KR101545217B1 - 줄기세포의 미분화 배양 및 분화 증진을 위한 폴리도파민-펩타이드 고정화 표면 기질 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리도파민 코팅을 기반으로 단백질/펩타이드가 고정화된 조직공학 고분자 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것이며, 본 발명에 따른 고분자 지지체는 세포부착성 또는 생리활성을 가진 단백질 유래 펩타이드 및 폴리도파민을 연결시킨 고분자 지지체로써, 기존의 지지체에 비해 세포부착성을 보유한 단백질/펩타이드가 고정화되어 있어 인간 전분화능 줄기세포의 증식 향상이 가능하고, 생리활성을 보유한 단백질/펩타이드를 표면에 효과적으로 고정화하여 중간엽 줄기세포의 골세포로 우수한 분화가 가능하다. 또한, 고분자 지지체 표면에 다양한 생리활성물질을 안정적으로 고정화시킬 수 있기 때문에 줄기세포의 분화 및 분화된 세포를 이용한 다양한 세포이식 치료의 가능성을 제시한다.

Description

줄기세포의 미분화 배양 및 분화 증진을 위한 폴리도파민-펩타이드 고정화 표면 기질 및 그 제조 방법{Polydopamine-peptide-immobilized Substrates for Feeder-free Maintenance and Enhanced Differentiation of Stem Cells and Methods for Preparing the Substrates}

본 발명은 줄기세포의 미분화 배양 및 분화 증진을 위한 폴리도파민-펩타이드 고정화 표면 기질 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

인간배아줄기세포 및 인간유도만능줄기세포를 포함하는 인간 전분화능 줄기세포의 미분화 증식 배양을 위한 기존의 방법은 대부분 동물유래의 지지세포(mouse embryonic fibroblast) 또는 매트리젤(Matrigel)과 같은 동물유래의 매트릭스를 이용하여 왔다.

기존의 방법에서 동물 유래 재료의 사용은 배양 공정을 까다롭고 어렵게 만들며 대량 생산을 위해 규모를 확대하는데 문제가 있다. 또한 배양 과정 시 동물 유래 전염성 바이러스/세균이 줄기세포 내로 감염되어 이를 치료제로 인간에 적용하였을 경우 인체 내로 이러한 병원성 바이러스 또는 세균이 전염될 수 있는 문제점이 존재한다. 이를 해결하기 위해서 폴리스티렌(polystyrene)과 같은 고분자 표면에 세포외기질 유래 펩타이드를 고정화하여 줄기세포의 배양에 사용하였는데, 펩타이드를 고정화하기 위해서 다양한 화학물질을 이용한 화학식 수식 방법 또는 물리적 흡착 방법이 많이 적용되었다. 대부분의 화학적 수식 방법은 고분자 표면의 복잡한 전처리 과정이 필요하고 펩타이드의 고분자 표면에 대한 고정화 효율이 낮은 문제가 발생한다. 한편, 물리적인 흡착 방법은 간단하지만 효율이 매우 낮고 특이적 반응성이 좋지 않은 문제가 있다.

본 발명의 목적은 홍합 유래의 접착물질인 폴리도파민 코팅 방법을 이용하여 세포 부착성 펩타이드를 쉽고 간편하게 고분자 기질 표면으로 도포하는 생체 모사 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 임상적용 가능한 줄기세포 치료제 개발을 위해 기존의 동물 유래 재료를 사용하지 않고 화학적으로 조성이 검증된 조건 하에서 인간 전분화능 줄기세포를 배양할 수 있으며, 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있는 배양 기질(substrate)을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 폴리도파민에 세포부착 펩타이드가 결합된 인간 전분화능 줄기세포 배양용 고분자 지지체 및 중간엽 줄기세포의 골세포 분화용 고분자 지지체에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예에서는 폴리도파민이 결합된 펩타이드로 고정화시킨 줄기세포 배양용 또는 줄기세포 분화용 복합체를 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 펩타이드는 세포부착성 펩타이드인 비트로넥틴이고, 상기 비트로넥틴은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드이며, 상기 줄기세포는 인간 전분화능 줄기세포이며, 상기 펩타이드는 상기 폴리도파민의 카테콜기에 화학적으로 결합되어 있으며, 상기 펩타이드는 이량체로 상기 폴리도파민에 결합되어 있으며, 상기 비트로넥틴은 인간 유도만능 줄기세포의 배양을 향상시키며, 상기 인간 전분화능 줄기세포의 배양은 지지세포 없이 배양하며, 상기 고분자는 폴리스티렌, 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 및 폴리락틱-글리콜산(PLGA)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 고분자 지지체 및 인간 유도만능 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서는 폴리도파민이 결합된 펩타이드로 고정화시킨 줄기세포 분화용 고분자 지지체를 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 펩타이드는 생리활성 펩타이드인 BMP-2이고, 상기 BMP-2는 서열번호 3으로 표시되는 펩타이드이며, 상기 BMP-2 펩타이드는 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화를 유도하는 펩타이드이며, 상기 지지체의 표면은 친수성이며, 상기 고분자는 폴리스티렌, 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 및 폴리락틱-글리콜산(PLGA)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 고분자 지지체 및 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서는 (a)고분자 지지체에 폴리도파민을 코팅시키는 단계; 및 (b) 상기 폴리도파민에 세포부착성 펩타이드를 결합시키는 단계;를 포함하는, 줄기세포 배양용 지지체의 제조 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 줄기세포는 인간 유도만능 줄기세포이고, 상기 세포부착성 펩타이드는 비트로넥틴이며, 상기 비트로넥틴은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드인 줄기세포 배양용 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서는 (a) 고분자 지지체에 폴리도파민을 코팅시키는 단계; 및 (b) 생리활성을 보유한 펩타이드를 상기 지지체 표면에 고정화시키는 단계;를 포함하는, 줄기세포 분화용 지지체의 제조 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 생리활성을 보유한 펩타이드는 BMP-2이고, 상기 BMP-2는 서열번호 3으로 표시되는 펩타이드이며, 상기 펩타이드는 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화용 지지체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 "고분자 지지체"는 중합반응에 의해 형성된 고분자 물질로 이루어진 지지체를 의미하고, 상기 고분자는 이에 한정하지는 않지만 폴리스티렌(PS), 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA)이 있다. 또한, 상기 고분자 지지체는 임상적으로 사용시에 pH 6~8인 생리적 용액(physiological solution)에 노출되었을 때 분해되는 성질인 "생분해성" 지지체를 포함할 수 있으며, 이에 한정하지는 않지만 폴리락틱-글리콜산(PLGA)을 사용할 수 있으며, 이식된 세포가 조직으로서 목적하는 기능과 역할을 충분히 수행할 때까지 유지된 후 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 특성이다.

본 발명에서 "줄기세포"는 생체를 구성하는 서로 다른 세포나 장기로 성장 가능한 일종의 모세포 또는 전능세포를 의미하며, 배아줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.

본 발명에서 "분화"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다.

본 발명에서 "세포부착 펩타이드"는 세포가 접착될 수 있도록 하는 단백질이며, 라미닌, 비트로넥틴 및 피브로넥틴을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 "생리활성 펩타이드"는 인간을 포함하는 포유동물에 투여되었을 때 유용한 생물학적 활성을 나타내는 펩타이드를 의미한다.

본 발명에 따른 폴리도파민-펩타이드 고분자 표면은 피더-프리 조건 하에서 사용되도록 개발된 배양 배지(mTeSR1)와 함께 인간 전분화능 줄기세포 (인간유도만능줄기세포) 배양에 적용되어 동물 유래의 지지세포 없이 성공적으로 인간유도만능줄기세포의 안정적인 부착 및 증식을 유도할 수 있다. 또한, 인간 전분화능 줄기세포의 계대 배양이 가능하여 임상적용 가능한 미분화상태의 전분화능 줄기세포를 효율적으로 증식시킬 수 있고, 중간엽 줄기세포의 골분화 유도를 향상시켜 골 조직 이식 및 재생 치료에 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 고정화된 고분자 지지체를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 고정화된 고분자 지지체의 표면을 분석한 결과 및 예측되는 구조를 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 고정화된 고분자 지지체 표면에 대한 인간 유도만능줄기세포의 부착 효율을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 고정화된 고분자 지지체 표면에 부착된 인간 유도만능줄기세포의 특성을 세포면역염색, AP 염색, RT-PCR 및 qPCR을 통해 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 세포부착성 펩타이드가 고정화된 고분자 지지체 표면상에 부착된 인간 유도만능줄기세포의 계대 배양 및 계대 배양된 인간 유도만능줄기세포의 특성을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 생리활성 펩타이드가 고정화된 고분자 지지체의 제조 및 이식실험 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 생리활성 펩타이드가 고분자 지지체에서 안정적으로 고정화된 것을 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 생리활성 펩타이드가 고정화된 고분자 지지체 상에서 중간엽 줄기세포의 골세포 분화를 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 생리활성 펩타이드가 고정화된 고분자 지지체 상에서의 중간엽 줄기세포의 골세포 분화 및 중간엽 줄기세포의 이식 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

전분화능 줄기세포의 피더 - 프리 미분화 증식 배양

1.1 폴리도파민을 통해 비트로넥틴 펩타이드가 고정화된 고분자 표면의 제조

1.1.1 폴리도파민 코팅

인간 유도만능줄기세포의 부착 실험을 위해 24-well 폴리스티렌 플레이트에 10 mM Tris-HCl 도파민 용액 2 mg/ml을 첨가하고 pH 조건을 8.5로 맞추어 도파민의 중합반응을 유도함으로써 폴리스티렌 표면에 폴리도파민을 코팅하였다. 상기 중합반응을 4시간 정도 수행한 후, 용액을 제거하고 증류수로 세척하여 코팅되지 않은 도파민을 제거하였다(도 1).

1.1.2 비트로넥틴의 결합

폴리도파민 코팅 후, pH 8.5의 10 mM Tris-HCl 완충액에 용해된 서열번호 1 (VN1): CGGPQVTRGDVFTMP 및 서열번호 2(VN2): CGGGKKQRFRHRNRKG로 표시되는 비트로넥틴 (vitronectin) 유래 두 종류의 펩타이드 용액을 각각 1 mg/ml, 2 mg/ml 또는 4 mg/ml로 첨가하여 6시간 동안 반응시킴으로써 폴리도파민 위에 펩타이드를 고정화시켰다. 그 후, 증류수로 세척하여 부착되지 않은 펩타이드는 제거하였다(도 1).

1.1.3 고분자 표면의 분석

상기 실시예에 따라 폴리도파민을 코팅하고 비트로넥틴을 고정화시키는 과정이 효율적으로 수행되었는지 확인하기 위하여 XPS 표면 분석을 수행하였다.

XPS 표면 분석

구분	C	N	O	S
PS	98.07	0.00	1.93	0.00
PS-PD	65.24	9.92	24.84	0.00
PS-PD-VN1	63.20	12.58	22.80	1.42
PS-PD-VN2	61.97	13.90	23.01	1.12

폴리스티렌(PS) 표면에서는 관찰되지 않았던 질소(N) 성분이 폴리도파민(PD) 이 코팅된 표면(PS-PD)에서는 9~10% 정도 검출되었으며 펩타이드가 고정화된 표면(PS-PD-VN1/VN2)에서는 더욱 증가하여 12~14% 정도 질소(N) 원소성분이 검출되었다. 고정화된 펩타이드 내 존재하는 시스테인 아미노산의 싸이올기(-SH)로 인해 PS-PD-VN1/VN2 표면에서는 황(S) 원소성분이 1~2% 정도 검출되었다(표 1).

XPS 표면 분석으로 얻은 표면 원소 정량 데이터를 통해 세포배양용 폴리스티렌(PS) 표면에 폴리도파민(PD) 필름이 잘 도포되었으며 그 위에 VN1 펩타이드 및 VN2 펩타이드가 잘 고정화되었음을 확인하였다(도 2a 및 도 2b). 또한, HPLC(도 2c) 및 질량 스펙트럼 분석(도 2d)을 통해, 지지세포 없이 인간 전분화능 줄기세포를 배양하기 위한 폴리도파민-펩타이드 표면 제작 과정에 있어 말단 시스테인 잔기를 가지는 VN2 펩타이드 2 분자가 이황화 결합 형성을 통해 우선적으로 이량체(dimer)를 형성하고 그 뒤에 형성된 이량체가 폴리도파민의 카테콜(catechol)기에 붙는 것으로 확인되었다.

인간 유도만능줄기세포를 지지세포 없이 배양하기 위한 본 발명에 따른 폴리도파민-VN 펩타이드 표면의 구조는 도 2e와 같을 것으로 예상되었다.

1.1.4 고분자 표면의 분석(Fluorescamine 분석)

세포배양용 폴리스티렌(PS) 고분자 또는 세포이식용 스캐폴드로 많이 사용되는 poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) 고분자에 폴리도파민(PD) 코팅을 이용하여 VN2 펩타이드를 고정화한 후 1주일 동안 37˚C, PBS 완충액에서 배양하면서 고분자 표면으로부터 탈착되는 VN2 펩타이드의 양을 fluorescamine 분석(펩타이드 정량 분석)을 통해 정량하였다. PD 및 PLGA 표면 상에 고정화되지 못하는 펩타이드(D0)는 적용 펩타이드의 4~5% 정도로 계산되었으며 이후 배양 기간 동안에는 추가적인 펩타이드의 탈착이 거의 관찰되지 않았다(도 2f). 이는 95% 이상의 펩타이드가 폴리도파민(PD) 코팅을 통해 세포 배양 조건 하에서 효율적이고 지속적으로 고분자 표면에 고정화되어 있음을 보여주는 결과이다.

1.2 인간 유도만능줄기세포 부착

인간 유도만능줄기세포(human iPSC)를 폴리도파민을 이용하여 VN1 또는 VN2 펩타이드가 고정화된 폴리스티렌 표면에 동물 유래의 지지세포 없이 배양하였을 때 매트리젤(Matrigel)과 유사하거나 보다 향상된 효율로 줄기세포가 부착되어 증식하였다. VN1 펩타이드는 4X 농도(4 mg/ml)에서 줄기세포 부착효율이 가장 높았으며 VN2 펩타이드는 2X 농도(2 mg/ml)에서 가장 높은 줄기세포 부착효율이 관찰되었다(도 3a).

VN 펩타이드 2 종류(VN1, VN2) 외에 다른 종류의 세포외기질 단백질 유래 펩타이드(피브로넥틴:FN, 라미닌:LM)도 폴리도파민 코팅을 이용하여 폴리스티렌 표면에 고정화한 후 인간유도만능줄기세포의 부착효율을 관찰하였다. VN 펩타이드와는 달리 FN 펩타이드 및 LM 펩타이드는 인간유도만능줄기세포의 부착을 유도하지 못함을 확인하였다(도 3b).

다른 종류의 전분화능 줄기세포인 인간 배아줄기세포(SNU-HES30)를 폴리도파민(PD) 코팅을 통해 VN1 펩타이드가 고정화된 폴리스티렌(PS) 표면에 부착시키고 전분화능 줄기세포 마커 중 하나인 AP(Alkaline Phosphatase) 염색을 실시하여 특성을 확인하였다. 인간 유도만능줄기세포(IPSC)처럼 세포 부착이 잘 되었으며 콜로니를 형성하고, 미분화 증식이 잘 이루어짐을 확인하였다(도 3c). 이는 본 발명에 따른 폴리도파민 기반 비트로넥틴 펩타이드의 고정화 표면을 이용하여 동물 유래의 지지세포 없이 다양한 종류의 인간 전분화능 줄기세포의 부착 및 미분화 배양이 가능하다는 것을 보여 주는 결과이다.

1.3 인간 유도만능줄기세포의 특성 분석

VN1 펩타이드 및 VN2 펩타이드가 폴리도파민(PD)을 통하여 고정화된 폴리스티렌 표면에 부착된 인간 유도만능줄기세포에 대한 전분화능 줄기세포 마커인 OCT4의 발현과 TRA1-60의 발현(도 4a), SSEA-4의 발현(도 4b) 및 AP(Alkaline phosphatase)의 발현(도 4c)이 관찰되었다. 이는 PD-VN1/PD-VN2 표면 상에 부착, 배양된 유도만능줄기세포가 전분화능 줄기세포의 특성을 유지하고 있음을 보여주는 결과이다.

또한, VN1/VN2 펩타이드가 폴리도파민을 통하여 고정화된 폴리스티렌 표면에 부착, 배양된 인간 유도만능줄기세포에 대한 RT-PCR 분석을 실시하여 전분화능 줄기세포 마커의 발현을 추가적으로 관찰하였다. VN1/VN2 펩타이드가 고정화된 표면 상에서 배양된 인간 유도만능줄기세포(VN1-iPSC, VN2-iPSC)는 양성 대조군인 매트리젤 또는 STO 지지세포 상에서 배양된 인간 유도만능줄기세포(MAT-iPSC, STO-iPSC)와 유사한 수준으로 Oct4, Nanog 및 TDGF와 같은 전분화능 줄기세포 마커를 발현하고 있음을 확인하였다(도 4d;RT-PCR, 도 4e:qPCR).

1.4 인간 유도만능줄기세포의 계대 배양

VN1/VN2 펩타이드가 폴리도파민(PD)을 통하여 고정화된 폴리스티렌(PS) 표면에서 배양한 인간 유도만능줄기세포(iPSC)를 같은 표면(PD-VN1, PD-VN2)으로 각각 계대 배양(Subculture)을 실시하였다. STO 지지세포나 매트리젤(Matrigel) 상으로 계대 배양을 실시하였을 경우에는 iPSC 부착에 1일 이상의 시간이 필요한 반면, PD-VN1 및 PD-VN2 표면으로 계대 배양한 경우에는 12시간 이내에 iPSC가 부착되었다(도 5a). 이는 PD-VN1 및 PD-VN2 표면에서 인간 유도만능줄기세포의 효율적인 계대 배양이 가능함을 보여주는 결과이다. 또한, 계대배양된 인간 유도만능줄기세포가 Oct4를 발현하고 있음을 면역세포 염색으로 확인하였기 때문에 계대 배양 이후에도 전분화능 줄기세포의 특성이 유지되고 있음을 확인하였다(도 5b).

골형성단백질 ( BMP -2) 펩타이드가 고정화된 고분자( PLGA ) 지지체에서 적용한 줄기세포의 골세포 분화

2.1 폴리도파민/BMP-2 펩타이드 고정화의 확인

도 6에 기재된 과정에 따라, 폴리도파민(PD)도포 후 생리활성을 가진 BMP-2 펩타이드(서열번호3: KIPKASSVPTELSAISTLYL)를 PLGA 지지체에 고정화하고 XPS 표면분석을 통해 펩타이드의 고정화를 분석하였다. 부착된 펩타이드가 배양 중에도 탈착되지 않으며 표면상에서 잘 유지가 되고 있음을 확인하였고(도 7a의 A), 낮은 표면 에너지를 가지고 있어서 표면에 펩타이드 고정화가 어려운 다른 종류의 고분자(EPTFE, PUA) 표면 상에서도 폴리도파민을 통해 매우 효율적으로 펩타이드가 고정화되어 있음을 형광현미경 분석을 통해 확인하였다(도 7a의 B). XPS 표면 피크 분석 및 XPS 표면 원소 정량분석을 실시하여 PD-BMP-2의 고정화 후 N 원소 함량의 증가를 통한 BMP-2 펩타이드의 고정화를 관찰하였다(도 7b 및 표 2).

XPS 표면 원소 정량분석

구분	C	O	N
PLGA	62.8	37.2	0
PD-PLGA	72.1	21.6	6.3
PD-BMP-2-PLGA	68.7	20.4	10.9
BMP-2-PLGA	63.6	33.3	3.1

AFM 표면 분석에 의해 PD-BMP-2 고정화 후 표면의 거칠기가 증가함을 확인하였고(도 7c의 A, B), 고분자 표면의 수 접촉각(water contact angle) 측정에 의해 PD-BMP-2 부착 후 PLGA 표면의 성질이 친수성으로 변하는 것을 확인함으로써(도 7c의 C, D), PLGA 표면 상에 PD를 통한 BMP-2 펩타이드의 고정화를 확인하였다. 또한, 삼차원(3D) 다공성 PLGA 고분자 지지체에 폴리도파민(PD)을 통해 BMP-2 펩타이드를 고정화한 후 전자주사현미경(SEM) 분석을 통해 펩타이드의 고정화를 관찰하여, PD-BMP-2 펩타이드 부착 후 PLGA 지지체 표면상에서 PD-BMP-2 코팅 및 PD-BMP-2 응집이 형성됨을 확인하였다(도 7d).

2.2 PD-BMP-2-PLGA 지지체 상에서의 중간엽 줄기세포의 골세포 분화 및 줄기세포의 이식

PD-BMP-2-PLGA 지지체 표면에서, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 골세포 분화인자가 포함된 골세포 분화용 배지 또는 골세포 분화인자가 포함되지 않은 일반 배지 조건 하에 배양하였다. 3주간 배양한 후에, 칼슘 침착 염색(alizarin red S 염색, 도 8a의 A 및 도 8b의 A), 골세포 마커(OPN, Col I)의 염색 (도 8a의 B 및 도 8b의 B), 및 정량적 PCR 결과(도 8a의 C. D 및 도 8b의 C, D)를 통해 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화를 분석하였다. PD-BMP-2-PLGA 표면에서 배양된 줄기세포가 PD 또는 BMP-2가 결여된 PLGA 표면에서 배양된 줄기세포 보다 향상된 골세포 분화능을 나타내었다(도 8a- 골세포 분화인자를 포함하는 배지 사용, 도 8b-골세포 분화인자를 포함하지 않는 배지 사용).

PD-BMP-2가 고정화된 다공성 PLGA 지지체에 인간 지방 유래 중간엽줄기세포를 부착하여 배양하고 두개골 결손 마우스 모델의 결손 부위에 이식하였다. 8주 후에, 마이크로 CT (도 9a), 골 조직 내 콜라젠을 염색하는 Goldner? trichrome 염색(도 9b) 및 골 조직 특이적 단백질(OPN, Col I)에 대한 면역 염색(도 9c)을 통해 두개골 결손 부위에서의 골 조직 재생 정도를 분석하였다. PD-BMP-2 펩타이드가 부착된 PLGA 지지체를 적용하였을 경우에 줄기세포 이식에 의한 골 조직 재생 효과가 가장 높음을 확인하였다.

지금까지 예시적인 실시예를 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시예로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

<110> YONSEI UNIVERSITY <120> Polydopamine-peptide-immobilized Substrates for Feeder-free Maintenance and Enhanced Differentiation of Stem Cells and Methods for Preparing the Substrates <130> IPDB50839 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> HUMAN <400> 1 Cys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> HUMAN <400> 2 Cys Gly Gly Gly Lys Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> HUMAN <400> 3 Lys Ile Pro Lys Ala Ser Ser Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser 1 5 10 15 Thr Leu Tyr Leu 20

Claims (26)

1. 폴리도파민에 결합된 세포부착성 펩타이드인 비트로넥틴을 고정화시킨 인간유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체로서, 상기 비트로넥틴은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서,
   상기 세포부착성 펩타이드는 상기 폴리도파민의 카테콜기에 화학적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 세포부착성 펩타이드는 이량체로 상기 폴리도파민에 결합된 것을 특징으로 하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 비트로넥틴은 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화를 향상시키는 것을 특징으로 하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포는 지지세포 없이 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체.
   
9. 제 1항 및 제 5항 내지 8항 중 어느 한 항에 따른 고분자 지지체 상에서의 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화 방법.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 고분자는 폴리스티렌, 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 및 폴리락틱-글리콜산(PLGA)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화 방법.
    
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17. 제 1항 및 제 5항 내지 8항 중 어느 한 항의 고분자 지지체를 포함하는 필름.
    
18. (a) 고분자 지지체에 폴리도파민을 코팅시키는 단계; 및
    (b) 상기 폴리도파민에 세포부착성 펩타이드인 비트로넥틴을 결합시키는 단계;를 포함하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체의 제조방법으로서, 상기 비트로넥틴은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체의 제조 방법.
    
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25. 제 18항에 있어서,
    상기 고분자는 폴리스티렌, 폴리카프로락톤, 폴리디메틸실록산 및 폴리락틱-글리콜산(PLGA)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체의 제조 방법.
    
26. 제 18항에 있어서,
    상기 폴리도파민 코팅은 약염기성 조건에서 수행되는 중합 반응인 것을 특징으로 하는 인간 유도만능 줄기세포 및 인간 배아 줄기세포의 증식 또는 분화용 고분자 지지체의 제조 방법.
    

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