JP5648453B2 - 補助電極付き細胞試験用基板 - Google Patents
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Description
(1)基材と、
前記基材上に配置された電極と
を備える細胞試験用基板であって、
前記電極は、主電極と、前記主電極に導電可能に接続された補助電極とを含み、
前記主電極上には、細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域とが配置されている
ことを特徴とする前記細胞試験用基板。
(2)補助電極の抵抗が主電極の抵抗よりも小さい、(1)に記載の細胞試験用基板。
(4)基材上に配置された対向電極を更に備え、前記対向電極が前記電極と電気的に絶縁されて配置されている、(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞試験用基板。
(5)補助電極と対向電極とが同一の物質である、(4)に記載の細胞試験用基板。
前記細胞試験用基板上の1又は複数の部分領域を底面とし上方に開放された1又は複数の凹部の側壁を形成する側壁部材と
を備える細胞試験用容器であって、
前記凹部の底面を構成する部分領域は、主電極上に配置された細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域とを含む前記細胞試験用容器。
(7)細胞試験用基板と側壁部材とが接触する位置に補助電極が配置されており、前記補助電極が接着材料を含み、前記細胞試験用基板と前記側壁部材とが前記補助電極を介して接合されている、(6)に記載の細胞試験用容器。
前記細胞試験用基板上の1又は複数の部分領域を底面とし上方に開放された1又は複数の凹部の側壁を形成する側壁部材と
を備える細胞試験用容器であって、
前記凹部の底面を構成する部分領域は、主電極上に配置された細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域と、対向電極と含む前記細胞試験用容器。
(9)補助電極が、凹部の底面を構成する部分領域の周縁の外に配置されている、(6)又は(8)に記載の細胞試験用容器。
(10)側壁部材が、厚さ方向に延びる複数の貫通孔が形成された板状体である、(6)〜(9)のいずれかに記載の細胞試験用容器。
図1は、本発明者らが既に出願している細胞試験用基板を使用した細胞試験用容器を示す。主電極11上の細胞接着性領域16と細胞接着阻害性領域17とを含むように側壁部材14が配置され、凹部15が形成される。対向電極13は細胞試験用容器10とは別個に設けられている。
本発明の細胞試験用基板に用いられる基材としては、基材上に電極を配置可能なものであれば特に制限されない。例えば、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス、セラミック、シリコン、エラストマー、プラスチック(例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂)で代表される無機材料や有機材料などを挙げることができる。導電性の基材を電極として使用してもよい。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜などの平坦な形状、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路などの立体的な形状、ならびに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常0.1〜1000μm、好ましくは1〜500μm、より好ましくは10〜200μmである。
主電極としては導電性の物質であれば特に制限されない。例えば、金属(金、銀、銅など)、金属酸化物(酸化インジウム錫(ITO)、酸化インジウム亜鉛(IZO)、酸化亜鉛(ZnO)など)、導電性ナノファイバー(カーボンナノチューブなど)、導電性の有機材料(ポリエチレンジオキシチオフェン(PEDOT)など)が挙げられる。細胞を観察する観点から、電圧印加後も透明である透明電極を使用することが好ましい。透明電極としては、例えば、ITO,IZO、ZnOなどの金属酸化物、PEDOTなどの導電性高分子、Agナノワイヤーやカーボンナノチューブをバインダーに分散させた材料、Agなどの金属材料を格子状に形成して開口部を持たせた膜などが挙げられる。主電極は電極材料を基材上に成膜して、その後パターニングすることにより形成することが好ましい。
補助電極としては導電性の物質であれば特に制限されない。例えば、主電極として使用可能な物質を使用することができる。補助電極の抵抗は主電極の抵抗よりも小さいことが好ましい。また、補助電極と主電極との抵抗の差が大きいほど好ましい。補助電極の抵抗がより小さく、また、抵抗の差が大きいほど主電極を単独で使用した場合に生じる電圧降下を改善することができる。具体的には、金、銀、銅などの導電率の高い金属を補助電極として使用することが好ましい。また、接着材料を含む導電性ペーストを使用してもよい。
対向電極としては導電性の物質であれば特に制限されない。例えば、主電極及び補助電極として使用可能な物質を使用することができる。好ましくは、補助電極と同一の物質が使用される。この場合、基材上に補助電極と対向電極とを一度に形成することができるため、細胞試験用基板の作成プロセスを簡素化することができる。
基材上における主電極、補助電極及び対向電極の形成は、公知のパターニング技術を利用できる。公知のパターニング技術としては、例えば、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法、フレキソ印刷法およびコンタクトプリンティング法などの各種印刷法による方法、各種リソグラフィー法を用いる方法、ならびにインクジェット法による方法、他に微細な溝を彫刻などする立体整形の手法などが挙げられる。具体的には、絶縁性材料からなる基材、例えばガラス基材に、導電性材料、例えば金属膜または金属酸化物膜を成膜し、これをフォトリソグラフィー技術などの公知の技術を用いてパターニングすることにより、主電極、補助電極及び対向電極を形成することができる。
本発明において細胞接着性とは、細胞が接着すること、または細胞が接着しやすいことを意味する。細胞接着阻害性とは、細胞が接着しにくいこと、または細胞が接着しないことを意味する。従って、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化された細胞試験用基板上に細胞を播くと、細胞接着性領域には細胞が接着するが、細胞接着阻害性領域には細胞が接着しないため、基板表面には細胞がパターン状に配列されることになる。
細胞接着性領域は、例えば、炭素酸素結合を有する有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜に酸化処理および/または分解処理を施して細胞接着性とした領域により形成される。
細胞接着性領域(結合層が存在する場合には結合層も含む)の炭素量は、細胞接着阻害性領域(結合層が存在する場合には結合層も含む)の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着性領域の炭素量が、細胞接着阻害性領域の炭素量に対して20〜99%であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ(結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計)が10μm以下の場合に特に好適である。「炭素量(atomic concentration、%)」は下記に定義する通りである。
本発明の親水性薄膜(結合層が存在する場合には結合層も含む)の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、X線光電子分光測定、各種質量分析法などを用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはX線光電子分光測定(XPS/ESCA)である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度(atomic concentration、%)で算出される。以下、本発明におけるX線光電子分光分析方法を詳細に説明する。
本発明の細胞試験用基板では、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化されて配置されていることが好ましい。パターンの形状は、二次元のパターンであれば特に制限されず、細胞の種類、形成させる組織などによって選択することができる。例えば、ライン状、ツリー状(樹状)、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形および四角形などの図形の内部がすべて細胞接着性領域または細胞接着阻害性領域となっているパターンなどを形成することができる。
細胞試験用基板に播種する細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよいし接着性細胞でもよいが、本発明は、接着性を有する細胞に対して好適に使用される。また遊走する性質を有する細胞に対して好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝がん細胞、グリオーマ細胞、結腸癌細胞、腎がん細胞、膵がん細胞、前立腺がん細胞、大腸がん細胞、乳癌細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞などのがん細胞、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。
上記のように、本発明の細胞試験用基板上に細胞を播種して培養し、細胞接着性領域に細胞を接着させた後、電極に電圧を印加して、主電極上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させ、その後の細胞の移動を観察することにより、細胞遊走を試験することができる。
(i)本発明の細胞試験用基板に細胞を播種し、細胞接着性領域に細胞を接着させる工程、
(ii)電極に電圧を印加することによって主電極上の細胞接着阻害性領域を細胞接着性領域に改変させる工程、
(iii)細胞接着性領域に接着していた細胞の、工程(ii)で細胞接着性領域に改変した領域への移動を観察する工程
を含む。
1.細胞試験用容器の作製
長さ×幅が125mm×85mmの無アルカリガラス基材上に補助電極(Ag)を膜厚100nmでスパッタ成膜し、ウェル部を避けるようにグリッド状にフォトリソグラフィーによってパターニングした。次いで、透明電極(ITO)を膜厚150nmで全面にスパッタ成膜した。
トルエン39.0g及びエポキシシランTSL8350(GE東芝シリコーン製)750μlの混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。UV洗浄したITO基材を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、19時間室温で振盪した。その後、下地処理された基材をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。
ポリエチレングリコール15gを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシシラン処理された基材を上記のポリエチレングリコールに浸漬し、80℃で60分間反応させた。反応後、基材をよく水洗いし、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成された基板が得られた。
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。あらかじめ露光機の照度を350nmの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は25mW/cm2であった。親水性薄膜が形成されたITO基板と上記触媒付き石英板を、親水性薄膜とフォトマスクの光触媒層が対向するように設置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。120秒間露光し、酸化処理を行った。
細胞試験用容器をエチレンオキサイドガスで滅菌した。各ウェルの中に5x104個のウシ血管内皮細胞を播種した。10%血清を含むDMEM培地を用いて、37℃、5%CO2濃度のインキュベータ内で24時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、細胞は酸化処理された部分にのみコンフルエントの状態で接着していた。
以下、96ウェルプレート(縦8×横12ウェル)の各ウェルの位置を(縦の位置,横の位置)で示す。縦方向には、上からA,B,C,D,E,F,G,Hと文字で表し、横方向には、左から順番に1から12番まで番号をつけて表す。例えば、縦方向の上から2番目で横方向の左から11番目のウェルの位置を(B,11)と表す。
補助電極は設けずに、実施例と同様に細胞培養用容器を作製した。ウェルA及びウェルBに対向電極を差し入れた状態で2.4Vを2分間かけた。ウェルAでは細胞遊走が観測されたが、ウェルBでは細胞遊走が観測されなかった。これは、ウェルA及びウェルBで電圧のかかり方が不均一であったため、より電圧が高いウェルB内で細胞にダメージを与えてしまい、細胞が遊走しなかったと考えられる。
30,60 細胞試験用基板
11,21,31,41,51,61,71,81 主電極(ITO電極)
22,32,42,52,62,72,82 補助電極
13,43,73,83,93 対向電極
14,24,34,44,54,74 側壁部材
15,25,45,85 凹部
16,26,46,76,95,96 細胞接着性領域
17,27,47,77,97 細胞接着阻害性領域(親水性膜)
38,48,58,78,88 基材(ガラス板)
39 電圧印加端子
49,99 細胞
29,59 細胞試験用基板
Claims (10)
- 基材と、
前記基材上に配置された電極と
を備える細胞試験用基板であって、
前記電極は、主電極と、前記主電極に導電可能に接続された補助電極とを含み、
前記主電極上には、細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域とが配置されている
ことを特徴とする前記細胞試験用基板。 - 補助電極の抵抗が主電極の抵抗よりも小さい、請求項1に記載の細胞試験用基板。
- 主電極が透明電極である、請求項1又は2に記載の細胞試験用基板。
- 基材上に配置された対向電極を更に備え、前記対向電極が前記電極と電気的に絶縁されて配置されている、請求項1〜3のいずれかに記載の細胞試験用基板。
- 補助電極と対向電極とが同一の物質である、請求項4に記載の細胞試験用基板。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の細胞試験用基板と、
前記細胞試験用基板上の1又は複数の部分領域を底面とし上方に開放された1又は複数の凹部の側壁を形成する側壁部材と
を備える細胞試験用容器であって、
前記凹部の底面を構成する部分領域は、主電極上に配置された細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域とを含む前記細胞試験用容器。 - 細胞試験用基板と側壁部材とが接触する位置に補助電極が配置されており、前記補助電極が接着材料を含み、前記細胞試験用基板と前記側壁部材とが前記補助電極を介して接合されている、請求項6に記載の細胞試験用容器。
- 請求項4又は5に記載の細胞試験用基板と、
前記細胞試験用基板上の1又は複数の部分領域を底面とし上方に開放された1又は複数の凹部の側壁を形成する側壁部材と
を備える細胞試験用容器であって、
前記凹部の底面を構成する部分領域は、主電極上に配置された細胞接着性領域と、前記細胞接着性領域に隣接する細胞接着阻害性領域と、対向電極と含む前記細胞試験用容器。 - 補助電極が、凹部の底面を構成する部分領域の周縁の外に配置されている、請求項6又は8に記載の細胞試験用容器。
- 側壁部材が、厚さ方向に延びる複数の貫通孔が形成された板状体である、請求項6〜9のいずれかに記載の細胞試験用容器。
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