KR101575226B1 - 폴리도파민이 결합된 생리활성 펩타이드로 고정화된 고분자 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리도파민 코팅을 기반으로 단백질/펩타이드가 고정화된 조직공학 고분자 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것이며, 본 발명에 따른 고분자 지지체는 생리활성을 가진 단백질 유래 펩타이드 및 폴리도파민을 연결시킨 고분자 지지체로써, 기존의 지지체에 비해 생리활성을 보유한 단백질/펩타이드를 표면에 효과적으로 고정화하여 줄기세포의 증식 향상, 신경줄기세포의 신경세포로 우수한 분화 및 부착이 가능하다. 또한, 고분자 지지체 표면에 다양한 생리활성물질을 안정적으로 고정화시킬 수 있기 때문에 줄기세포를 이용한 다양한 조직이식 치료의 가능성을 제시한다.

Description

폴리도파민이 결합된 생리활성 펩타이드로 고정화된 고분자 지지체 및 이의 제조방법{Polydopamine-linked bioactive peptide-immobilized scaffold materials and the method for preparing the same}
본 발명은 폴리도파민이 결합된 생리활성 펩타이드로 고정화된 고분자 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근에는, 재생의학과 관련하여 인체이식이 가능한 인공조직 개발을 위한 조직공학적인 기초 및 응용기술의 개발이 활발히 진행되고 있다. 특히, 세포 이식용 생체적합 삼차원적 지지체의 개발 및 줄기세포의 증식과 분화에 대한 연구는 핵심적인 연구 분야이다. 인체 조직을 재생시키기 위해 사용되는 지지체 재료는 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원 구조를 가진 조직으로 형성될 때까지 기질 또는 틀의 역할을 원활히 수행해야 하며, 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 중간 매개체 역할도 필요로 한다. 또한, 이식된 세포가 정상 기능을 보여주게 되면 시간이 지남에 따라 생체 내에서 완전히 분해되어 사라지는 생분해성도 갖추어야 한다.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 여러 종류의 결합조직의 수선세포(repair cell)로 알려져 있으며, 이들 세포는 중간엽계의 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다. 미분화된 중간엽 줄기세포는 이식 조직 내에서 다른 형태의 세포로 분화할 수 있는 능력이 있어서 생체 내에서 이형조직이 형성될 위험이 있기 때문에 사용에 제한성이 있는 실정이다. 최근에는 줄기세포의 세포분화능을 향상시키기 위하여 고분자 지지체 내에 성장인자나 리간드 펩타이드와 같은 생리활성물질을 포함시키는 다양한 연구들이 시도되었는데, 성장인자를 이용하여 세포를 활성화시키는 방법(T. Motoki 등, Cell and Tissue Research 285: 205, 1996), 거품형성/염 침출을 이용하여 성장인자를 방출하는 방법(J.J. Yoon 등, Biomaterials 24: 2323, 2003), 성장인자를 함유한 다공성 젤라틴 미립구를 이용하여 골 조직을 형성하는 방법(Z.S. Patel 등, Bone 43: 931, 2008) 등이 보고되었다.
하지만, 상기 방법들은 비교적 복잡한 제조과정을 거쳐야 하고, 고분자 열분해 등을 통해 표면을 개질할 때 분자량이 낮은 고분자의 경우 다공성 생분해성 고분자 지지체의 변형이 유발되기도 하며, 세포의 증식이나 분화를 유도할 수 있는 기능에 있어서 특정 조직으로의 분화 및 조직재생 시 세포친화성이 저하되는 문제점을 가지고 있다. 또한, PLGA와 같은 고분자 표면에 생리활성을 보유한 단백질/펩타이드를 고정화하기 위하여 화학적 수식 방법 또는 물리적 흡착 방법을 사용하였으나, 화학적 수식 방법에 사용하는 화학물질(EDC, NHS)들이 고가이고 화학 반응 중 쉽게 분해되는 단점이 있으며, 물리적 흡착 방법은 고정화 효율이 매우 낮고 특이적 반응성이 좋지 않다는 단점이 있다.
본 발명자들은 폴리도파민 코팅한 고분자 지지체에 생리활성을 보유한 단백질/펩타이드를 효과적으로 고정화시키고, 이에 의한 인간 신경줄기세포의 우수한 부착 및 신경세포로의 분화를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폴리도파민 코팅을 기반으로 단백질/펩타이드가 고정화된 조직공학 고분자 지지체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 폴리도파민이 결합된 생리활성을 보유한 세포부착성 펩타이드를 고정화시킨 고분자 지지체를 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 세포부착성 펩타이드는 파이브로넥틴 또는 라미닌이고, 상기 파이브로넥틴은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드이고 상기 라미닌은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 펩타이드이며, 상기 펩타이드는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하며, 상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 상기 펩타이드는 줄기세포의 배양 효과를 포함하며, 상기 지지체의 표면은 친수성인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 고분자 지지체를 사용하여 신경줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 고분자 지지체에 도파민을 코팅시키는 단계; 및 생리활성을 보유한 펩타이드를 상기 지지체 표면에 고정화시키는 단계;를 포함하는, 생리활성을 가진 단백질 유래 펩타이드 및 폴리도파민을 연결시킨 고분자 지지체의 제조 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 도파민 코팅은 약염기성 조건(pH 8.5)에서 수행되는 중합 반응이고, 상기 생리활성을 보유한 펩타이드는 신경성장인자, 혈관성장인자 또는 세포부착성 펩타이드이며, 상기 세포부착성 펩타이드는 파이브로넥틴 또는 라미닌이며, 상기 파이브로넥틴은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드이고 상기 라미닌은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 펩타이드이며, 상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 "고분자 지지체"는 중합반응에 의해 형성된 고분자 물질로 이루어진 지지체를 의미하고, 상기 고분자는 이에 한정하지는 않지만 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)이 있다. 또한, 상기 고분자 지지체는 임상적으로 사용시에 pH 6~8인 생리적 용액(physiological solution)에 노출되었을 때 분해되는 성질인 "생분해성" 지지체를 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않지만 폴리락틱-글리콜산(PLGA)을 사용할 수 있으며, 이식된 세포가 조직으로서 목적하는 기능과 역할을 충분히 수행할 때까지 유지된 후 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 특성이다.
본 발명에서 "줄기세포"는 생체를 구성하는 서로 다른 세포나 장기로 성장 가능한 일종의 모세포 또는 전능세포를 의미하며, 배아줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.
본 발명에서 "세포부착펩타이드"는 세포가 접착될 수 있도록 하는 단백질이며, 신경성장인자(GDNF) 또는 세포부착성 펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 폴리도파민 코팅을 기반으로 단백질/펩타이드가 고정화된 조직공학 고분자 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 기존의 지지체에 비해 생리활성을 보유한 단백질/펩타이드를 표면에 효과적으로 고정화하여 신경줄기세포의 인간 신경세포로의 우수한 분화 및 부착이 가능하다. 또한, 표면에 다양한 생리활성물질을 안정적으로 고정화시킬 수 있기 때문에 다양한 조직이식 치료의 가능성을 제시한다.
도 1은 본 발명의 고분자 지지체를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 고분자 지지체의 표면을 분석한 결과를 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명의 고분자 지지체 표면에 고정화된 펩타이드와 단백질을 시각적으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 고분자 지지체 표면에 부착된 신경성장인자(GDNF) 또는 세포부착성 펩타이드가 고정화되어 유지되는 것을 ELISA 분석 또는 플루오레스카민 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 고분자 지지체 표면상에 신경성장인자(GDNF) 또는 세포부착성 펩타이드가 효율적으로 고정화되어 있음을 AFM 표면 분석 또는 전자주사현미경(SEM) 표면 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 고분자 표면이 신경성장인자(GDNF) 또는 세포부착성 펩타이드의 안정적인 부착에 의해 친수성으로 변화한 것을 보여주는 결과이다.
도 7은 본 발명의 신경성장인자 또는 세포부착성 펩타이드를 고정화한 폴리스티렌(PS) 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA) 고분자 지지체의 표면에서 배양한 인간 신경줄기세포의 부착 및 분화를 보여주는 결과이다.
도 8은 본 발명의 고분자 지지체 상에서 인간신경줄기세포, 인간중간엽줄기세포 및 인간혈관세포의 배양 및 증식을 보여주는 결과이다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
PLGA 고분자 지지체의 제조
1.1 폴리도파민 코팅
고분자 지지체 시료에 폴리도파민(PD, polydopamine)을 코팅하기 위해, 시료를 약염기성의 도파민 용액(농도: 2mg/ml in 10mM Tris-HCl, pH 8.5)에 담그고 18시간 동안 흔들면서 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 시료 표면을 증류수로 씻어주면서 시료 표면에 부착되지 않은 도파민을 제거하였다(도1).
1.2 펩타이드 및 성장인자 고정화
폴리도파민이 코팅된 고분자 필름 시료 상에 세포부착성 펩타이드(파이브로넥틴 서열: CGG RGD , KGG RGD , 라미닌 서열: CGG YIGSR , KGG YIGSR ) 또는 신경성장인자(NGF, GDNF)를 고정화하였다. 폴리도파민이 코팅된 시료에 1mg/ml 농도의 펩타이드 용액과 1ug/ml 농도의 성장인자 용액을 첨가하고 상온에서 12시간 동안 반응시켰다. 증류수로 필름 표면을 씻어내어 고정화되지 않은 펩타이드 및 성장인자를 제거하였다(도1).
1.3 시료 표면의 분석
광전자 분광기(XPS)를 통해 고분자 시료 표면의 화학적 원소 성분을 분석하고 정량화하였다. N 원소 및 S 원소 함량의 증가를 통해 고분자 지지체 표면상에서 성장인자 단백질 및 세포부착펩타이드의 효율적인 고정화를 확인하였다(도2). 펩타이드 및 성장인자 단백질의 고정화 정도를 정량하기 위해 반응 후 용액 내 남아 있는 부착되지 않은 펩타이드와 성장인자의 양을 각각 플루오레스카민(fluorescamine) 방법과 ELISA 방법을 통해 분석하였다. 고정화된 펩타이드와 단백질을 시각적으로 검출하기 위해 형광염료가 부착된 펩타이드(FITC-CGGRGD)와 단백질(Texas-Red-BSA)을 폴리도파민이 코팅된 표면에 고정화한 후 형광분석기를 통해 확인하였다(도3). ELISA 분석과 플루오레스카민 분석을 통해 지지체에 부착된 단백질 또는 펩타이드의 고정화가 유지됨을 확인하였다(도4). 고분자 지지체의 표면 형태와 표면의 조도는 원자간력현미경(AFM)과 전자주사현미경(SEM)으로 분석하여 신경성장인자 또는 세포부착성 펩타이드가 고분자 지지체 표면상에 효율적으로 고정화되어 있음을 확인하였다(도5). 또한, 고분자 지지체 표면상에서 물방울의 표면 접촉각을 측정하여 표면의 친수성 정도를 분석하여 신경성장인자 또는 세포부착성 펩타이드의 부착 및 고정화에 의해 고분자 지지체의 표면이 친수성으로 변화하는 것을 확인하였다(도6).
신경 줄기세포( Neural Stem Cell , NSC )의 배양
2.1 인간 신경줄기세포의 배양
인간 태아 유래 신경줄기세포는 대뇌피질로부터 분리하였다. 세포는 6.0 x 105/ml 농도로 부착시켰으며, 섬유아세포 성장인자(bFGF, 20 ng/ml), 표피성장인자
(EGF, 20 ng/ml), 백혈병억제인자(LIF, 10 ng/ml)와 N2 supplement를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) 배지, 5%의 이산화탄소 농도 및 37°C 조건에서 배양하였다.
2.2 마우스 신경줄기세포의 배양
마우스 태아 유래 신경줄기세포는 13일된 ICR 마우스의 배아로부터 분리하였다. 대뇌피질로부터 추출된 신경줄기세포는 6.0 x 105/ml 농도로 부착시켰으며, 섬유아세포 성장인자(bFGF, 20 ng/ml), 표피성장인자(EGF, 20 ng/ml)와 N2 suppleme
nt를 첨가한 DMEM/F12 배지, 5%의 이산화탄소 농도 및 37°C 조건에서 배양하였다.
2.3 인간 유도만능줄기세포 유래 신경줄기세포의 배양
인간 유도만능줄기세포로부터 분화된 신경줄기세포는 5.0 x 104/ml의 농도로 부착시켰으며, 섬유아세포 성장인자(bFGF,20 ng/ml), 표피성장인자(EGF,20 ng/ml)와 N2 supplement를 첨가한 DMEM/F12 배지, 5%의 이산화탄소 농도 및 37°C 조건에서 배양하였다.
펩타이드 /성장인자가 고정화된 고분자 필름 시료에서의 신경줄기세포 배양
인간 및 마우스 신경줄기세포는 2.0 x 105/ml 농도로, 인간 유도만능줄기세포 유래 신경줄기세포는 2.0 x 104/ml의 농도로 자발적 분화(spontaneous differen
tiation)를 유도하기 위해 bFGF, EGF, LIF 성장인자를 포함하지 않은 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. 코팅되지 않은 고분자 시료를 음성대조군으로, 매트리젤(matrigel)이 코팅된 고분자 시료는 양성대조군으로 사용하였다. 신경줄기세포 분화는 세포면역염색(immunocytochemistry)과 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(quantitative real-time polymerase chain reaction; qRT-PCR)을 통해 분석하였고 세포 증식은 알라마 블루(Alamar Blue) 방법으로 조사하였다.
신경 줄기세포 분화
4.1 세포 면역 염색(Immunohistochemistry)
고분자 시료 위에 배양한 신경줄기세포는 4%의 파라포름알데히드(para-form
aldehyde)로 15분간 고정화하고 0.1% Triton X-100으로 5분간 처리하여 세포 내로 항체 투과가 용이하게 하였다. 비특이적 항체 반응을 최소화하기 위해서 2%의 염소(goat) 혈청으로 45분간 blocking을 하고 4°C에서 일차 항체[mouse monoclonal anti-neuronal class III β-tubulin (Tuj1), mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP)]를 하룻밤 동안 반응시켰다. PBS용액으로 씻어준 후 형광염료가 부착된 이차 항체를 상온에서 45분간 반응시켰다. 세포핵은 4'-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 염색하였으며 세포 내 염색된 신호는 형광현미경으로 관찰하였다(도7a; A,C & 도7b; E,G).
4.2 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)
각각의 고분자 필름 시료 상에서 배양된 줄기세포로부터 RNA를 추출하였고, 분광광도계(UV-Vis spectrophotometer)를 사용하여 260 nm 파장에서 시료들의 흡광도를 측정함으로써 RNA 농도를 측정하였다. 역전사반응(reverse transcription)은 500 ng RNA로 수행하였으며, qRT-PCR 분석은 StepOnePlus Real-Time PCR System을 사용하여 진행하였다. TaqMan 유전자 발현 분석 진단 키트(assay kit)를 사용하여 분화된 신경줄기세포 내의 신경세포 마커(Tuj1) 및 성상교세포 마커(GFAP)의 유전자 발현을 정량하였다(도7a; B, D & 도7b; F, H). GDNF, NGF 성장인자 단백질 또는 YIGSR, RGD 펩타이드가 고정화된 폴리스티렌(PS) 및 폴리락틱-글리콜산(PLGA) 표면 상에서 배양된 신경줄기세포의 분화가 촉진되었음이 확인되었다.
인간 줄기세포 및 혈관세포의 부착 및 증식
폴리도파민을 이용하여 폴리스티렌(PS) 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA) 고분자 지지체의 표면에 다양한 성장인자 단백질(신경; GDNF, NGF, 혈관; VEGF, bFGF, 세포부착성펩타이드; RGD, YIGSR)을 고정화한 후, 인간 신경줄기세포, 인간 중간엽 줄기세포 및 인간 혈관세포를 배양하고 알라마 블루(Alamar Blue) 분석을 통해 각각의 세포의 증식을 조사하였다.
폴리도파민을 통해 성장인자 단백질 및 세포부착성 펩타이드가 부착된 고분자 지지체의 표면 상에서 배양된 줄기세포 및 혈관 세포는 일반적인 세포배양 표면
(단백질/펩타이드가 고정화되지 않은 표면)에서의 증식에 비해 향상된 증식능을 보여주었다(도8).
지금까지 예시적인 실시예를 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시예로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> YONSEI UNIVERSITY <120> Polydopamine-linked bioactive peptide-immobilized scaffold materials and the method for preparing the same <130> IPDB50347 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> HUMAN <400> 1 Cys Gly Gly Arg Gly Asp 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> HUMAN <400> 2 Lys Gly Gly Arg Gly Asp 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> HUMAN <400> 3 Cys Gly Gly Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> HUMAN <400> 4 Lys Gly Gly Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5

Claims (14)

  1. 세포부착성 펩타이드가 폴리도파민을 매개로 결합하여 고정화된 고분자 지지체로서, 상기 세포부착성 펩타이드는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 파이브로넥틴이며 신경줄기세포의 신경세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 세포부착성 펩타이드는 줄기세포의 증식을 향상시키는 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 지지체의 표면은 친수성인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체.
  8. 제 1항 및 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 고분자 지지체 상에서 신경줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.
  9. (a) 고분자 지지체에 도파민을 코팅시키는 단계; 및
    (b) 세포부착성 펩타이드를 상기 지지체 표면에 고정화시키는 단계;
    를 포함하고, 상기 세포부착성 펩타이드는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 파이브로넥틴인, 세포부착성 펩타이드 및 폴리도파민을 연결시킨 제 1항에 따른 고분자 지지체의 제조 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 도파민 코팅은 약염기성 조건에서 수행되는 중합 반응인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체의 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 9항에 있어서,
    상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고분자 지지체의 제조 방법.
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