JP2005328727A - 細胞培養基板および細胞培養器 - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞定着性が良好で、かつ製造コストのダウンが可能な簡略化した構造の細胞培養基板および細胞培養器を提供する。
【解決手段】 本発明の細胞培養基板１は、基板２上に接着型細胞を接着させて培養する導電性金属酸化物３を備え、導電性金属酸化物３の表面の粗さＲａが、その表面の細胞定着性を向上させる程度のものであり、本発明の細胞培養器１０は、細胞定着性を向上させた本発明の細胞培養基板１と培養ウェル４とを備える。
【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞を培養するための細胞培養基板および細胞培養器に関し、特に、細胞定着性が良好な簡略化した構造の細胞培養基板および細胞培養器に関する。

近年、動植物細胞を培養することで、培養細胞から得られる産生物質の利用や、培養細胞自体を創薬または毒性試験などにおける試験材料として用いることが盛んに行われている。その中で細胞が出す外部環境への応答を抽出するため、もしくは細胞の持つ特性を発現させるために、電気的インターフェイスを備えた細胞培養器が用いられている。

細胞は大きく浮遊型と接着型に分類され、ほとんどが接着型細胞である。接着型細胞はガラスやプラスチック、コラーゲンなどの基質に接着して初めて増殖することが可能になる。

一方、電気的インターフェイスを備えた細胞培養器においては、光学的観察を可能にするために細胞培養基板が透明であることが望まれ、酸化インジウム錫（ＩＴＯ）などの透明な導電性金属酸化物が好適に用いられているが、その細胞接着性は必ずしも良好であるとは言えず、安定に使用できなかった。

そこで、細胞培養器への細胞の接着性を向上させるために、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を電極上にコートしたものや導電性高分子ポリマーなどを電極上にコートした細胞培養器が用いられてきている。

導電性高分子ポリマーを電極上にコートしたものとして、例えば、特許文献１に記載された細胞培養器が知られている。

図３は、特許文献１記載の細胞培養器の断面側面図を示したものである。細胞培養器３０は、ＩＴＯ等の導電性膜３３を有するガラス等の基板３２上に導電性高分子であるポリマー膜３５が形成された細胞培養基板３１と、基板３１上に接着された培養ウェル３５とからなっている。

この細胞培養器３０によれば、細胞への接着機能だけではなく、培養細胞の機能を保持できる旨が記載されている。
特開平６−３３５３８１号公報

しかし、従来の細胞接着性タンパク質を電極上にコートしたものや、導電性高分子ポリマーを電極上にコートしたものによれば、製造工程が煩雑化し、製造コストもアップする。また、特に、細胞接着性タンパク質をコートした場合に、細胞と電極の間に無用のインピーダンス成分を挿入することになる。

従って、本発明の目的は、細胞定着性が良好で、かつ製造コストのダウンが可能な簡略化した構造の細胞培養基板および細胞培養器を提供することにある。

本発明者らは、鋭意研究の末、導電性金属酸化物に細胞を直接接着させて培養するに際し、その細胞定着性は、当該導電性金属酸化物の表面の粗さＲａに依存することを見出し、当該表面の粗さＲａを所定の範囲にすることにより当該表面の細胞定着性を向上させ得ることを見出した。

本発明は、上記目的を達成するため、基板上に接着型細胞を接着させて培養する導電性金属酸化物を備えた細胞培養基板において、前記導電性金属酸化物の表面の粗さＲａが、前記表面の細胞定着性を向上させる程度のものであることを特徴とする細胞培養基板、およびこれを備えた細胞培養器を提供する。

ここで、「細胞定着性」とは、細胞の接着性と接着状態の維持期間を表し、「細胞定着性を向上させる」とは、細胞の接着性が良好で、かつ接着状態の維持期間を長期化することをいう。「接着状態の維持期間を長期化する」とは、所望の培養期間を得ることができる程度であればよく、培養する細胞によっても異なるが、例えば、ＰＣ１２細胞のような細胞であれば、３日以上培養が可能であり、より好ましくは５日以上培養が可能であり、さらに好ましくは１０日以上培養が可能であることをいう。

本発明の細胞培養基板および細胞培養器によれば、細胞定着性が良好で、かつ製造コストのダウンが可能な簡略化した構造の細胞培養基板および細胞培養器を提供できる。

また、本発明の細胞培養基板および細胞培養器によれば、細胞と電極の間に無用のインピーダンス成分を挿入しないため、培養の制御が容易化し、かつコストダウンが可能な細胞培養基板および細胞培養器を提供することができる。

さらに、本発明の細胞培養基板および細胞培養器によれば、構成が単純であるため、堅牢な材料を用いることにより、洗浄および殺菌等による劣化が少なく再利用が容易化し、感染性廃棄物等の減量化が可能な細胞培養基板および細胞培養器を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態を図を参照して説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（細胞培養器の全体の構成）
図１は、本発明の実施の形態に係る細胞培養器の断面側面図を示す。この細胞培養器１０は、基板２および基板２の表面に形成された導電性金属酸化物３からなる細胞培養基板１と、細胞培養基板１上に接着された培養ウェル４とを有して概略構成されている。

（細胞培養器の各部の構成）
細胞培養基板１は、例えば、透明ガラス基板等からなる基板２と、基板２上に形成されたＩＴＯ等からなる導電性金属酸化物３とから構成されており、光学的観察を可能にするために全体として透明性を有していることが望ましい。ここでいう透明性とは、無色透明であることが望ましいが、有色透明であってもよい。

基板２は、種々の材料からなる基板を使用でき、例えば、ガラス、シリコン等が挙げられる。光学的観察を可能にするために透明基板であることが望ましく、ガラスが好適に用いられる。

導電性金属酸化物３は、種々の導電性金属酸化物を用いることができるが、透明性を有する透明導電性金属酸化物が好適に用いられる。透明導電性金属酸化物としては、例えば、ＩＴＯ、ＳｎＯ_２、ＺｎＯ等が挙げられるが、ＩＴＯが最も好適に用いられる。

各種の導電性金属酸化物において好適な表面粗さＲａは、適宜実験等により判断することができる。例えば導電性金属酸化物がＩＴＯである場合は、その好適な表面粗さＲａは、３ｎｍ以上であり、上限は特に限定されないが、２０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、４ｎｍ以上１８ｎｍ以下であり、さらに好ましくは、５ｎｍ以上１５ｎｍ以下であり、最も好ましくは、６ｎｍ以上１２ｎｍ以下である。ここで、表面粗さＲａは、ＪＩＳ Ｂ ０６０１：１９９４に記述された方法で算出している。導電性金属酸化物（この場合はＩＴＯ）３の表面粗さを上記範囲とすることにより、細胞定着性が良好となり、長期の細胞培養が可能な細胞培養器の提供が可能となる。

培養ウェル４は、ガラスやシリコーン樹脂等を材料に用いて形成され、形状は特に限定されないが、円筒形状等を好適に用いることができる。

本発明の細胞培養器にて好適に培養される細胞は、接着性細胞であれば接着性良く培養可能であり、特に、神経系細胞、中でもＰＣ１２細胞、グリア細胞などが挙げられる。

（細胞培養器の製造方法）
本発明の細胞培養器１０の製造方法を以下に説明する。
基板２上に、電子ビーム蒸着装置を用いて、表面粗さＲａが所定の範囲となるように導電性金属酸化物３を成膜して細胞培養基板１を作製し、この上に培養ウェル４を形成して、細胞培養器１０を作製する。導電性金属酸化物３の成膜方法は、表面粗さＲａを上記の所定の範囲に制御できる方法であれば特に制限無く用いることができるが、電子ビーム蒸着法が望ましい。

次に、細胞の定着性をより向上させるために、作製した細胞培養器１０に親水化処理を施す。親水化処理の方法としては、例えば、所定濃度の水酸化ナトリウム水溶液に所定時間浸漬する方法や、アセトンなどによる表面の脱脂洗浄を挙げることができる。

＜実施例１〜３＞
図２は、本発明の実施例に係る細胞培養器の斜視図を示す。
細胞培養器２０を以下の通り作製した。ガラス基板２２上に、電子ビーム蒸着装置を用いて、表面粗さＲａが約６，９，１０ｎｍであるＩＴＯ膜２３を成膜して細胞培養基板２１を作製し、さらに、この上に円筒形ガラス管を接着剤にて取り付け、培養ウェル２４を形成した。表面粗さＲａは、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）（ＫＥＹＥＮＣＥ社製、ＶＺ−７７００）を使用して計測した。その際、プローブとして、Ｓｉ_３Ｎ_４製プローブ（Ｖｅｅｃｏ社製、ＮＰ−Ｓ２０）を使用した。

作製した細胞培養器２０を親水化処理のため１規定の水酸化ナトリウム水溶液に２４時間浸漬した。その後、純水で洗浄し、空気中で、１２０℃、２気圧の環境で、オートクレーブにより２０分間殺菌処理した。

（細胞培養器の評価）
培養細胞としてはラット由来の株細胞であるＰＣ１２細胞を用いた。ＰＣ１２細胞はＮＧＦ(神経成長因子)による刺激で神経様分化を起こす細胞であり、神経系の分化の研究によく用いられている。また、分化の様子など、細胞の形状からその活性状態を推測しやすく、さらに危険性も低く入手しやすいため選択した。

まず、非働化した１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において、約５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＰＣ１２細胞の細胞懸濁液２５を図２に示されるように細胞培養器２０に播種した後、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で２日間培養を行った。その後１日間は、ピペットで上澄みを吸い取り、無血清ＤＭＥＭ培地を加え、洗浄するという作業を２回以上繰り返すことにより、無血清のＤＭＥＭ培地に交換し、培養した後、さらにＮＧＦを添加して培養を続けた。

無血清のＤＭＥＭ培地に交換し、ＮＧＦを添加した後、約１０日間培養を続けたが、ＩＴＯ膜２３の表面粗さＲａが６，９，１０ｎｍである細胞培養器２０のいずれにおいても、神経様分化したＰＣ１２細胞は、栄養欠乏で細胞死することなく培養可能であった。

無血清ＤＭＥＭ培地への交換後に、実施例１〜３のそれぞれについて細胞定着性の官能評価を行った結果を表１に示す。

＜比較例１〜２＞
ガラス基板上にスパッタ法により表面粗さＲａが約１，２ｎｍであるＩＴＯ膜を成膜した以外は実施例１〜３と同様にして細胞培養器を作製した。表面粗さＲａも実施例１〜３と同様にして測定した。

作製した細胞培養器にて、実施例１〜３と同じ条件で評価実験を行ったところ、ＩＴＯ膜の表面粗さＲａが１，２ｎｍである細胞培養器のいずれにおいても、無血清のＤＭＥＭ培地に交換する際、接着性が悪く、また定着が不安定で多くの細胞は細胞培養器から培地と共に除去された。

無血清ＤＭＥＭ培地への交換後に、比較例１〜２のそれぞれについて細胞定着性の官能評価を行った結果を表１に示す。

［細胞定着性の評価基準］
５ 非常に良好
４ 良好
３ やや不安定
２ かなり不安定
１ 全く定着性無し

本発明の実施の形態に係る細胞培養器の断面側面図である。 本発明の実施例に係る細胞培養器の斜視図である。 従来の細胞培養器の断面側面図である。

符号の説明

１ 細胞培養基板
２ 基板
３ 導電性金属酸化物
４ 培養ウェル
１０ 細胞培養器
２１ 細胞培養基板
２２ ガラス基板
２３ ＩＴＯ膜
２４ ガラス製培養ウェル
２５ 細胞懸濁液
２０ 細胞培養器
３１ 細胞培養基板
３２ 基板
３３ 導電性金属酸化物
３４ ポリマー膜
３５ 培養ウェル
３０ 細胞培養器

Claims (6)

1. 基板上に接着型細胞を接着させて培養する導電性金属酸化物を備えた細胞培養基板において、
   前記導電性金属酸化物の表面の粗さＲａが、前記表面の細胞定着性を向上させる程度のものであることを特徴とする細胞培養基板。
2. 前記導電性金属酸化物は、透明導電性金属酸化物であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養基板。
3. 前記透明導電性金属酸化物は、酸化インジウム錫であることを特徴とする請求項２記載の細胞培養基板。
4. 前記表面の粗さＲａは、３ｎｍ以上であることを特徴とする請求項３記載の細胞培養基板。
5. 前記表面の粗さＲａは、４ｎｍ以上１８ｎｍ以下であることを特徴とする請求項３記載の細胞培養基板。
6. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養基板を備えたことを特徴とする細胞培養器。