CN106676607A - 一种具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管及其制备方法，属于生物医用材料领域，包括以下步骤：A.钛材表面二氧化钛纳米管阵列的制备；B.多巴胺在纳米管阵列表面上的自我聚合，形成聚多巴胺；C.通过聚多巴胺将成骨生长肽固定在纳米管阵列的表面，即得：具良好成骨作用二氧化钛纳米管。一方面，二氧化钛纳米管阵列为细胞生长提供了适宜的拓扑结构；另一方面，成骨生长肽能刺激成骨细胞活性，通过纳米拓扑结构与成骨生长肽的协同作用，促进了成骨细胞的分化作用，进而提高了钛材早期的骨整合性。

Description

一种具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管及其制备方法
技术领域
本发明提供一种具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管及其制备方法，属于生物医用材料领域，涉及钛材表面纳米结构化，还涉及生物功能化该纳米钛材。
背景技术
钛及钛合金由于具有良好的物理性能已被作为植入体材料并广泛应用于骨科临床领域。不足之处是其表面存在生物惰性，缺乏诱导骨生成潜能，以致钛基植入体与周边自然骨组织的整合性差，如何提高钛基植入体与周边自然骨组织结合的长期稳定性是其临床应用所面临的普遍问题。
目前，为了改善钛材表面特性，国内外研究人员通过模拟自然骨的微米/纳米结构，提高钛材的生物学效应。Brammer和Park等研究证实二氧化钛纳米管的纳米结构对细胞成骨分化发挥重要作用（Brammer, 2009,Actabiomaterialia&Park, 2009, Small）。同时，二氧化钛纳米管因重复性好、简单易行且具有独特的纳米拓扑结构，可作为负载药物、生长因子等的载体在生物医学工程领域得到广泛应用。
成骨生长肽，作为一个可溶性、短线性生长因子肽段，能直接调控体外细胞增殖成骨分化和矿化以及体内骨形成与骨愈合。Policastro和Moore等研究证实利用成骨生长肽修饰材料表面和支架能够表现良好的骨诱导性（Policastro, 2015, Biomacromolecules&Moore, 2010，Biomaterials)。目前，未见成骨生长肽通过化学连接用于修饰二氧化钛纳米管提高骨整合性的报道。
此外，Lee等证实化合物多巴胺能以自我聚合的方式在各自底物表面形成一层聚多巴胺层，通过聚多巴胺的邻苯二酚与醌基团可以将蛋白质生长因子等固定在底物表面上（Lee, 2007, Science）。本研究目的是探究纳米拓扑结构与成骨生长肽对成骨分化的协同效应。
发明内容
本发明的目的是要提供一种具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管及其制备方法，通过表面的纳米拓扑结构与化学成分协同促进成骨作用，进而提高钛材的早期骨整合性。
本发明的目的是这样实现的：利用阳极氧化法在钛材表面合成二氧化钛纳米管，进一步通过聚多巴胺将成骨生长肽固定在二氧化钛纳米管表面。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
a、将钛材按常规方法进行预处理备用；
b、利用阳极氧化法在步骤a预处理后的钛片表面制备管径为30-100 nm的二氧化钛纳米管阵列；
c、在步骤b制得的二氧化钛纳米管阵列表面沉积聚多巴胺；
d、通过成骨生长肽溶液与步骤c制得的表面沉积有聚多巴胺的二氧化钛纳米管阵列上，即制得具良好促成骨作用二氧化钛纳米管。
4、进一步，所述步骤a是将钛材剪切成 (1-2) cm× (1-2) cm的钛片，依次利用丙酮、无水乙醇和双蒸水超声清洗10-30 min，并于37-40℃烘箱中烘干备用。
5、进一步，所述步骤b是以步骤a所准备的钛片为阳极，铂片为阴极，丙三醇与双蒸水体积比为1比1 配制的0.27 mol /L的氟化铵溶液为电解质，在10-30 V的恒定电压下电解 1-3 h，将氧化后的钛片超声清洗2-5 min，干燥，最后放置于马弗炉中400℃条件下加热1-3 h，制得管径为30-100 nm的二氧化钛纳米管。
6、进一步，所述步骤c是利用5-15 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为1-3 mg/mL的盐酸多巴胺溶液，并调pH至8-9，将步骤b制得的二氧化钛纳米管浸入盐酸多巴胺溶液中，室温避光反应过夜，然后利用双蒸水清洗，常温干燥，制得表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管。
7、进一步，所述步骤d是利用5-15 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为10-20 ng/mL的成骨生长肽溶液，将步骤c所制得的表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管浸入上述成骨生长肽溶液中，室温避光反应过夜，然后利用PBS清洗，常温干燥，即制得具良好促成骨作用二氧化钛纳米管。
本发明的有益效果在于：由于采用了上述方案，本发明通过阳极氧化法在钛材表面构建了二氧化钛纳米管，进一步通过聚多巴胺在二氧化钛纳米管表面固定成骨生长肽。一方面，二氧化钛纳米管提供了良好的纳米拓扑结构；另一方面，成骨生长肽作为生长因子多肽能够直接促进成骨分化，通过纳米拓扑结构与化学成分协同促进成骨分化，进一步提高钛材的早期骨整合性，达到了本发明的目的。此外，该方法简单直接、周期短、成本较低，因此具有良好的应用前景。
附图说明
图1是扫描电子显微镜图像：未处理钛材（a），二氧化钛纳米管（b），二氧化钛纳米管-聚多巴胺（c），二氧化钛纳米管-聚多巴胺-成骨生长肽（d）。
图2是原子力显微镜图像：未处理钛材（a），二氧化钛纳米管（b），二氧化钛纳米管-聚多巴胺（c），二氧化钛纳米管-聚多巴胺-成骨生长肽（d）。
图3是成骨细胞在经过不同处理的钛材表面的碱性磷酸酶含量，其中* 表示两组间p<0.05，** 表示两组间p<0.01。
图4是成骨细胞在经过不同处理的钛材表面的矿化含量，其中* 表示两组间p<0.05，** 表示两组间p<0.01。
具体实施方式
实施例1.具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管的制备
a、将钛材剪切成1 cm×1 cm的钛片，依次利用丙酮、无水乙醇和双蒸水超声清洗20min，并于37℃烘箱中烘干备用；
b、以步骤a所准备的钛片为阳极，铂片为阴极，丙三醇与双蒸水体积比为1比1 配制的0.27 mol/L的氟化铵溶液为电解质，在10 V的恒定电压下电解 1 h，将氧化后的钛片超声清洗2 min，干燥，最后放置于马弗炉中400℃条件下加热2 h，制得管径为30 nm的二氧化钛纳米管；
c、利用10 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为2 mg/mL的盐酸多巴胺溶液，并调pH至8.5，将步骤b制得的二氧化钛纳米管浸入盐酸多巴胺溶液中，室温避光反应过夜，进一步利用双蒸水清洗，常温干燥，制得表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管；
d、利用10 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为10 ng/mL的成骨生长肽溶液，将步骤c所制得的表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管浸入上述成骨生长肽溶液中，室温避光反应过夜，然后利用PBS清洗，常温干燥，即制得具良好促成骨作用二氧化钛纳米管。
实施例2.具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管的制备
a、将钛材剪切成1 cm×1 cm的钛片，依次利用丙酮、无水乙醇和双蒸水超声清洗20min，并于37℃烘箱中烘干备用；
b、以步骤a所准备的钛片为阳极，铂片为阴极，丙三醇与双蒸水体积比为1比1 配制的0.27 mol/L的氟化铵溶液为电解质，在20 V的恒定电压下电解 1 h，将氧化后的钛片超声清洗2 min，干燥，最后放置于马弗炉中400℃条件下加热2 h，制得管径为70 nm的二氧化钛纳米管；
c、利用10 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为2 mg/mL的盐酸多巴胺溶液溶，并调pH至8.5，将步骤b制得的二氧化钛纳米管浸入盐酸多巴胺溶液中，室温避光反应过夜，进一步利用双蒸水清洗，常温干燥，制得表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管；
d、利用10 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为10 ng/mL的成骨生长肽溶液，将步骤c所制得的表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管浸入上述成骨生长肽溶液中，室温避光反应过夜，然后利用PBS清洗，常温干燥，即制得具良好促成骨作用二氧化钛纳米管。
分别取经过步骤b、c和d制得的二氧化钛纳米管，对其表面化学元素进行XPS分析,结果如表1所示，N元素的逐步提高，说明已成功将成骨生长肽固定在二氧化钛纳米管表面。
表1、各组样品表面化学元素组成（按质量百分含量计算）
底物 C% O% N% Ti%
二氧化钛纳米管 21.21 54.63 0 24.15
表面沉积有聚多巴胺的二氧化钛纳米管 58.77 26.84 3.55 10.84
成骨生长肽修饰的二氧化钛纳米管 58.88 27.35 4.36 9.40
由图1结果可见，经过阳极氧化在钛材表面形成了管径为70nm的二氧化钛纳米管，通过沉积多巴胺后，纳米管部分被遮盖，表明表面形成了一层聚多巴胺物质，最后通过沉积成骨生长肽后，纳米管仍有部分被遮盖。
由图2结果可见，经过阳极氧化处理后，表面可观察到山谷样结构，这与二氧化钛纳米管结构相关。进一步处理后，表面更加粗糙。结合XPS结果，表明二氧化钛纳米管表面成功接入成骨生长肽。
实施例3.具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管的制备
a、将钛材剪切成1 cm×1 cm的钛片，依次利用丙酮、无水乙醇和双蒸水超声清洗20min，并于37℃烘箱中烘干备用；
b、以步骤a所准备的钛片为阳极，铂片为阴极，丙三醇与双蒸水体积比为1比1 配制的0.27 mol/L的氟化铵溶液为电解质，在30 V的恒定电压下电解 1 h，将氧化后的钛片超声清洗2 min，干燥，最后放置于马弗炉中400℃条件下加热2 h，制得管径为100 nm的二氧化钛纳米管；
c、利用10 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为2 mg/mL的盐酸多巴胺溶液，并调pH至8.5，将步骤b制得的二氧化钛纳米管浸入盐酸多巴胺溶液中，室温避光反应过夜，进一步利用双蒸水清洗，常温干燥，制得表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管；
d、利用10 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为10 ng/mL的成骨生长肽溶液，将步骤c所制得的表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管浸入上述成骨生长肽溶液中，室温避光反应过夜，然后利用PBS清洗，常温干燥，即制得具良好促成骨作用二氧化钛纳米管。
实验例1．具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管对成骨细胞早期分化的促进能力
取实施例2经过不同处理后得到的“二氧化钛纳米管”、“二氧化钛纳米管-聚多巴胺”和“二氧化钛纳米管-聚多巴胺-成骨生长肽”材料以及未处理纯钛（简称为“钛材”），在不同材料表面接种新生大鼠头盖骨的成骨细胞，接种密度为1×104/cm2，用含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行培养，每隔2天进行换液。分别培养4天和7天后，用200μL 1%的Triton X-100溶液收集细胞，2500转离心5 min，利用试剂盒检测细胞上清液中的碱性磷酸酶和蛋白质含量，最后用酶标仪分别于波长520nm和562nm处测定吸光度。分别培养4天和7天，用体积分数为1%的Triton X-100溶液收集细胞，2500转离心5 min，利用试剂盒检测分别与细胞上清液中的碱性磷酸酶和总蛋白含量发生反应，分别于波长520nm和562nm下，用酶标仪测定其吸光度。
结果如图3所示，不论在第4天还是7天，与未处理的钛相比，在二氧化钛纳米管及聚多巴胺修饰的纳米管上生长的细胞表达更高的碱性磷酸酶(p <0.05或 p < 0.01)，说明二氧化钛纳米管能促进成骨分化，同时多巴胺具有良好的生物相容性也能够促进成骨分化。
与其他组相比，在成骨生长肽修饰的二氧化钛纳米管上生长的细胞所表达的碱性磷酸酶含量最高 (p <0.05或p < 0.01)，说明二氧化钛纳米管的纳米结构和成骨生长肽能够协同促进成骨分化。
实验例2．具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管对成骨细胞后期分化的促进能力
取实施例2经过不同处理后得到的“二氧化钛纳米管”、“二氧化钛纳米管-聚多巴胺”和“二氧化钛纳米管-聚多巴胺-成骨生长肽”材料以及未处理纯钛（简称为“钛材”），在不同材料表面接种新生大鼠头盖骨的成骨细胞，接种密度为1×104/cm2，用含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行培养，每隔2天进行换液。分别培养7天和14天后，在4℃条件下，用2%戊二醛固定20 min；用PBS清洗3次，每次5 min；加入40 mM茜素红染色20 min；蒸馏水清洗3次；加入400μL，10%（v/v）醋酸溶液，摇晃混匀，孵育30 min；收集细胞并转移到离心管中，震荡30 s以混合均匀；在85℃条件下，加热10 min；离心15 min，将200μL上清液转移到新的离心管中；加入氢氧化铵（200μL10%）中和酸；在405 nm波长下，用酶标仪检测上清液的吸光值。
结果如图4所示，为成骨细胞在不同材料上的矿化情况。与未处理的钛材相比，细胞在二氧化钛纳米管和聚多巴胺修饰的二氧化钛纳米管上表现较高的矿化含量（p <0.05）。以其它组相比，在成骨生长肽修饰的二氧化钛纳米管上生长的细胞所表达的矿化含量最高（p < 0.01）。结果表明成骨生长肽修饰的二氧化钛纳米管促进了成骨细胞后期分化。
经过上述实验步骤，可以获得具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管。上述实施方案中需要注意的问题是：所有与细胞培养有关的仪器设备和试剂都必须无菌，所有涉及细胞培养的操作步骤都必须严格按照无菌操作规范。
最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制。尽管通过上述实施例已经对本发明做了较为详细的描述，但本领域技术人员仍可以根据发明内容和实施例部分所描述的技术内容，在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (7)

1.一种具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管，其特征在于：钛材表面具有管径为30-100 nm的二氧化钛纳米管阵列，所述二氧化钛纳米管阵列表面还固定成骨生长肽即成骨生长肽。
2.根据权利要求1所述的具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管的制备方法，其特征是：成骨生长肽通过聚多巴胺固定在二氧化钛纳米管阵列表面。
3.根据权利要求1或2所述的具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将钛材进行预处理；
b、步骤a处理后的钛片表面制备管径为30-100 nm的二氧化钛纳米管阵列；
c、在步骤b制得的二氧化钛纳米管阵列表面沉积聚多巴胺；
d、进一步通过成骨生长肽溶液与二氧化钛纳米管阵列接触，将成骨生长肽固定在步骤c制得的沉积有聚多巴胺的二氧化钛纳米管阵列上，即制得具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管。
4.根据权利要求3所述的具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管的制备方法，其特征在于：所述步骤a是将钛材剪切成 (1-2) cm× (1-2) cm的钛片，依次利用丙酮、无水乙醇和双蒸水超声清洗10-30 min，并于37-40℃烘箱中烘干备用。
5.根据权利要求3所述的具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管的制备方法，其特征在于：所述步骤b是以步骤a所准备的钛片为阳极，铂片为阴极，丙三醇与双蒸水体积比为1比1配制的0.27 mol/L的氟化铵溶液为电解质，在10-30 V的恒定电压下电解 1-3 h，将氧化后的钛片超声清洗2-5 min，干燥，最后放置于马弗炉中400-600℃条件下加热1-3 h，制得管径为30-100 nm的二氧化钛纳米管。
6.根据权利要求3所述的具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管的制备方法，其特征在于：所述步骤c是利用5-15 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为1-3 mg/mL的盐酸多巴胺溶液，并调pH至8-9，将步骤b制得的二氧化钛纳米管浸入盐酸多巴胺溶液中，室温避光反应过夜，进一步利用双蒸水清洗，常温干燥，制得表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管。
7.根据权利要求3所述的具良好促成骨作用的二氧化钛纳米管的制备方法，其特征在于：所述步骤d是利用5-15 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制浓度为10-20 ng/mL的成骨生长肽溶液，将步骤c所制得的表面沉积聚多巴胺的二氧化钛纳米管浸入上述成骨生长肽溶液中，室温避光反应过夜，再利用PBS清洗，常温干燥，即制得具良好促成骨作用二氧化钛纳米管。
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