に接触したときの衝撃を吸収する機構を有する、請求項１０に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
12. 前記塗布工程において、前記塗布針の先端が鉛直方向に移動するように構成された、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
13. 前記塗布針の先端は、前記塗布工程の前記塗布針の移動方向に直交する平面を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
14. 前記塗布針の先端は、凹面を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。
15. 前記細胞含有溶液における細胞としては、細胞表面がコーティングされた細胞が用いられる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の細胞チップおよび三次元組織チップの製造方法。

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