KR101895669B1

KR101895669B1 - 접착성 헤파린과 콜라겐을 이용한 줄기세포의 배양방법

Info

Publication number: KR101895669B1
Application number: KR1020160077827A
Authority: KR
Inventors: 이해신; 이미현; 한용만; 김영진
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2016-06-22
Filing date: 2016-06-22
Publication date: 2018-09-05
Also published as: KR20180000098A

Abstract

본 발명은 접착성 헤파린과 콜라겐을 이용한 줄기세포 배양용 플레이트의 제조 및 배양방법에 관한 것으로, 구체적으로 카테콜(cathchol) 기능기 또는 피로갈롤(pyrogallol) 기능기가 컨쥬게이션(conjugation)된 헤파린, 및 콜라겐을 표면에 코팅시킨 줄기세포 배양용 플레이트에 줄기세포를 배양하였을 때, 가격이 저렴하면서 세포배양 표면의 부착률을 크게 향상시키고 장기간 미분화 성장을 가능하게 하며 기계적 계대배양을 가능케 하므로, 접착성 헤파린과 콜라겐을 이용한 줄기세포의 배양방법은 줄기세포를 안정적으로 대량배양하는 것에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

접착성 헤파린과 콜라겐을 이용한 줄기세포의 배양방법{Method for culture of stem cells using co-immobilization of adhesive heparins and collagen}

본 발명은 접착성 헤파린과 콜라겐을 이용한 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cells)는 전구 상태의 세포에서 특정 기능을 가지는 세포로 분화할 수 있는 세포를 말하며, 개체의 여러 조직에 존재하고 있는 성체줄기세포와 발생중인 수정란에서 유래하는 배아줄기세포의 두 종류로 구분될 수 있다. 그 중 배아줄기세포는 개체를 이루는 모든 세포로의 분화가 가능한 전분화능을 지니며 미분화 상태의 무한 자가 증식 능력을 지니는 특징이 있다.

이러한 특징을 이용하여, 배아줄기세포는 특정 세포로의 분화 및 발달 과정을 연구하는데 이용되어 왔다. 또한 암, 당뇨병, 난치성 질환 및 신경퇴행성 질환 등의 세포치료제로서도 주목 받을 뿐만 아니라, 유전체학 및 생물정보학의 발달과 더불어 줄기세포를 이용한 재생 의학 분야에 연구가 진행되고 있으므로 배아줄기세포는 관련 신약 개발 및 독성 검사를 위한 플랫폼으로도 활발히 연구되고 있다. 따라서 배아줄기세포로부터 특화된 기능을 가진 세포들로 분화하는데 관여하는 다양한 세포 내 신호전달 체계들을 조절하고, 임상 적용을 위한 안정적이고 성숙한 세포를 얻기 위해서는 정교하고 적절한 세포 배양 환경의 조성이 필수적이다.

일반적인 배아줄기세포는 생쥐 배아섬유아세포(mouse embryononic fibroblast, MEF)로 대표되는 지지세포와 함께 배양된다. 이러한 지지세포는 배아줄기세포의 미분화 상태를 유지하기 위해 사용되나, 동물세포로부터 유래한 지지세포의 사용은 동물세포로부터 유래한 병원균 및 바이러스 오염의 가능성을 남겨두고, 배양 조건에 따른 줄기세포의 가변성을 유도할 수 있으며, 임상 적용 및 신약 개발을 위한 플랫폼 제작에도 한계로 작용 할 수 있다. 따라서, 최근 지지세포를 사용하지 않는 배양 방법(Feeder-free culture)확립의 필요성이 대두되기 시작하여 다양한 세포외기질 extracellular matrix)들이 지지세포를 대신하여 사용되고 있다. 이 중 가장 대표적으로 사용되는 것은 마트리젤(Matrigel)이지만, 이 또한 쥐의 암 조직에서 유래하였기 때문에 구성 성분이 명확하게 밝혀지지 않았고, 동물 병원균 오염의 가능성 및 배양 조건의 가변성 유도 등의 한계를 여전히 갖고 있다.

배아줄기세포의 계대배양은 기계적인 분리(Mechanical dissociation)와 효소적 분리(Enzymatic dissociation)방법 등을 통해 진행되는데, 여기에 대표적으로 사용되는 효소로는 콜라게네이즈 IV (Collagenase IV), 디스페이즈(Dispase) 및 트립신(Trypsin) 등이 있지만, 이러한 효소들도 동물에서 추출되었기 때문에 역시 동물 병원균의 오염의 위험성과 배아줄기세포의 계대배양 시 유전적 변이를 유발할 위험성이 여전히 존재하기 때문에, 안정적인 장기 계대에는 적합하지 않다는 단점이 있다.

따라서, 지지세포를 사용하지 않고 안정적인 장기 계대에 적합한 배아줄기세포 배양 시스템을 구축하기 위한 노력이 활발히 이루어지고 있으나, 아직 뚜렷한 대체제는 개발되지 못하였다.

이에, 본 발명자들은 인간배아줄기세포를 체외에서 장기간 미분화 증식 가능하면서 경제적이고 보관이 용이한 줄기세포 배양 표면을 연구하던 중, 헤파린-카테콜과 콜라겐이 동시 고정화된 표면이 지지세포 및 마트리젤을 대신하여 다양한 표면에 안정적으로 코팅될 수 있으며, 저렴하면서도 구성성분이 명확하기 때문에 오염가능성이 훨씬 낮아지는 효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 접착성 헤파린과 콜라겐을 이용한 줄기세포 배양용 플레이트의 제조방법 및 배양방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카테콜(cathchol) 기능기 또는 피로갈롤(pyrogallol) 기능기가 컨쥬게이션(conjugation)된 헤파린, 및 콜라겐을 표면에 코팅시킨 줄기세포 배양용 플레이트의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 헤파린에 카테콜 기능기를 컨쥬게이션(conjugation)하여 카테콜 기능기가 도입된 헤파린을 제조하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 헤파린을 녹인 용액 및 콜라겐 용액의 혼합용액을 줄기세포 배양용 플레이트에 처리하고 교반하여 코팅하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양용 플레이트의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 제 1항의 줄기세포 배양용 플레이트를 UV에 멸균 후, 줄기세포 배양액을 플레이트 표면에 처리하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 플레이트에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 접착성 헤파린과 콜라겐을 이용한 줄기세포 배양용 플레이트의 제조방법은 세포배양 표면의 부착률을 크게 향상시키고 장기간 미분화 성장을 가능하게 하며 기계적 계대배양을 가능케 하므로, 접착성 헤파린과 콜라겐을 이용한 줄기세포 배양용 플레이트의 제조방법 및 배양방법은 줄기세포를 안정적으로 대량배양하는 것에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 헤파린-카테콜이 용해된 용액의 UV 흡광 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 2는 헤파린-카테콜이 코팅된 표면의 X-선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy; XPS)분석 스펙트럼 결과를 헤파린만을 코팅한 표면과 비교하여 N1s, S2p에 대해 나타낸 도이다.
도 3은 헤파린(Hep) 또는 헤파린-카테콜(HepC)이 표면에 코팅되는 양을 분석한 표면 플라즈몬 공명 분석의 센소그램을 나타낸 도이다.
도 4는 지지세포로부터 마트리젤(Matrigel), 콜라겐(Col), 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I(HepC-Col) 코팅 표면으로 처음 배양된 인간배아줄기세포(Passage 1)의 줄기세포 마커 단백질(SSEA4, SOX2, NANOG 및 OCT4)을 면역 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 지지세포로부터 마트리젤(Matrigel-P1), 콜라겐(Col-P1), 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I(HepC-Col-P1) 코팅 표면으로 처음 배양된 인간배아줄기세포(Passage 1)의 줄기세포 마커 유전자(OCT4, SOX2 및 NANOG)를 정량분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 지지세포로부터 마트리젤(Matrigel-P1), 콜라겐(Col-P1), 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I(HepC-Col-P1) 코팅 표면으로 처음 배양된 인간배아줄기세포(Passage 1)의 분화 마커 유전자(T, PAX6 및 CXCR4)를 정량분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 지지세포로부터 마트리젤 코팅 표면으로 처음 배양된 인간배아줄기세포(Matrigel-P1) 및 콜라겐(Col-P), 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I(HepC-Col-P6) 코팅 표면에서 6번 계대된 인간배아줄기세포의 줄기세포 마커 유전자(OCT4, SOX2 및 NANOG)를 정량 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 지지세포로부터 마트리젤 코팅 표면으로 처음 배양된 인간배아줄기세포(Matrigel-P1) 및 콜라겐(Col-P), 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I(HepC-Col-P6) 코팅 표면에서 6번 계대된 인간배아줄기세포의 분화 마커 유전자(T, PAX6 및 CXCR4)를 정량분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 지지세포로부터 마트리젤 코팅 표면으로 처음 배양된 인간배아줄기세포(Matrigel-P1) 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I(HepC-Col-P18) 코팅 표면에서 18번 계대된 인간배아줄기세포의 줄기세포 마커 유전자 (OCT4, SOX2 및 NANOG)를 정량분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 지지세포로부터 마트리젤 코팅 표면으로 처음 배양된 인간배아줄기세포(Matrigel-P1) 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I(HepC-Col-P18) 코팅 표면에서 18번 계대된 인간배아줄기세포의 분화 마커 유전자(PAX6, T 및 CXCR4)를 정량분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I(HepC-Col-P18) 코팅 표면에서 18번 계대된 인간배아줄기세포의 줄기세포 마커(OCT4) 및 분화 마커 유전자 (PAX6, α-SMA 및 GATA4) 의 발현을 면역 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면에서 18번 계대된 인간배아줄기세포의 정상적인 염색체 배열을 핵형검사를 통해 나타낸 도이다.
도 13은 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면에서 25번 계대된 인간배아줄기세포로부터 제작된 배상체들(Embryoid bodies, EBs)을 나타낸 도이다.
도 14는 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면에서 25번 계대된 인간배아줄기세포로부터 제작된 배상체들(Embryoid bodies, EBs)을 부착하여 인간배아줄기세포의 줄기세포 마커(OCT4) 및 분화 마커 유전자(TUJ1, α-SMA 및 GATA4)의 발현을 면역 염색한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 카테콜(cathchol) 기능기 또는 피로갈롤(pyrogallol) 기능기가 컨쥬게이션(conjugation)된 헤파린, 및 콜라겐이 표면에 코팅된 줄기세포 배양용 플레이트를 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어“헤파린-카테콜(Heparin-catechol)”이란 카테콜 기능기가 도입된 헤파린 고분자 물질을 의미한다.

또한, 상기 헤파린은 분자 곁가지로 하이드록시기를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 카테콜 기능기로는 도파(dopa), 도파민(dopamine), 노르에피네프린(norepinephrine), 리토스퍼믹산(lithospermic acid), 카페인산(caffeic acid), 로즈마리산(rosmarinic acid), 살비아놀산(salvianolic acid), 갈산(gallic acid) 및 폴리도파민(polydopamine)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 것이 바람직하다. 또한 적어도 2개의 하이드록실 기를 보유하는 피로갈롤(pyrogallol) 기능기를 헤파린에 컨쥬게이션(conjugation)할 수도 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

헤파린은 황산염(sulfate) 작용기를 다량으로 함유하고 있는 다당류로서, 뛰어난 항응고작용을 가지고 있어 현재 항응고제로써 널리 쓰이고 있는 의약품이다. 또한, 황산염의 음전하에 기인하여 다양한 단백질와 정전기적 상호작용이 가능하며, 이를 통해 다양한 생물학적 활성을 조절한다. 하지만 헤파린 자체로는 표면에 흡착되는 성질이 거의 없기 때문에, 표면상에서의 다양한 활용에 한계가 있다.

또한, 도파민은 홍합의 접착 성질을 모방한 접착성 분자이다. 도파민은 약염기성에 용해될 시, 자가중합과정을 통해 폴리도파민을 형성하면서 거의 모든 물질 표면에 코팅될 수 있다. 더불어, 도파민을 고분자에 컨쥬게이션할 경우 도파민 도입된 고분자는 폴리도파민과 마찬가지로 거의 모든 표면에 코팅 가능한 접착성을 띠게 된다. 따라서, 헤파린에 접착성을 부여하여 표면에서 활용하기 위해, 도파민을 헤파린에 컨주게이션한 헤파린-카테콜 고분자를 표면의 코팅에 사용할 수 있다. 그러나 헤파린-카테콜 코팅만으로는 인간배아줄기세포의 표면 접착률이 40 - 80%로 다소 낮아 장기 배양이 어려울 수 있으므로 여기에 인체 세포외기질 중 가장 풍부하게 존재하는 단백질인 콜라겐을 함께 표면에 코팅시켜 표면 부착력을 증가시킬 수 있다. 콜라겐은 일반적으로 폴리스티렌 세포배양 표면에 잘 흡착되는 것으로 알려져 있다.

또한, 본 발명의 상기 콜라겐은 콜라겐 타입 I일 수 있다. 콜라겐 타입 I은 인체 세포외기질 중 가장 다량으로 존재하는 단백질 성분으로서 표면에 줄기세포의 부착을 잘 유도하는 성질이 있다. 하지만, 기존 연구결과에 따르면 콜라겐 타입 I만을 단독으로 사용하여 세포배양을 지속할 경우(< 6회 계대배양, 1 개월), 줄기세포의 자연분화가 발생할 수 있기 때문에, 카테콜(catechol) 기능기가 컨쥬게이션(conjugation)된 헤파린을 콜라겐 타입 I과 동시에 표면 코팅시키면 부착력이 더욱 효율적으로 증가될 수 있다.

또한, 세포 배양용 플레이트 표면은 폴리우레탄(polyurethane), 폴리다이메틸실록산(PDMS), 테플론(Teflon), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 실리콘(silicone), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride), 폴리카보네이트(polycarbonate), 생분해성 지방족폴리에스테르계 고분자, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 인산칼슘(calcium phosphate), 산화알루미늄(aluminum oxide), 산화티타늄(titanium oxide), 산화실리콘(silicon oxide), 산화철(iron oxide), 유리(glass), 석영(quartz), 금(gold), 백금(platinum), 텅스텐(tungsten), 은(silver), 구리(copper), 스텐리스스틸(stainless steel), 코발트-크롬합금(cobalt-chromium alloy) 및 니티놀(nitinol)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 헤파린에 컨쥬게이션된 카테콜 기능기, 및 콜라겐 타입 I이 다양한 소재의 표면에 안정적으로 코팅되는 능력을 가짐을 이용하여, 표면에 헤파린-카테콜과 콜라겐 타입 I의 동시 코팅을 도입하는 과정을 포함한다. 상기 표면은 카테콜 기능기와 콜라겐 타입 I이 코팅될 수 있는 소재면 제한 없이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은

상기 단계 1)의 헤파린-카테콜 수용액은 헤파린 수용액에 도파민 염화수소산 염을 이용하여 카테콜 기능기를 도입하여 제조하는 것이 바람직하고, 헤파린은 분자 곁가지로 하이드록시기를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 헤파린-카테콜 컨쥬게이션은 하이드록시기와 아민기의 접합에 의해 카바메이트 결합(carbamate bond)이 생성되는 반응이고, 헤파린-카테콜의 치환도는 5 내지 50%이고, 특히 10 내지 30%인 것이 바람직하다. 또한 상기 헤파린-카테콜 수용액은 헤파린-카테콜을 1-10 mg/ml 포함하는 것이 바람직하다

또한, 상기 단계 2)의 콜라겐은 아세트산 수용액에 0.1-4 mg/ml 로 용해된 상태로 상기의 헤파린-카테콜 수용액과 혼합되며, 이때 헤파린-카테콜 수용액 및 콜라겐 타입 I 수용액이 1:1(v:v)의 비율로 혼합되도록 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 2)의 교반은 70 내지 90 rpm으로 12시간 내지 24시간 교반시키는 것이 바람직하며, 코팅은 헤파린-카테콜이 녹아있는 pH8.0 내지 pH9.0의 트리스 버퍼(Tris buffer)에 산화제를 도입해 표면에 코팅하는 것이 바람직하다.

상기의 산화제는 과산화수소 및 이의 염, 차아염소산염(hypochlorite), 과황산염(persulfate), 과산화 유기산(peroxyorganic acid), 과망간산 염(permanganate salt), 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite), 과탄산나트륨(sodium percarbonate), 염소산염(chlorate), 질산(nitric acid) 및 이의 염, 과옥소산염(periodate), 과브롬산염(perbromate), 요오드산염(iodate), 과염소산염(perchlorate), 브롬산염(bromate) 및 과옥소산염 나트륨(Sodium periodate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한 상기 단계 2)의 코팅 이후, 플레이트 표면을 UV를 10분 내지 60분 동안 조사하여 멸균하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은

상기 단계 1)은 UV 빛에 5 내지 30 분 동안 노출시켜 멸균한 후, MEF-Conditioned 배지를 플레이트에 채운 다음, 12시간 내지 24시간 동안 인큐베이터에서 보관하는 것이 바람직하고, 상기 단계 2)의 배양은 지지세포(feeder cell)의 첨가 없이 배양하는 것이 바람직하다. 일반적으로 지지세포로는 이종의 세포를 사용하는 데 이들의 증식을 억제하기 위해서, 마이토마이신C(mitomycin C)를 처리하거나, 방사선 조사를 하는 추가적인 처리를 해야하는 번거로움 및 세포 오염 등의 위험이 있으나 본 발명은 이러한 문제점들을 해결하였다.

또한, 상기 단계 2)의 줄기세포는 인간배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 단계 2)에서 배양된 줄기세포를 회수하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I층으로부터 줄기세포를 회수하는 단계는 바람직하게는 기계적 분리방법, 예를 들어 유리봉 등을 사용하여 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I층으로부터 줄기세포를 긁어냄으로써 수행할 수 있다. 즉, 기계적 분리방법을 사용함으로써 별도의 효소 처리를 배제할 수 있어, 효소에 의한 오염 문제를 회피할 수 있고, 장기적인 물리적 계대배양이 가능할 수 있다. 특히, 상기 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I층은 배양된 세포를 기계적으로 긁어낼 수 있을 정도의 충분한 강도를 지니고 있으므로, 간단하게 줄기세포를 회수할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 헤파린-카테콜을 제조하기 위하여, 먼저 헤파린과 도파민, 염화수소산 염을 각각 3차 증류수에 용해시켜 준비한 뒤, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-Ethyl-3-(3dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC)를 용해시킨 용액을 첨가 후 20 - 30분 간 교반한다. 이후 도파민 용액을 상기 용액에 더한 후 용액의 산도를 pH4 - pH4.5 범위를 유지하면서 5시간 동안 교반한다. 이어서, 정제를 위하여 상기 반응 혼합 용액에 냉장 에탄올을 더하여 1 - 3회 침전 후. 침전물을 3차 증류수에 다시 용해하여 분자량한계(Molecular Weight Cut-Off; MWCO) 3500 막을 이용하여 pH3 - pH4 의 증류수에서 1내지 3일간 투석 정제한다. 끝으로, 상기 물질을 액체질소를 이용하여 급속냉동 후 동결 건조하며, 제조된 헤파린-카테콜 내의 카테콜 양을 UV 빛 흡광도 측정으로 분석한 결과, 15 - 20%의 카테콜 기능기를 갖는 헤파린-카테콜이 형성되었음을 확인하였다(도 1 참조).

다음으로, 상기 헤파린-카테콜의 표면 코팅능과 콜라겐 타입 I의 표면 흡착능을 이용하여 두 물질이 동시에 표면 코팅되도록 하였다. pH8 - pH9의 트리스 버퍼에 헤파린-카테콜을 2 mg - 4 mg 농도로 녹인 용액에 코팅할 표면을 담근 뒤, 산화제로서 과옥소산염 나트륨 (Sodium periodate, NaIO4) 용액을 가한다. 여기에 콜라겐 타입 I(1 - 4 mg/ml)을 아세트산에 용해시킨 콜라겐 타입 I 수용액을 가하고, 교반기에서 70 - 100 rpm으로 12시간 - 24시간 동안 교반한 뒤, 고온 멸균한 3차 증류수로 표면을 헹군 뒤 질소 가스로 건조하였다.

또한, 본 발명의 헤파린-카테콜이 표면에 코팅되는지 여부를 확인하기 위하여 X-선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy; XPS)을 사용하여 헤파린만을 코팅한 표면과 비교하여 분석해 본 결과, 헤파린-카테콜이 표면에 코팅되었음을 확인하였다(도 2 참조). 그리고 헤파린-카테콜이 표면에 코팅되는 양을 정량하기 위해 Surface Plasmon Resonance (SPR) 분석을 실시한 결과, 헤파린은 표면에 거의 코팅되지 않는 반면, 헤파린 카테콜은 30분 만에 다량으로 코팅되는 것을 확인하였다(도 3 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 인간배양줄기세포 배양을 위한 코팅된 표면을 준비하기 위해, 상기 표면을 UV 빛에 30분 조사하여 멸균하였다. 이후 지지세포와의 배양으로부터 수득한 줄기세포 배양액 (Conditioned media, CM)을 표면에 넣어 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(Incubator)에서 전처리하여 균질화하였다. 그리고 상기 전처리된 표면에서 인간배아줄기세포를 배양하였으며, 그 결과 모든 배아줄기세포 집합체들(clumps)이 표면에 부착하였음을 확인하였고, 이후 장기 배양 후에도 배아줄기세포는 본래의 특성을 유지하며 증식하는 것을 확인하였다(도 4 참조).

또한 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 동시 코팅된 표면을 이용하여 장기배양을 하기 위해 6일 동안 배양되어 증식한 인간배아줄기세포 콜로니(colony)를 인슐린 주사기를 이용한 기계적 방법을 통해 작은 인간배아줄기세포 집합체(Clumps)로 분리하였고, 이를 새로 준비된 헤파린-카테콜 표면에 옮겨 배양하였다. 또한 반복적인 물리적인 계대 방법을 통해서 장기 배양된 인간배아줄기세포는 그 특성을 잃지 않고 유전적 변이가 일어나지 않음을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).

따라서 본 발명의 헤파린-카테콜과 콜라겐 타입 I의 동시 코팅은 다양한 표면에 안정적으로 코팅될 수 있고, 저렴하면서도 오염가능성을 크게 낮출 수 있으며, 지지세포(feeder cell)의 첨가없이 기계적 계대배양 및 장기간 미분화 성장을 가능하게 하여 인간배아줄기세포를 안정적으로 대량배양하는 것에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 헤파린-카테콜의 합성

헤파린-카테콜을 다음과 같이 합성하였다. 헤파린 나트륨 염(Heparin sodium, Wako)을 3차 증류수에 5 mg/ml로 녹인 용액 및 도파민 염화수소산염(Dopamine hydrochloride, Sigma Aldrich, 미국)을 3차 증류수에 16 mg/ml로 녹인 용액을 제조하여, 상기 두 용액을 섞어준 뒤 pH를 4.5로 유지하였다. 상기 혼합용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC, Sigma Aldrich)를 16 mg/ml로 녹인 용액을 더하고, 20분 간 실온에서 교반하였다. 이 혼합용액에 도파민 용액을 섞어준 후 5시간동안 pH4 - pH4.5를 유지하며 교반하였다. 교반 후, 냉장 에탄올로 2회 침전한 뒤 침전물을 3차 증류수에 용해하여 투석 방법으로 3일 간 정제한 뒤 동결건조 하였다.

상기 방법의 카테콜 컨주게이션 효율을 알아내기 위하여 UV 빛 흡광 분석을 진행하였다. 건조된 헤파린-카테콜 2 mg/ml를 증류수에 용해한 후 UV 빛 흡광을 측정하였다.

그 결과, 280 nm 근처에서 카테콜 기능기 특이적인 강한 흡광 영역을 확인하였다(도 1). 또한 도파민을 이용한 카테콜농도-흡광도 관계식에, 관찰된 헤파린-카테콜의 흡광도를 대입 후, 카테콜 도입 효율이 15 - 20% 사이인 것을 계산하였다.

< 실시예 2> 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I의 동시 표면 고정화

헤파린-카테콜과 콜라겐 타입 I의 표면 고정화를 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 헤파린-카테콜을 4 mg/ml 농도로 고온 멸균한 트리스 버퍼 pH8.5 에 녹인 용액, 과옥소산염 나트륨 (Sodium periodate, NaIO4)을 동일 버퍼에 20 mg/ml로 녹인 용액, 및 콜라겐 I이 아세트산에 2 mg/ml 로 용해된 용액 (Collagen type 1, BD Sciences)을 준비하였다. 헤파린-카테콜 용액을 세포배양 플레이트가 50% 가량 잠기도록 채운 후 과옥소산염 나트륨 용액을 헤파린-카테콜 용액의 1/10 양만큼(부피비) 더하였다. 여기에 콜라겐 타입 I 수용액을 헤파린-카테콜 용액과 동일한 부피만큼 더하였다. 상기 플레이트를 교반기에서 100 rpm으로 15시간동안 교반 후, 고온 멸균된 3차 증류수로 표면을 여러 회 헹궈준 뒤 질소 가스로 건조하였다.

또한, 헤파린-카테콜의 표면 코팅 여부를 X선 광전자 분광법(X-ray photoelectron spectroscopy; XPS)으로 분석하였다.

그 결과, 헤파린-카테콜 코팅한 표면에서는 상기 두 원소인 헤파린의 S2p 피크와 도파민의 N1s 피크가 모두 강하게 검출된 것을 확인하여, 표면에 헤파린-카테콜이 코팅되었음을 확인하였다(도 2).

또한, 표면에 코팅된 헤파린-카테콜의 양을 SPR 분석법(Surface Plasmon Resonance)으로 정량하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다. SPR 센소그램에서 샘플 주사 전, 후의 베이스라인 (baseline) 값의 변화를 측정함으로써 표면에 코팅된 고분자의 양을 알아낼 수 있었다. 헤파린 단독의 경우(215 pg/mm²)와는 달리 헤파린-카테콜의 경우, 30분의 코팅시간 동안 3,886 pg/mm²이 표면에 코팅된 것을 확인하였다.

< 비교예 1> 헤파린 표면 고정 후 X선 광전자 분광법 실시

헤파린만으로 코팅 처리한 표면을 상기 <실시예 2>와 같이 동일한 조건으로 X선 광전자 분광법을 실시하였다(도 2).

< 비교예 2> 헤파린 표면 고정 후 SPR 분석법 실시

헤파린만으로 코팅 처리한 표면을 상기 <실시예 2>와 같이 동일한 조건으로 SPR 분석법을 실시하였다(도 3).

< 실험예 1> 콜라겐( Collagen ) 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅을 이용하여 배양한 인간배아줄기세포 특성 확인

<1-1> 배아줄기세포의 증식 및 마커 단백질의 분석

인간배아줄기세포의 배양을 위해 콜라겐 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅이 도입된 배양 플레이트를 다음과 같은 과정을 통해 준비하였다. 상기 표면을 UV 빛에 30분간 노출시켜 멸균한 뒤, M지지세포와의 배양으로부터 수득한 줄기세포 배양액 (Conditioned media, CM)을 표면에 넣어 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(Incubator)에서 전처리하였다. 이후 표면의 배양액을 버리고 새로운 배양액를 채운 뒤 인간배아줄기세포 집합체들(Clumps)를 넣고 37℃ 5% CO₂ 조건에서 배양한다. 지지세포가 없는 배양(Feeder-free culture) 조건의 대조군으로 마트리젤 (Matrigel) 코팅이 도입된 플레이트를 사용하였다.

그 결과, 지지세포가 없는 배양(Feeder-free culture)으로 처음 배양된 인간배아줄기세포는 마트리젤 (Matrigel), 콜라겐 (Collagen), 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I (HepC-Col) 코팅 조건에서 모두 유사한 증식률을 보였다(도 4).

또한 줄기세포 마커 단백질 (SSEA4, SOX2, NANOG 및 OCT4) 과 분화 마커 단백질 (PAX6, α-SMA, GATA4 및 TUJ1)의 발현을 구체적으로, 4% 포름알데히드(Formaldehyde, HT5011, Sigma-Aldrich)에 세포를 30분간 고정한 후, 0.1% Triton X-100(T8787, Sigma-Aldrich) 용액에서 30분간 유화(Permeabilization) 시킨 후에 5% 일반 당나귀 혈청(rmal donkey serum)(017-000-010, Jackson ImmunoResearch)에 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 다음의 1차 항체로 각각 처리하였다: goat anti-OCT4(sc-8629, Santa Cruz), rabbit anti-SOX2(3579s, Cell Signaling), mouse anti-SSEA4(ab16287, Abcam), rabbit anti-NANOG(3580s, Cell signaling), mouse anti-PAX6(MAB5552, Millipore), mouse anti-α-SMA(MAB1420, R&D), mouse anti-GATA4(sc-25310, Santa Cruze), rabbit anti-TUJ1(ab18207, Abcam). PBS로 헹군 뒤 Alexa Fluor 488- donkey secondary antibodies(Invitrogen) 또는 Alexa Fluor 594-donkey 2차 항체(Invitrogen)에 1시간동안 처리한 뒤, 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 줄기세포 마커인 OCT4, SOX2, NANOG 의 경우 마트리젤에 비해 낮은 발현을 보였지만(도 5), 중배엽 마커인 T, 외배엽 마커인 PAX6, 내배엽 마커인 CXCR4는 모두 마트리젤 수준과 유이하게 발현이 되지않음을 확인하였다(도 6). 이는 콜라겐 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면에서 줄기세포의 미분화능이 유지되는 것을 의미한다.

<1-2> 배아줄기세포 마커 유전자의 정량분석

콜라겐 (Collagen) 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I (HepC-Col) 코팅 표면에서의 장기적인 인간배아줄기세포의 배양 가능성을 확인하기 위해 실험예<1-1>에 기재된 방법을 사용하여 상기 표면에서 기계적 방법을 통해 인간배아줄기세포를 계대배양하였다. 콜라겐 및 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면에서 6번 계대배양을 수행한 뒤, 인간배아줄기세포와 마트리젤 코팅 표면에서 지지세포가 없는 배양(Feeder-free culture)으로 처음 배양된 인간배아줄기세포의 줄기세포 마커 유전자와 분화 마커 유전자의 발현을 실험예<1-1>과 같은 방법으로 확인 및 정량 분석하였다.

그 결과, 대표적인 줄기세포 마커인 OCT4의 발현은 마트리젤 표면과 비교하였을 때 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I에서 유의미하게 증가하였고(도 7), 중배엽 마커인 T, 외배엽 마커인 PAX6의 발현은 콜라겐 코팅 표면에서 마트리젤 표면보다 유의미한 증가를 보임을 확인하였다(도 8). 이러한 결과는 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I (HepC-Col) 코팅 표면에서 인간배아줄기세포를 장기 배양하였을 때 줄기세포 본래의 미분화 특성이 유지되지만, 콜라겐 코팅 표면에서는 미분화 특성이 감소하고 자연적인 분화의 경향성이 증가하는 것을 의미한다.

<1-3> 배아줄기세포의 4개월 이상의 장기 배양시 마커 유전자의 정량분석

헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면에서의 인간배아줄기세포의 장기적인 배양 가능성을 파악하기 위해 실험예<1-1>에 기재된 방법으로 배아줄기세포의 배양을 시작하여 18번의 기계적인 방법을 통해 대략 4개월 이상의 기간 동안 인간 배야줄기세포를 계대배양하였고 마트리젤 코팅 표면에서 지지세포가 없는 배양(Feeder-free culture)으로 처음 배양된 인간배아줄기세포의 줄기세포 마커 유전자와 분화 마커 유전자의 발현을 실험예<1-1>과 같은 방법으로 확인 및 정량 분석하였다.

그 결과, 줄기세포 마커인 OCT4, SOX2, 및 NANOG의 발현 양상은 마트리젤 코팅 표면과 유사하거나 증가되는 양상을 보였고(도 9) 외배엽 마커인 PAX6, 중배엽 마커인 T, 그리고 내배엽 마커인 CXCR4 의 유전자 발현 양상은 마트리젤 코팅 표면과 유사하거나 감소되는 경향을 보였다(도 10). 또한 중배엽 마커인 α-SMA와 내배엽 마커인 GATA4를 추가적인 마커로 사용하여 같은 세포에서의 유전자의 발현 양상을 형광현미경을 통해 확인하였다.

상기의 결과로부터 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면에서 4개월 이상 장기 배양된 인간배아줄기세포는 줄기세포 본래의 특성을 잃지 않는 것과, 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면이 인간배아줄기세포의 장기 배양에 적합할 수 있음을 확인하였다.

<1-4> 배아줄기세포의 5개월 이상의 장기 배양시 특성 확인

헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면에서의 인간배아줄기세포의 장기적인 배양 가능성을 파악하기 위해 실험예<1-1>에 기재된 방법으로 배아줄기세포의 배양을 시작하여 25번의 기계적인 방법을 통해 대략 5개월 이상의 기간 동안 인간 배아줄기세포를 계대배양하였다.

그 결과, 세포의 염색체 배열을 핵형 검사를 통해 확인하였고(도 12), 또한 상기 표면에서 장기 배양된 인간배아줄기세포의 전분화능을 확인하기 위하여 인간배아줄기세포로부터 삼차원적 세포 구조체인 배상체들(Embryoid bodies, EBs)을 제작하였으며(도 13), 이렇게 제작된 배상체들을 부착하여 줄기세포 마커 (OCT4) 및 외배엽 마커인 TUJ1, 중배엽 마커인 α-SMA, 내배엽 마커인 GATA4의 단백질 발현을 형광현미경을 통해 확인하였다(도 14). 이러한 결과는 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I 코팅 표면에서 장기 배양된 인간배아줄기세포는 유전적 변이 없이 안정적으로 유지됨을 보여주며 또한 줄기세포 본래의 특성인 전분화능을 그대로 유지할 수 있음을 보여준다. 이는 인간배아줄기세포를 안정적으로 장기 배양함에 있어 헤파린-카테콜/콜라겐 타입 I을 동시 코팅한 표면이 적합할 수 있음을 나타낸다.

Claims

카테콜(cathchol) 기능기가 컨쥬게이션(conjugation)된 헤파린, 및 콜라겐 타입 I이 표면에 코팅된 줄기세포 배양용 플레이트.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 플레이트의 표면은 폴리우레탄(polyurethane), 폴리다이메틸실록산(PDMS), 테플론(Teflon), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 실리콘(silicone), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride), 폴리카보네이트(polycarbonate), 생분해성 지방족폴리에스테르계 고분자, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 인산칼슘(calcium phosphate), 산화알루미늄(aluminum oxide), 산화티타늄(titanium oxide), 산화실리콘(silicon oxide), 산화철(iron oxide), 유리(glass), 석영(quartz), 금(gold), 백금(platinum), 텅스텐(tungsten), 은(silver), 구리(copper), 스텐리스 스틸(stainless steel), 코발트-크롬합금(cobalt-chromium alloy) 및 니티놀(nitinol)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 플레이트.
1) 헤파린에 카테콜 기능기를 컨쥬게이션(conjugation)하여 카테콜 기능기가 도입된 헤파린을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 헤파린을 녹인 용액 및 콜라겐 타입 I 용액의 혼합용액을 줄기세포 배양용 플레이트에 처리하고 교반하여 코팅하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양용 플레이트의 제조 방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 1)의 카테콜 기능기가 도입된 헤파린은 헤파린 수용액에 도파민 염화수소산 염을 이용하여 제조한 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 플레이트의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 2) 이후에 코팅된 플레이트 표면을 멸균하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양용 플레이트의 제조방법.
1) 제 1항의 줄기세포 배양용 플레이트를 UV에 멸균 후, 줄기세포 배양액을 플레이트 표면에 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 플레이트에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양방법.
제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 배양은 지지세포의 첨가없이 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법.
제 7항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 유도만능줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법.
제 7항에 있어서, 상기 배양방법은 효소의 사용 없이 장기적인 물리적 계대배양이 가능한 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법.