KR101755041B1

KR101755041B1 - 패턴화된 세포 배양기판 및 이를 이용한 패턴을 갖는 세포시트 제조방법

Info

Publication number: KR101755041B1
Application number: KR1020110043298A
Authority: KR
Inventors: 신흥수; 전인동; 박경민; 박기동
Original assignee: 한양대학교 산학협력단; 아주대학교산학협력단
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2017-07-07
Also published as: KR20120125702A

Abstract

본 발명은 패턴화된 세포 배양기판 및 이를 이용한 패턴을 갖는 세포시트 제조방법에 관한 것으로, 온도감응성 하이드로젤과 세포부착 펩타이드를 포함하며 일면에 패턴이 형성된 패턴화된 세포 배양기판 및 이를 이용한 패턴을 갖는 세포시트 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 패턴을 유지하면서 세포 손상 없이 빠르게 배양기판으로부터 세포시트를 쉽게 회수할 수 있으며, 패턴을 갖는 세포시트는 인체 내 조직 중 방향성을 가진 조직의 재생을 위한 인공조직으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

패턴화된 세포 배양기판 및 이를 이용한 패턴을 갖는 세포시트 제조방법{PATTERNED SUBSTRATE FOR CULTURING CELLS AND PREPARATION METHOD OF CELL SHEET USING THE SAME}

본 발명은 온도 변화에 따라 용이하게 세포시트를 분리 회수할 수 있는 패턴화된 세포 배양기판, 이를 이용한 패턴을 갖는 세포시트 제조방법에 관한 것이다.

인체의 손상된 조직을 재건하기 위한 이식방법에는 이종이식, 동종이식, 자가이식이 있다. 이종이식은 면역 부적합성 및 레트로바이러스를 포함하는 인수공통 병원체 전달의 문제를 갖는다. 또한, 동종이식은 제공자의 면역 거부 및 이용불가능성의 문제를 가지며, 자가이식은 필요한 양만큼의 적절한 조직을 얻기 어려우며 환자에 대한 외상의 증가의 문제를 가진다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 인공 대체물이나 세포를 배양하여 조직화시킨 것을 그대로 이식하려고 하는 기술이 주목되고 있다. 2004년 순수한 세포 자체를 이용하여 제작한 세포시트(cell sheet)를 이용한 망막 재생에 관한 연구가 New England journal of Medicine에 발표된 뒤 조직공학 분야에서 세포만을 이용한 3차원 인공 조직에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근에는 일본 동경여자대학교 오카노 교수 등은 세포시트공학(Cell Sheet Engineering)을 통해 배양세포들을 간단히 온도만을 낮추어줌으로써 세포들이 서로 연결된‘시트모양’조직으로 이용할 수 있다고 제시하고 있다.

구체적으로, 일반적으로 시판되는 폴리스티렌 배양 접시 표면에 전자빔을 통해 온도감응성 고분자인 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PIAAm)를 라디칼 중합방법에 의하여 고정시켰다. 이와 같이 온도감응성 고분자가 표면에 형성되는 경우, 32℃를 임계온도로 하여 이보다 고온에서는 소수성 성질을 나타내고, 이보다 저온에서는 친수성 성질을 나타내게 된다. 따라서, 37 ℃의 배양 환경에서는 배양접시의 바닥이 세포 접착성을 띠므로 세포는 배양 접시에 붙게 된다. 접시에 붙은 접착세포는 곧 세포분열에 의하여 수적 증가를 하게 되고, 배양 접시의 표면을 전부 세포로 메우게 되는 컨플루언시(confluency) 상태에 이르게 된다. 컨플루언시에 도달하게 되면 임계온도인 32 ℃ 이하로 저온처리를 해주면 배양 접시 표면이 세포 비접착성으로 변하여 연속성 있는 시트 모양의 구조물이 배양 접시로부터 떨어져 나오게 된다. 이때, 배양 접시에 강력하게 접착되어 있는 폴리머는 세포시트와 떨어지게 되며 배양 접시에 그대로 남아 있게 된다.

그러나, 이와 같은 기술은 저온 처리시 세포 및 세포시트의 가장자리에서부터 물이 침투되고 그로 인해 표면에 그래프트된 온도감응성 고분자의 친수화가 서서히 진행되므로 세포 및 세포시트를 회수하는 시간이 느리다.

한편, 패턴을 가지면서 온도감응성 특성을 가진 배양 매트릭스를 개발하기 위해 매트릭스 표면을 엠보싱 공정 등으로 강하게 압박하여 패턴을 가진 매트릭스를 만들고 그 후에 온도감응성 재료를 전자선을 이용하여 그래프트하는 방법 등이 제안되었으나, 공정이 복잡한 단점이 있다.

또한, 많은 연구가 진행되고 있는 배양 매트릭스 재료, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜-디아크릴레이트(PEG-DA), 알긴산(alginate), PDMS, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PIPAAm) 등은 세포가 부착될 때 필요한 생체분자(biomolecule) 등의 리간드가 거의 없기 때문에 세포-매트릭스 간에 상호작용을 하는 데 있어 상당한 제한을 가진다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 과제는 온도 변화에 따라 팽윤과 수축을 가역적으로 나타내는 온도감응성 하이드로젤과 세포부착 펩타이드를 배양기판으로 이용하여 세포를 배양함으로써, 패턴을 유지하면서 세포의 손상 없이 쉽고 빠르게 세포시트를 회수할 수 있는 패턴화된 배양기판을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 과제는 상기 패턴화된 배양기판을 이용하여 방향성을 가진 조직 재생을 위한 인공조직으로 사용될 수 있는 패턴을 갖는 세포시트 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

온도감응성 하이드로젤과 세포부착 펩타이드를 포함하며 일면에 패턴이 형성된, 패턴화된 세포 배양기판을 제공한다.

또한, 본 발명은

온도감응성 하이드로젤과 세포부착 펩타이드를 포함하며, 일면에 패턴이 형성된 세포 배양기판을 준비하는 단계;

상기 배양기판 상에서 세포를 배양하는 단계; 및

상기 배양기판의 온도를 저임계 용액온도 미만으로 낮춘 후 저임계 용액온도 이상으로 승온하여 세포시트를 배양기판으로부터 분리 회수하는 단계

를 포함하는 세포시트 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 패턴을 유지하면서 세포 손상 없이 빠르게 배양기판으로부터 세포시트를 쉽게 회수할 수 있으며, 패턴을 갖는 세포시트는 인체 내 조직 중 방향성을 가진 조직의 재생을 위한 인공조직으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포시트 제조방법의 공정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포시트 분리회수 단계를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 사용한 PDMS 몰드의 표면을 촬영한 주사전자 현미경 사진과, 이를 이용하여 제작된 패턴화된 세포 배양기판을 촬영한 광학현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 제조된 테트로닉-티라민 컨쥬게이트 하이드로젤 배양기판의 실온, 37 ℃ 및 4 ℃에서의 크기 변화를 촬영한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 제조된 테트로닉-티라민 컨쥬게이트 하이드로젤 배양기판의 팽윤율과 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 테트로닉-티라민 컨쥬게이트 하이드로젤(Tet-TA hydrogel)과 비온도감응성특성을 가진 알지네이트 하이드로젤(Alginate hydrogel)을 세포 배양을 위한 기판으로 사용하여 온도 변화에 따른 세포시트의 분리양상을 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에서 패턴화된 테트로닉-티라민 컨쥬게이트 하이드로젤 배양기판과 패턴이 없는 테트로닉-티라민 컨쥬게이트 하이드로젤 배양기판을 이용해 제조한 세포시트의 세포 형태 및 부착능을 면역형광염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에서 패턴화된 테트로닉-티라민 컨쥬게이트 하이드로젤 배양기판의 온도변화를 통해 세포시트를 분리회수하고, 이를 커버글라스로 이동하는 과정을 사진이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에서 분리회수한 패턴을 갖는 세포시트와 패턴이 없는 세포시트를 파이브로넥틴이 코팅된 글라스 표면에 이동시킨 후, 다시 각각 24 시간, 72 시간 동안 배양한 다음 세포의 세포골격, 세포외 기질 단백질인 파이브로넥틴 어셈블리(fibronectin assembly), 부착 단백질인 팍실린을 면역염색을 통하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에서 분리 회수한 세포시트 중 근아세포 핵의 평균 배향도(orientation degree of nuclei)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에서 분리회수한 세포시트 근아세포 핵의 종행비를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에서 분리회수한 패턴을 갖는 세포시트를 파이브로넥틴이 코팅된 글라스 표면에 이동한 후, 다시 배양한 다음 근아세포의 분화능 척도인 근관(myotube)를 면역 염색을 통하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 패턴을 갖는 세포시트와 패턴이 없는 세포시트를 커버글라스로 이동하여 배양한 후 근아세포의 근관(myotube)를 면역염색하여 근관의 평균 배향도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 패턴화된 세포 배양기판, 이를 이용하여 일정한 방향성의 패턴을 갖는 세포시트를 제조하는 방법을 제시한다.

본 발명에 따른 패턴화된 세포 배양기판은 온도감응성 하이드로젤과 세포부착 펩타이드를 포함하며, 일면에 패턴이 형성되어 있다.

상기 온도감응성 하이드로젤은 가교결합을 갖는 고분자로서, 온도변화에 따라 졸-겔 거동이 아닌 수축과 팽윤을 가역적으로 나타낸다. 이에 따라 저임계 용액온도(LCST, lower critical solution temperature) 미만에선 함수율이 증가하여 팽윤현상을, 저임계 용액온도 이상에선 함수율이 감소하여 수축현상을 보이며 크기가 변화한다. 이러한 하이드로젤의 온도감응성 성질을 이용하여 온도조절만으로 배양기판으로부터 패턴을 유지하면서 세포시트를 분리회수할 수 있다.

상기 세포부착 펩타이드는 세포부착 활성을 담당하는 아미노산 서열을 갖는 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 일예로, 아미노산 서열 RGD, RGDS, REDV, YKNR, QPQGLAK 또는 YIGSR을 포함하는 펩타이드가 가능하다.

본 발명의 배양기판은 주형으로서 다수의 음각패턴이 형성된 고분자 복제몰드를 사용하여 제조할 수 있으며, 특히 PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드를 사용하는 것이 바람직하다. 이때 PDMS 몰드는 기본 주형으로서 다수의 양각패턴이 형성된 실리콘 몰드를 사용하며 제조할 수 있으며, PDMS를 형성하는 고분자 프리폴리머 및 개시제의 혼합한 용액을 부어서 경화시킨 다음, 상기 실리콘 몰드로부터 분리함으로써 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 PDMS 몰드는 수 회 이상 반복적으로 사용가능하다.

준비된 PDMS 몰드에 온도감응성 하이드로젤을 생성할 수 있는 출발물질과 세포부착 펩타이드를 함께 주입한 후 겔화하여, PDMS 몰드의 패턴이 복제된 배양기판을 얻는다.

이때 온도감응성 하이드로젤은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 하기 식(Ⅱ)a로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 곁가지형(branched) 고분자, 하기 식(Ⅱ)b로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 스타형 고분자 및 하기 식(Ⅱ)c로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 선형 고분자에서 선택된 1종 이상의 고분자 혼합물에 당근 과산화효소(HRP)와 과산화수소를 첨가시켜 페놀 유사체 간의 탈수소 결합을 통해 제조된다:

[반응식 1]

이와 같이, PDMS 몰드에 페놀 유사체가 결합된 고분자에 당근 과산화효소와 과산화수소를 첨가하여 한 번에 겔화시킴으로써 간단한 공정을 통해 패턴화된 세포 배양기판을 얻을 수 있다.

바람직하기로, 페놀 유사체로 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드의 공중합체/티라민 컨쥬게이트에 당근 과산화효소와 과산화수소를 첨가하여 컨쥬게이트 사이의 탈수소 결합을 통해 가교결합을 형성하여 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드의 공중합체/티라민 하이드로젤을 얻는다. 상기 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드의 공중합체로는 Pluronic, Poloxamer, Tetronic의 상품명을 갖는 공중합체가 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서 사용한 테트로닉-티라민 컨쥬케이트는 실온(15 내지 25 ℃)에서 저임계 용액온도를 나타낸다.

패턴화된 세포 배양기판은 1 내지 100㎛ 폭을 갖는 볼록부를 가지며, 볼록부 사이의 간격은 1 내지 100㎛인 것이 바람직하다.

본 발명의 배양기판은 온도 변화에 따라 팽윤과 수축을 가역적으로 나타내므로 세포의 손상 없이 쉽고 빠르게 세포시트를 회수할 수 있으므로, 다양한 세포의 세포시트 제조에 사용될 수 있다

이하, 본 발명의 패턴화된 세포 배양기판을 이용한 패턴을 갖는 세포시트 제조방법을 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 세포시트 제조방법의 공정을 나타낸 개략도이다. 도 3을 참조하여, 상기 단계들을 구체적으로 설명하기로 한다.

먼저, 온도감응성 하이드로젤과 세포부착 펩타이드를 포함하며, 일면에 패턴이 형성된 세포 배양기판을 준비한다.

세포 배양기판 준비는 상기에서 언급한 바를 따른다.

다음으로, 상기 배양기판 상에서 세포를 배양한다.

배양되는 세포는 본 발명에서 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 간, 신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도(islet), 내장, 귀, 피부, 쓸개조직, 전립선, 방광, 배아(embryo), 면역계 및 조혈계 등으로부터 분리되거나 활성화할 수 있는 세포를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 섬유아세포, 골아세포, 근아세포, 신장세포, 혈관내피세포, 연골세포, 간세포, 지방세포, 각막상피세포, 각종 줄기세포, 신경세포, 각질세포, 근육세포, 심장근육세포 또는 식도상피세포를 배양한다.

이때 배양조건은 세포의 종류에 따라 달라질 수 있고, 이러한 내용은 이미 이 분야에서 널리 알려진 공지의 기술이므로 자세한 설명은 생략한다.

배양 과정을 동안 배양기판에 형성된 패턴 표면의 세포부착 펩타이드는 세포에 대한 리간드로 작용함으로써 세포의 점착 및 증식을 효과적으로 유도하며, 배양기판에 형성된 패턴을 따라서 세포가 증식하게 된다. 그 결과, 배양기판의 패턴과 같이 일정한 방향성을 특이적으로 유지하면서 세포가 성장하게 된다.

이어서, 상기 배양기판의 온도를 저임계 용액온도 미만으로 낮춘 후 저임계 용액온도 이상으로 승온하여 세포시트를 배양기판으로부터 분리 회수한다.

본 발명의 온도감응성 하이드로젤은 저임계 용액온도 미만에선 함수율이 증가하여 팽윤현상을, 저임계 용액온도 이상에선 함수율이 감소하여 수축현상을 보이며 크기가 변화한다. 이러한 특성을 이용하여 배양기판으로부터 세포시트를 분리회수한다.

도 2는 본 발명에 따른 세포시트 분리회수 단계를 나타낸 모식도이다.

도 2를 참조하면, 세포배양은 저임계 용액온도 이상에서 이루어지므로 세포 측의 수용체(예를 들어 인테그린)과 배양기판의 세포부착 펩타이드가 상호작용을 통해 연결되어 있다. 그러나, 배양기판을 저임계 용액온도 미만으로 낮추면 온도감응성 하이드로젤의 함수율이 증가하여 팽윤하여 커지며, 배양기판의 세포부착 펩타이드와 세포측의 수용체 사이의 거리가 멀어지면서 배양기판으로부터 세포시트가 분리된다.

이때 배양기판의 온도를 저임계 용액온도 미만인 2 내지 8 ℃로 낮춰 5 내지 15 분 동안 유지한 후 저임계 용액온도 이상인 35 내지 38 ℃로 승온하는 것이 바람직하다.

이와 같이 기판의 온도만을 변화하여 배양된 세포 시트를 기판으로부터 분리회수하는 방법은 종래 트립신과 같은 단백질 분해효소를 이용한 방법과 달리 세포의 손상 없이 세포를 회수할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 제조방법을 통해 얻은 세포시트는 배양시에 세포가 스스로 분비했던 접착 단백분자, 세포외 기질, 세포의 막단백질 및 접착단백질이 그대로 회수될 뿐만 아니라 형성된 패턴을 유지하면서 새로운 배양 표면으로의 이동이 가능하고 이동한 표면에서도 좋은 생존력을 가지게 된다. 또한, 종래 사용된 온도감응성 고분자인 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PIPAAm) 등과 같이 온도변화에 따라 친수/소수의 성질변화가 아니라 크기변화를 통해 세포시트를 회수하므로 회수 시간이 단축되는 이점이 있다.

이렇게 본 발명의 제조방법을 통해 각종 세포를 시트화하고, 얻어진 시트를 여러 겹으로 적층화함으로써 여러 가지 장기에 대하여 생체 외에서의 조직 구축이 가능해진다. 또한, 패턴을 갖는 세포시트는 인체 내 조직 중 방향성을 가진 조직, 예를 들어, 근육조직 등과 같은 조직의 재생을 위한 인공조직으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1>

공개특허 제2010-0076173호에 개시된 바에 따라 실시하여 테트로닉-티라민 컨쥬게이트를 제조하였다. 5.2 wt% 테트로닉-티라민 컨쥬게이트(Tet-TA)과 RGD 펩타이드(2.0 mg/ml)를 0.025 mg/ml 당근 과산화효소(HRP)에 녹여 용액 A를 준비하였다. 5.2 wt% 테트로닉-티라민 컨쥬게이트(Tet-TA)을 0.0125 wt% 과산화수소에 녹여 용액 B를 준비하였다. 각각의 용액 A,B를 듀얼 주사기에 넣어 놓고, 10 ㎛ 폭의 음각 패턴이 25㎛ 간격으로 형성된 PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드와 유리판 사이에 두께가 0.5 mm인 테프론 시트가 있는 공간에 두 용액을 균일하게 주사를 하여 겔화시킨 후, 패턴이 형성된 하이드로젤 배양기판을 얻었다.

< 실험예 1>

상기 제조예 1에서 사용한 PDMS 몰드의 표면을 주사전자 현미경 분석을 통해 실시하였으며, 이를 이용하여 제작된 패턴이 형성된 하이드로젤 배양기판의 표면 형태를 광학현미경 분석을 통하여 관찰하고, 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, PDMS 몰드와 같은 패턴 형태로 하이드로젤이 제작이 되었음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2>

상기 제조예 1에서 제조한 하이드로젤 배양기판의 물성을 알아보기 위하여, 30분 간격으로 온도를 4 ℃와 37 ℃로 바꾸어 가며 온도 차이에 따른 하이드로젤의 팽윤율과 크기를 관찰하고, 이를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 저임계용액온도(LCST) 이하인 4 ℃에서는 온도감응성 하이드로젤이 팽윤하여 크기가 1.5 ~ 1.7배 정도 증가하였고, 저임계용액온도(LCST) 이상인 37 ℃에서는 팽윤 정도와 크기가 감소하였음을 확인하였다.

< 실험예 3>

상기 제조예 1에 제조한 패턴이 형성된 하이드로젤 배양기판 표면에서의 세포의 부착능을 알아보기 위해 패턴이 형성된 하이드로젤 배양기판과 유리 기판 표면에 각각 근아세포를 1 x 10⁵ cell/cm²로 37 ℃, 24시간 동안 배양하였다. 세포시트를 분리회수하기 위해 기판의 온도를 4 ℃로 낮춰 10분 동안 유지한 후 다시 37 ℃로 올렸다.

도 6은 테트로닉-티라민 컨쥬게이트 하이드로젤(Tet-TA hydrogel)과 비온도감응성특성을 가진 알지네이트 하이드로젤(Alginate hydrogel)을 세포 배양을 위한 기판으로 사용하여 온도 변화에 따른 세포시트의 분리양상을 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 온도감응성 하이드로젤을 배양기판으로 사용한 경우 저임계용액온도(LCST)를 기준으로 온도 변화에 따라 하이드로젤이 팽윤과 수축이 가역적으로 발생함에 따라 세포시트가 배양기판 표면으로 분리되는 반면, 비온도감응성 특성을 가진 알지네이트 하이드로젤(alginate hydrogel)을 배양기판으로 사용한 경우 온도가 변화하더라도 세포시트가 기판에 그대로 부착되어 있었다.

< 실험예 4>

상기 제조예 1에 제조한 패턴이 형성된 하이드로젤 배양기판 표면에서의 세포의 형태 및 부착능을 알아보기 위해 근아세포를 1 x 10⁵ cell/cm²로 패턴이 형성된 하이드로젤과 패턴이 없는 하이드로젤 표면에 각각 37 ℃, 24시간 동안 배양하다. 세포시트를 분리회수하기 위해 기판의 온도를 4 ℃로 낮추었다가 다시 37 ℃로 올렸다. 세포의 형태 및 부착능을 면역형광염색법을 이용하여 확인하고, 이를 도 7에 나타내었다.

도 7을 참조하면, 부착관련 단백질인 팍실린(paxilin)과 세포골격 구조인 액틴 필라멘트가 패턴을 가진 하이드로젤 표면에서 패턴의 방향성에 따라서 부착관련 단백질의 발현과 액틴 필라멘트가 형성이 되었음을 확인하였으며, 패턴이 없는 하이드로젤 배양기판 표면에서 배양된 세포의 경우 세포골격 역시 방향성이 없게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 5>

상기 실험예 3에서 온도 변화를 통해 하이드로젤 배양기판으로 분리회수한 패턴을 갖는 세포시트를 세포외 기질 단백질 중 하나인 파이브로넥틴이 코팅된 커버글라스에 고정하였고, 이러한 과정을 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제시한 방법을 통하여 온도감응성 하이드로젤 배양기판 표면에 배양된 세포시트가 온도변화에 따라 하이드로젤로부터 온전하게 떨어져서 커버글라스에 이동되었음을 확인하였다.

< 실험예 6>

상기 실험예 3에서 분리회수한 패턴을 갖는 세포시트와 패턴이 없는 세포시트를 파이브로넥틴이 코팅된 글라스 표면에 이동시킨 후, 다시 각각 24 시간, 72 시간 동안 배양을 하였다.

배양 후 세포의 세포골격, 세포외 기질 단백질인 파이브로넥틴 어셈블리(fibronectin assembly), 부착 단백질인 팍실린을 면역염색을 통하여 관찰하고 이를 도 9에 나타내었다. 관찰된 사진을 통하여 세포시트 근아세포 핵의 평균 배향도(orientation degree of nuclei) 및 핵의 종횡비를 정량분석하고, 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다. 이때 패턴의 방향성(0°)을 기준으로 평균배향도를 측정하거나 또는 부착된 대다수의 세포가 나타내는 방향성을 기준으로 평균배향도를 측정하였다.

도 10 및 도 11을 참조하면, 패턴이 형성된 하이드로젤 배양기판에서 배양된 세포시트가 표면이 평평한 글라스에 이동을 하여도, 초기에 하이드로젤 배양기판에 부착된 세포의 방향성 및 핵의 종횡비를 유지한다는 것을 확인하였으며, 액틴 필라멘트, 파이브로넥틴, 팍실린의 발현 역시 패턴의 방향성을 계속 유지하고 있다는 것을 확인하였다.

< 실험예 7>

상기 실험예 3에서 분리회수한 패턴을 갖는 세포시트와 패턴이 없는 세포시트를 파이브로넥틴이 코팅된 글라스 표면에 이동한 후, 다시 24시간 동안 배양하여 분화 배지(5% 말혈청) 조건 하에서 48 시간을 더 배양한 다음 근아세포의 분화능 척도인 근관(myotube)를 면역 염색을 통하여 관찰하고, 이를 도 12에 나타내었다.

도 12를 참조하면, 패턴이 형성된 하이드로젤 배양기판에서 배양된 세포시트가 표면이 평평한 글라스에 이동을 하여, 세포시트가 분화가 되어 근관(myotube)으로 형성되어도, 초기에 패턴 방향성을 가진 하이드로젤 배양기판에 부착된 세포의 방향성을 유지하면서 패턴 방향성을 가진 근관(myotube)으로 형성이 되었음을 알 수 있었다.

도 13은 패턴을 갖는 세포시트와 패턴이 없는 세포시트를 커버글라스로 이동하여 배양한 후 근아세포의 근관(myotube)를 면역염색하여 근관의 평균 배향도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 패턴화된 세포시트에서 배양되어 분리회수된 세포시트는 다른 배양기판으로 이동한 후에도 패턴의 방향성을 계속 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

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온도감응성 하이드로젤과 세포부착 펩타이드를 포함하며, 일면에 패턴이 형성된 배양기판을 준비하는 단계;
상기 배양기판 상에서 세포를 배양하는 단계; 및
상기 배양기판의 온도를 저임계 용액온도 미만으로 낮춘 후 저임계 용액온도 이상으로 승온하여 세포시트를 배양기판으로부터 분리 회수하는 단계
를 포함하는 패턴을 갖는 세포시트 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 온도감응성 하이드로젤은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 하기 식(Ⅱ)a로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 곁가지형(branched) 고분자, 하기 식(Ⅱ)b로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 스타형 고분자 및 하기 식(Ⅱ)c로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 선형 고분자에서 선택된 1종 이상의 고분자 혼합물에 당근 과산화효소와 과산화수소를 첨가시켜 페놀 유사체 간의 탈수소 결합을 통해 제조되는 것인 제조방법:
[반응식 1]
제5항에 있어서, 상기 온도감응성 하이드로젤은 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드/티라민 컨쥬게이트 하이드로젤인 것인 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 세포부착 펩타이드는 아미노산 서열 RGD, RGDS, REDV, YKNR, QPQGLAK 또는 YIGSR을 포함하는 펩타이드인 것인 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 배양기판의 온도를 저임계 용액온도 미만인 2 내지 8 ℃로 낮춰 5 내지 15 분 동안 유지한 후 저임계 용액온도 이상인 35 내지 38 ℃로 승온하여 세포시트를 배양기판으로부터 분리 회수하는 것인 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 세포는 상기 세포는 근아세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 연골세포, 간세포, 골아세포, 신장세포, 지방세포, 각막상피세포, 줄기세포, 신경세포, 각질세포, 근육세포, 심장근육세포 및 식도상피세포로 구성된 군으로부터 선택된 1종인 것인 제조방법.