KR20170029237A

KR20170029237A - 생체고분자 패턴이 형성된 세포 배양기판을 통한 마이크로 세포시트의 제작 및 전달방법

Info

Publication number: KR20170029237A
Application number: KR1020150126305A
Authority: KR
Inventors: 신흥수; 이유빈; 김세정; 김은미; 박기동; 이윤기; 오동환
Original assignee: 한양대학교 산학협력단; 아주대학교산학협력단
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2015-09-07
Publication date: 2017-03-15

Abstract

본 발명은 생체고분자 패턴이 형성된 세포 배양기판, 이의 제조방법 및 이를 통하여 마이크로 사이즈의 세포시트를 형성하고 전달할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 배양기판은 온도변화에 따라 팽윤과 수축을 가역적으로 나타내는 온도감응성 하이드로젤 상에 형성된 폴리카테콜계 고분자 패턴을 따라 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도되어 세포시트의 형태를 자유롭게 조절할 수 있는바 복잡한 인체 조직의 구조 및 기능의 모사가 용이하며, 또한 세포시트의 형태 및 기능을 유지하면서 상기 하이드로젤로부터 빠른 시간 내에 세포시트를 분리함과 동시에 목표체로의 전달을 가능하게 하는바, 의료용 세포전달, 치료 시스템 및 세포기반 재생의학용 인공조직 이식체로의 응용이 가능한 장점이 있다.

Description

생체고분자 패턴이 형성된 세포 배양기판을 통한 마이크로 세포시트의 제작 및 전달방법{Substrate with biopolymer pattern for culturing micro-sized cell sheet and method for delivering the same}

본 발명은 생체고분자 패턴이 형성된 세포 배양기판, 이의 제조방법 및 이를 통하여 마이크로 사이즈의 세포시트를 형성하고 전달하는 방법에 관한 것이다.

인체의 손상된 조직을 재건하기 위한 이식방법에는 이종이식, 동종이식, 자가이식이 있다. 이종이식은 면역 부적합성 및 레트로바이러스를 포함하는 인수공통 병원체 전달의 문제를 갖는다. 또한, 동종이식은 제공자의 면역 거부 및 이용불가능성의 문제를 가지며, 자가이식은 필요한 양만큼의 적절한 조직을 얻기 어려우며 환자에 대한 외상의 증가의 문제를 가진다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 인공 대체물이나 세포를 배양하여 조직화시킨 것을 그대로 이식하려고 하는 기술이 주목받고 있다. 2004년 순수한 세포 자체를 이용하여 제작한 세포시트(cell sheet)를 이용한 망막 재생에 관한 연구가 New England journal of Medicine에 발표된 뒤 조직공학 분야에서 세포만을 이용한 3차원 인공 조직에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

최근, 일본 동경여자대학교 오카노 교수 등은 세포시트공학(Cell Sheet Engineering)을 통해 배양세포들을 간단히 온도만을 낮추어줌으로써 세포들이 서로 연결된‘시트모양’조직으로 이용할 수 있다고 제시한바 있다. 구체적으로, 세포배양용 폴리스티렌 접시에 온도에 따라 친수성 또는 소수성 특성이 변화하는 온도감응성 고분자인 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm)를 라디칼 중합방법에 의하여 고정시켰다. 이때, 상기 온도감응성 고분자는 32℃를 임계온도로 하여 이보다 고온에서는 소수성 성질을 나타내고, 이보다 저온에서는 친수성 성질을 나타내게 된다. 따라서, 37 ℃의 세포배양 환경에서는 배양접시의 바닥이 세포 접착성을 띠므로 세포는 배양 접시에 붙게 된다. 접시에 붙은 접착세포는 곧 세포분열에 의하여 수적 증가를 하게 되고, 배양 접시의 표면을 전부 세포로 메우게 되는 컨플루언시(confluency) 상태에 이르게 된다. 컨플루언시에 도달하게 되면 임계온도인 32 ℃ 이하로 저온처리를 해주면 배양 접시 표면이 세포 비접착성으로 변하여 연속성 있는 시트 모양의 구조물이 배양 접시로부터 떨어져 나오게 된다. 이때, 배양 접시에 강력하게 접착되어 있는 폴리머는 세포시트와 떨어지게 되며 배양 접시에 그대로 남아 있게 된다.

그러나, 이와 같은 기술은 저온 처리시 세포 및 세포시트의 가장자리에서부터 물이 침투되고 그로 인해 표면에 그래프트된 온도감응성 고분자의 친수화가 서서히 진행되므로 세포 및 세포시트를 회수하는 시간이 매우 느린바, 세포 전달을 이용한 치료에 있어 전달하고자 하는 세포의 활성 및 생존능을 저해하는 원인이 될 수 있어 임상적 적용 및 삼차원적 인공 조직체로의 적용에는 한계가 존재한다. 또한, 세포시트 획득 과정에서 세포의 수축으로 인해 세포시트의 온전한 형태 및 기능의 유지가 어렵다는 단점이 있다.

한편, 패턴을 가지면서 온도감응성 특성을 가진 배양 매트릭스를 개발하기 위해 매트릭스 표면을 엠보싱 공정 등으로 강하게 압박하여 패턴을 가진 매트릭스를 만들고 그 후에 온도감응성 재료를 전자선을 이용하여 그래프트하는 방법 등이 제안되었으나, 공정이 복잡한 단점이 있으며, 여전히 세포시트의 획득과정에서의 재료와 세포의 결속 상실로 인해 세포의 수축을 유발하여 세포시트의 온전한 형태 및 기능을 유지하기 어렵다는 단점이 있다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명에서는 온도변화에 따라 팽윤과 수축을 가역적으로 나타내는 온도감응성 하이드로젤 상에 생체고분자인 폴리카테콜(polycatechol)계 고분자 패턴이 형성되어 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도되도록 함으로써, 마이크로 사이즈의 세포시트의 형태 및 기능을 유지하면서 상기 하이드로젤로부터 빠른 시간 내에 세포 시트를 분리함과 동시에 목표체로 전달할 수 있는 세포 배양기판을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명에서는 상기 세포 배양기판의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명에서는 상기 세포 배양기판을 이용하여 목표체로 세포시트를 전달하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 온도감응성 하이드로젤; 상기 온도감응성 하이드로젤 상에 형성된 폴리카테콜(polycatechol)계 고분자 패턴;을 포함하고, 상기 폴리카테콜(polycatechol)계 고분자 패턴 상에 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도되는 것을 특징으로 하는 세포 배양기판을 제공한다.

또한, 본 발명은 일면에 패턴이 형성된 기판을 준비하는 단계; 상기 기판 상에 폴리카테콜계 고분자를 코팅하는 단계; 및 상기 폴리카테콜계 고분자가 코팅된 기판을 온도감응성 하이드로젤의 표면과 접촉시켜, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리카테콜계 고분자 패턴을 형성하는 단계;를 포함하는 세포 배양기판의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 배양기판에 세포를 분주 및 배양하여 상기 세포 배양기판의 폴리카테콜계 고분자 패턴을 따라 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도된 마이크로 사이즈의 세포시트를 형성시키는 단계; 상기 마이크로 사이즈의 세포시트가 형성된 세포 배양기판을 목표체에 접촉시킨 후 온도를 4 내지 10 ℃로 조절하여 상기 온도감응성 하이드로젤의 팽창을 유도하는 단계; 및 상기 온도감응성 하이드로젤이 팽창된 세포 배양기판을 상기 목표체로부터 분리하는 단계;를 포함하는 세포시트의 전달방법을 제공한다.

본 발명에 따른 세포 배양기판은 온도변화에 따라 팽윤과 수축을 가역적으로 나타내는 온도감응성 하이드로젤 상에 형성된 폴리카테콜계 고분자 패턴을 따라 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도되어 세포시트의 형태를 자유롭게 조절할 수 있는바 복잡한 인체 조직의 구조 및 기능의 모사가 용이하며, 또한 세포시트의 형태 및 기능을 유지하면서 상기 하이드로젤로부터 빠른 시간 내에 세포시트를 분리함과 동시에 목표체로의 전달을 가능하게 하는바, 의료용 세포전달, 치료 시스템 및 세포기반 재생의학용 인공조직 이식체로의 응용이 가능한 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 세포 배양기판의 제조공정 및 세포시트 전달 시스템을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포 배양기판을 이용하여 세포시트를 전달하는 방법 및 원리를 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판을 제조 시, PDMS 상에 폴리도파민 코팅 전과 후, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성 후의 PDMS 표면의 물에 대한 접촉각의 변화를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판을 제조 시, PDMS 상에 폴리도파민을 코팅하는 시간에 따른, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성 전과 후의 PDMS 표면의 물에 대한 접촉각의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판을 제조 시, PDMS 상에 폴리도파민을 코팅하는 시간에 따른, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성 전과 후의 PDMS 표면에 존재하는 아민 그룹의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판을 제조 시, 일면에 패턴의 폭과 간격이 50/50 ㎛, 100/100 ㎛, 200/200 ㎛인 패턴이 형성된 PDMS의 표면에 대한 SEM 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판을 제조 시, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성 후의 온도감응성 하이드로젤의 표면에 대한 광학현미경 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판을 제조 시, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성 후의 온도 변화에 따른 패턴 폭의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판 상에 섬유아세포(fibroblast)를 분주 후 시간에 따른 온도감응성 하이드로젤의 표면, 세포시트의 목표체(커버글래스)로의 전달 후의 온도감응성 하이드로젤과 목표체의 표면에 대한 SEM 이미지이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 섬유아세포 세포시트를 목표체로 전달 후, 전달된 세포시트를 형광염색을 통해 시각화하여 이미지를 분석한 결과로서, (a)는 폴리도파민 패턴에 대한 세포시트의 충실도(fidelity), (b)는 세포시트의 패턴 폭, (c)는 세포시트를 구성하는 섬유아세포 핵의 종횡비(aspect ratio), (d)는 기준 축 대비 섬유아세포 핵의 장축 간 각도를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판 상에 근아세포(myoblast)를 분주 후 시간에 따른 온도감응성 하이드로젤의 표면, 세포시트의 목표체(커버글래스)로의 전달 후의 온도감응성 하이드로젤과 목표체의 표면에 대한 SEM 이미지이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 근아세포 세포시트를 목표체로 전달 후, 전달된 세포시트를 형광염색을 통해 시각화하여 이미지를 분석한 결과로서, (a)는 폴리도파민 패턴에 대한 세포시트의 충실도(fidelity), (b)는 세포시트의 패턴 폭, (c)는 세포시트를 구성하는 근아세포 핵의 종횡비(aspect ratio), (d)는 기준 축 대비 근아세포 핵의 장축 간 각도를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 폴리도파민 패턴의 폭과 간격이 100/100 ㎛인 배양기판에서 형성된 근아세포 세포시트를 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 전기방사 나노섬유 지지체 상으로 전달 후, 전달된 세포시트의 형광현미경 이미지(a) 및 SEM 이미지(b)이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 폴리도파민 패턴의 폭과 간격이 100/100 ㎛인 배양기판에서 형성된 근아세포 세포시트를, 이미 근아세포 세포시트가 전달된 커버글래스 상으로 전달 후의 광학현미경 이미지(a) 및 형광현미경 이미지(b)이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판 상에 근아세포(myoblast)를 분주 및 배양하여 근아세포를 근육세포로 분화시키는 과정에서 시간에 따른 온도감응성 하이드로젤의 표면, 분화된 근아세포 세포시트의 목표체(커버글래스)로의 전달 후의 온도감응성 하이드로젤과 목표체의 표면에 대한 SEM 이미지이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 분화된 근아세포 세포시트를 목표체로 전달 후, 전달된 세포시트를 형광염색을 통해 시각화하여 이미지를 분석한 결과로서, (a)는 폴리도파민 패턴에 대한 세포시트의 충실도(fidelity), (b)는 세포시트를 구성하는 분화된 근아세포 핵의 종횡비(aspect ratio), (c)는 근아세포의 분화능 척도인 근관(myotube) 지수(index), (d)는 기준 축 대비 분화된 근아세포 핵의 장축 간 각도를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 온도변화에 따라 팽윤과 수축을 가역적으로 나타내는 온도감응성 하이드로젤 상에 생체고분자인 폴리카테콜(polycatechol)계 고분자 패턴이 형성되어 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도되도록 함으로써, 세포시트의 형태 및 기능을 유지하면서 온도감응성 하이드로젤로부터 빠른 시간 내에 세포 시트를 분리함과 동시에 목표체로 전달할 수 있는 세포 배양기판, 이의 제조방법 및 본 발명에 따른 세포 배양기판을 이용하여 세포시트를 전달하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 세포 배양기판은 온도감응성 하이드로젤; 상기 온도감응성 하이드로젤 상에 형성된 폴리카테콜(polycatechol)계 고분자 패턴;을 포함하고, 상기 폴리카테콜(polycatechol)계 고분자 패턴 상에 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도되는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 폴리카테콜계 고분자 패턴의 형태는 인체 조직의 구조 모사가 용이하도록 자유롭게 조절이 가능하며, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 의하면 상기 패턴의 폭은 50 내지 500 ㎛이고, 패턴의 간격은 50 내지 500 ㎛인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 패턴 형성에 사용된 생체고분자인 폴리카테콜계 고분자는 홍합의 족사에서 분비되는 접착 단백질에서 반복적으로 발견되는 카테콜기를 모방한 것으로서, 카테콜기가 여러 기질들과 접합성을 가지므로 여러 가지 기판의 표면에 코팅하여 재료에 관계없이 동일한 화학적 특성을 지니도록 표면을 개질할 수 있는 물질로 주목받고 있다. 본 발명에서는 상기 폴리카테콜계 고분자의 접착 능력을 이용하여, 세포 배양기판상에서 세포들이 폴리카테콜계 고분자 패턴을 따라 흡착되도록 함으로써 세포의 흡착을 지역특이적으로 조절하고자 한다.

본 발명에 사용되는 폴리카테콜계 고분자는 세포의 흡착을 유도할 수 있는 것이라면 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 폴리도파민(polydopamine), 폴리에피네프린(polyepinephrine), 폴리노르에피네프린(polynorepinephrine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 사용된 온도감응성 하이드로젤은 가교결합을 갖는 고분자로서, 온도변화에 따라 졸-겔 거동이 아닌 수축과 팽윤을 가역적으로 나타낸다. 이에 따라 저임계 용액온도(LCST, lower critical solution temperature) 미만에선 함수율이 증가하여 팽윤현상을, 저임계 용액온도 이상에서는 함수율이 감소하여 수축현상을 보이며 크기가 변화하는바, 하기 도 2에 도시된 바와 같이 본 발명에서는 이러한 하이드로젤의 온도감응성 성질을 이용하여 온도 조절만으로 세포 배양기판으로부터 세포시트의 형태 및 기능을 유지하면서 목표체로 세포시트를 용이하게 전달할 수 있다.

이때, 상기 온도감응성 하이드로젤은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 하기 식(Ⅱ)a로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 곁가지형(branched) 고분자, 하기 식(Ⅱ)b로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 스타형 고분자 및 하기 식(Ⅱ)c로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 선형 고분자에서 선택된 1종 이상의 고분자 혼합물에 당근 과산화효소와 과산화수소를 첨가시켜 페놀 유사체 간의 탈수소 결합을 통해 제조된다:

[반응식 1]

.

이때, 상기 온도감응성 하이드로젤은 페놀 유사체로 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드의 공중합체/티라민 컨쥬게이트에 당근 과산화효소와 과산화수소를 첨가하여 컨쥬게이트 사이의 탈수소 결합을 통해 가교결합을 형성하여 제조된 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드의 공중합체/티라민 컨쥬게이트 하이드로젤일 수 있다. 이때, 상기 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드의 공중합체로는 Pluronic, Poloxamer, Tetronic의 상품명을 갖는 공중합체가 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서 사용된 온도감응성 하이드로젤은 테트로닉-티라민 컨쥬게이트(Tetronic-tyramine, Tet-TA)는 실온(15 내지 25 ℃)에서 저임계 용액온도를 나타낸다.

또한, 본 발명에 따른 세포 배양기판의 제조방법은 일면에 패턴이 형성된 기판을 준비하는 단계; 상기 기판 상에 폴리카테콜계 고분자를 코팅하는 단계; 및 상기 폴리카테콜계 고분자가 코팅된 기판을 온도감응성 하이드로젤의 표면과 접촉시켜, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리카테콜계 고분자 패턴을 형성하는 단계;로 구성된다(도 1).

구체적으로, 먼저 일면에 패턴이 형성된 기판을 준비한다. 이때, 상기 기판은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 유리, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 하기 실시예에서 사용한 바와 같이, 일면에 폭 50 내지 500 ㎛이고, 간격이 50 내지 500 ㎛인 패턴이 형성된 실리콘 기판을 주형으로 PDMS를 경화 및 분리하여 제조된 PDMS 기판을 사용하는 것이 바람직하다.

다음으로, 상기 기판 상에 폴리카테콜계 고분자를 코팅하게 된다. 이때 고분자의 코팅은 약염기성 조건에서 수행되는 자가중합반응(self-polymerization)을 통해 수행할 수 있으며, 상기 폴리카테콜계 고분자는 상기 세포 배양기판에서 설명한 바와 동일한바, 세포의 흡착을 유도할 수 있는 것이라면 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 폴리도파민(polydopamine), 폴리에피네프린(polyepinephrine), 폴리노르에피네프린(polynorepinephrine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

마지막으로, 상기 폴리카테콜계 고분자가 코팅된 기판을 온도감응성 하이드로젤의 표면과 접촉시켜, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리카테콜계 고분자 패턴을 형성하는 단계를 통해 본 발명에 따른 세포 배양기판을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 세포시트의 전달방법은 본 발명에 따른 세포 배양기판에 세포를 분주 및 배양하여 상기 세포 배양기판의 폴리카테콜계 고분자 패턴을 따라 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도된 마이크로 사이즈의 세포시트를 형성시키는 단계; 상기 마이크로 사이즈의 세포시트가 형성된 세포 배양기판을 목표체에 접촉시킨 후 온도를 4 내지 10 ℃로 조절하여 상기 온도감응성 하이드로젤의 팽창을 유도하는 단계; 및 상기 온도감응성 하이드로젤이 팽창된 세포 배양기판을 상기 목표체로부터 분리하는 단계;로 구성된다.

이때, 본 발명에 따른 세포 배양기판에서 배양되는 세포는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 간, 신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도, 내장, 귀, 피부, 쓸개조직, 전립선, 방광, 배아, 면역계 및 조혈계 등으로부터 분리되거나 활성화할 수 있는 세포를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 근아세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 연골세포, 간세포, 골아세포, 신장세포, 지방세포, 각막상피세포, 줄기세포, 신경세포, 각질세포, 근육세포, 심장근육세포 및 식도상피세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 배양할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 배양기판은 온도감응성 하이드로젤 상에 세포를 흡착할 수 있는 폴리카테콜계 고분자 패턴이 형성되어 있는바, 배양기판에 세포를 분주하면 상기 세포들은 폴리카테콜계 고분자 패턴을 따라 흡착되어 배양되는바, 패턴의 형태에 따라 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도될 수 있다.

세포의 배양은 온도감응성 하이드로젤의 저임계 용액온도 이상에서 이루어지며(예를 들어 37 ℃), 이때 세포 측의 수용체(예를 들어 인테그린)는 배양기판의 패턴에 포함된 폴리카테콜계 고분자와 상호작용을 통해 연결되어 있다. 이때, 배양기판상에서 세포가 흡착 및 배양되어 세포시트를 형성한 후, 전달하고자 하는 목표체에 세포시트의 표면을 접촉시킨 뒤에 배양기판의 온도를 저임계 용액온도 이하로 낮추어 주면, 온도감응성 하이드로젤은 팽창하게 되고, 폴리카테콜계 고분자와 세포 측의 수용체 사이의 거리가 멀어지면서 배양기판으로부터 세포시트가 분리됨과 동시에 목표체로 세포시트가 전달된다(도 2).

본 발명에 따른 세포시트의 전달방법은 세포시트 형성 후 목표체와의 직접적인 접촉을 통해 전달하는바, 배양기판의 온도감응성 하이드로젤 표면으로부터 분리됨과 동시에 목표체로 전달할 수 있어 세포시트의 형태 및 기능이 변형되는 것을 방지할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 세포 배양기판 및 세포시트 전달방법을 이용하면 온도 변화에 따라 팽윤과 수축을 가역적으로 나타내는 온도감응성 하이드로젤 상에 형성된 폴리카테콜계 고분자 패턴을 따라 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도되어 세포시트의 형태를 자유롭게 조절할 수 있는바 복잡한 인체 조직의 구조 및 기능의 모사가 용이하며, 또한 세포시트의 형태 및 기능을 유지하면서 상기 하이드로젤로부터 빠른 시간 내에 세포시트를 분리함과 동시에 목표체로의 전달을 가능하게 하는바, 의료용 세포전달, 치료 시스템 및 세포기반 재생의학용 인공조직 이식체로의 응용이 가능한 장점이 있다.

이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1.

(1) 일면에 패턴이 형성된 PDMS 기판의 제조

먼저, 레이저 빔을 이용하여 실리콘 기판에 깊이 15 ㎛, 패턴의 폭과 패턴의 간격이 각각 50 ㎛(50/50 ㎛로 표시)가 되도록 각인하였다. 상기 패턴이 각인된 실리콘 기판 상에 폴리디메틸실록산(PDMS) 프리폴리머 혼합물을 붓고 95 ℃에서 열 경화(폴리머:경화제 = 10:1)한 후 박리하여 일면에 50/50 ㎛ 패턴이 형성된 PDMS 기판을 제조하였다. 상기 기판은 폴리도파민 코팅 전 70% 에탄올에서 30 분 동안 자외선 조사를 통해 멸균시킨 후 증류수로 표면을 세척 후 상온에서 건조하였다.

(2) 폴리도파민 코팅

먼저, 도파민(dopamine hydrochloride, Sigma-Aldrich 사)을 pH 8.5, 10 mM의 트리스 완충액(Tris-base, Tris-HCl, Sigma-Aldrich 사)에 2 mg/ml 농도로 용해시켜 폴리도파민 용액을 제조하였다. 다음으로, 상기 (1)에서 제조한 PDMS 기판을 6 well plate(직경 35 mm) 크기로 자른 후 상기 폴리도파민 용액 5 ml을 도포하여 1, 2, 3 시간 동안 중합 및 코팅하였다. 상기 폴리도파민 코팅 후 폴리도파민 용액을 제거하고 상온에서 자연 건조시킨 후 10 mm의 원형 펀치를 이용하여 폴리도파민이 코팅된 PDMS 기판을 잘랐다.

(3) 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성

먼저, 공개특허 제2010-0076163호에 개시된 바에 따라 테트로닉 말단의 hydroxy 작용기를 p-니트로페닐 틀로로포메이트(PNC)와 반응시킨 후 티라민과 반응시켜 테트로닉-티라민 컨쥬게이트(Tet-TA)를 제조하였다. 다음으로 Tet-TA를 15%로 0.1 wt%의 과산화수소 용액과 0.0025 mg/ml의 당근 과산화효소(HRP)에 각각 녹인 용액을 1:1의 비율로 섞은 뒤 주사기를 통해 1 mm의 틈을 가진 유리 판 사이에 주입하여 15분 동안 가교 후 8 mm biopsy punch를 이용하여 하이드로젤을 원형으로 잘라내었다. 원형의 하이드로젤을 70% 에탄올 용액에서 자외선을 30분 동안 조사하여 멸균하였으며 37 ℃의 PBS로 5회 세척하였다. 세척한 원형의 하이드로젤을 24 well tissue culture plate(지름 15 mm)의 중앙에 위치시킨 후 상기 (2)에서 제조한 폴리도파민이 코팅된 PDMS 기판을 수직으로 내려 패턴면과 하이드로젤 표면이 맞닿도록 접촉시켰다. 2분 후 하이드로젤로부터 PDMS 기판을 분리하여 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴이 형성된 세포 배양기판을 제조하였으며 이후 37 ℃의 PBS에 보관하였다.

실시예 2.

상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하되, 패턴의 폭과 간격을 100 ㎛(100/100 ㎛로 표시)로 하여 세포 배양기판을 제조하였다.

실시예 3.

상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하되, 패턴의 폭과 간격을 200 ㎛(200/200 ㎛로 표시)로 하여 세포 배양기판을 제조하였다.

실험예 1.

본 발명에 따른 세포 배양기판 제조 시 PDMS 기판 상에 폴리도파민을 코팅하는 시간에 따른 물 접촉각의 변화 및 하이드로젤 상에 패턴 형성 전후의 PDMS 기판의 표면 변화를 관찰하여 폴리도파민의 코팅 여부 및 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성 여부를 확인하였다. 실험은 패턴의 폭과 간격을 따로 형성시키지 않고 PDMS 기판의 전면에 폴리도파민을 코팅한 후 표면의 변화를 관찰하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판을 제조 시, PDMS 상에 폴리도파민 코팅 전과 후, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성 후의 PDMS 표면의 물에 대한 접촉각의 변화를 도시한 도면이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판을 제조 시, PDMS 상에 폴리도파민을 코팅하는 시간에 따른, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성 전과 후의 PDMS 표면의 물에 대한 접촉각의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이 폴리도파민이 코팅되지 않은 PDMS 기판은 물 접촉각이 101.56±2.77°로 측정되었으나 폴리도파민을 1 시간부터 3 시간까지 1시간 간격으로 코팅한 후에는 각각 68.67±4.29°, 56.27±3.72°, 53.88±5.38°로 측정되어 PDMS 기판 표면의 친수성이 증가함을 확인하였으며, 이를 통해 PDMS 기판 상에 폴리도파민이 원활하게 코팅됨을 알 수 있었다. 또한, 마이크로 컨택 프린팅을 통해 온도감응성 하이드로젤 표면에 폴리도파민 패턴을 형성한 후의 PDMS 기판의 표면의 접촉각은 폴리도파민의 코팅 시간(1-3 시간)에 따라 각각 73.14±1.58°, 73.25±5.65°, 71.28±6.14°로 측정되었는바, 마이크로 컨팩 프린팅 전보다 증가한 물 접촉각을 보였는바 이를 통해 마이크로 컨택 프린팅으로 인한 폴리도파민의 전송으로 인해 PDMS 기판 표면의 소수성이 증가하였음을 알 수 있다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 배양기판을 제조 시, PDMS 상에 폴리도파민을 코팅하는 시간에 따른, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리도파민 패턴 형성 전과 후의 PDMS 표면에 존재하는 아민 그룹의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5에 나타난 바와 같이 PDMS 기판 표면은 폴리도파민의 코팅으로 인해 폴리도파민 내의 아민그룹의 함량이 증가하는 것을 확인하였으며, 마이크로 컨택 프린팅을 통해 온도감응성 하이드로젤 상으로 폴리도파민 패턴을 전달한 후에는 PDMS 기판 표면에 존재하는 아민 그룹의 함량이 감소하였는바, 이를 통해 PDMS 기판으로부터 온도감응성 하이드로젤 상으로 폴리도파민 패턴이 잘 전달되었음을 확인하였다.

실험예 2.

상기 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 세포 배양기판의 온도감응성 하이드로젤 상의 폴리도파민 패턴 형성 여부를 관찰하였다.

도 6은 실시예 1(패턴의 폭과 간격이 50/50 ㎛), 실시예 2(100/100 ㎛), 실시예 3(200/200 ㎛)에 따라 세포 배양기판을 제조 시, 일면에 패턴이 형성되어 있는 PDMS 표면에 대한 SEM 이미지이다.

도 7 내지 8은 마이크로 컨택 프린팅을 통해 폴리도파민이 코팅된 PDMS 기판으로부터 전달받은 폴리도파민 패턴 형성 후의 온도 변화에 따른 온도감응성 하이드로젤의 표면에 대한 광학현미경 이미지 및 패턴 폭의 변화를 나타낸 그래프이다.

이를 통해 PDMS 기판 표면의 폴리도파민 코팅과 동일한 패턴이 온도감응성 하이드로젤 상에 형성되었음을 확인할 수 있었으며, 패턴의 폭이 50/50 ㎛, 100/100 ㎛, 200/200 ㎛인 세포 배양기판의 패턴 폭이 37 ℃에서는 각각 51.50±1.30°, 105.91±3.19°, 209.33±6.69°로 측정되었으며, 온도가 4 ℃로 낮아졌을때에는 하이드로젤의 팽창으로 인하여 68.44±1.08°, 133.68±7.03°, 252.80±4.34°로 패턴의 폭이 증가함을 확인하였다. 이는 표면의 추가적인 패턴형성이 세포의 전달에서 중요한 하이드로젤의 온도감응성에 대한 저해 효과가 없음을 증명한다.

실험예 3.

먼저, 본 발명에 따른 세포 배양기판 상에 섬유아세포와 근아세포를 각각 배양하였다. 먼저 섬유아세포 (human dermal fibroblast), 근아세포 (C2C12, myoblast)는 10 % fetal bovine serum (FBS), 1 % 페니실린이 첨가된 High glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium를 배양액으로 하여 tissue culture plate에서 배양하였다(37 , 5% CO₂). 섬유아세포, 근아세포는 trypsin-EDTA (0.05%)과 3분 배양하여 단일 세포로 획득 한 후 1 x 10⁵ cells/cm²의 밀도로 세포 배양기판의 하이드로젤 위에 도포한 후 하이드로젤 상에서 24 시간 동안 배양하여 세포시트를 형성하는 과정을 관찰하였다.

세포시트가 전달되는 목표체로는 커버글래스, poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) 전기방사 나노섬유 지지체를 이용하였으며, 상기 목표체는 20 ㎍/ml의 파이브로넥틴 (fibronectin) 용액을 2시간 처리하여 파이브로넥틴이 코팅되도록 하였다. 마이크로 세포시트가 형성된 세포 배양기판을 목표체에 엎어서 세포패치와 목표체의 표면이 맞닿도록 배치한 후 4 ℃에서 10분 동안 배양하여 하이드로젤의 팽창을 유도한 후 팽창된 하이드로젤을 포셉으로 목표체로부터 분리함과 동시에 목표체로 세포시트를 전달하였다.

도 9 및 도 11은 본 발명에 따른 세포 배양기판 상에 섬유아세포(fibroblast)(도 9) 및 근아세포(myoblast)(도 11)를 각각 분주 후 시간에 따른 온도감응성 하이드로젤의 표면, 세포시트의 목표체(커버글래스)로의 전달 후의 온도감응성 하이드로젤과 목표체의 표면에 대한 SEM 이미지를 나타내며 이를 통해 세포시트의 형성 과정 및 세포시트의 전달여부를 관찰하였다.

도 9 및 도 11에 나타난 바와 같이 세포 배양 후 6시간에서는 세포의 흡착이 충분히 일어나지 않아 패턴이 없는 부분에도 세포들이 존재함을 확인할 수 있고, 12 시간에서는 패턴을 따라 세포들이 흡착하여 세포시트를 형성하고 있으나 패턴이 없는 부분에서 흡착을 못한 채 부유하고 있는 세포들이 존재하는 것을 확인할 수 있으며, 세포 배양 후 24 시간에서는 세포시트가 패턴을 따라 안정하게 형성되어 있음을 확인할 수 있다. 또한, 목표체인 커버글래스로 세포시트가 전달된 후 목표체의 표면은 세포시트가 형태를 유지한 채로 전달되었음을 확인할 수 있으며, 하이드로젤 표면에는 폴리도파민 패턴만이 관찰되었을뿐 잔존하는 세포가 거의 관찰되지 않았는바, 배양된 세포시트가 안정적으로 형태를 유지하면서 세포 배양기판으로부터 목표체로 전송되었음을 확인하였다.

실험예 4.

상기 실험예 3을 통해 목표체인 커버글래스 표면으로 전송된 세포시트를 형광염색을 통해 시각화한 후 이미지를 분석하였으며 그 결과를 하기 도 10 및 도 12에 나타내었다.

도 10 및 도 12는 섬유아세포(도 10) 및 근아세포(도 12) 세포시트를 목표체로 전달 후, 전달된 세포시트를 형광염색을 통해 시각화하여 이미지를 분석한 결과로서, (a)는 폴리도파민 패턴에 대한 세포시트의 충실도(fidelity), (b)는 세포시트의 패턴 폭, (c)는 세포시트를 구성하는 섬유아세포 및 근아세포 핵의 종횡비(aspect ratio), (d)는 기준 축 대비 섬유아세포 및 근아세포 핵의 장축 간 각도를 나타낸다.

구체적으로, 패턴의 폭과 간격이 50/50 ㎛인 그룹에서는 패턴이 존재하는 위치에서 약 20개의 세포수가 관찰된 반면 패턴이 없는 위치에서는 약 5-7개의 세포수를 보였다. 패턴의 폭과 간격이 100/100, 200/200 ㎛인 그룹에서는 패턴이 존재하는 위치에서 각각 약 40, 80개의 세포구가 관찰되었으며 패턴이 없는 위치에서는 3개 이하의 세포수가 관찰되었는바, 패턴의 폭과 간격이 넓을수록 세포시트의 형태가 더 안정적으로 유지됨을 확인하였다.

다음으로, 세포시트를 구성하는 섬유아세포 및 근아세포 핵의 종횡비(aspect ratio)는 패턴의 폭과 간격이 50/50, 100/100, 200/200 ㎛인 그룹에서 각각 1.62±0.27, 1.54±0.22, 1.57±0.27로 유사하게 측정되었으며, 기준 축 대비 섬유아세포 및 근아세포 핵의 장축 간 각도는 패턴의 폭과 간격이 50/50 ㎛인 그룹에서는 대부분 ±30 °내로 수렴한 반면, 100/100, 200/200 ㎛로 패턴의 폭과 간격이 넓어질수록 수렴의 정도가 작아짐을 확인하였다. 이러한 현상들은 본 발명의 세포 배양기판이 표면에 형성된 패턴의 종류에 따라 세포의 배열을 조절함으로써 특정 조직의 구조적인 특성을 효율적으로 모사하는 시스템으로 사용될 수 있음을 암시한다.

실험예 5.

도 13은 폴리도파민 패턴의 폭과 간격이 100/100 ㎛인 배양기판에서 형성된 근아세포 세포시트를 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 전기방사 나노섬유 지지체 상으로 전달 후, 전달된 세포시트의 형광현미경 이미지(a) 및 SEM 이미지(b)이다.

이를 통해 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 전기방사 나노섬유 지지체 상에 세포시트의 형태 및 기능이 안정적으로 유지되면서 전달되었음을 확인하였다. 이는 마이크로 사이즈의 세포시트가 글래스 위와 같은 플랫한 표면 위 뿐만 아니라 세포외기질 구조와 유사한 나노섬유형 지지체를 비롯한 다양한 표면구조를 지닌 목표체에도 전달이 될 수 있음을 의미한다.

실험예 6.

도 14는 폴리도파민 패턴의 폭과 간격이 100/100 ㎛인 배양기판에서 형성된 근아세포 세포시트를, 이미 근아세포 세포시트가 전달된 커버글래스 상으로 전달 후의 광학현미경 이미지(a) 및 형광현미경 이미지(b)이다.

이를 통해, 이미 세포시트가 전달된 목표체에도 별개의 세포시트가 형태 및 기능을 안정적으로 유지하면서 전달될 수 있음을 확인하였다. 이는 마이크로 사이즈의 세포시트가 전달된 표면 위에 또 다른 마이크로 사이즈의 세포시트가 적층되는 형식으로 전달이 될 수 있음을 보여주는 것으로, 인체 내 조직은 한가지 세포층으로만 형성되어 있지 않으며 또한 적층된 세포층이 서로 다른 각도로 나열되어 있는 경우가 많은 것을 고려할 때, 이러한 결과는 서로 다른 각도의 마이크로 세포시트기 적층되면서 인체 내 조직에 효율적으로 전달될 수 있음을 의미한다.

실험예 7.

도 15는 본 발명에 따른 세포 배양기판 상에 근아세포(myoblast)를 분주 및 배양하여 근아세포를 근육세포로 분화시키는 과정에서 시간에 따른 온도감응성 하이드로젤의 표면, 분화된 근아세포 세포시트의 목표체(커버글래스)로의 전달 후의 온도감응성 하이드로젤과 목표체의 표면에 대한 SEM 이미지이다.

도 16은 분화된 근아세포 세포시트를 목표체로 전달 후, 전달된 세포시트를 형광염색을 통해 시각화하여 이미지를 분석한 결과로서, (a)는 폴리도파민 패턴에 대한 세포시트의 충실도(fidelity), (b)는 세포시트를 구성하는 분화된 근아세포 핵의 종횡비(aspect ratio), (c)는 근아세포의 분화능 척도인 근관(myotube) 지수(index), (d)는 기준 축 대비 분화된 근아세포 핵의 장축 간 각도를 나타낸다.

근육세포의 경우 분화가 유도될 때 여러 개의 핵으로 이루어진 근관을 형성하며 이들 근관의 배열이 근육의 기능을 유지하는데 중요한 역할을 하게 되는바, 하기 도 15 내지 16을 통해 근관의 배열이 단방향으로 유지되고 있는 것을 확인하였고, 이를 통해 본 발명에 따른 세포 배야기판 상에서 근아세포가 근육세포로 분화될 수 있음을 확인함과 동시에 분화 후의 세포시트가 목표체로 그 형태와 기능을 안정적으로 유지하면서 전달될 수 있음을 확인하였다.

Claims

온도감응성 하이드로젤; 상기 온도감응성 하이드로젤 상에 형성된 폴리카테콜(polycatechol)계 고분자 패턴;을 포함하고,
상기 폴리카테콜(polycatechol)계 고분자 패턴 상에 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도되는 것을 특징으로 하는 세포 배양기판.
제1항에 있어서,
상기 폴리카테콜계 고분자 패턴의 폭은 50 내지 500 ㎛이고, 패턴의 간격은 50 내지 500 ㎛인 것을 특징으로 하는 세포 배양기판.
제1항에 있어서,
상기 폴리카테콜계 고분자는 폴리도파민(polydopamine), 폴리에피네프린(polyepinephrine), 폴리노르에피네프린(polynorepinephrine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양기판.
제1항에 있어서,
상기 온도감응성 하이드로젤은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 하기 식(Ⅱ)a로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 곁가지형(branched) 고분자, 하기 식(Ⅱ)b로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 스타형 고분자 및 하기 식(Ⅱ)c로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 선형 고분자에서 선택된 1종 이상의 고분자 혼합물에 당근 과산화효소와 과산화수소를 첨가시켜 페놀 유사체 간의 탈수소 결합을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 세포 배양기판:
[반응식 1]

.
제1항에 있어서,
상기 온도감응성 하이드로젤은 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드의 공중합체/티라민 컨쥬게이트 하이드로젤인 것을 특징으로 하는 세포 배양기판.
제1항에 있어서,
상기 세포는 근아세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 연골세포, 간세포, 골아세포, 신장세포, 지방세포, 각막상피세포, 줄기세포, 신경세포, 각질세포, 근육세포, 심장근육세포 및 식도상피세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양기판.
일면에 패턴이 형성된 기판을 준비하는 단계;
상기 기판 상에 폴리카테콜계 고분자를 코팅하는 단계; 및
상기 폴리카테콜계 고분자가 코팅된 기판을 온도감응성 하이드로젤의 표면과 접촉시켜, 온도감응성 하이드로젤 상에 폴리카테콜계 고분자 패턴을 형성하는 단계;를 포함하는 세포 배양기판의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 패턴의 폭은 50 내지 500 ㎛이고, 패턴의 간격은 50 내지 500 ㎛인 것을 특징으로 하는 세포 배양기판의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 폴리카테콜계 고분자 코팅은 약염기성 조건에서 수행되는 중합 반응인 것을 특징으로 하는 세포 배양기판의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 기판은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 유리, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양기판의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 폴리카테콜계 고분자는 폴리도파민(polydopamine), 폴리에피네프린(polyepinephrine), 폴리노르에피네프린(polynorepinephrine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양기판의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 온도감응성 하이드로젤은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 하기 식(Ⅱ)a로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 곁가지형(branched) 고분자, 하기 식(Ⅱ)b로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 스타형 고분자 및 하기 식(Ⅱ)c로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 선형 고분자에서 선택된 1종 이상의 고분자 혼합물에 당근 과산화효소와 과산화수소를 첨가시켜 페놀 유사체 간의 탈수소 결합을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 세포 배양기판의 제조방법:
[반응식 1]

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제7항에 있어서,
상기 온도감응성 하이드로젤은 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드의 공중합체/티라민 컨쥬게이트 하이드로젤인 것을 특징으로 하는 세포 배양기판의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 세포는 근아세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 연골세포, 간세포, 골아세포, 신장세포, 지방세포, 각막상피세포, 줄기세포, 신경세포, 각질세포, 근육세포, 심장근육세포 및 식도상피세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양기판의 제조방법.
제1항에 따른 세포 배양기판에 세포를 분주 및 배양하여 상기 세포 배양기판의 폴리카테콜계 고분자 패턴을 따라 세포의 흡착이 지역특이적으로 유도된 마이크로 사이즈의 세포시트를 형성시키는 단계;
상기 마이크로 사이즈의 세포시트가 형성된 세포 배양기판을 목표체에 접촉시킨 후 온도를 4 내지 10 ℃로 조절하여 상기 온도감응성 하이드로젤의 팽창을 유도하는 단계; 및
상기 온도감응성 하이드로젤이 팽창된 세포 배양기판을 상기 목표체로부터 분리하는 단계;를 포함하는 세포시트의 전달방법.