JP2017169560A - 三次元培養構造物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞の接着及び伸展に優れ、効率よく製造可能な三次元培養構造物の提供。
【解決手段】細胞と、前記細胞を支持する細胞支持材料と、生体親和性粒子と、を含有する三次元培養構造物である。前記生体親和性粒子が、前記細胞支持材料の少なくとも一部の表面から露出している態様、前記生体親和性粒子が、前記細胞支持材料から突出している態様、前記生体親和性粒子の露出表面積の占有割合が、前記三次元培養構造物表面全体に対して、２０％以上である態様、前記生体親和性粒子が、前記細胞支持材料中に分散している態様などが好ましい。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞培養用の三次元培養構造物及びその製造方法に関する。

近年、細胞培養技術の分野では、基体上に細胞を配し、生体外にて作製した細胞シートを用いて損傷した生体組織の再生を誘導する方法が開発されている。

前記細胞シートは、下限臨界溶解温度を有する温度応答性のポリマーを基体の表面に被覆して、温度を前記ポリマーの下限臨界溶解温度超に昇温させることによりゾル状態のポリマーをゲル状態とし、ゲル状態の前記ポリマー上において、細胞を培養して作製されている。作製された細胞シートは、温度を前記ポリマーの下限臨界溶解温度以下に降温することにより、前記ポリマーをゲル状態からゾル状態に相変化させて、前記基体上の前記ポリマーから剥離することができる。

しかし、前記細胞シートの作製には、前記ポリマー上では、前記細胞の接着及び伸展が進まず、細胞シートを効率よく、かつ大量に得ることができないという問題がある。

そこで、培養細胞と、ゼラチンハイドロゲル粒子から構成される粒子とを含有する細胞集合体が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、生体親和性を有する生体高分子と、機械強度を有する生分解性高分子とからなる多孔性三次元構造体による骨再生移植片が提案されている（例えば、特許文献２参照）。

本発明は、細胞の接着及び伸展に優れ、効率よく製造可能な三次元培養構造物を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための手段としての本発明の三次元培養構造物は、細胞と、前記細胞を支持する細胞支持材料と、生体親和性粒子と、を含有する。

本発明によると、細胞の接着及び伸展に優れ、効率よく製造可能な三次元培養構造物を提供することができる。

図１Ａは、生体親和性粒子の露出表面積の占有割合が１％である原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）の写真を示す。 図１Ｂは、生体親和性粒子の露出表面積の占有割合が１８％である原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）の写真を示す。 図１Ｃは、生体親和性粒子の露出表面積の占有割合が５０％〜５８％である原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）の写真を示す。 図２は、ゼラチン粒子を含む液体の粘度及びゼラチンを含む液体の粘度を示すグラフである。 図３Ａは、本発明で用いられる三次元培養構造物を製造する製造装置の一例を示す概略図である。 図３Ｂは、本発明で用いられる三次元培養構造物を製造する製造装置の他の一例を示す概略図である。 図４は、ゼラチン粒子作製時におけるゼラチン含有量の変化によるゼラチン粒子の粒度分布の変化を示すグラフである。 図５は、乾燥状態のゼラチン粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。 図６は、ゼラチン粒子作製時における架橋剤含有量の変化によるゼラチン粒子の粒度分布の変化を示すグラフである。 図７Ａは、比較例１における２４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図７Ｂは、実施例１における２４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図７Ｃは、実施例２における２４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図７Ｄは、比較例２における２４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図７Ｅは、実施例３における２４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図７Ｆは、実施例４における２４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図８Ａは、比較例１における４８時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図８Ｂは、実施例１における４８時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図８Ｃは、実施例２における４８時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図８Ｄは、比較例２における４８時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図８Ｅは、実施例３における４８時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図８Ｆは、実施例４における４８時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図９Ａは、実施例１の４８時間培養後の細胞の状態を示す写真である。 図９Ｂは、図９Ａにおける実線部の部分拡大写真を示す。 図９Ｃは、図９Ｂにおける実線部の部分拡大写真を示す。 図１０Ａは、実施例５における４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図１０Ｂは、実施例５における２４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図１１Ａは、実施例６における４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図１１Ｂは、実施例６における２４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図１２Ａは、比較例３における４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 １２Ｂは、比較例３における２４時間細胞培養後の細胞の状態を示す写真である。 図１３は、本発明の三次元培養構造物の一例を示す模式図である。 図１４は、本発明の三次元培養構造物における、細胞と細胞支持材料と親和性粒子の配置の一例を示す模式図である。 図１５は、本発明の三次元培養構造物における、細胞と細胞支持材料と親和性粒子の配置の他の一例を示す模式図である。 図１６Ａは、ゼラチン水溶液を得る工程の一例を示す模式図である。 図１６Ｂは、図１６Ａのゼラチン水溶液から白濁液を得る工程の一例を示す模式図である。 図１６Ｃは、図１６Ｂの白濁液から、ゼラチン粒子を得る工程の一例を示す模式図である。 図１６Ｄは、図１６Ｃのゼラチン粒子を精製し、してゼラチン粒子の粉末を得る工程の一例を示す模式図である。 図１７は、細胞支持材料前駆体をゲル化する一例を示す模式図である。

（三次元培養構造物）
本発明の三次元培養構造物は、細胞と、前記細胞を支持する細胞支持材料と、生体親和性粒子と、を含み、更に必要に応じて、その他の成分を含む。図１４、及び図１５は、本発明の三次元培養構造物における、細胞と細胞支持材料と生体親和性粒子の配置の一例を示す模式図である。
図１３に、本発明の三次元培養構造物の一例を示す模式図を示す。図１３に示すように、細胞支持材料３中に、生体親和性粒子２が存在しており、生体親和性粒子２が細胞支持材料３の少なくとも一部の表面から露出しており、細胞１が露出した生体親和性粒子２と接することにより、細胞の接着や伸展をより促進することができる。

＜生体親和性粒子＞
前記生体親和性粒子は、細胞等の生体と接着点を有すれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼラチン粒子、ポリ乳酸粒子、ポリスチレン粒子、シリカ粒子などが挙げられる。
粒子状の前記ゼラチン粒子には、前記三次元培養構造物への細胞の接着性を向上することができ、非粒子状のゼラチンと比較すると、長期間、細胞に分解されることなく三次元培養構造物中に存在することができるため、細胞の接着性を向上させ、さらに、長期にわたって、細胞の栄養源として利用されるという利点がある。また、粒子状のゼラチン粒子は、前記三次元培養構造物の作製時の三次元培養構造物用組成液の粘度を低くすることができ、三次元培養構造物の作製を容易にすることができる。
また、非粒子状のゼラチン等の高分子は、そのままインクジェットで吐出すると皮膜ができやすく、ノズルが詰まりやすいという課題がある。しかし、本発明のように生体親和性材料を粒子状態とすることにより、粒が点在する溶液（インク）を吐出すればよく、ノズル詰まりも防止することができる。さらに、細胞支持材料の中で、粒子形状のゼラチンは分離して点在する。そのため、細胞支持材料とゼラチン粒子とを混ぜることにより細胞支持材料の粘度が上がることも避けることができる。
またさらに、非粒子状のゼラチンは培養温度の領域で脆いため、多層構造の一層に、ゼラチン、又はゼラチン溶液を混ぜた溶液を含む場合、構造体が崩れやすいという課題がある。しかし、ゼラチンを粒子形状にすることにより、培養温度の領域で構造体自体の強度を下げることなく、構造体を形成することができる。すなわち、構造体を上下方向に何層も重ねるような多層構造とするときも、型崩れせずに形成することができる。

前記接着点としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞接着シグナルなどが挙げられる。
前記細胞接着シグナルとしては、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列（ＲＧＤ配列）、セリン−アラニン−セリン配列（ＳＡＳ配列）、ＣＳ１配列、ＣＳ５配列、ＲＥＤＶ配列、ＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、Ｆ−９ペプチド、ＩＫＶＡＶ配列、ＰＤＳＧＲ配列などが挙げられる。
前記接着点における接着とは、細胞が足場となる材料が有する前記配列と結合することを意味する。足場となる材料の構造が前記配列を有する他に、材料がコーティングや化学修飾などの処理により接着点となる配列有する場合を含む。三次元構造物を形成するための細胞の成長、分裂には、細胞と前記配列との接着が必要である。

前記生体親和性粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜、形状等を選択することができる。
前記生体親和性粒子の形状としては、例えば、球状、線状、不定形状などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

前記生体親和性粒子としては、前記細胞支持材料の少なくとも一部の表面から露出していることが好ましく、前記細胞支持材料から突出していることがより好ましい。
前記露出とは、内部に存在する生体親和性粒子が平面視した時に三次元培養構造物の表面に現れることを意味する。
前記露出は、例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により確認することができる。
前記突出は、前記三次元培養構造物の厚み方向の断面を、例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により観察することにより確認することができる。
表面から露出している生体親和性粒子を増やす（占有面積を広げる）方法としては、例えば、溶液（インク）内でのゼラチンの濃度を上げることにより達成することができる。溶液内で生体親和性粒子数が増えれば、おのずと表面から露出する粒子も増え、表面での生体親和性粒子同士の間隔も近くなる。
生体親和性粒子同士の左右方向の間隔としては、少なくとも使用する細胞の１個分の大きさよりも狭い状態が好ましい。この状態では、各細胞に対して少なくとも２個以上の生体親和性粒子が接着するため、細胞が細胞支持材料上を伸展しながら接着させることができる。細胞１１としては、生体親和性粒子１２を介して、細胞支持材料１３に接着していることが好ましい（図１４）。細胞支持材料２３上において、生体親和性粒子２２が細胞２１の周囲に接着していることが好ましい（図１５）。

前記生体親和性粒子の露出表面積の占有割合としては、前記三次元培養構造物表面全体に対して、１％以上有していれば接着が起こる。効率よく伸展を起こすには２０％以上がより好ましく、５０％以上が特に好ましい。図１Ａに前記生体親和性粒子の露出表面積の占有割合が１％、図１Ｂに前記生体親和性粒子の露出表面積の占有割合が１８％、図１Ｃに前記生体親和性粒子の露出表面積の占有割合が５０％〜５８％である原子力間顕微鏡（ＡＦＭ）の写真を示す。
前記占有割合は、例えば、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により得られた画像を、ＩｍａｇｅＪ（ソフトウェア）を用いて解析することにより算出することができる。

また、他の態様として、前記生体親和性粒子は、前記細胞支持材料中に分散していることも好ましい。
前記分散とは、連続的な均一相の物質中に、他の物質が粒子の状態となって散在している現象を意味する。

前記生体親和性粒子のキュムラント径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１μｍ以上１．０μｍ以下が好ましく、０．２５μｍ以上０．７μｍ以下がより好ましく、０．３０μｍ以上０．７０μｍ以下が特に好ましい。なお、前記キュムラント径は、濃厚系粒径アナライザー（商品名：ＦＰＡＲ−１０００、大塚電子株式会社製）を用いて、下記のサンプル液の調製例により得られたサンプル液を用いて、以下の測定条件により測定することができる。なお、前記生体親和性粒子のキュムラント径は、前記生体親和性粒子の膨潤状態における粒径である。また、前記生体親和性粒子の粒度分布は、粒度分布計（商品名：ＵＰＡ１５０、日機装株式会社製）を用いて測定することができる。
−サンプル液の調製例−
純水製造装置（商品名：ＧＳＨ−２０００、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて得られた純水に、生体親和性粒子を濃度０．５質量％で分散させる。測定用の液量は５ｍＬ、分散は２０ｍｍ回転子をスターラーを用いて２００ｒｐｍ、約１日間撹拌することでサンプル液を調製することができる。
−測定条件−
・溶媒：水（屈折率：１．３３１４、２５℃における粘度：０．８８４ｍＰａ・ｓ（ｃＰ）、ＮＤフィルターにより最適光量調製は適宜設定）
・測定プローブ：濃厚用プローブ
・測定ルーチン：測定：２５℃で１８０秒間→測定：２５℃で６００秒間（本体側を３５℃に変更すると次第に液温が２５℃から３５℃になる。その間の粒子径変化をモニタ）→測定：３５℃で１８０秒間

前記生体親和性粒子としては、適宜合成したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記生体親和性粒子がゼラチン粒子である場合、ゼラチン粒子の原料であるゼラチンとしては、例えば、商品名：ＡＰＨ−２５０（新田ゼラチン株式会社製）、ゼラチン（和光純薬）、ゼラチン（ナカライテスク）、メディゼラチン（株式会社ニッピ）などが挙げられる。
前記ポリ乳酸粒子としては、例えば、商品名：ＰＬＡ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（コアフロント株式会社製）などが挙げられる。
前記ポリスチレン粒子としては、例えば、商品名：ｍｉｃｒｏｍｅｒ−ｒｅｄＦ（コアフロント株式会社製）などが挙げられる。
前記シリカ粒子としては、例えば、商品名：ｓｉｃａｓｔａｒ−ｒｅｄＦ（コアフロント株式会社製）などが挙げられる。

前記生体親和性粒子としては、その構造中において架橋剤により架橋されていることが好ましい。生体親和性粒子としてゼラチン粒子を用いる場合は、ゼラチンを架橋剤により架橋することが好ましい。架橋剤により架橋されることにより、生体親和性粒子のキュムラント径を小さくすることができ、生体親和性粒子を含む三次元培養構造物上において、細胞の増殖を促進することができる。

前記架橋剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド；エチレンプロピレンジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジルエーテル；ヘキサメチレンジイソシアネート、α−トリジンイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタン−４，４，４−トリイソシアネート等のイソシアネート；グルコン酸カルシウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アルデヒドが好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。

前記架橋剤の含有量としては、生体親和性粒子がゼラチン粒子である場合は、ゼラチン全量に対して、１質量％以上２０質量％以下が好ましく、２質量％以上１０質量％以下がより好ましい。前記含有量が、１質量％以上２０質量％以下であると、生体親和性粒子のキュムラント径を小さくすることができ、生体親和性粒子を含む三次元培養構造物上において、細胞の増殖を促進することができる。

前記生体親和性粒子の含有量としては、三次元培養構造物全量に対して、０．５質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．５質量％以上５質量％以下がより好ましく、０．５質量％以上２質量％以下が特に好ましい。前記含有量が、０．５質量％以上１０質量％以下であると、三次元培養構造物上に十分細胞を接着し、細胞の増殖を促進することができる。

［生体親和性粒子の作製方法］
前記生体親和性粒子としては、ゼラチン粒子の例として以下のようにして作製することができる。図１６Ａ〜図１６Ｄを参照しながら説明する。
生体親和性粒子としてゼラチンを２質量％となるように水と混ぜて６０℃の湯浴中にて溶解して２質量％ゼラチン水溶液３１を得る（図１６Ａ）。次に、４０℃に加温した２質量％ゼラチン水溶液４０ｍＬを２００ｍＬビーカーに入れて撹拌する。その後、アセトン６０ｇを一気に添加して白濁液３２を得る（コアセルベーション、図１６Ｂ）。
前記白濁液３２に、架橋剤として２４質量％以上２６質量％以下のグルタルアルデヒド水溶液を、例えば、１６０μＬ（ゼラチン全量に対するグルタルアルデヒドの含有量：５質量％）添加して、６０℃の湯浴中で３００ｒｐｍ程度にて撹拌させながら３０分間保持する。次第に白濁液がクリーム色に変化し、ゼラチン粒子３３を形成することができる（図１６Ｃ）。
次に、室温（２５℃）に戻して、アセトン１００ｇを添加し、ゼラチン粒子を凝集沈殿させて沈殿物を得る。
上澄み液の除去とアセトン洗浄とを数回繰り返し、得られた沈殿物から水分と未反応架橋剤とを除去し、必要に応じてろ過を行なう。その後、６０℃ホットプレート上で沈殿物を乾燥して、５０℃ホットプレート上で１時間減圧乾燥してゼラチン粒子（生体親和性粒子）の粉末３４を得ることができる（図１６Ｄ）。

＜細胞支持材料（細胞間距離調整材料）＞
前記細胞間距離調整材料（以下、「細胞支持材料」と称することもある）としては、細胞を支持することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体適合性を有するものが好ましい。
前記細胞支持材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多糖類、両親媒性ゲル、タンパクゲル(例えば、フィブリン糊等)などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、多糖類が好ましい。
前記多糖類としては、例えば、ゲル状多糖類などが好ましい。
前記ゲル状多糖類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルギン酸カルシウム、ジェランガム、アガロース、グァーガム、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、ローカストビーンガム、タマリンドガム、ダイユータンガム、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。これらの中でも、アルギン酸カルシウムが好ましい。
前記アルギン酸カルシウムは、アルギン酸のカルボキシル基にカルシウムイオンが結合した塩であり、カルシウムイオンは２価であるため、２つのカルボキシル基にまたがるかたちで結合（イオン架橋）して増粘することにより、三次元培養構造物を形成することができる。
また、前記細胞支持材料は、所定の領域に細胞を支持（保持）することができるため、細胞間の距離を調整することができる。

前記細胞支持材料の含有量としては、三次元培養構造物全量に対して、１０質量％以上１００質量％未満が好ましい。前記含有量が、１０質量％以上１００質量％未満であると、細胞が接着及び伸展することができる足場としての好適な強度とすることができる。

［三次元培養構造物中の生体親和性粒子及び細胞支持材料の測定方法］
前記三次元培養構造物中の生体親和性粒子及び細胞支持材料の測定方法としては、例えば、ＧＣ−ＭＳ測定により得られるピーク強度から測定する方法；ゲル浸透クロマトグラフ（ＧＰＣ）による分子量分布測定で得られるピーク強度から測定する方法；^１Ｈ ＮＭＲ測定で得られる積分値から測定する方法などが挙げられる。

＜細胞＞
前記細胞は、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。
前記真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞が好ましく、前記細胞が細胞集合体を形成する場合は、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する接着性細胞がより好ましい。

前記接着性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。
前記分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。前記接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、又はそれらを何代か継代させたものでもよい。
前記未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。

前記原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。

前記三次元培養構造物の粘度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２００ｍＰａ・ｓ以上５００ｍＰａ・ｓ以下が好ましく、３００ｍＰａ・ｓ以上４００ｍＰａ・ｓ以下が好ましい。前記粘度が、２００ｍＰａ・ｓ以上５００ｍＰａ・ｓ以下であると、細胞の密着、増殖、及び伸展を向上できる。
なお、前記粘度は、下記条件により測定することができる。
［粘度測定条件］
・計測器 ：ＭＣＲ−３０１（株式会社アントンパール・ジャパン製）
・コーン ：ＣＰ５０−１
・温度 ：２５℃
・せん断速度 ：１２０（１／ｓ）

（三次元培養構造物の製造方法）
本発明の三次元培養構造物の製造方法は、層形成工程と、細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液付与工程と、細胞層形成材料付与工程と、を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
本発明の三次元培養構造物の製造方法は、本発明の三次元培養構造物を好適に製造することができる。

＜層形成工程＞
前記層形成工程は、基体上に、細胞支持材料前駆体水溶液の細胞支持材料前駆体水溶液層を形成する工程である。

−細胞支持材料前駆体水溶液層−
前記細胞支持材料前駆体水溶液層としては、細胞支持材料前駆体水溶液（培養インク）を含み、更に必要に応じてその他の水溶液を含む。
前記細胞支持材料前駆体水溶液（培養インク）としては、生体親和性粒子及び細胞支持材料前駆体を含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。

−−生体親和性粒子−−
前記生体親和性粒子は、本発明の三次元培養構造物における生体親和性粒子と同様のものを用いることができる。

−−細胞支持材料前駆体−−
前記細胞支持材料前駆体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン等の生体由来ポリマー；アルギン酸、ジェランガム等の多糖化合物金属塩；ポリ乳酸等の合成ポリマーなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、多糖化合物金属塩が好ましく、アルギン酸塩がより好ましい。
前記アルギン酸塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アルギン酸ナトリウムが好ましい。

前記細胞支持材料前駆体水溶液層の形成が、前記細胞支持材料前駆体水溶液を前記基体上に飛翔させることにより行われることが好ましい。
前記細胞支持材料前駆体水溶液の前記基体上への飛翔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、インクジェット方式が好ましい。

前記細胞支持材料前駆体水溶液の飛翔の態様としては、例えば、液体流路内の前記インクを加圧する圧力発生手段として圧電素子を用いて液体流路の壁面を形成する振動板を変形させて液体流路内容積を変化させて液体滴を吐出させる、いわゆるピエゾ方式（例えば、特公平２−５１７３４号公報参照）、発熱抵抗体を用いて液体流路内で液体を加熱して気泡を発生させる、いわゆるサーマル方式（例えば、特公昭６１−５９９１１号公報参照）、インク流路の壁面を形成する振動板と電極とを対向配置し、前記振動板と前記電極との間に発生させる静電力によって前記振動板を変形させることで、液体流路内容積を変化させて液体滴を吐出させる静電方式（例えば、特開平６−７１８８２号公報参照）などが挙げられる。

前記飛翔させる前記細胞支持材料前駆体水溶液の液滴は、その大きさとしては、例えば、３ｐＬ以上４０ｐＬ以下が好ましく、その吐出噴射の速さとしては、５ｍ／ｓ以上２０ｍ／ｓ以下が好ましく、その駆動周波数としては、１ｋＨｚ以上が好ましい。

前記細胞支持材料前駆体水溶液の粘度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｍＰａ・ｓ以下が好ましく、１５ｍＰａ・ｓ以下が好ましい。前記粘度が、２０ｍＰａ・ｓ以下であると、基体への液体層の形成が容易になり、また、インクジェット方式を用いる場合は、吐出安定性を向上することができる。
前記細胞支持材料前駆体水溶液の粘度としては、生体親和性材料を粒子状とした生体親和性粒子とすることにより、インクジェット方式に適した粘度にすることができる。図２は、生体親和性粒子であるゼラチン粒子を含む液体、及び生体親和性材料であるゼラチンを含む液体の粘度を示すグラフである。図２に示すように、１質量％未処理ゼラチン及び１質量％アルギン酸ナトリウムを含む液体の粘度と比較して、１質量％粒子化ゼラチン及び１質量％アルギン酸ナトリウムを含む液体の粘度は低くなり、インクジェット方式に適した粘度になっていることが分かる。

また、前記未処理ゼラチンは、アルギン酸ナトリウムと混合し、その後、ゲル化した場合に、細胞培養温度において、未処理ゼラチンが溶解し、流出してしまうため細胞支持強度が維持されず、崩壊してしまうことから細胞の培養に用いることはできない。一方、粒子化したゼラチンは、温度による形態変化がないため、細胞支持強度を維持することができ、細胞の培養中に崩壊することがなく、好適に細胞を培養することができる。

前記細胞支持材料前駆体水溶液層の平均厚みとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３μｍ以上２００μｍ以下が好ましく、１０μｍ以上１００μｍ以下がより好ましい。前記平均厚みが、３μｍ以上２００μｍ以下であると、細胞の増殖を好適に促進することができる。なお、前記平均厚みは、公知の方法に従って測定することができる。

前記生体親和性粒子の体積平均粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１μｍ以上５μｍ以下が好ましく、０．１μｍ以上３μｍ以下がより好ましい。前記体積平均粒径が、０．１μｍ以上５μｍ以下であると、粘度を下げることができ、インクジェット方式による吐出に好適な粘度とすることができる。前記体積平均粒径は、前記生体親和性粒子のキュムラント径と同様にして測定することができる。

−基体−
前記基体としては、細胞の活性や増殖を阻害しないものであれば、その大きさ、形状、構造、材質等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサート等の立体形状；平膜状などが挙げられる。
前記構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多孔質構造、メッシュ構造、凹凸構造、ハニカム構造などが挙げられる。
前記基体の材質としては、例えば、有機材料、無機材料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記有機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、セルロースなどが挙げられる。
前記無機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。

＜細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液付与工程＞
前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液付与工程は、前記細胞支持材料前駆体水溶液層上に、前記細胞支持材料前駆体水溶液と接触すると前記細胞支持材料前駆体をゲル化させる細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液を付与する工程である。
前記細胞支持材料前駆体水溶液層に、細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液を付与することにより、細胞支持材料前駆体水溶液中の細胞支持材料前駆体と、細胞支持材料前駆体ゲル化ポリマーとが反応して、イオン架橋して増粘することにより、三次元培養構造物を形成することができる。

−細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液−
前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液としては、前記細胞支持材料前駆体水溶液と接触すると前記細胞支持材料前駆体をゲル化させる細胞支持材料前駆体ゲル化ポリマーを含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、塩化カルシウム水溶液、キトサン水溶液、キチン水溶液が好ましい。

−−細胞支持材料前駆体ゲル化ポリマー−−
前記細胞支持材料前駆体ゲル化ポリマーとしては、前記細胞支持材料前駆体水溶液と接触すると前記細胞支持材料前駆体をゲル化できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多糖類、多価金属塩、フィブリノーゲン、トロンビン、フィブロネクチン、ラミニン、リコンビナントペプチド、キトサン、キチンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、多価金属塩、キトサン、キチンが好ましく、塩化カルシウム、キトサン、キチンがより好ましく、塩化カルシウムが特に好ましい。

前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液付与工程における細胞支持材料前駆体水溶液層上への細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液の付与としては、前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液を前記細胞支持材料前駆体水溶液層上に飛翔させることにより行われることが好ましい。
前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液の前記細胞支持材料前駆体水溶液層上への飛翔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、インクジェット方式が好ましい。
前記インクジェット方式としては、層形成工程におけるインクジェット方式と同様のものを用いることができる。
図１７に、細胞支持材料前駆体をゲル化する一例を示す模式図である。図１７に示すように、生体親和性粒子４２を含む細胞支持材料前駆体４１に、塩化カルシウム等由来のカルシウムイオンなどの細胞支持材料前駆体ゲル化ポリマーを付与することにより、生体親和性粒子４２を含む細胞支持材料４３を形成することができる。

＜細胞層形成材料付与工程＞
前記細胞層形成材料付与工程は、前記層形成工程と、前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液付与工程と、により形成される三次元培養構造物上に細胞を含む細胞層形成材料を付与する工程である。
前記細胞としては、三次元培養構造物における細胞と同様のものを用いることができる。

−細胞層形成材料の付与方法−
前記細胞層形成材料の付与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、インクジェット法、ディスペンサー法、ピペット法、アスピレータ法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、一細胞レベルで精密かつ複雑な細胞配置できる点から、インクジェット法が好ましい。

前記インクジェット法は、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。なお、前記インクジェット法を実施するには公知のインクジェット吐出装置を、細胞層形成材料付与手段として好適に使用することができる。

前記遊離状態における細胞の体積平均粒径としては、１００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下が特に好ましい。前記体積平均粒径が、１００μｍ以下であれば、インクジェット法に好適に用いることができる。

なお、前記細胞の体積平均粒径としては、下記の測定方法で測定することができる。
インキュベーター（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ_２環境）内において、１質量％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｄ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００×）、和光純薬工業株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬工業株式会社製、以下、「Ｄ−ＭＥＭ」とも称することがある）で細胞を培養後、アスピレータ（商品名：ＶＡＣＵＳＩＰ、ＩＮＴＥＧＲＡ社製）を用いて、１００ｍｍディッシュ内の１０質量％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」とも称することがある）、及び前記培地を除去する。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（和光純薬工業株式会社製、以下、「ＰＢＳ（−）」とも称することがある）を３ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（−）を吸引除去し、表面を洗浄する。ＰＢＳ（−）による洗浄作業を３回繰り返した後、０．１質量％トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ， ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、和光純薬工業株式会社製）を３ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離する。位相差顕微鏡で細胞の剥離を確認後、１０質量％ＦＢＳ、１質量％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを４ｍＬ加え、トリプシンを失活させる。遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０^３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５ｍｉｎ、５℃）を行い、アスピレータで上清を除去する。除去後、遠沈管に１０質量％ＦＢＳ、１質量％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させる。その細胞層形成材料から１０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、０．４質量％トリパンブルー染色液１０μＬを加えてピペッティングを行って細胞を染色する。染色した細胞層形成材料から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。なお、細胞数、細胞生存率も同様の測定方法により求めることができる。前記細胞は、遊離状態であると、略球状の形状をとるため、体積平均粒径を測定することができる。

前記細胞層形成材料中の細胞数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５×１０^５個／ｍＬ以上５×１０^８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０^５個／ｍＬ以上５×１０^７個／ｍＬ以下がより好ましい。前記細胞数が、５×１０^５個／ｍＬ以上５×１０^８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができ、細胞の精密配置に好適である。前記細胞数としては、前記体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。

ここで、図３Ａは、本発明で用いられる三次元培養構造物を製造する製造装置の一例を示す概略図である。図３Ｂは、本発明で用いられる三次元培養構造物を製造する製造装置の他の一例を示す概略図である。図３Ａ及び図３Ｂの三次元培養構造物の製造装置は、インクジェットヘッド５２、５３を配列したヘッドユニットを用いて、インクジェットヘッド５２から細胞支持材料前駆体水溶液を基体５１上に吐出して細胞支持材料前駆体水溶液層を形成する。その後、前記細胞支持材料前駆体水溶液層上に、インクジェットヘッド５３から細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液を吐出して、前記細胞支持材料前駆体水溶液層中の細胞支持材料前駆体水溶液と接触させて細胞支持材料を形成するものである。その後、形成された細胞支持材料上に、細胞層形成材料を吐出して、細胞層を形成することも可能である。このとき、前記細胞層形成材料は、前記細胞支持材料前駆体水溶液、又は前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液に含有させて吐出してもよく、前記インクジェットヘッド５２、５３とは異なるインクジェットヘッドから吐出してもよい。また、前記細胞支持材料及び細胞層の形成を繰り返すことにより、本発明の三次元培養構造物を製造することも可能である。

以下に、本発明の実施例及び比較例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、ゼラチン粒子のキュムラント径及び粒度分布、並びに細胞支持材料前駆体水溶液の粘度、生体親和性粒子の露出表面積の占有割合、及び生体親和性粒子の細胞支持材料表面への突出の有無は、以下のようにして測定した。

＜ゼラチン粒子のキュムラント径＞
前記ゼラチン粒子のキュムラント径は、濃厚系粒径アナライザー（商品名：ＦＰＡＲ−１０００、大塚電子株式会社製）を用いて、下記のサンプル液の調製例により得られたサンプル液を用いて、以下の測定条件により測定した。
−サンプル液の調製例−
純水製造装置（商品名：ＧＳＨ−２０００、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて得られた純水に、生体親和性粒子を濃度０．５質量％で分散させた。測定用の液量は５ｍＬ、分散は２０ｍｍ回転子をスターラーを用いて２００ｒｐｍ、約１日間撹拌することでサンプル液を調製した。
−測定条件−
・溶媒：水（屈折率：１．３３１４、２５℃における粘度：０．８８４ｍＰａ・ｓ（ｃＰ）、ＮＤフィルターにより最適光量調製は適宜設定）
・測定プローブ：濃厚用プローブ
・測定ルーチン：測定：２５℃で１８０秒間→測定：２５℃で６００秒間（本体側を３５℃に変更すると次第に液温が２５℃から３５℃になる。その間の粒子径変化をモニタ）→測定：３５℃で１８０秒間

＜ゼラチン粒子の粒度分布＞
前記ゼラチン粒子の粒度分布は、粒度分布計（商品名：ＵＰＡ１５０、日機装株式会社製）を用いて測定した。

＜細胞支持材料前駆体水溶液の粘度＞
前記細胞支持材料前駆体水溶液の粘度は、下記の条件により測定した。
［粘度測定条件］
・計測器 ：ＭＣＲ−３０１（株式会社アントンパール・ジャパン製）
・コーン ：ＣＰ５０−１
・温度 ：２５℃
・せん断速度 ：１２０（１／ｓ）

＜生体親和性粒子の露出表面積の占有割合＞
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により得られた画像を、ＩｍａｇｅＪ（ソフトウェア）を用いて解析することにより算出した。

＜生体親和性粒子の細胞支持材料表面への突出の有無＞
前記生体親和性粒子の細胞支持材料表面への突出の有無は、前記三次元培養構造物の厚み方向の断面を、走査型電子顕微鏡により観察することにより確認した。

（生体親和性粒子水溶液の作製例１）
＜ゼラチン粒子水溶液Ａの作製＞
生体親和性粒子の原料としてゼラチン（商品名：ＡＰＨ−２５０、新田ゼラチン株式会社製）０．５ｇを水４９．５ｍＬに混ぜて、６０℃の湯浴中にて溶解し、１質量％ゼラチン水溶液を得た。４０℃に加温した１質量％ゼラチン水溶液４０ｍＬを２００ｍＬビーカーに入れて撹拌した。その後、アセトン６０ｇを一気に添加して白濁液を得た（コアセルベーション）。
前記白濁液に、架橋剤として２４質量％以上２６質量％以下のグルタルアルデヒド水溶液（東京化成工業株式会社製）をゼラチン全量に対する架橋剤が５質量％となるように添加して、６０℃の湯浴中で３００ｒｐｍ程度にて撹拌させながら３０分間保持した。次第に白濁液がクリーム色に変化し、１．０質量％ゼラチン粒子水溶液Ａ（ゼラチンに対する架橋剤濃度：５質量％）を得た。得られた１．０質量％ゼラチン粒子水溶液Ａのゼラチン粒子のキュムラント径を下記表１に示し、ゼラチン粒子の粒度分布を図４に示す。

（生体親和性粒子水溶液の作製例２）
＜ゼラチン粒子水溶液Ｂの作製＞
生体親和性粒子水溶液の作製例１において、ゼラチンの量を０．５ｇから１ｇに変更し、水の量を４９．５ｍＬから４９ｍＬに変更した以外は、生体親和性粒子水溶液の作製例１と同様にして、２．０質量％ゼラチン粒子水溶液Ｂ（ゼラチンに対する架橋剤濃度：５質量％、架橋剤量：１６０μＬ）を得た。得られた２．０質量％ゼラチン粒子水溶液Ｂのゼラチン粒子のキュムラント径を下記表１に示し、ゼラチン粒子の粒度分布を図４に示す。
次に、得られた２．０質量％ゼラチン粒子水溶液Ｂを室温（２５℃）に戻して、アセトン１００ｇを添加し、ゼラチン粒子を凝集沈殿させて沈殿物を得た。上澄み液の除去とアセトン洗浄とを数回繰り返し、得られた沈殿物から水分と未反応架橋剤とを除去した。その後、６０℃ホットプレート上で沈殿物を乾燥して、５０℃ホットプレート上で１時間減圧乾燥してゼラチン粒子の粉末を得た（収率：７０％）。走査型電子顕微鏡（装置名：Ｍ−ＳＥＭ、日本電子株式会社製）を用いて、ゼラチン粒子の粉末（乾燥状態のゼラチン粒子）のＳＥＭ像を観察した。結果を図５に示す。
図５の結果から、ゼラチン粒子の形状は、球状であり、ゼラチン粒子のキュムラント径は、ほとんどが０．１μｍ以上０．５μｍ以下であるが、１μｍ以上の粗大粒子の存在も確認できた。また、図４から膨潤状態のゼラチン粒子のキュムラント径は、０．２μｍ以上１μｍ以下であって、乾燥状態のゼラチン粒子と比較して、キュムラント径が２倍大きくなっていることが分かる。

（生体親和性粒子水溶液の作製例３）
＜ゼラチン粒子水溶液Ｃの作製＞
生体親和性粒子水溶液の作製例１においてゼラチンの量を０．５ｇから１．５ｇに変更し、水の量を４９．５ｍＬから４８．５ｍＬに変更した以外は、生体親和性粒子水溶液の作製例１と同様にして、３．０質量％ゼラチン粒子水溶液Ｃ（ゼラチンに対する架橋剤濃度：５質量％）を得た。得られた３．０質量％ゼラチン粒子水溶液Ｃのゼラチン粒子のキュムラント径を下記表１に示し、ゼラチン粒子の粒度分布を図４に示す。

（生体親和性粒子水溶液の作製例４）
＜ゼラチン粒子水溶液Ｄの作製＞
生体親和性粒子水溶液の作製例１においてゼラチンの量を０．５ｇから２ｇに変更し、水の量を４９．５ｍＬから４８ｍＬに変更した以外は、生体親和性粒子水溶液の作製例１と同様にして、４．０質量％ゼラチン粒子水溶液Ｄ（ゼラチンに対する架橋剤濃度：５質量％）を調製したところ、ゼラチンは粒子化せず塊状となった。なお、前記ゼラチンが粒子化していないため、ゼラチン粒子のキュムラント径及び粒度分布は測定することができなかった。

（生体親和性粒子水溶液の作製例５）
＜ゼラチン粒子水溶液Ｅの作製＞
生体親和性粒子水溶液の作製例１において、ゼラチンの量を０．５ｇから２．５ｇに変更し、水の量を４９．５ｍＬから４７．５ｍＬに変更した以外は、生体親和性粒子水溶液の作製例１と同様にして、５．０質量％ゼラチン粒子水溶液Ｅ（ゼラチンに対する架橋剤濃度：５質量％）を調製したところ、ゼラチンは粒子化せず塊状となった。なお、前記ゼラチンが粒子化していないため、ゼラチン粒子のキュムラント径及び粒度分布は測定することができなかった。

前記表１の結果から、ゼラチン濃度が低いほど、ゼラチン粒子のキュムラント径を小さくすることができ、ゼラチン濃度が高いほど、粗大粒子ができやすいことが分かる。また、ゼラチン濃度が、４質量％以上であると、ゼラチン成分が粒子化せず塊状となることから、収量を確保する点から、ゼラチン濃度は、１質量％以上２質量％以下が好ましいことが分かる。

（生体親和性粒子水溶液の作製例６）
＜ゼラチン粒子水溶液Ｆの作製＞
生体親和性粒子水溶液の作製例２において、グルタルアルデヒド水溶液の量１６０μＬ（ゼラチン全量に対する架橋剤：５質量％）を８０μＬ（ゼラチン全量に対する架橋剤：２．５質量％）に変更した以外は、生体親和性粒子水溶液の作製例２と同様にして、ゼラチン粒子水溶液Ｆを得た。得られた２質量％ゼラチン粒子水溶液Ｆのゼラチン粒子のキュムラント径を下記表２に示し、ゼラチン粒子の粒度分布を図６に示す。

（生体親和性粒子水溶液の作製例７）
＜ゼラチン粒子水溶液Ｇの作製＞
生体親和性粒子水溶液の作製例２において、グルタルアルデヒド水溶液の量１６０μＬ（ゼラチン全量に対する架橋剤：５質量％）を２４０μＬ（ゼラチン全量に対する架橋剤：７．５質量％）に変更した以外は、生体親和性粒子水溶液の作製例２と同様にして、ゼラチン粒子水溶液Ｇを得た。得られた２質量％ゼラチン粒子水溶液Ｇのゼラチン粒子のキュムラント径を下記表２に示し、ゼラチン粒子の粒度分布を図６に示す。

（生体親和性粒子水溶液の作製例８）
＜ゼラチン粒子水溶液Ｈの作製＞
生体親和性粒子水溶液の作製例２において、グルタルアルデヒド水溶液の量１６０μＬ（ゼラチン全量に対する架橋剤：５質量％）を３２０μＬ（ゼラチン全量に対する架橋剤：１０．０質量％）に変更した以外は、生体親和性粒子水溶液の作製例２と同様にして、ゼラチン粒子水溶液Ｈを得た。得られた２質量％ゼラチン粒子水溶液Ｈのゼラチン粒子のキュムラント径を下記表２に示し、ゼラチン粒子の粒度分布を図６に示す。

前記表２の結果から、架橋剤濃度が高いほど、ゼラチン粒子のキュムラント径が小さくなることが分かる。これは、架橋剤濃度により、ゼラチン粒子の膨潤率が異なるため、ゼラチン粒子のキュムラント径に違いが現れたためであると推測される。
また、図６の結果から、架橋剤濃度が高いほど、粒度分布も狭くなっていることが分かる。これは、不均一な膨潤が起きにくいためであると推測される。

（実施例１）
＜三次元培養構造物の作製＞
アルギン酸ナトリウム（商品名：ＳＫＡＴ−ＯＮＥ、株式会社キミカ製）０．０２ｇを水１０ｍＬに溶解して２質量％アルギン酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを調製し、ゼラチン粒子水溶液Ｆ（ゼラチン濃度：２質量％、架橋剤濃度：２．５質量％）１０ｍＬを添加（体積比（２質量％アルギン酸ナトリウム水溶液：ゼラチン粒子水溶液Ｆ）が１：１）してベンコット（商品名：ベンコットＭ−１、旭化成株式会社製）を敷いた６ｗｅｌｌプレート（商品名：Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ、コーニング社製）に、ピペットを用いて、３ｍＬずつ加えて、一晩６０℃で乾燥させた。乾燥後、１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）塩化カルシウム水溶液３ｍＬを前記６ｗｅｌｌプレートに加えて３０分間以上静置し、アルギン酸カルシウム（細胞支持材料）が形成され、ゼラチン粒子（生体親和性粒子）を含む三次元培養構造物を得た。
得られた三次元培養構造物を、イオン交換水にて３回洗浄した。次いで７０質量％エタノール水溶液にて３回以上洗浄した。
アルギン酸ナトリウムと塩化カルシウムとの反応により作製された薄膜を安定化させるために、３７℃、５体積％ＣＯ_２条件にて、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ：和光純薬工業株式会社製）に７２時間浸漬させた。なお、培地は、２４時間毎に交換した。

−細胞層形成材料の調製−
継代数１０以上２０以下のＮＨＤＦ（ヒト皮膚繊維芽細胞、ロンザジャパン株式会社製）をＤ−ＭＥＭ（和光純薬工業株式会社製）を用いて、ポリスチレンディッシュ上にて、３７℃、５体積％ＣＯ_２条件下で７２時間培養した。その後、０．０５質量％トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ， ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、和光純薬工業株式会社製）と０．０２質量％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、和光純薬工業株式会社製）とを含み、かつカルシウム及びマグネシウムを含有しないＰＢＳを用いて、細胞を、３７℃にて５分間トリプシン処理を行ないポリスチレンディッシュから剥がした。トリプシン処理後、１０質量％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭを加えて酵素反応を停止させて、細胞含有溶液を得た。得られた細胞含有溶液２３４ｇを５℃にて５分間遠心分離処理して、上澄みを取り除いた後に１０質量％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭに懸濁させ、細胞層形成材料を得た。

−細胞培養−
７２時間Ｄ−ＭＥＭ培地に浸漬させた三次元培養構造物上に、細胞層形成材料を、細胞数が４，０００個／ｃｍ^２となるように付与した。その後、３７℃、５体積％ＣＯ_２条件下で４８時間培養した。なお、培地は、培養開始から２４時間後に一度交換した。

（細胞の接着及び伸展）
前記細胞培養において、培養開始から２４時間後及び４８時間後に位相差顕微鏡を用いて、細胞の接着及び伸展を確認した。結果を図７Ｂ（２４時間後）及び図８Ｂ（４８時間後）に示す。

前記位相差顕微鏡により取得した蛍光画像からＩｍａｇｅＪ（ソフトウェア）を用いて細胞数をカウントし、画像６枚の平均から細胞数を算出した。また、伸展している細胞数もカウントすることで伸展率を求めた。伸展率の結果を下記表３に示す。
また、前記蛍光画像を観察した結果を図９Ａ〜図９Ｃに示す。図９Ａは、実施例１の４８時間培養後の細胞の状態を示す写真である。図９Ａ中、破線部は伸展している細胞を表す。図９Ｂは、図９Ａにおける実線部の部分拡大写真を示す。図９Ｃは、図９Ｂにおける実線部の部分拡大写真を示す。図９Ｃから、細胞の仮足が、ゼラチン粒子密集部を這うようにして伸展していることが分かる。

（実施例２）
実施例１において、ゼラチン粒子水溶液Ｆ（ゼラチン濃度：２質量％、架橋剤濃度：２．５質量％）１０ｍＬをゼラチン粒子水溶液Ｇ（ゼラチン濃度：２質量％、架橋剤濃度：７．５質量％）１０ｍＬに変更した以外は、実施例１と同様にして、細胞の接着及び伸展を確認した。結果を下記表３、図７Ｃ（２４時間後）、及び図８Ｃ（４８時間後）に示す。

（比較例１）
実施例１において、ゼラチン粒子水溶液Ｆ（ゼラチン濃度：２質量％、架橋剤濃度：２．５質量％）１０ｍＬを使用しなかった以外は、実施例１と同様にして、細胞の接着及び伸展を確認した。結果を下記表３、図７Ａ（２４時間後）、及び図８Ａ（４８時間後）に示す。また、実施例１と同様にして、細胞の伸展率を求めた。結果を下記表３に示す。

（実施例３）
実施例１において、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム水溶液３ｍＬを、５００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）塩化カルシウム水溶液３ｍＬに変更した以外は、実施例１と同様にして、細胞の接着及び伸展を確認した。結果を下記表３、図７Ｅ（２４時間後）、及び図８Ｅ（４８時間後）に示す。また、実施例１と同様にして、細胞の伸展率を求めた。結果を下記表３に示す。

（実施例４）
実施例２において、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム水溶液３ｍＬを、５００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）塩化カルシウム水溶液３ｍＬに変更した以外は、実施例２と同様にして、細胞の接着及び伸展を確認した。結果を下記表３、図７Ｆ（２４時間後）、及び図８Ｆ（４８時間後）に示す。また、実施例１と同様にして、細胞の伸展率を求めた。結果を下記表３に示す。

（比較例２）
実施例３において、ゼラチン粒子水溶液Ｆ（ゼラチン濃度：２質量％、架橋剤濃度：２．５質量％）１０ｍＬを使用しなかった以外は、実施例３と同様にして、細胞の接着及び伸展を確認した。結果を下記表３、図７Ｄ（２４時間後）、及び図８Ｄ（４８時間後）に示す。また、実施例１と同様にして、細胞の伸展率を求めた。結果を下記表３に示す。

図７Ａ〜図７Ｆ及び図８Ａ〜図８Ｆの結果から、生体親和性粒子であるゼラチン粒子、及び細胞支持材料であるアルギン酸カルシウムを含む三次元培養構造物は、前記三次元培養構造物上で培養される細胞の接着及び伸展が促進されることから、細胞の培養に好適に用いることができることが分かる。

なお、ゲル浸透クロマトグラフ（ＧＰＣ）を用いて、実施例１〜４の三次元培養構造物を測定したところ、ゼラチン粒子及びアルギン酸カルシウムが含まれていることが確認できた。

（実施例５）
＜三次元培養構造物の作製＞
アルギン酸ナトリウム（商品名：ＳＫＡＴ−ＯＮＥ、株式会社キミカ製）０．０１ｇを水１０ｍＬに溶解して１質量％アルギン酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを調製し、ゼラチン粒子水溶液Ｆ（ゼラチン濃度：２質量％、架橋剤濃度：２．５質量％）をゼラチン濃度１％に希釈したゼラチン粒子水溶液Ｆ希釈液を１０ｍＬを添加（体積比（１質量％アルギン酸ナトリウム水溶液：ゼラチン粒子水溶液Ｆ１％）が１：１）し、混合液Ａを得た。次に、６ｗｅｌｌプレート（商品名：Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ、コーニング社製）に、産業用インクジェットヘッドＧＥＮ４（リコーインダストリー株式会社製）を用いて、得られた混合液Ａを一辺８ｍｍ、平均厚さが３０μｍの層を形成するように印字後、１００ｍＭ塩化カルシウムを平均厚さが１０μｍとなるように混合液Ａの上に重ねて印字し、構造物を形成した。その後、得られた構造物に無血清ダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で１回洗い、三次元培養構造物を得た。

−細胞の染色−
冷凍保存された緑色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を室温まで解凍し、１０ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」とも称することがある）へ溶解させ、無血清ダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と混合し、濃度が１０μＭの緑色蛍光染料含有無血清培地を調製した。次に、実施例１において調製した細胞層形成材料に調製した緑色蛍光染料含有無血清培地をディッシュ１枚あたり５ｍＬ添加し、インキュベータ内で３０分間染色し、緑色蛍光染料で染色された細胞を含む細胞層形成材料を得た。

−細胞培養−
得られた三次元培養構造物上に、緑色蛍光染料で染色された細胞を含む細胞層形成材料を、細胞数が４，０００個／ｃｍ^２となるように付与した。その後、３７℃、５体積％ＣＯ_２条件下で４８時間培養した。なお、培地（無血清ダルベッコ変法イーグル培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）は、培養開始から２４時間後に一度交換した。

（細胞の接着及び伸展）
前記細胞培養において、培養開始から４時間後及び２４時間後に位相差顕微鏡を用いて、細胞の接着及び伸展を確認した。結果を図１０Ａ（４時間後）及び図１０Ｂ（２４時間後）に示す。伸展率は、４時間後が５０％、２４時間後が９０％であった。結果を下記表４に示す。

（実施例６）
実施例５において、混合液Ａを、アルギン酸ナトリウム（商品名：ＳＫＡＴ−ＯＮＥ、株式会社キミカ製）０．００５ｇを水１０ｍＬに溶解して０．５質量％アルギン酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを調製し、ゼラチン粒子水溶液Ｂ（ゼラチン濃度：２質量％、架橋剤濃度：５質量％）をゼラチン濃度０．５質量％に希釈したゼラチン粒子水溶液Ｂ希釈液を１０ｍＬを添加（体積比（０．５質量％アルギン酸ナトリウム水溶液：ゼラチン粒子水溶液Ｂ０．５％）が１：１）して得た混合液Ｂに変更した以外は、実施例５と同様にして、三次元培養構造物を得た。
次に、実施例５と同様にして、細胞培養し、実施例５と同様にして、細胞の接着及び伸展を確認した。結果を図１１Ａ（４時間後）及び図１１Ｂ（２４時間後）に示す。伸展率は、４時間後が６０％、２４時間後が９８％であった。結果を下記表４に示す。

（比較例３）
実施例６において、ゼラチン粒子水溶液Ｂを添加しなかった以外は、実施例６と同様にして、三次元培養構造物を得た。
次に、実施例６と同様にして、細胞培養し、実施例６と同様にして、細胞の接着及び伸展を確認した。結果を図１２Ａ（４時間後）及び図１２Ｂ（２４時間後）に示す。伸展率は、４時間後が０％、２４時間後が０％であった。結果を下記表４に示す。

（比較例４）
実施例５において、ゼラチン粒子水溶液Ｆを粒子化しないゼラチン水溶液（ゼラチン濃度：１質量％）に変更した以外は、実施例５と同様にして、三次元培養構造物の作製を試みたが、安定して吐出ができなかった。そこで、手技でアルギン酸ゼラチン混合液をｗｅｌｌに塗布した。次に、実施例５と同様にして、１００ｍＭ塩化カルシウムを平均厚さが１０μｍとなるように混合液の上に重ねて印字し、三次元培養構造物を得た。
次に、実施例５と同様にして、細胞培養したところ、三次元構造物は崩壊してしまった。

（実施例７）
アルギン酸ナトリウム（商品名：ＳＫＡＴ−ＯＮＥ、株式会社キミカ製）０．０２ｇを水１０ｍＬに溶解して２質量％アルギン酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを調製し、ポリ乳酸粒子溶液（ポリ乳酸濃度：２質量％ＰＬＡ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ２５０ｎｍ、コアフロント株式会社製）１０ｍＬを添加（体積比（アルギン酸ナトリウム水溶液１質量％：ポリ乳酸粒子溶液１質量％溶液）が１：１）し、混合液Ｃを得た。
次に、実施例５において、混合液Ａを混合液Ｃに変更した以外は、実施例５と同様にして、三次元培養構造物を得た。
次に、実施例５と同様にして、細胞培養し、実施例５と同様にして、伸展率を測定した。前記伸展率は、４時間後が１０％、２４時間後が５０％であった。結果を下記表５に示す。

（実施例８）
実施例７において、ポリ乳酸粒子溶液をポリスチレン粒子溶液（ポリスチレン濃度：２質量％ ＰＬＡ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、２５０ｎｍ、コアフロント株式会社製）に変更し、添加量を（体積比（アルギン酸ナトリウム水溶液１質量％：ポリスチレン粒子溶液１質量％溶液）が１：１）としたこと以外は、実施例７と同様にして、三次元培養構造物を得た。
次に、実施例５と同様にして、細胞培養し、実施例７と同様にして、伸展率を測定した。前記伸展率は、４時間後が１０％、２４時間後が５０％であった。結果を下記表５に示す。

（実施例９）
実施例７において、ポリ乳酸粒子溶液をシリカ粒子溶液（シリカ濃度：４質量％ ＰＬＡ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、コアフロント株式会社製）に変更し、添加量を（体積比（アルギン酸ナトリウム水溶液１質量％：シリカ粒子溶液２質量％溶液）が１：１）としたこと以外は、実施例７と同様にして、三次元培養構造物を得た。
次に、実施例５と同様にして、細胞培養し、実施例７と同様にして、伸展率を測定した。前記伸展率は、４時間後が１０％、２４時間後が４０％であった。結果を下記表５に示す。

（実施例１０）
実施例７において、ポリ乳酸粒子溶液をゼラチン粒子水溶液Ｆ（ゼラチン濃度：２質量％、架橋剤濃度：２．５質量％）をゼラチン濃度１質量％に希釈したゼラチン粒子水溶液Ｆ希釈液に変更し、添加量を（体積比（アルギン酸ナトリウム水溶液１質量％：ゼラチン粒子水溶液Ｆ希釈液１質量％溶液）が１：１）としたこと以外は、実施例７と同様にして、三次元培養構造物を得た。
次に、実施例５と同様にして、細胞培養し、実施例７と同様にして、伸展率を測定した。前記伸展率は、４時間後が５０％、２４時間後が９０％であった。結果を下記表５に示す。

本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞ 細胞と、前記細胞を支持する細胞支持材料と、生体親和性粒子と、を含有することを特徴とする三次元培養構造物である。
＜２＞ 前記生体親和性粒子が、前記細胞支持材料の少なくとも一部の表面から露出している前記＜１＞に記載の三次元培養構造物である。
＜３＞ 前記生体親和性粒子が、前記細胞支持材料から突出している前記＜２＞に記載の三次元培養構造物である。
＜４＞ 前記生体親和性粒子の露出表面積の占有割合が、前記三次元培養構造物表面全体に対して、２０％以上である前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の三次元培養構造物である。
＜５＞ 前記生体親和性粒子が、前記細胞支持材料中に分散している前記＜１＞に記載の三次元培養構造物である。
＜６＞ 前記生体親和性粒子が、前記細胞と接着する接着点を有する前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の三次元培養構造物である。
＜７＞ 前記生体親和性粒子のキュムラント径が、０．１μｍ以上１．０μｍ以下である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の三次元培養構造物である。
＜８＞ 前記生体親和性粒子が、ゼラチン粒子を含む前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の三次元培養構造物である。
＜９＞ 前記細胞支持材料が、多糖類を含む前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の三次元培養構造物である。
＜１０＞ 前記多糖類が、アルギン酸カルシウムを含む前記＜９＞に記載の三次元培養構造物である。
＜１１＞ 前記生体親和性粒子の含有量が、０．５質量％以上２質量％以下である前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の三次元培養構造物である。
＜１２＞ 前記細胞が、接着性細胞である前記＜１＞から＜１１＞のいずれかに記載の三次元培養構造物である。
＜１３＞ 基体上に、生体親和性粒子及び細胞支持材料前駆体を含む細胞支持材料前駆体水溶液の細胞支持材料前駆体水溶液層を形成する層形成工程と、
前記細胞支持材料前駆体水溶液層上に、前記細胞支持材料前駆体水溶液と接触すると前記細胞支持材料前駆体をゲル化させる細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液を付与する細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液付与工程と、
細胞を含む細胞層形成材料を付与する細胞層形成材料付与工程と、を含み、
前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の三次元培養構造物を製造することを特徴とする三次元培養構造物の製造方法である。
＜１４＞ 前記層形成工程における前記基体上への細胞支持材料前駆体水溶液層の形成が、前記細胞支持材料前駆体水溶液を前記基体上に飛翔させることにより行われ、
前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液付与工程における細胞支持材料前駆体水溶液層上への細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液の付与が、前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液を前記細胞支持材料前駆体水溶液層上に飛翔させることにより行われる前記＜１３＞に記載の三次元培養構造物の製造方法である。
＜１５＞ 前記細胞支持材料前駆体水溶液の前記基体上への飛翔、及び前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液の細胞支持材料前駆体水溶液層上への飛翔が、インクジェット方式により行われる前記＜１４＞に記載の三次元培養構造物の製造方法である。
＜１６＞ 前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液が、塩化カルシウム水溶液、キトサン水溶液、及びキチン水溶液から選択される少なくとも１種である前記＜１３＞から＜１５＞のいずれかに記載の三次元培養構造物の製造方法である。
＜１７＞ 前記細胞支持材料前駆体水溶液が、アルギン酸ナトリウム水溶液、アルギン酸カリウム水溶液、及びアルギン酸アンモニウム水溶液から選択される少なくとも１種である前記＜１３＞から＜１６＞のいずれかに記載の三次元培養構造物の製造方法である。
＜１８＞ 前記細胞支持材料前駆体水溶液の粘度が、２０ｍＰａ・ｓ以下である前記＜１３＞から＜１７＞のいずれかに記載の三次元培養構造物の製造方法である。
＜１９＞ 前記細胞が、接着性細胞である前記＜１３＞から＜１８＞のいずれかに記載の三次元培養構造物の製造方法である。
＜２０＞ 前記接着性細胞が、繊維芽細胞である前記＜１９＞に記載の三次元培養構造物の製造方法である。

前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の三次元培養構造物、及び前記＜１３＞から＜２０＞のいずれかに記載の三次元培養構造物の製造方法は、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。

国際公開第２０１１／０５９１１２号パンフレット 特許第４４１２５３７号公報

１、１１、２１ 細胞
２、１２、２２、４２ 生体親和性粒子
３、１３、２３、４３ 細胞支持材料
４１ 細胞支持材料前駆体

Claims (12)

1. 細胞と、前記細胞を支持する細胞支持材料と、生体親和性粒子と、を含有することを特徴とする三次元培養構造物。
2. 前記生体親和性粒子が、前記細胞支持材料の少なくとも一部の表面から露出している請求項１に記載の三次元培養構造物。
3. 前記生体親和性粒子が、前記細胞支持材料から突出している請求項２に記載の三次元培養構造物。
4. 前記生体親和性粒子の露出表面積の占有割合が、前記三次元培養構造物表面全体に対して、２０％以上である請求項２から３のいずれかに記載の三次元培養構造物。
5. 前記生体親和性粒子が、前記細胞支持材料中に分散している請求項１に記載の三次元培養構造物。
6. 前記生体親和性粒子が、前記細胞と接着する接着点を有する請求項１から５のいずれかに記載の三次元培養構造物。
7. 前記生体親和性粒子のキュムラント径が、０．１μｍ以上１．０μｍ以下である請求項１から６のいずれかに記載の三次元培養構造物。
8. 基体上に、生体親和性粒子及び細胞支持材料前駆体を含む細胞支持材料前駆体水溶液の細胞支持材料前駆体水溶液層を形成する層形成工程と、
   前記細胞支持材料前駆体水溶液層上に、前記細胞支持材料前駆体水溶液と接触すると前記細胞支持材料前駆体をゲル化させる細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液を付与する細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液付与工程と、
   細胞を含む細胞層形成材料を付与する細胞層形成材料付与工程と、を含み、
   請求項１から７のいずれかに記載の三次元培養構造物を製造することを特徴とする三次元培養構造物の製造方法。
9. 前記層形成工程における前記基体上への細胞支持材料前駆体水溶液層の形成が、前記細胞支持材料前駆体水溶液を前記基体上に飛翔させることにより行われ、
   前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液付与工程における細胞支持材料前駆体水溶液層上への細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液の付与が、前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液を前記細胞支持材料前駆体水溶液層上に飛翔させることにより行われる請求項８に記載の三次元培養構造物の製造方法。
10. 前記細胞支持材料前駆体水溶液の前記基体上への飛翔、及び前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液の細胞支持材料前駆体水溶液層上への飛翔が、インクジェット方式により行われる請求項９に記載の三次元培養構造物の製造方法。
11. 前記細胞支持材料前駆体ゲル化水溶液が、塩化カルシウム水溶液、キトサン水溶液、及びキチン水溶液から選択される少なくとも１種である請求項８から１０のいずれかに記載の三次元培養構造物の製造方法。
12. 前記細胞支持材料前駆体水溶液が、アルギン酸ナトリウム水溶液、アルギン酸カリウム水溶液、及びアルギン酸アンモニウム水溶液から選択される少なくとも１種である請求項８から１１のいずれかに記載の三次元培養構造物の製造方法。