JP6363401B2 - 人工多能性幹細胞の分化誘導方法 - Google Patents

Description

本発明は、パターン培養用基材を用いて人工多能性幹細胞を分化誘導する方法に関する。

近年、細胞移植に基づく再生医療が臓器移植に代替する治療法として注目を集めつつある。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は多能性及び無限増殖性を有しているため、再生医療に必要とされる細胞を調製するための細胞ソースとして期待されている。また近年ＥＳ細胞に相応する性質を備えた人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が成人の体細胞から調製可能であることが示され、これらの細胞の臨床応用への期待はますます高まってきている。そして、再生医療技術の発展に伴い、これらの幹細胞から短期間で目的細胞に分化誘導させる技術の確立が必須となっている。

通常、分化誘導は、様々な因子を液体培地中に添加することで行われている。非特許文献１に示されているように、因子の種類や組み合わせ、それらを添加するタイミングや期間などは多岐に渡る。これら液性因子は高価であり、培養中、継続的に分化誘導シグナルを細胞に送る為には培地交換のたびに添加せねばならず、かつ分化に数週間を要するという課題があった。

Human embryonic and rat adult stem cells with primitive endoderm-like phenotype can be fated to definitive endoderm, and finally hepatocyte-like cells. PloS One 2010 Aug 11;5(8)

本発明は、効率良くかつ安定的に、幹細胞から内胚葉系細胞を分化誘導するための手法を提供することを目的とする。

本発明者らは、基材上にポリエチレングリコールを固定化し、部分的に酸化及び／又は分解処理を施して細胞接着性とした細胞培養基材であって、細胞接着領域が一定の面積範囲を有するものを用い、その細胞接着領域に人工多能性幹細胞を接着させて培養すると、外胚葉系遺伝子や中胚葉系遺伝子が発現亢進しないのに対し、内胚葉系遺伝子のみ発現亢進することを見出した。

すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）人工多能性幹細胞から内胚葉系細胞を分化誘導する方法であって、
基材と、基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域及び各細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材を準備する工程、
人工多能性幹細胞を、細胞培養基材に対し播種する工程、及び
播種した人工多能性幹細胞を培地中で培養する工程、
を含み、
細胞培養基材の細胞非接着領域が、ポリエチレングリコールが基材上に固定化されて形成されたものであり、細胞接着領域が基材上に固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部が酸化及び／又は分解されて形成されたものであり、各細胞接着領域の面積が０．７８５ｍｍ^２未満である、前記分化誘導方法。
（２）細胞接着領域が、直径０．２ｍｍ〜０．８ｍｍの円形の形状で形成されている、（１）記載の分化誘導方法。
（３）人工多能性幹細胞を播種後１４日以上培養する、（１）又は（２）記載の分化誘導方法。
（４）細胞接着領域が、基材上に固定化されたポリエチレングリコールが紫外線照射により酸化されて形成されたものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の分化誘導方法。（５）人工多能性幹細胞を３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の初期細胞密度で播種する、（１）〜（４）のいずれかに記載の分化誘導方法。
（６）基材と、基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域及び各細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材であって、
細胞培養基材の細胞非接着領域が、ポリエチレングリコールが基材上に固定化されて形成されたものであり、細胞接着領域が基材上に固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部が酸化及び／又は分解されて形成されたものであり、各細胞接着領域の面積が０．７８５ｍｍ^２未満であり、細胞接着領域が、直径０．４ｍｍ〜０．７ｍｍの円形の形状で形成されている、前記細胞培養基材。
（７）前記細胞接着領域が、０．７０ｍｍ以上互いに離れて配置されている、（６）記載の細胞培養基材。
（８）基材上にポリエチレングリコールを固定化する工程、及び
固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部を酸化及び／又は分解して、細胞接着領域を形成する工程、
を含む、（６）又は（７）記載の細胞培養基材の製造方法。

本発明によれば、効率良くかつ安定的に、幹細胞から内胚葉系細胞を分化誘導することが可能となる。

細胞培養基材のうち、直径０．３ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものと、全面を露光して細胞接着性にしたものに、ヒトｉＰＳ細胞を播種し、細胞接着領域のパターンサイズと遺伝子発現傾向の相関を、ピアソン相関係数を用いてクラスタリング解析した結果を示す。 直径０．３ｍｍ又は１．５ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものと、全面露光して細胞接着性にしたものにヒトｉＰＳ細胞播種後４日目、７日目、１４日目で細胞からＲＮＡを抽出し、内胚葉系遺伝子ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７について定量的ＰＣＲを行った結果を示す。横軸は播種後の日数を、縦軸は各基材上で培養されたヒトｉＰＳ細胞での発現量を１とした際のマーカー発現量を示す。 直径０．３ｍｍ又は１．５ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものと、全面露光して細胞接着性にしたものにヒトｉＰＳ細胞播種後４日目、７日目、１４日目で細胞からＲＮＡを抽出し、外胚葉系遺伝子β−ＴＵＢＬＩＮ、中胚葉系遺伝子ＦＬＫ−１、未分化マーカーＯＣＴ３／４について定量的ＰＣＲを行った結果を示す。横軸は播種後の日数を、縦軸は各基材上で培養されたヒトｉＰＳ細胞での発現量を１とした際のマーカー発現量を示す。 直径０．０５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．３ｍｍ、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ又は１．５ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものと、全面露光して細胞接着性にしたものにヒトｉＰＳ細胞播種後１４日目で細胞からＲＮＡを抽出し、内胚葉系遺伝子ＡＦＰ、外胚葉系遺伝子β−ＴＵＢＬＩＮ、又は中胚葉系遺伝子ＦＬＫ−１を認識、増幅するプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った結果を示す。縦軸は、ヒトｉＰＳ細胞における各マーカー遺伝子の発現量を基準とした場合の発現量の相対値を示す。 直径０．３ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものに、ヒトｉＰＳ細胞を、３．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２、６．２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２、１．２４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２、又は２．４８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種後１４日目で細胞からＲＮＡを抽出し、内胚葉系遺伝子ＡＬＢＵＭＩＮ、ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＳＯＸ１７と外胚葉系遺伝子β−ＴＵＢＬＩＮ、中胚葉系遺伝子ＦＬＫ−１、未分化マーカーＯＣＴ３／４を認識、増幅するプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った結果を示す。縦軸は、３．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の初期細胞密度における各マーカー遺伝子の発現量を基準とした場合の発現量の相対値を示す。 直径０．３ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものに、ヒトｉＰＳ細胞を、２．４８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種し、分化誘導した。播種後１４日目に細胞を固定処理し、内胚葉マーカーであるＡＦＰに対する抗体及び外胚葉マーカーであるＴｕｊ１に対する抗体を用いて、免疫染色を行った結果を示す。Ａ：ＤＡＰＩによる核染色の画像；Ｂ：抗ＡＦＰ抗体による免疫染色の画像；Ｃ：抗Ｔｕｊ１抗体による免疫染色の画像；Ｄ：ＤＡＰＩによる核染色、抗ＡＦＰ抗体による免疫染色及び抗Ｔｕｊ１抗体による免疫染色の重ね合わせ画像；Ｅ：細胞塊の断面におけるＤＡＰＩによる核染色、抗ＡＦＰ抗体による免疫染色及び抗Ｔｕｊ１抗体による免疫染色の重ね合わせ画像。 直径０．３ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンが、０．３５ｍｍ、０．７０ｍｍ又は１．４０ｍｍの距離で互いに離れて配置されているものに、ヒトｉＰＳ細胞を、２．４８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種し、分化誘導した。播種後１４日目に細胞からＲＮＡを抽出し、内胚葉系遺伝子ＡＬＢＵＭＩＮ、ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＳＯＸ１７と外胚葉系遺伝子β−ＴＵＢＬＩＮ、中胚葉系遺伝子ＦＬＫ−１、未分化マーカーＯＣＴ３／４を認識、増幅するプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った結果を示す。縦軸は、開口部間の最短距離が０．３５ｍｍの細胞培養基材における各マーカー遺伝子の発現量を基準とした場合の発現量の相対値を示す。 本発明の細胞培養基材を示す。Ａ：本発明の細胞培養基材の平面図；Ｂ：Ｉ−Ｉ’断面図。

本発明の人工多能性幹細胞の分化誘導方法は、基材と、基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域（細胞接着性の領域）及び各細胞接着領域を囲む細胞非接着領域（細胞非接着性の領域）とを備える細胞培養基材を用いることを特徴とする。

本発明において「細胞接着性」とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。細胞接着領域とは、細胞接着性が良好な領域を意味し、細胞非接着領域とは、細胞の接着性が悪い領域を意味する。従って、細胞接着領域と細胞非接着領域とがパターン化された基材上に細胞を播くと、細胞接着領域には細胞が接着するが、細胞非接着領域には細胞が接着しないため、細胞培養基材表面には細胞がパターン状に配列されることになる。

細胞接着性を判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％のインキュベータ内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。

細胞の播種は、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に懸濁させて測定対象物上に播種し、その後、細胞ができるだけ均一に分布するよう、細胞が播種された測定対象物をゆっくりと振とうすることにより行うものである。さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。細胞接着伸展率の測定では、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所（例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁）を除いた箇所を測定箇所とする。

一方、細胞非接着性とは、細胞が接着しにくい性質をいう。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。細胞非接着性の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。

本発明で用いる細胞培養基材は、細胞非接着領域が、ポリエチレングリコールが基材上に固定化されて形成されたものであり、細胞接着領域が基材上に固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部が酸化及び／又は分解されて形成されたものである。このような細胞培養基材は、例えば、基材の表面全体にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の薄膜を形成し、次いで、細胞の接着が望まれる領域に対して酸化処理又は分解処理を施して細胞接着性を付与することにより製造できる。前記処理を施さない部分はＰＥＧが固定化された細胞非接着領域である。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、1つ以上のエチレングリコール単位（（ＣＨ_２）_２−Ｏ）からなるエチレングリコール鎖（ＥＧ鎖）を少なくとも含むが、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。エチレングリコール鎖は、例えば、次式：
−（（ＣＨ_２）_２−Ｏ）_ｍ−
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。ｍは、好ましくは１〜１３の整数であり、より好ましくは１〜１０の整数である。

ＰＥＧにはエチレングリコールオリゴマーも包含される。また、ＰＥＧには、官能基が導入されたものも包含される。官能基としては、例えば、エポキシ基、カルボキシル基、Ｎ−ハイドロキシスクシイミド基、カルボジイミド基、アミノ基、グルタルアルデヒド基、（メタ）アクリロイル基等が挙げられる。官能基は、場合によりリンカーを介して、好ましくは末端に導入されたものである。官能基が導入されたＰＥＧとして、例えば、ＰＥＧ（メタ）アクリレート、ＰＥＧジ（メタ）アクリレートが挙げられる。

細胞培養基材に用いられる基材としては、その表面にＰＥＧ薄膜を形成することが可能な材料で形成されたものであれば特に限定されるものではない。具体的には、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。

基材上に形成されるＰＥＧ薄膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがさらに好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、基材表面のＰＥＧ薄膜で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。さらに、ＰＥＧ薄膜の厚みを一定以上とすることで、細胞非接着性が低下して、細胞が細胞接着領域以外の領域まで接着伸展するのを抑制できる。またＰＥＧ薄膜の厚みを一定以下とすることで、培養液中に含まれる細胞生存に必要な因子を、細胞接着領域内の基材に近い細胞にもゆきわたらせることができる。

基材表面へのＰＥＧ薄膜の形成方法としては、基材へＰＥＧを直接吸着させる方法、基材へＰＥＧを直接コーティングする方法、基材へＰＥＧをコーティングした後に架橋処理を施す方法、基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、次いでＰＥＧをコーティングする方法、基材表面に重合開始点を形成し、次いでＰＥＧを重合する方法等を挙げることができる。基材上に下地層を形成し、次いでＰＥＧをコーティングする方法が好ましい。

下地層は、例えば、特開２０１２−１７５９８３に記載の方法により形成することができ、好ましくはＰＥＧ末端のヒドロキシル基又は導入された官能基と反応して共有結合を形成することができる官能基、あるいは、そのような官能基に変換可能な官能基を有するシランカップリング剤を用いて形成できる。そのような官能基としては、例えば、（メタ）アクリロイル基、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、グリシジル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基、イソシアネート基、マレイミド基等が挙げられ、なかでも（メタ）アクリロイル基、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。

例えば、メタクリロイル基を末端に有するシランカップリング剤（メタクリロイルシラン）を例にとると、メタクリロイルシランを付加した基材表面の水接触角は、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上、より望ましくは４８°以上、さらにより望ましくは５０°以上である。それにより、次にＰＥＧを固定化することによって十分な細胞非接着領域を形成することができる。

基材上に固定化されるＰＥＧの密度及び細胞非接着性は、表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。例えば、ＰＥＧ固定化後の表面の水接触角が典型的には４８°以下、好ましくは４０°以下、より好ましくは３０°以下であれば、ＰＥＧが十分な密度で存在し、細胞非接着性と考えられる。なお、本発明において水接触角とは、２３℃において測定される水接触角をさす。

本発明において「酸化」とは狭義の意味であり、有機化合物、すなわちＰＥＧが酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を意味する。本発明において「分解」とは有機化合物、すなわちＰＥＧの結合が切断される反応を指す。「分解」としては典型的には、酸化による分解、紫外線照射による分解などが挙げられるがこれらには限定されない。「分解」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解」と「酸化」とは同一の処理を指す。

紫外線照射による分解は、ＰＥＧが紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、ＰＥＧが、酸素を含む分子種（酸素、水など）とともに存在している系中に紫外線を照射すると、紫外線がＰＥＧに吸収されて分解が起こる以外に、該分子種が活性化してＰＥＧと反応する場合がある。後者の反応は「酸化」に分類できる。そして活性化された分子種による酸化によりＰＥＧが分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類できる。以上のように「酸化」と「分解」は操作としては重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない。そこで本明細書では「酸化及び／又は分解」という用語を使用する。

酸化及び／又は分解の方法としては、ＰＥＧ薄膜を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。ＰＥＧ薄膜を部分的に酸化及び／又は分解する場合は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いたりするとよい。また、紫外線レーザ等のレーザを用いた方式等の直描方式で酸化及び／又は分解してもよい。

紫外線照射処理の場合は、波長１８５ｎｍや２５４ｎｍの紫外線を出す水銀ランプや波長１７２ｎｍの紫外線を出すエキシマランプなどのＶＵＶ領域からＵＶ−Ｃ領域の紫外線を出すランプを光源として用いることが好ましい。光触媒処理する場合は、波長３６５ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることが好ましく、波長２５４ｎｍ以下の紫外線を出す光源を用いることがより好ましい。光触媒としては、酸化チタン光触媒、金属イオンや金属コロイドで活性化された酸化チタン光触媒を用いるのが好ましい。酸化剤としては、有機酸や無機酸を特に制限なく用いることができるが、高濃度の酸は取り扱いが難しいので、１０％以下の濃度に希釈して用いると良い。最適な紫外線処理時間、光触媒処理時間、酸化剤処理時間は、用いる光源の紫外線強度、光触媒の活性、酸化剤の酸化力や濃度などの諸条件に応じて適宜決定することができる。

細胞接着領域（下地層が存在する場合には下地層も含む）の炭素量は、細胞非接着領域（下地層が存在する場合には下地層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着領域の炭素量が、細胞非接着領域の炭素量に対して２０〜９９％であることが好ましい。また、細胞接着領域（下地層が存在する場合には下地層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞非接着領域（下地層が存在する場合には下地層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞非接着領域における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５〜９９％であることが好ましい。パターニング時の紫外線露光量の増加に伴い、細胞接着性が増加するが、細胞回収時に接着性が高いと細胞が剥がれにくくなり、回収が困難になるからである。

本発明において、「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義され、「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。

本発明で用いる細胞培養基材においては、各細胞接着領域の面積は０．７８５ｍｍ^２未満、好ましくは０．５ｍｍ^２以下、より好ましくは０．４ｍｍ^２以下、さらに好ましくは０．３ｍｍ^２以下、さらにより好ましくは０．１５ｍｍ^２以下、とりわけさらにより好ましくは０．０１ｍｍ^２以下であり、好ましくは０．００７８５ｍｍ^２以上、より好ましくは０．０３ｍｍ^２以上、さらに好ましくは０．１２５ｍｍ^２以上の範囲となるようパターン形成されている。本発明の一実施形態において、各細胞接着領域の面積は、０．０３ｍｍ^２〜０．１５ｍｍ^２の範囲であることが好ましく、０．１２５ｍｍ^２〜０．４ｍｍ^２の範囲であることがより好ましい。人工多能性幹細胞を０．００７８５ｍｍ^２以上の面積を有する細胞接着領域に接着させて培養することにより、細胞が剥離することなく、細胞を接着させたまま培養することができる。また、人工多能性幹細胞を０．７８５ｍｍ^２未満の面積を有する細胞接着領域に接着させて培養することにより、外胚葉系遺伝子や中胚葉系遺伝子を発現亢進させることなく、内胚葉系遺伝子を発現亢進させることができる。すなわち、内胚葉系細胞への分化を効果的に誘導することができる。

各細胞接着領域の形状は特に制限されないが、四角形を初めとする多角形、円形、楕円形等であることができる。円形のものが好ましく、直径が１．０ｍｍ未満、好ましくは０．８ｍｍ以下、好ましくは０．１ｍｍ以上、より好ましくは０．２ｍｍ以上、さらに好ましくは０．３ｍｍ以上の円形が好ましい。本発明の一実施形態において、各細胞接着領域の形状は、０．２ｍｍ〜０．８ｍｍの円形が好ましく、０．４ｍｍ〜０．７ｍｍの円形がより好ましい。１つの細胞培養基材において、複数存在する細胞接着領域は、いずれも同じ面積を有することが好ましく、同じ面積と形状を有することがさらに好ましいが、異なる面積や形状が混在していてもよい。前記形状を有する細胞接着領域に人工多能性幹細胞を接着させて培養することにより、外胚葉系遺伝子や中胚葉系遺伝子を発現亢進させることなく、内胚葉系遺伝子を発現亢進させることができる。すなわち、内胚葉系細胞への分化を効果的に誘導することができる。

また、細胞培養基材において、各細胞接着領域は、細胞非接着領域に囲まれており、すなわち互いに隔離されており、好ましくは０．３５ｍｍ以上、より好ましくは０．７０ｍｍ以上、さらに好ましくは０．７５ｍｍ以上、特に好ましくは１．４０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。すなわち、細胞接着領域間の最短距離（円の場合、二つの円の中心間の距離が、各半径の合計に上記値を加えた値となる）が好ましくは０．３５ｍｍ以上、より好ましくは０．７０ｍｍ以上、さらに好ましくは０．７５ｍｍ以上、特に好ましくは１．４０ｍｍ以上となるように配置される。各細胞接着領域を一定距離以上隔離することにより、各細胞接着領域内の細胞が他の細胞接着領域の細胞と細胞間結合を形成することなく均一に一定間隔で培養され、再現性の高い実験系を構築できる。また、前記間隔で互いに隔離された各細胞接着領域に人工多能性幹細胞を接着させて培養することにより、外胚葉系遺伝子や中胚葉系遺伝子を発現亢進させることなく、内胚葉系遺伝子を発現亢進させることができる。すなわち、内胚葉系細胞への分化を効果的に誘導することができる。

本発明で用いる細胞培養基材の面積は、細胞の分化誘導に使用される細胞培養容器の形状、並びに細胞接着領域の面積及び数に基づき、適宜設定することができる。具体的には、本発明で用いる細胞培養基材は、通常は、該細胞培養基材に形成される１個の細胞接着領域の面積の最小値を超える面積を有し、使用される細胞培養容器における培養面の面積未満の面積を有する。例えば、本発明で用いる細胞培養基材の面積は、０．００７８５ｍｍ^２を超えることが好ましい。

細胞培養基材における細胞接着領域の割合は、通常１〜５０％、好ましくは５〜４０％、より好ましくは１０〜２０％である。培養液に対する細胞の量を一定以上とすることで細胞の死滅を防止でき、一定以下とすることで生存に必要な因子の枯渇とそれによる細胞へのダメージを防止できる。

また、各細胞接着領域は、規則的に一定の間隔で、例えば格子状に、縦横同じピッチで配置されていることが好ましい。各細胞接着領域の細胞からの産生物質によるパラクライン効果を一定にすることで、分化に与える影響を一定にすることができる。

例えば、円形の細胞接着領域を複数有するパターンは、複数の円形の開口部を有するフォトマスクを用い、ＰＥＧ薄膜が形成されたガラス基板とフォトマスクを対向するように配置し、フォトマスクの側から紫外線を照射し、ＰＥＧ薄膜においてフォトマスクの開口部に相当する領域を酸化処理することにより形成することができる。

本発明で用いる細胞培養基材は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の細胞接着領域への接着を促進する目的で、プレコート処理されていることが好ましい。プレコート処理は、細胞外マトリックス（コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、ビトロネクチン）、ゼラチン、リジン、ペプチド、それらを含むゲル状マトリックス、血清等で細胞培養基材をコーティングすることにより実施できる。プレコート処理を実施することにより、接着性の低いｉＰＳ細胞の細胞接着領域への接着を促進でき、細胞の接着培養及び分化誘導を効果的に実施できる。

同様に、ｉＰＳ細胞の細胞接着領域への接着を促進する目的で、ｉＰＳ細胞の播種前にフィーダー細胞を播種して２４時間程度培養し、フィーダー細胞上でｉＰＳ細胞の培養を実施することが好ましい。フィーダー細胞としては、当技術分野で通常用いられるものを使用でき、特に制限されないが、例えば、線維芽細胞等が挙げられる。フィーダー細胞は、細胞培養基材に対し１．２６×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２未満の密度、好ましくは６．３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度で、好ましくは３．１５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度で播種する。

本発明の分化誘導方法においては、プレコート処理とフィーダー細胞の播種を双方実施してｉＰＳ細胞の培養を行って用いてもよく、プレコート処理のみを行ってもｉＰＳ細胞の培養を行ってもよく、又はプレコート処理を行わずフィーダー細胞の播種のみを行ってｉＰＳ細胞の培養を行ってもよい。

本発明の分化誘導方法において使用される人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。人工多能性幹細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Rudolf Jaenisch)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（James Thomson）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Konrad Hochedlinger）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。

ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本発明で言う体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、すい臓細胞、血球細胞、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。

ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本発明におけるｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。

体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子

細胞培養基材に播種する前のｉＰＳ細胞は非分化誘導化培地を用いて未分化性を維持したものとする。細胞培養基材表面へ播種する前後において分化誘導化培地に切り換え、基材表面へ播種し、そのまま細胞を細胞接着領域内でコンフルエントになるまで増殖させる。得られた細胞集合体に対し酵素処理を行うことで目的とする分化誘導細胞を得ることができる。

本発明で用いる非分化誘導化培地は、ｉＰＳを分化誘導させない培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳの未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ ＦＧＦを含む培地等が挙げられる。分化誘導化培地は、ｉＰＳ細胞を分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清に代替する性質を有する既知成分を含有した無血清培地等が挙げられる。用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。培地に、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。例えば、０．１〜２％のピルビン酸、０．１〜２％の非必須アミノ酸、０．１〜２％のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１〜１％のグルタミン、０．１〜２％のβメルカプトエタノール、１ｍＭ〜２０ｍＭのＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）を添加してもよい。分化誘導培地には、液性因子を添加してもよいが、本発明の分化誘導方法は液性因子を添加しなくても内胚葉系細胞へ分化誘導できる点を特徴とする。したがって、一実施形態においては、液性因子を含まない分化誘導培地を用いて培養を行う。

細胞培養基材へのｉＰＳ細胞の播種密度は常法に従えばよく特に限定されるものではない。本発明においては、ｉＰＳ細胞を、細胞培養基材に対し、１．２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２未満の密度、好ましくは３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度で、好ましくは１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度で播種する。本発明の一実施形態において、ｉＰＳ細胞を、細胞培養基材に対し、３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度で播種することが好ましく、３×１０^４〜５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種することがより好ましく、３×１０^４〜２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で播種することがさらに好ましい。ｉＰＳ細胞の初期細胞密度が１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２未満の場合、細胞接着領域の表面全体に亘って、ｉＰＳ細胞が均質に接着できない可能性がある。このような場合、細胞培養基材上で形成される細胞の集合体（以下、「細胞塊」とも記載する）に隙間が生じる可能性がある。これに対し、１．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上、好ましくは３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の初期細胞密度でｉＰＳ細胞を培養することにより、外胚葉系遺伝子群（外胚葉に特異的な遺伝子）及び中胚葉系遺伝子群（中胚葉に特異的な遺伝子）を発現亢進させることなく、内胚葉系遺伝子群（内胚葉に特異的な遺伝子）を発現亢進させることができる。すなわち、内胚葉系細胞への分化を効果的に誘導することができる。それ故、前記範囲の初期細胞密度でｉＰＳ細胞を播種することにより、内胚葉系細胞へ正常に分化し得る細胞塊を形成することができる。

通常、高い初期細胞密度でｉＰＳ細胞を播種するほど、細胞培養基材上で形成される細胞塊の厚さは高くなる。本発明者らは、細胞培養基材上で形成される細胞塊の厚さが高くなるほど、外胚葉系遺伝子群の産物である外胚葉マーカーの発現量と比較して、内胚葉系遺伝子群の産物である内胚葉マーカーの発現が特異的に亢進されることを見出した。例えば、前記初期細胞密度でｉＰＳ細胞を播種した場合、細胞培養基材上で形成される細胞塊のうち、内胚葉系遺伝子群の発現が特異的に亢進されている細胞塊の厚さは、通常は１５μｍ以上、典型的には２１μｍ以上となる。細胞培養基材上で形成される細胞塊の厚さが前記範囲の場合、内胚葉系細胞への分化を効果的に誘導することができる。

培養温度は、通常３７℃である。ＣＯ_２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ_２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。

ｉＰＳ細胞を細胞培養基材へ播種後の培養期間は、好ましくは１２日以上、より好ましくは１４日以上、さらに好ましくは２１日以上であり、好ましくは３０日以下、より好ましくは２７日以下である。本発明者らは、ｉＰＳ細胞を細胞培養基材へ播種後１４日目において、内胚葉系遺伝子群が有意に発現亢進することを見出した。本発明の分化誘導方法により、培養１４日目において、内胚葉系遺伝子群の発現を未分化ｉＰＳ細胞と比較して２５倍まで亢進させることができ、これは驚くべき結果である。本発明者らはさらに、内胚葉系遺伝子群（内胚葉に特異的な遺伝子）の発現が２５倍まで亢進したのに対し、外胚葉系遺伝子群（外胚葉に特異的な遺伝子）及び中胚葉系遺伝子群（中胚葉に特異的な遺伝子）の発現は、有意に亢進しないことも見出した。

内胚葉は消化管のほか肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などを形成する。したがって、本発明において内胚葉系細胞とはこれらの器官の細胞をさす。ｉＰＳ細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＳＴ、ＩＳＬ１、ＩＰＦ１、ＩＡＰＰ、ＥＯＭＥＳ、ＨＧＦ、ＡＬＢＵＭＩＮ、ＰＡＸ４、ＴＡＴ等を挙げることができる。

外胚葉は皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体などを形成する。外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。また末梢神経系も形成する。外胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、β−ＴＵＢＬＩＮ、ＮＥＳＴＩＮ、ＧＡＬＡＮＩＮ、ＧＣＭ１、ＧＦＡＰ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＯＬＩＧ２、ＳＹＮＡＰＴＰＨＹＳＩＮ、ＤＥＳＭＩＮ、ＴＨ等を挙げることができる。

中胚葉は体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）を形成する。中胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、ＦＬＫ−１、ＣＯＬ２Ａ１、ＦＬＴ１、ＨＢＺ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＲＵＮＸ２、ＰＥＣＡＭ１、ＣＤ３４等を挙げることができる。

本発明の方法によりｉＰＳ細胞から分化誘導された内胚葉系細胞、例えば、膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系の治療用細胞を得ることができる。例えば、腸系では、クリプト細胞などの腸前駆細胞を得た場合には、これをカテーテルなどで移植することにより、潰瘍性大腸炎、クローン病、短腸症などの治療へ利用できる。膵臓系では、例えばβ細胞やインスリン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、糖尿病の治療へ利用できる。肝臓系では、例えばアルブミン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、大量出血を伴う外傷治療などへ利用できる。例えば膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系における治療用組織を、高分子支持担体などを利用して培養することにより得ることもできる。例えば、肝臓組織を誘導して得た場合は、肝癌、肝硬変、急性肝不全や、ヘモクロマトーシスなどの肝代謝障害の治療へ利用できる。肺細胞組織を得た場合、これを患部へ移植することにより嚢胞性線維症や喘息などの肺呼吸器疾患治療へ利用できる。腎臓系では、メサンギウム細胞や尿細管上皮細胞、糸球体細胞など含む組織を得た場合、これを直接移植することにより、腎不全や腎炎の治療や透析治療などへ利用できる。肝臓系の、物質代謝が可能な細胞を得ることにより、アルブミン産生細胞、血液凝固因子産生細胞、α１アンチトリプシンなどの代謝酵素産生細胞を作製し、産生した代謝酵素を直接注射するか点滴投与することにより、これらのタンパク質の欠乏症の治療に用いることができる。例えばβ細胞などの、物質代謝が可能な膵臓系の細胞を得ることにより、インスリン産生細胞を作製し、産生したインスリンを直接注射することにより、Ｉ型糖尿病の治療に用いることもできる。あるいは、得られた内胚葉系細胞を被検物質の薬効／毒性評価や作用メカニズムの解明、あるいは生物現象メカニズムの解析に用いることも可能である。

本発明はまた、細胞培養基材に関する。本発明の細胞培養基材を図8に示す。図8に示すように、本発明の細胞培養基材1は、基材11と、基材11上に形成された複数の隔離された細胞接着領域12及び各細胞接着領域12を囲む細胞非接着領域13とを備える。本発明の細胞培養基材1は、場合により、基材11の上面に下地層14を備えていてもよい。この場合、細胞接着領域12及び細胞非接着領域13は、下地層14の上面に配置される。本発明の細胞培養基材及び該細胞培養基材を構成する各部材は、前記で説明した特徴を有する。前記特徴を有する本発明の細胞培養基材は、本発明の人工多能性幹細胞の分化誘導方法に用いることができる。

本発明はまた、基材上にポリエチレングリコールを固定化する工程、及び固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部を酸化及び／又は分解して、細胞接着領域を形成する工程を含む、本発明の細胞培養基材の製造方法に関する。本発明の細胞培養基材の製造方法を構成する各工程は、前記で説明した特徴を有する。前記特徴を有する本発明の細胞培養基材の製造方法により、本発明の細胞培養基材を得ることができる。

以上のように、本発明により、人工多能性幹細胞の分化誘導方法、該方法に使用される細胞培養基材、及び該細胞培養基材の製造方法を提供することができる。これにより、効率良くかつ安定的に、幹細胞から内胚葉系細胞を分化誘導することが可能となる。

以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。

＜実施例１＞細胞培養基材の作製
トルエン３９．０ｇ、メタクリロイルシランＴＳＬ８３７０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌してから、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済みの５ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、ガラス基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これによりガラス基板表面にメタクリロイル基を含む薄膜が形成された。

ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧｄＡ、アルドリッチ製）１０ｇに重合開始剤２，２’−ジメトキシ−２−フェニル−アセトフェノン（ＤＭＰＡ、アルドリッチ製）０．１ｇを室温で溶かした。これを上記メタクリロイル化基板に１５００ｒｐｍで５秒間スピンコートした。その後、速やかに窒素雰囲気下で３秒間紫外線を基板全面に照射した。次いで１６０℃で１０分間ポストベークした。このＰＥＧｄＡ化基板を一晩水に浸漬した後に水洗し、次いで乾燥させた。平均乾燥膜厚は、０．３３μｍであった。

フォトマスクは、同じ大きさの円形の開口部が複数形成されたパターンを有する５インチサイズのものを４種類用いた。４種類のフォトマスクは、円形の開口部の直径が異なり、それぞれ直径０．３ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍの円形の開口部が形成され、開口部間のスペース、すなわち開口部間の最短距離は全て０．３５ｍｍのパターンを有するものであった。

マスクをＰＥＧｄＡ化基板のＰＥＧｄＡ面に静かに載せ、マスクの裏面側からキセノンエキシマーランプ（１７２ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ^２）を光源とする真空紫外線を１分間照射した。これにより、ＰＥＧｄＡ膜表面のフォトマスクの開口部に相当する領域を酸化処理した。基板を２．５ｃｍ角に切断し細胞培養に用いた。

得られた細胞培養基材における細胞接着領域の形状は円形で、その直径はそれぞれ０．３ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍであり、細胞接着領域間のスペース、すなわち細胞接着領域間の最短距離は全て０．３５ｍｍであった。また、細胞培養基材における細胞接着領域の割合は、それぞれ、１５．６％、４３．１％、５１．８％、５６．９％であった。比較例として、全面を露光して細胞接着領域とした細胞培養基材を用意した。

＜実施例２＞
実施例１で作製した細胞培養基材のうち、直径２．０ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものにヒトｉＰＳ細胞を播種し、細胞が未分化のまま接着することを検証した。以下その詳細を記載する。

実施例１で作製した細胞培養基材（２５ｍｍ×１５ｍｍ；面積６．４５ｃｍ^２）を滅菌処理し、３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ）上に配置してフィブロネクチン（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を室温で３０分プレコートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ヒトｉＰＳ細胞は月経血から取得した細胞に山中４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ）をセンダイウイルスベクターによって一過的に発現させて樹立したものである（DNA Methylation Dynamics in Human Induced Pluripotent Stem Cells over Time. PLoS Genet. 2011 May;7(5)）培養にはｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｂａｓｉｃ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加したｉＰＳｅｌｌｏｎ培地（Ｃａｒｄｉｏ）を用いた。細胞播種２日後に４％パラホルムアルデヒドで固定処理を行い、免疫染色法によって細胞接着領域の細胞全てに未分化マーカー（ＯＣＴ３／４、ＴＲＡ１−６０）が各々検出された。

免疫染色には、マウスＩｇＧ２ｂ標識抗ＯＣＴ３／４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ 希釈率１／３００）及びマウスＩｇＭ標識抗ＴＲＡ１−６０抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 希釈率１／３００）をそれぞれ用いた。

＜実施例３＞
実施例１で作製した細胞培養基材のうち、直径０．３ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものと、全面を露光して細胞接着性にしたものに、ヒトｉＰＳ細胞を播種し、細胞接着領域のパターンサイズと遺伝子発現傾向の相関を検証した。以下その詳細を記載する。

細胞培養基材にゼラチン（Ｓｉｇｍａ）を３０分間室温でプレコートし、マウス胎児線維芽細胞をフィーダー細胞として３．１５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種した。２４時間後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分散したヒトｉＰＳ細胞を２．９３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種して２週間分化誘導し、各々の細胞培養基材上の細胞からＲＮＡを抽出した。９６種類の未分化マーカー及び分化マーカーを検出する定量的ＰＣＲを行った。フィーダー細胞の維持には１０％のウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）と１％のペニシリン／ストレプトマイシン及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）を用い、ｉＰＳ細胞の分化誘導には２０％の血清代替物ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１％のピルビン酸、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１％のβメルカプトエタノールとＹ２７６３２（ＷＡＫＯ）を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。４日目以降はＹ２７６３２非添加の培地を使用した。

得られたデータにピアソン相関係数を用いたクラスタリング解析を行った結果を図１に示す。直径０．３ｍｍの円形パターンの場合は、１．０ｍｍ及び１．５ｍｍの円形パターンの場合と有意に差があり、全面露光した基材とパターン基材にも差があることが分かった。また、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＳＴ、ＩＳＬ１等の内胚葉系の遺伝子群は、細胞接着領域の面積が小さいほど発現が増加する傾向が見られた。

＜実施例４＞
実施例１で作製した細胞培養基材のうち、直径０．３ｍｍ又は１．５ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものと、全面露光して細胞接着性にしたものに、マウス胎児線維芽細胞をフィーダー細胞として３．１５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種して２４時間後、さらにヒトｉＰＳ細胞を２．９３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種して２週間分化誘導した。ｉＰＳ細胞播種後４日目、７日目、１４日目で各々の細胞培養基材上の細胞からＲＮＡを抽出した。内胚葉系遺伝子ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２と外胚葉系遺伝子β−ＴＵＢＬＩＮ、中胚葉系遺伝子ＦＬＫ−１、未分化マーカーＯＣＴ３／４を認識、増幅するプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った。結果を図２及び図３に示す。

分化誘導していないヒトｉＰＳ細胞からもＲＮＡを抽出して定量的ＰＣＲを実施し、その計測値を基準とした。７日目まではいずれの発現も上昇せず、１４日目で直径０．３ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するもののみ内胚葉系遺伝子の発現が亢進した。なお、未分化マーカーは、いずれの基材でも１４日目に減少した。

＜実施例５＞
実施例１で作製した直径０．３ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有する細胞培養基材に５μｇ／ｍｌビトロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレコートし、ヒトｉＰＳ細胞を２．９３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種して２週間分化誘導した。４％パラホルムアルデヒドで固定処理を行い、免疫染色を行った結果、細胞接着領域の細胞全てに内胚葉系マーカーであるＡＦＰが検出された。抗体として、マウスＩｇＧ１標識抗ＡＦＰ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ 希釈率１／５００）を用いた。

＜実施例６＞細胞培養基材の作製
実施例１において、円形の開口部の直径が、それぞれ直径０．０５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．３ｍｍ、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ又は１．５ｍｍの円形の開口部が形成され、開口部間のスペース、すなわち開口部間の最短距離が全て０．３５ｍｍのパターンを有する５種類のフォトマスクを用いた他は、実施例１と同様の手順で、細胞培養基材を作製した。比較例として、全面を露光して細胞接着領域とした細胞培養基材を用意した。

＜実施例７＞
実施例６で作製した細胞培養基材のうち、直径０．０５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．３ｍｍ、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ又は１．５ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものと、全面を露光して細胞接着性にしたものに、ヒトｉＰＳ細胞を播種し、細胞接着領域のパターンサイズと遺伝子発現傾向の相関を検証した。以下その詳細を記載する。

細胞培養基材（２５ｍｍ×１５ｍｍ；面積６．４５ｃｍ^２）を滅菌処理し、３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ）上に配置した。細胞培養基材にゼラチン（Ｓｉｇｍａ）を３０分間室温でプレコートし、マウス胎児線維芽細胞をフィーダー細胞として３．１５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種した。２４時間後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分散したヒトｉＰＳ細胞を２．９３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種して２週間分化誘導し、各々の細胞培養基材上の細胞からＲＮＡを抽出した。フィーダー細胞の維持には１０％のウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）と１％のペニシリン／ストレプトマイシン及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）を用い、ｉＰＳ細胞の分化誘導には２０％の血清代替物ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１％のピルビン酸、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１％のβメルカプトエタノールとＹ２７６３２（ＷＡＫＯ）を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。４日目以降はＹ２７６３２非添加の培地を使用した。

ｉＰＳ細胞播種後１４日目で各々の細胞培養基材上の細胞からＲＮＡを抽出した。内胚葉系遺伝子ＡＦＰ、外胚葉系遺伝子β−ＴＵＢＬＩＮ、又は中胚葉系遺伝子ＦＬＫ−１を認識、増幅するプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った。結果を図４に示す。図中、「比較例」は、全面を露光して細胞接着性にした細胞培養基材を用いた結果を、「ヒトｉＰＳ細胞」は、月経血由来のヒトｉＰＳ細胞における各マーカー遺伝子の発現量の測定結果を、それぞれ示す。図中、縦軸は、ヒトｉＰＳ細胞における各マーカー遺伝子の発現量を基準とした場合の発現量の相対値を示す。

直径０．３〜１．０ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有する細胞培養基材を用いた場合、内胚葉系遺伝子の発現が顕著に亢進した。全面を露光して細胞接着性にした細胞培養基材を用いた比較例の場合、いずれのマーカー遺伝子とも発現亢進しなかった。

＜実施例８＞
実施例６で作製した細胞培養基材のうち、直径０．３ｍｍの円形の細胞接着領域のパターンを有するものに、異なる初期細胞密度でヒトｉＰＳ細胞を播種し、初期細胞密度と遺伝子発現傾向の相関を検証した。以下その詳細を記載する。

細胞培養基材（２５ｍｍ×１５ｍｍ；面積６．４５ｃｍ^２）を滅菌処理し、３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ）上に配置した。細胞培養基材にゼラチン（Ｓｉｇｍａ）を３０分間室温でプレコートし、マウス胎児線維芽細胞をフィーダー細胞として３．１５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種した。２４時間後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分散したヒトｉＰＳ細胞を、３．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２、６．２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２、１．２４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２、又は２．４８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度で播種して２週間分化誘導し、各々の細胞培養基材上の細胞からＲＮＡを抽出した。フィーダー細胞の維持には１０％のウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）と１％のペニシリン／ストレプトマイシン及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）を用い、ｉＰＳ細胞の分化誘導には２０％の血清代替物ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１％のピルビン酸、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１％のβメルカプトエタノールとＹ２７６３２（ＷＡＫＯ）を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。４日目以降はＹ２７６３２非添加の培地を使用した。

ｉＰＳ細胞播種後１４日目で各々の細胞培養基材上の細胞からＲＮＡを抽出した。内胚葉系遺伝子ＡＬＢＵＭＩＮ、ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＳＯＸ１７と外胚葉系遺伝子β−ＴＵＢＬＩＮ、中胚葉系遺伝子ＦＬＫ−１、未分化マーカーＯＣＴ３／４を認識、増幅するプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った。結果を図５に示す。図中、縦軸は、３．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の初期細胞密度における各マーカー遺伝子の発現量を基準とした場合の発現量の相対値を示す。

ＳＯＸ１７を除く内胚葉系遺伝子の発現は、初期細胞密度が高くなるほど顕著に亢進した。外胚葉系遺伝子及び中胚葉系遺伝子の発現も、初期細胞密度が高くなるほど亢進したが、初期細胞密度の増加量に対する発現量の増加量の比率は、内胚葉系遺伝子の場合と比較して低かった。

＜実施例９＞
実施例８において、初期細胞密度を２．４８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした他は、実施例８と同様の手順で、ヒトｉＰＳ細胞を２週間分化誘導した。その後、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定処理し、内胚葉マーカーであるＡＦＰに対する抗体及び外胚葉マーカーであるＴｕｊ１に対する抗体を用いて、免疫染色を行った。共焦点蛍光顕微鏡を用いて、免疫染色された細胞塊の厚さを測定するとともに、該細胞塊の共焦点画像を取得した。結果を図６に示す。図中、Ａは、ＤＡＰＩによる核染色の画像を、Ｂは、抗ＡＦＰ抗体による免疫染色の画像を、Ｃは、抗Ｔｕｊ１抗体による免疫染色の画像を、Ｄは、ＤＡＰＩによる核染色、抗ＡＦＰ抗体による免疫染色及び抗Ｔｕｊ１抗体による免疫染色の重ね合わせ画像を、Ｅは、細胞塊の表面から１０８μｍの断面におけるＤＡＰＩによる核染色、抗ＡＦＰ抗体による免疫染色及び抗Ｔｕｊ１抗体による免疫染色の重ね合わせ画像を、それぞれ示す。また、免疫染色された細胞塊の各部分の厚さと、当該部分におけるマーカー発現量の相対値との関係を表１に示す。

表１に示すように、厚さ２１μｍ以上の細胞塊では、内胚葉マーカーであるＡＦＰの発現量が高くなった。これに対し、厚さ１４μｍ以下の細胞塊では、外胚葉マーカーであるＴｕｊ１の発現量が高くなった。また、神経細胞様の形態が観察された。

＜実施例１０＞細胞培養基材の作製
実施例１において、円形の開口部の直径が、直径０．３ｍｍの円形の開口部が形成され、開口部間のスペース、すなわち開口部間の最短距離が、０．３５ｍｍ、０．７０ｍｍ又は１．４０ｍｍのパターンを有する３種類のフォトマスクを用いた他は、実施例１と同様の手順で、細胞培養基材を作製した。

＜実施例１１＞
実施例１０で作製した細胞培養基材に、実施例７と同様の手順でヒトｉＰＳ細胞を播種し、細胞接着領域の距離と遺伝子発現傾向の相関を検証した。ｉＰＳ細胞播種後１４日目で各々の細胞培養基材上の細胞からＲＮＡを抽出した。内胚葉系遺伝子ＡＬＢＵＭＩＮ、ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＳＯＸ１７と外胚葉系遺伝子β−ＴＵＢＬＩＮ、中胚葉系遺伝子ＦＬＫ−１、未分化マーカーＯＣＴ３／４を認識、増幅するプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った。結果を図７に示す。図中、縦軸は、開口部間の最短距離が０．３５ｍｍの細胞培養基材における各マーカー遺伝子の発現量を基準とした場合の発現量の相対値を示す。

細胞接着領域の距離が大きくなるにしたがって、ＳＯＸ１７を除く内胚葉系遺伝子の発現が亢進した。これに対し、外胚葉系遺伝子及び中胚葉系遺伝子の発現は、細胞接着領域の距離が異なる細胞培養基材を用いた場合でもほぼ同程度であった。

１…本発明の細胞培養基材
１１…基材
１２…細胞接着領域
１３…細胞非接着領域
１４…下地層

Claims (8)

1. 人工多能性幹細胞から内胚葉系細胞を分化誘導する方法であって、
   基材と、基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域及び各細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材を準備する工程、
   人工多能性幹細胞を、細胞培養基材に対し播種する工程、及び
   播種した人工多能性幹細胞を培地中で培養する工程、
   を含み、
   細胞培養基材の細胞非接着領域が、ポリエチレングリコールが基材上に固定化されて形成されたものであり、細胞接着領域が基材上に固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部が酸化及び／又は分解されて形成されたものであり、各細胞接着領域の面積が０．７８５ｍｍ^２未満である、前記分化誘導方法。
2. 細胞接着領域が、直径０．２ｍｍ〜０．８ｍｍの円形の形状で形成されている、請求項１記載の分化誘導方法。
3. 人工多能性幹細胞を播種後１４日以上培養する、請求項１又は２記載の分化誘導方法。
4. 細胞接着領域が、基材上に固定化されたポリエチレングリコールが紫外線照射により酸化されて形成されたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の分化誘導方法。
5. 人工多能性幹細胞を３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の初期細胞密度で播種する、請求項１〜４のいずれか１項記載の分化誘導方法。
6. 基材と、基材上に形成された複数の隔離された細胞接着領域及び各細胞接着領域を囲む細胞非接着領域とを備える細胞培養基材であって、
   細胞培養基材の細胞非接着領域が、ポリエチレングリコールが基材上に固定化されて形成されたものであり、細胞接着領域が基材上に固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部が酸化及び／又は分解されて形成されたものであり、各細胞接着領域の面積が０．７８５ｍｍ^２未満であり、細胞接着領域が、直径０．４ｍｍ〜０．７ｍｍの円形の形状で形成されている、前記細胞培養基材。
7. 前記細胞接着領域が、０．７０ｍｍ以上互いに離れて配置されている、請求項６記載の細胞培養基材。
8. 基材上にポリエチレングリコールを固定化する工程、及び
   固定化されたポリエチレングリコールの少なくとも一部を酸化及び／又は分解して、細胞接着領域を形成する工程、
   を含む、請求項６又は７記載の細胞培養基材の製造方法。

Images