JP5688695B2 - 基板、細胞培養装置、細胞チップおよび培養方法 - Google Patents
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Description
〔基板1〕
まず、本発明に係る基板の一実施形態における基本的な構成について説明する。図1は、本発明に係る基板の一実施形態を示す図である。
本実施形態における阻害領域13の変形例について、図3を参照して説明する。図3は、本発明に係る基板の一実施形態における阻害領域の構成の一変形例を示す図である。
次に、本発明に係る基板を製造する方法の一例について説明する。図10(a)〜(f)および図11(a)〜(c)は、本発明の一実施形態における基板を製造する方法について説明するための図である。なお、ここでは、基板の製造方法において、阻害領域13を形成させる工程について説明するが、当該工程によって同時に接着領域12をも形成させることが可能である。
阻害領域13の形成方法1では、図10(a)〜(f)を参照して、10〜20μmの高さの構造物22を備えた阻害領域13を形成する場合について説明する。
阻害領域13の形成方法2では、図11(a)〜(c)を参照して、5μm以下の高さの構造物22を備えた阻害領域13を形成する場合について説明する。
次に、本発明に係る細胞チップの一実施形態について説明する。図4は、本発明に係る細胞チップの一実施形態を示す図である。なお、本実施形態における細胞チップは、上述した基板1の基本的な構成を備えている。したがって、基板1における構成要素と同様の機能を有する構成要素には同一の番号を付して、その詳細な説明を省略する。
図5は、本発明の一実施形態における細胞チップの一変形例を示す図である。図5に示す細胞チップ2bは、それぞれ異なる形状の複数の接着領域12d、12e、12fと、当該接着領域12d、12e、12fが形成されていない領域全体に形成された阻害領域13とを備えている。細胞チップ2bの材料としては、細胞チップ2aと同じものを用いることができる。
図6は、本発明の一実施形態における細胞チップの他の変形例を示す図である。図6に示す細胞チップ2cは、細胞チップ2cに形成された複数の凹み部分のそれぞれに、パターン形成領域14a、14b、14c、14dを備えている。細胞チップ2cの材料としては、細胞チップ2aと同じものを用いることができる。
図7は、本発明の一実施形態における細胞チップの他の変形例を示す図である。図7に示す細胞チップ2dは、丸形状の複数の接着領域12と、当該接着領域12が形成されていない領域全体に形成された阻害領域13とを備えている。細胞チップ2dの材料としては、細胞チップ2aと同じものを用いることができる。
図8は、本発明の一実施形態における細胞チップの他の変形例を示す図である。図8に示す細胞チップ2eは、丸形状の複数の接着領域12と、当該接着領域12が形成されていない領域全体に形成された阻害領域13とを備えている。細胞チップ2eの材料としては、細胞チップ2aと同じものを用いることができる。
次に、本実施形態における細胞チップの製造方法について説明する。図9(a)〜(b)は、本発明の一実施形態における細胞チップを製造する方法について説明するための図である。
次に、本発明に係る細胞培養装置の一実施形態について説明する。図12は、本発明に係る細胞培養装置の一実施形態の構成を示す図である。
本発明に係る培養方法について、上述した基板1を用いる場合を例にして説明する。
以上の構成によって、本実施形態は、以下の効果を有するものである。また、本実施形態が以下の結果を有することは、後述する各実施例の結果からも強く示唆される。
(1)本実施形態に係る基板は、多種類の細胞に対して有効であり、かつ、細胞の接着を充分に排除できる阻害領域を備えている。
(2)本実施形態に係る基板は、阻害領域を備えることによって、接着領域の形、サイズ、および配置を自由に設計することが可能である。
〔基板60〕
次に、本発明に係る基板の他の実施形態について説明する。図13は、本発明に係る基板の他の実施形態を示す図である。
上述した基板1および基板60と同様の構成の基板を作製した。以下、実施形態において説明した部材と同じ機能を有する部材には、同じ部材番号を付すこととし、ここではその詳細な説明を省略する。
各実施例においては、細胞として、ブラックテトラ(Gymnocorymbus ternetzi)の鱗上に存在する移動性細胞であるケラトサイト(fish epidermal keratocyte)を用いた。なお、ケラトサイトは移動性の強い細胞であり、非常に速い速度において直線的に運動することが知られている。また、ケラトサイトは、足場の化学的性質に対して接着選択性が低い細胞であることが知られている。
基板1上のケラトサイトを、反射型顕微鏡(MEIJI)を用いて20倍の対物レンズによって観察した。また、デジタルカメラ(Olympus)を用いて、一定時間間隔にて顕微鏡画像を観察した。そして、ケラトサイトが、接着領域12から阻害領域13との境界に達した後、3分以内に向きを変えて接着領域12内に戻ってきたときには、阻害領域13から排除されたと判断した。また、ケラトサイトが、接着領域12から阻害領域13との境界に達した後、3分以上阻害領域13内に留まっていたときには、阻害領域13から排除されなかったと判断した。その後、阻害領域13の阻害率を算出した。
実施例1においては、表面にSiO2膜を成膜した基板1を用いた。また、本実施例では、構造物22の頂上面22aの辺長aおよび配置間隔bが異なる複数の基板1を作製した。なお、構造物22の高さhは、20μmとした。
また、構造物22の辺長aが5μm、配置間隔bが1μmである阻害領域13を備えた基板1上のケラトサイトについて、一定時間間隔における顕微鏡画像の一部を図15(a)〜(f)に示す。図15(a)〜(f)は、本発明の一実施例における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から0分後、1分30秒後、2分30秒後、3分30秒後、4分30秒後、6分後における顕微鏡画像を表す図である。
実施例2においては、表面にAu膜をコートした基板1を用いた。また、本実施例では、構造物22の頂上面22aの辺長を5μm、配置間隔bを2.5μm、および高さhを20μmとした。
この基板1を用いて、上述した方法によって阻害率を計測した。その結果、実験数6において、阻害率は100%であった。
また、この基板1上のケラトサイトについて、一定時間間隔における顕微鏡画像の一部を図16(a)〜(f)に示す。図16(a)〜(f)は、本発明の他の実施例における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から0分後、2分後、4分後、6分後、8分後、9分30秒後における顕微鏡画像を表す図である。
実施例3においては、表面にSiO2膜を成膜した基板1を用いた。また、本実施例では、構造物22の頂上面22aの辺長aを5μm、配置間隔bを1μm、および高さhを20μmとした。
Fibronectin(BD Bioscience)をPBS(−)(Lonza)に溶解し、50μg/mlのファイブロネクチン溶液を作製した。35mmペトリディッシュに基板1を置いて、50μg/mlのファイブロネクチン溶液を1ml加え、室温にて1時間静置した。その後基板1を超純水にて3回洗浄し、風乾した。
次に、この基板1を用いて、上述した方法によって阻害率を計測した。その結果、実験数13において、阻害率は100%であった。
また、この基板1上のケラトサイトについて、一定時間間隔における顕微鏡画像の一部を図17(a)〜(f)に示す。図17(a)〜(f)は、本発明の他の実施例における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から0分後、1分30秒後、3分後、4分30秒後、6分後、7分30秒後における顕微鏡画像を表す図である。
実施例4においては、表面にSiO2膜を成膜した基板1を用いた。本実施例では、構造物22の頂上面22aの辺長aを5μm、および高さhを20μmとした。また、本実施例では、構造物22の配置間隔bを1μmまたは3μmとした2種類の基板1を用いた。
(1)細胞100の顕微鏡写真を30秒毎に撮影した。
(2)接着領域12と阻害領域13との境界に細胞100が接触する直前の顕微鏡写真の2コマまたは3コマを、2値化した。
(3)2値化した画像から、細胞100の重心を求めた(図18(a))。
(4)最小二乗近似直線を用いて、重心の軌跡をフィットさせた(図18(b))。
(5)最小二乗近似直線と、接着領域12および阻害領域13の境界線とのなす角(0°〜90°)を計算し、進入角とした(図18(c))。
実施例5においては、基板60を用いた。本実施例では、溝63の幅が1.5μm、4μmまたは20μmである基板60を用いた。
また、溝63の幅が1.5μmである基板60上のケラトサイトについて、一定時間間隔における顕微鏡画像の一部を図20(a)〜(h)に示す。図20(a)〜(h)は、本発明の実施例5における基板上のケラトサイトについての、それぞれ観察開始から0分後、2分後、4分後、6分後、8分後、10分後、12分後、14分後における顕微鏡画像を表す図である。
2、2a、2b、2c、2d、2e 細胞チップ
12、12a、12b、12c、12d、12e、12f 接着領域
13、13a、13b 阻害領域
21a 接着面
22 構造物
22a 頂上面
50 細胞培養装置
60 基板
61a 接着面
62 接着領域
63 溝
Claims (11)
- 細胞を接着させるための接着面を有する接着領域と、
上記接着領域に隣接して設けられる、細胞の接着を阻害するための阻害領域とを備えており、
上記阻害領域は、複数の多角柱形状の構造物を備えており、
上記構造物は、上記接着面と略同じ高さの頂上面を有しており、
隣接する2つの上記構造物の間隔は、0.5μm以上1.5μm以下であることを特徴とする基板。 - 複数の上記構造物は、上記接着領域と上記阻害領域との境界に沿って、複数の列において配置されていることを特徴とする請求項1に記載の基板。
- 上記構造物は、四角柱形状であることを特徴とする請求項1または2に記載の基板。
- 上記構造物の頂上面の一辺の長さは、3μm以上20μm以下であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の基板。
- 上記接着領域と上記阻害領域との境界に隣接して設けられた上記構造物の頂上面における少なくとも1つの角は、上記接着領域に対向していることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の基板。
- シリコン、ガラス、シリコーンゴム、プラスチックおよび金属からなる群より選択されるいずれかにより構成されていることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の基板。
- 上記構造物は、リソグラフィー法を用いて形成されたものであることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の基板。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の基板を備えていることを特徴とする細胞培養装置。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の基板を備えており、
上記基板は、上記接着領域を複数備えており、かつ、複数の上記接着領域の各々に細胞が固定されていることを特徴とする細胞チップ。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の基板を用いて細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする培養方法。
- 上記基板は、上記阻害領域に取り囲まれた上記接着領域を複数備えており、
上記培養工程は、複数の上記接着領域の各々において、それぞれ異なる種類の細胞を培養するものであることを特徴とする請求項10に記載の培養方法。
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