JP5862008B2 - 細胞培養基材 - Google Patents
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Description
前記導電性領域と前記細胞接着阻害領域が重なる重畳領域が、前記細胞接着領域と隣接し、前記重畳領域は、電圧印加によって細胞接着性に改変可能であることを特徴とする。
図1は本発明の一実施形態に係る細胞培養基材を説明する図である。図1(A)は細胞培養基材の上面図であり、図1(B)は図1(A)におけるX−X断面図である。細胞培養基材100は、基材1に細胞接着領域A、細胞接着阻害領域B、および導電性領域Cを含む細胞培養領域Dを有している。細胞接着領域Aの周囲に隣接して細胞接着阻害領域Bが配置され、細胞接着領域Aと細胞接着阻害領域Bに重なるように導電性領域Cが配置されている。図面を見やすくするため、細胞培養基材の上面図では導電性領域Cを点線で囲った領域として図示している。細胞培養領域Dにおいて細胞培養が行われる。
図5を参照して本発明に係る細胞培養基材の製造方法について説明する。図5は、本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の製造工程を説明する図である。
基材1上に導電性材料を成膜して導電層4を形成し、導電性領域を画定する。導電性材料の成膜方法としては、例えば、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法、フレキソ印刷法、マイクロコンタクトプリント法などの各種印刷法による方法、インクジェット法による方法、CVD法、スパッタ法、蒸着法等を使用できる。成膜する導電性材料に応じて上記方法から適宜選択すればよい。電気的に独立した複数の導電性領域を形成する場合、導電層4をエッチングなどを施せばよい。
導電層4を形成した基材1上に細胞接着阻害層3を形成し、細胞接着阻害領域を画定する。細胞接着阻害3として細胞接着阻害性の親水性膜を利用する場合には、基材へ親水性有機化合物を直接吸着させる方法、基材へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、基材へ親水性有機化合物をコーティングした後に架橋処理を施す方法を挙げることができる。
細胞接着阻害層3の所定の部位を紫外線で分解して細胞接着性とすることで、細胞接着層2を形成し、細胞接着領域を画定する。紫外線照射処理の場合は、波長185nmや254nmの紫外線を出す水銀ランプや波長172nmの紫外線を出すエキシマランプなどのVUV領域からUV−C領域の紫外線を出すランプを光源として用いることが好ましい。フォトマスクPを介してVUV光を細胞接着阻害層3に照射することにより、細胞接着層2とすることができる。
以上の工程により、基材1上に導電層4が配置され、導電層4上に細胞接着層2および細胞接着阻害層4を備える細胞培養基材100が製造される。
図6を参照して本発明に係る細胞培養基材を用いた細胞培養方法について説明する。図6は、本発明の一実施形態に係る細胞培養基材を用いた細胞培養方法を説明する図である。以下に示す細胞培養方法は、細胞接着領域と、細胞接着領域と隣接する細胞接着阻害領域と、細胞接着阻害領域の一部と重なる導電性領域と、を含む細胞培養領域を有する基材を準備する工程と、細胞接着領域に細胞を播種し、細胞を分化させる工程と、導電性領域に電圧を印加し、細胞接着阻害領域を細胞接着性に改変する工程と、細胞接着性に改変した細胞接着阻害領域で分化した細胞を培養する工程と、を含む。
本発明の一実施形態に係る細胞培養基板を準備し、分化能を有する細胞10を細胞接着領域に播種する。細胞としては、例えば、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘍細胞(EC細胞)、胚性生殖幹細胞(EG細胞)、核移植ES細胞(ntES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神経幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、がん幹細胞などの幹細胞を挙げることができる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。なお、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。
分化能を有する細胞10を細胞接着領域に播種した後、細胞10が分化するまで培養を行う。細胞を培養する時間は、培養時の細胞操作の有無などに左右されるが、通常6時間〜30日、好ましくは12時間〜72時間である。培養する温度は、通常37℃である。CO2細胞培養装置などを利用して、5%程度のCO2 濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。培養した後、細胞培養用基板を洗浄することにより、接着していない細胞が洗い流され、細胞接着領域にのみ分化した細胞20を接着させることができる。上記のように細胞接着領域は、「細胞の分化に適した形状および/または大きさ」を有する。したがって細胞10は細胞接着領域の足場から受けるメカニカルストレスなどの影響により、特定の細胞への分化が誘導されて分化した細胞20となる。細胞としてヒト間葉系幹細胞を用いた場合、細胞接着領域が100μm×100μmの正方形である場合には骨芽細胞(分化した細胞20)へ、一方細胞接着領域が10μm×10μmの正方向である場合には脂肪細胞(分化した細胞20)への分化が誘導される。
導電性領域Cに電圧を印加して、導電性領域Cと重なる細胞接着阻害領域Bを細胞接着領域A´に改変させる。導電性領域Cへの電圧の印加は、細胞培養基材100内に対極を設けて電圧を印加する方法や、導電性領域Cに対峙するようにPt(白金)等の対極を設けて電圧を印加する方法により行うことができる。印加する電圧は、当業者であれば適宜決定することができるが、通常1V〜10V、好ましくは2V〜5Vであり、印加する時間は、細胞に悪影響を与えない程度の時間に設定すればよく、通常1秒〜60分間、好ましくは10秒〜10分間である。
細胞接着阻害領域を細胞接着性に変化させた後、分化した細胞20の培養を行う。細胞を培養する時間は、培養時の細胞操作の有無などに左右されるが、通常6時間〜96時間、好ましくは12時間〜72時間である。培養する温度は、通常37℃である。CO2細胞培養装置などを利用して、5%程度のCO2 濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。導電性領域への電圧印加により細胞接着領域が拡張されるため、当初の細胞接着領域に存在していた、分化した細胞20が、拡張された細胞接着領域において細胞が生存するのに適した条件下で分裂を繰り返すため、分化した細胞20が増殖する。
図7を参照して細胞培養基材の別の態様である、細胞培養基材200について説明する。図7は本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の別の態様を説明する図である。なお、図面の見やすさのために細胞接着阻害領域の図示は省略している。そして細胞培養領域Dを一点鎖線で囲んで図示している。
図9を参照して細胞培養基材の別の態様である、細胞培養基材400について説明する。図9は本発明の一実施形態に係る細胞培養基材の別の態様を説明する図である。説明のため、細胞培養基材400のうち、基材と導電性領域、細胞接着領域と細胞接着阻害領域に各々分解して図示している。図9(A)は導電性領域上に形成した細胞接着領域および細胞接着阻害領域の配置するための上面図であり、図9(B)は基材上に形成した導電性領域の配置を説明するための上面図である。
図10を参照して細胞培養基材の変形例である、細胞培養基材500,600について説明する。図10(A)は導電層が露出した領域が細胞接着領域となる例を示す図であり、図10(B)は導電層上に細胞接着層が存在しない例を示す図である。
Claims (7)
- 細胞接着性を有し、10μm2〜10000μm2の大きさである細胞接着領域と、
細胞接着阻害性を有し、前記細胞接着領域と隣接する細胞接着阻害領域と、
前記細胞接着阻害領域の少なくとも一部と重なる導電性領域と、
を含む細胞培養領域を基材上に備え、
前記導電性領域と前記細胞接着阻害領域が重なる重畳領域が、前記細胞接着領域と隣接し、
前記重畳領域は、電圧印加によって細胞接着性に改変可能であることを特徴とする細胞培養基材。 - 細胞接着性を有する細胞接着領域と、
細胞接着阻害性を有し、前記細胞接着領域と隣接する細胞接着阻害領域と、
前記細胞接着阻害領域の少なくとも一部と重なる導電性領域と、
を含む細胞培養領域を基材上に備え、
前記導電性領域と前記細胞接着阻害領域が重なる重畳領域が、前記細胞接着領域と隣接し、
前記重畳領域は、電圧印加によって細胞接着性に改変可能であって、
前記導電性領域は、第1導電性領域および第2導電性領域を含み、
前記第1導電性領域は、前記細胞接着領域および前記細胞接着阻害領域の一部と重なり、
前記第2導電性領域は、前記細胞接着領域と隣接し、かつ、前記第1導電性領域と絶縁性領域によって離隔されていることを特徴とする細胞培養基材。 - 前記重畳領域は、前記細胞接着領域よりも面積が大きいことを特徴とする請求項1または2記載の細胞培養基材。
- 前記細胞培養領域は、前記基材上に複数配列されていることを特徴とする請求項1乃至3のいずれか1項記載の細胞培養基材。
- 前記導電性領域が、基材上にITO膜が存在する領域であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項記載の細胞培養基材。
- 請求項1乃至5のいずれか1項記載の細胞培養基材の製造方法であって、
前記細胞接着阻害領域が、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む親水性膜で形成されており、
炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および/または分解処理を施して前記細胞接着領域に細胞接着性を付与することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。 - 炭素酸素結合を有する有機化合物がアルキレングリコールオリゴマーであることを特徴とする請求項6記載の細胞培養基材の製造方法。
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