JP5670020B2 - 三次元細胞培養体チップ及びその使用方法 - Google Patents
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すなわち、本発明は、その一態様において、基板と、前記基板上に空間的に離れて配置される2つ以上の三次元細胞培養体とを備え、前記三次元細胞培養体は前記基板の法線方向に積層された少なくとも2層の細胞層を有し、前記三次元細胞培養体の基板投影形状を含む最小円の直径は10μm〜20mmである三次元細胞培養体チップに関する。
本発明の三次元細胞培養体チップの基板上に配置される三次元培養細胞体は、基板の法線方向に積層された少なくとも2層の細胞層を備える。1つの三次元培養細胞体において積層される細胞層の数は特に制限されないが、ヒト等の生体組織とより同等の性質・機能を発揮させる観点から、3層以上が好ましく、4層以上がより好ましく、5層以上がさら好ましく、6層以上がさらにより好ましい。積層される細胞数の上限は特に制限されないが、例えば、100層以下、50層以下、40層以下、30層以下、20層以下、10層以下などである。本発明において「基板の法線方向の積層」とは、例えば、xy平面の基板に対してz方向の積層を含み、或いは、基板を足場とすることなく下層細胞層及び又は下層細胞層の上に形成された細胞外マトリックスを足場として上層細胞層が形成されている構成を含み得る。
本発明における三次元細胞培養体は、細胞の他に、細胞外マトリックスを含むことが好ましい。本発明において、細胞外マトリックスは、生体内で細胞の外の空間を充填し、骨格的役割、足場を提供する役割、及び又は、生体因子を保持する役割などの機能を果たす生体内物質を含み、さらに、in vitroの細胞培養において骨格的役割、足場を提供する役割、及び又は、生体因子を保持する役割などの機能を果たせる物質を含む。
RGD配列を有する第1物質、すなわち、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子における前記RGD配列とは、一般に知られている「Arg−Gly−Asp」配列をいう。本発明において「RGD配列を有する」とは、元来、RGD配列を有するものでもよいし、RGD配列が化学的に結合されたものであってもよい。RGD配列を有する第1物質は、生分解性であることが好ましく、また、水溶性であることが好ましい。RGD配列を有するタンパク質としては、例えば、従来公知の接着性タンパク質が挙げられ、具体的には、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、コラーゲン等が挙げられる。また、RGD配列を有するタンパク質は、例えば、RGD配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、抗体等であってもよい。RGD配列を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子、及び合成高分子があげられる。RGD配列を有する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリエステル、キチンやキトサン等の糖、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、これらの共重合体等があげられる。RGD配列を有する合成高分子としては、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等のRGD配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール‐グラフト‐ポリアクリル酸、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−ポリアクリル酸)、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ(メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン)等が挙げられる。
相互作用する第2物質は、生分解性であることが好ましく、また、水溶性であることが好ましい。相互作用する第2物質のうち、RGD配列を有する第1物質と相互作用するタンパク質としては、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、抗体等が挙げられる。また、RGD配列を有する第1物質と相互作用する高分子としては、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、ポリエステル、ヘパリンやヘパラン硫酸等の糖、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体を含む天然高分子、あるいは、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等のポリマー又は共重合体である合成高分子であって、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール‐グラフト‐ポリアクリル酸、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−co−ポリアクリル酸)、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ(メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン)等の合成高分子が挙げられる。
正の電荷を有する第1物質のうち、正の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましく、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムc、ペルオキシダーゼ、ミオグロビン等が挙げられる。また、正の電荷を有する第1物質のうち、正の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられ、天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリエステル、糖、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート及びその共重合体等が挙げられ、前記合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等のポリマー又は共重合体が挙げられ、具体的には、キチン、キトサン、ポリ(α−リジン)、ポリ(ε−リジン)、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアミドアミンデンドリマー等があげられる。
負の電荷を有する第2物質のうち、負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましく、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、卵白アルブミン等が挙げられる。また、負の電荷を有する第2物質のうち、負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられ、前記天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリエステル、糖、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネートおよびその共重合体等が挙げられ、前記合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、星型等のポリマー又は共重合体が挙げられ、具体的には、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール等が挙げられる。
本発明における三次元細胞培養体のうち基板と接触する層は、細胞外マトリックスの層であってもよく、細胞層であってもよい。基材を細胞層が足場とできない場合には、三次元細胞培養体を配置する領域に上述の細胞外マトリックスを配置するかあるいは従来公知の細胞培養のためのコーティングを施すことが好ましい。
本発明において、三次元細胞培養体チップの基板上に配置される三次元培養細胞体は、安全性や薬物動態に関する試験・検査の効率化及び容易化の観点から、その基板投影形状を含む最小円の直径が10μm〜20mmであって、20μm〜10mmが好ましく、30μm〜5mmがより好ましく、40μm〜2.5mmがさらに好ましく、50μm〜2mmがさらにより好ましい。
本発明の三次元細胞培養体チップの基板上に空間的に離れて配置される三次元培養細胞体の数は、安全性や薬物動態に関する試験・検査の効率化及び容易化の観点から、2以上であって、3以上が好ましく、6以上がより好ましく、12以上がさらに好ましい。配置される三次元細胞培養体の数の上限としては、基板上に空間的に離れて配置される範囲であって、例えば、10000以下、5000以下、1000以下、500以下、100以下、50以下である。
本発明の三次元細胞培養体チップに用いる基板としては、特に制限されず、例えば、ガラス、各種ポリマー、ろ紙、金属、ハイドロゲル等の従来公知の材料を適宜使用できる。基板の形状は、特に制限されず、例えば、通常のバイオチップで採用されている形状であってよく、矩形の板状が挙げられる。
本発明は、その他の一態様において、三次元細胞培養体チップの製造方法(以下、「本発明の製造方法」ともいう)であって、基板上の空間的に離れた少なくとも2つの所定の領域に第1液と第2液とを交互に配置して細胞外マトリックスを形成すること、前記所定の領域に細胞含有溶液を配置することにより細胞層を形成すること、及び、前記細胞外マトリックス形成及び前記細胞層形成を交互に行い、前記所定の領域に前記基板の法線方向に積層された少なくとも2層の細胞層を備える三次元細胞培養体を形成することを含み、前記第1液の含有物と前記第2液の含有物との組合せが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組合せ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組合せであり、前記第1液、第2液、及び、細胞含有溶液の配置が、液吐出ノズルを備える噴射装置により行われる、三次元細胞培養体チップの製造方法に関する。
本発明の製造方法における細胞外マトリックス形成は、基板上の所定の場所又は前記所定の場所に形成された細胞層上に、第1液と第2液とを交互に配置することにより行う。第1液に含有される含有物は、上述したRGD配列を有する第1物質及び正の電荷を有する第1物質から選択して使用でき、第2液に含有される含有物は、上述した相互作用する第2物質及び負の電荷を有する第2物質からそれぞれ選択して使用できる。ここで第1液又は第2液の含有物とは、前記液の液媒体に溶解及び又は分散して含まれる物質をいう。第1液の含有物及び第2液の含有物の好ましい組合せも上述の通りである。
本発明の製造方法における細胞層形成は、基板上の所定の場所又は前記所定の場所に形成された細胞マトリックス上に細胞含有溶液を配置することにより行う。細胞含有溶液の配置は、第1液及び第2液の配置と同様に、液吐出ノズルを備える噴射装置(例えば、インクジェット式吐出装置)を用いて行うことができる。前記噴射装置とその駆動制御装置、及び、基板を保持するステージ又は噴射装置のxy平面の移動手段とその駆動制御装置を組み合わせることで、基板上の空間的に離れた少なくとも2つの所定の場所に正確かつ簡便に細胞層を形成できる。
本発明の製造方法に使用する液吐出ノズルを備える噴射装置は、上述のとおり、第1液、第2液、及び、細胞含有液を基板上の所定の領域に吐出できる装置であって、例えば、ピエゾ駆動のインクジェット式吐出装置を採用できる。当業者であれば、適切なインクジェット式吐出装置を採用することは容易である。前記噴射装置はその駆動制御装置、及び、基板を保持するステージ又は前記噴射装置のxy平面の移動手段とその駆動制御を組み合わせることで、基板上の空間的に離れた少なくとも2つの所定の場所に正確かつ簡便に細胞外マトリックス及び細胞層を形成できる装置とすることが好ましい。
本発明は、さらにその他の一態様において、評価方法であって、本発明の三次元細胞培養体チップを用い、前記チップ上の三次元細胞培養体の少なくとも1つと、評価対象である化合物、医薬組成物、化粧品、及び、食品からなる群から選択される物質とを接触させることを含む評価方法に関する。本発明の評価を用いれば、例えば、医薬、製薬、化粧品、食品及び環境の分野における安全性や薬物動態に関する試験・検査を行うことができるという効果を好ましくは奏する。さらに、それらの試験・検査についてヒトの生体をよく反映した信頼性の高い結果を得られるという効果を好ましくは奏する。あるいは、本発明の評価を用いれば、例えば、再生医療分野においてヒトの組織への分化誘導に関する試験・研究が、容易かつ効率的に行うことができるという効果を好ましくは奏し得る。したがって、本発明は、さらにその他の一態様において、評価キットであって、上記の本発明の評価方法行うためのキットであって、本発明の三次元細胞培養体チップを含むキットに関する。
第1液:0.2mg/mlフィブロネクチン、50mMトリス緩衝液(pH=7.4)溶液。
第2液:0.2mg/mlゼラチン、50mMトリス緩衝液(pH=7.4)溶液。
2x107cells/mLのマウスL929線維芽細胞、50mMトリス緩衝液(pH=7.4)の溶液。但し、第4層用の細胞は、CellTracker(商標)グリーン(CMFDA、Molecular Probes社製)で標識した細胞を用いた。
0.2mg/mlのフィブロネクチン、50mMトリス緩衝液(pH=7.4)の溶液。
図3の凹部33のようなウェルを50個備える基板(25mm×76mm)を使用した。なお、ウェルの寸法は、図3B寸法におけるd1〜d3で示すと、d1=1mm、d2=3mm、及び、d3=0.2mmであった。
基板のウェルへの上記溶液の配置は、下記インクジェット式吐出装置及び駆動装置のほか、基板が配置されるステージが平面方向(x−y方向)に移動制御可能な移動手段とその駆動制御装置及び観察システムを含む吐出システム(クラスターテクノロジー社製)を使用した。前記インクジェット式吐出装置として、パルスインジェクター(商標、クラスターテクノロジー社製)を使用し、インクジェット式吐出装置の駆動装置として、WaveBuilder(商標、クラスターテクノロジー社製)を使用した。
以下のようにして9つのウェルそれぞれに三次元細胞培養体を作製し、三次元細胞培養体チップを製造した。まず、前記ウェルそれぞれに下地膜用溶液を、7V、1000Hzの条件で10000滴吐出して細胞接着のための下地膜を作製した。その後、細胞含有液を各ウェルに17V、1000Hzの条件で10000滴吐出した。これを4回繰り返すことで、ウェルを完全に覆う細胞数を吐出した。細胞培養インキュベーター(37℃、5%CO2)で一晩培養することで細胞を接着させた(第1細胞層)。次に、細胞外マトリックス形成用第1溶液を、各ウェルに7V、1000Hzの条件で細胞表面へ5000滴吐出し、その後細胞外マトリックス形成用第2溶液を、7V、1000Hzの条件で5000滴吐出した。このフィブロネクチンとゼラチンの吐出を交互に9回繰り返すことで、細胞表面にフィブロネクチンーゼラチンの薄膜(細胞外マトリックス)を形成した。その後すぐに、前記細胞外マトリックスの上に、細胞含有液を17V、1000Hzの条件で10000滴吐出を4回繰り返すことで第2層目の細胞を播種した。インキュベーターで一晩培養することで、細胞を接着させた(第2細胞層)。この細胞外マトリックス形成と細胞層形成を繰り返し、9つのウェルそれぞれに4層の細胞層が積層された構造の三次元細胞培養体を作製した。これらの三次元細胞培養体は、基板上に空間的に離れて配置された三次元細胞培養体である。なお、上述したとおり、第4層目の細胞はセルトラッカーグリーンで蛍光標識後に吐出した。
2 基板
3 三次元細胞培養体
32 基板
33 凹部(ウェル)
Claims (5)
- 三次元細胞培養体チップであって、
基板と、前記基板上に空間的に離れて配置される2つ以上の三次元細胞培養体とを備え、
前記三次元細胞培養体は、前記基板の法線方向に積層された4層以上の細胞層と、前記細胞層間に配置されたRGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組合せ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組合せを含む細胞外マトリックスとを有し、
前記三次元細胞培養体の形成は、液吐出ノズルを備えるインクジェット式噴射装置により行われ、
前記三次元細胞培養体の基板投影形状を含む最小円の直径は、10μm〜20mmである、三次元細胞培養体チップ。 - 前記基板は2つ以上の凹部を有し、前記凹部に前記三次元細胞培養体が形成されている、請求項1記載の三次元細胞培養体チップ。
- 前記基板上の空間的に離れた少なくとも2つの所定の領域に第1液と第2液とを交互に配置して細胞外マトリックスを形成すること、
前記所定の領域に細胞含有溶液を配置することにより細胞層を形成すること、及び、
前記細胞外マトリックス形成及び前記細胞層形成を交互に行い、前記所定の領域のそれぞれに前記三次元細胞培養体を形成することを含む製法により製造され得る三次元細胞培養体チップであって、
前記第1液、第2液、及び、細胞含有溶液の配置が、前記インクジェット式噴射装置により行われ、
前記第1液の含有物と前記第2液の含有物との組合せが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組合せ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組合せである、請求項1又は2記載の三次元細胞培養体チップ。 - 三次元細胞培養体チップの製造方法であって、
基板上の空間的に離れた少なくとも2つの所定の領域に第1液と第2液とを交互に配置して細胞外マトリックスを形成すること、
前記所定の領域に細胞含有溶液を配置することにより細胞層を形成すること、及び、
前記細胞外マトリックス形成及び前記細胞層形成を交互に行い、前記所定の領域に前記基板の法線方向に積層された4層以上の細胞層を備える三次元細胞培養体を形成することを含み、
前記三次元細胞培養体の基板投影形状を含む最小円の直径は、10μm〜20mmであり、
前記第1液の含有物と前記第2液の含有物との組合せが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組合せ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組合せであり、
前記第1液、第2液、及び、細胞含有溶液の配置が、液吐出ノズルを備えるインクジェット式噴射装置により行われる、三次元細胞培養体チップの製造方法。 - 評価方法であって、請求項1から3のいずれかに記載の三次元細胞培養体チップを用い、前記チップ上の三次元細胞培養体の少なくとも1つと、評価対象である化合物、医薬組成物、化粧品、及び、食品からなる群から選択される物質とを接触させることを含む、評価方法。
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