CN111110916A - 3d打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系及制备方法 - Google Patents

3d打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系及制备方法，结构包括PDA修饰的阳极氧化所得的双管径纳米管膜层，上层为小管径层，用作与细胞相互作用的界面及药物释放的“阀门”；下层为大管径层，用于装载药物。首先将3D打印多孔钛双管径纳米管电解得到双管径纳米管膜层，在加入锌离子的负载和抗菌肽的负载。本发明可以在多孔钛基表面构建以双管径二氧化钛纳米管为基础的可控释药体系，极大地提高了钛及其合金在硬组织植入及药物载体等方面的实际应用。

Description

3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系及制备方法
技术领域
本发明属于多孔钛表面处理技术应用于生物种植体领域，涉及一种3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系及制备方法，尤其是一种双管径二氧化钛纳米管层和聚多巴胺修饰相结合的载药体系的制备方法，该方法可获得以多孔钛植入体为基体的对药物可控释放的载药体系，以实现感染微环境下的高效抗菌与骨整合的平衡。
背景技术
钛及其合金具有良好的耐腐蚀、力学性能、生物相容性等，广泛应用于硬组织修复及替换领域。然而，致密钛植入体与周围骨组织弹性模量不匹配而产生的应力屏蔽效应，是致使正常骨组织萎缩及植入体松动的主要原因。而在宿主防御能力薄弱区域很易发生细菌入侵。相比之下，多孔钛及其合金可具有与自然骨更接近的弹性模量、更大的表面积及孔-孔的连通性，为骨的长入提供可能。然而，钛及其合金生物活性差，需要进行表面生物功能化改性。
相较于同种材料的致密形态，纳米管状的拓扑形态更能促进成骨细胞的黏附、繁殖及分化；植入动物体内后，能与骨形成骨性结合，并促进新骨的形成。此外，纳米管独特的纳米管状结构是抗/杀菌药物负载和释放的理想平台。如纳米管负载如Ag、Zn、庆大霉素等抗菌剂，可预防细菌感染，防止骨组织坏疽；负载Sr、Mg、骨形成蛋白、RGD肽等生物活性因子，可为成骨相关细胞的黏附、增殖、分化提供良好界面。因此，纳米管在种植体、填置式给药系统、组织工程等生物应用领域具有很好的应用潜力。
在碱性溶液等温和条件下，多巴胺(DA)不需要预处理便可牢固地粘附在各种基材表面，并自氧化原位聚合形成PDA层。可贵的是，PDA能够牢固粘附在TiO2纳米管内表面而不掩盖其管状结构，且PDA分子间强π-π键堆积能保证其在正常生理体液中的牢固粘附。此外，PDA的电荷性具有随pH而变化的特点：在碱性和中性下带负电、酸性下带正电，可通过静电引力或静电斥力来减缓或加速药物释放。而局部生理体液pH降低是感染等生理环境恶化的最直接的物理化学信号。通过pH等胞外刺激而进行“按需”释药，无感染刺激时则药物低量释放，可有效降低药物的副作用、提高利用率。Yang等人[ACS Appl.Mater.Inter.,2017,10,7649-7660]利用PDA对单管径二氧化钛纳米管进行修饰后，虽能对药物进行有效缓控释，但未考虑纳米管管径与载药量及细胞行为的相互关系。从纳米管对细胞行为的影响来说，二氧化钛纳米管的管径对细胞的黏附、增殖、分化起决定作用。研究表明：管径15～30纳米的二氧化钛纳米管有利于成骨相关细胞的黏附、增殖和分化；管径大于50纳米后，成骨相关细胞黏附受到抑制，甚至发生凋亡。从纳米管对药物负载来说，小管径(如15～30纳米)的纳米管没有足够的空间用于抗菌剂的高量负载，也就无法提供长期药释。因此，细胞成骨分化及抗菌剂长期释放与其高量负载对二氧化钛纳米管的相反管径需求存在矛盾。前期研究工作中[ACS Appl.Mater.Interfaces 2017,9,9449-9461]，利用双管径二氧化钛纳米管可实现对药物的高量负载和长期控释抗菌。然而，这种利用纳米管结构进行药物控释，并不能及时“感知”感染微环境，从而根据抗感染的需要释放抗菌药剂(即“按需”释药)。在植入早期，组织未发生感染情况下，仍可能出现大量药剂的迅速释放，造成细胞毒性，且无法维持长期缓控释抗菌，最终导致抗菌与细胞成骨分化难以兼顾。此外，前期工作是对平板钛进行表面改性，在多孔钛表面因电流密度的分布不同，阳极氧化的工艺参数需要进一步调整。
鉴于以上考虑，多孔钛表面所得药物控释载药体系的开发，已成为其能否实际应用于感染微环境下骨整合的关键。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系及制备方法，提供能兼顾高效抗菌与骨整合的表面改性方法，能够在多孔钛或多孔钛合金表面生成结合牢固、有一定厚度的、pH控制释放的载药体系层。
技术方案
一种3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系，其特征在于包括PDA修饰的阳极氧化所得的双管径纳米管膜层，膜层厚度为8～25微米：上层为细胞相互作用的界面及药物释放的“阀门”的小管径层，管径为20～60纳米，用作与细胞相互作用的界面及药物释放的“阀门”；下层为装载药物的大管径层，管径大小为80～140纳米；PDA层在纳米管内壁沉积，厚度为5～25纳米；所述药物为：抗菌肽LL37和锌离子。
所述双管径纳米管采用多孔钛或多孔钛合金利用3D打印技术获得。
一种所述3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：采用多孔钛或多孔钛合金利用3D打印技术获得双管径纳米管；
步骤2：以多孔钛或多孔钛合金的双管径纳米管为阳极，石墨棒为阴极，电解液为氟盐、乙二醇和去离子水；电解时采用直流电源；所述电解液的比例为每份0.08M氟盐、250mL乙二醇(含50mL二乙二醇)和2wt.％去离子水；
对阳极的双管径纳米管氧化，得到双管径二氧化钛纳米管，过程为三个阶段：
第一阶段在如5V～30V电压下，阳极氧化处理1～8小时，形成小管径结构的纳米管；
第二阶段，将电压以每分钟10～60伏特的速率升至80～140伏特，并在该电压下维持15～60分钟；
第三阶段，以每秒5～50毫升的速率向电解液中添加镁盐溶液，每升电解液中添加镁盐的量为0.06摩尔，处理时间为30～120分钟；
步骤3：将双管径二氧化钛纳米管浸于pH为8.5的含DA的Tris-HCl缓冲液之中，在磁力搅拌下，DA发生氧化自聚合反应；搅拌速率为300～700转每分钟，反应时间为1～24小时；采用去离子水充分清洗后，真空干燥；所述DA的浓度为1～8毫克每毫升；所述Tris-HCl浓度为10毫摩尔每升；
步骤4：
锌离子的负载：将纳米管浸入硝酸锌的水溶液中，震荡1～24小时；采用去离子水充分清洗后，室温真空干燥；所述硝酸锌溶液的浓度为0.5M；
抗菌肽的负载：用移液器移取80微升的抗菌肽LL37的磷酸盐缓冲液均匀涂覆在纳米管表面，并使溶液充分浸润多孔内表面，室温静置30～60分钟后，将样品转移至真空干燥箱，室温真空干燥1～2小时，重复此步骤，使得抗菌肽的总理论负载量为200～400微克，最后一次负载干燥后，用PBS快速清洗样品表面，除去残留在纳米管表面的、多余的抗菌肽，清洗的溶液收集；并4摄氏度保存；所述抗菌肽LL37的浓度为5毫克每毫升。
所述阴阳极之间的距离为5厘米。
所述镁盐溶液的浓度为0.06M。
有益效果
本发明提出的一种3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系及制备方法，结构包括PDA修饰的阳极氧化所得的双管径纳米管膜层，上层为小管径层，用作与细胞相互作用的界面及药物释放的“阀门”；下层为大管径层，用于装载药物。首先将3D打印多孔钛双管径纳米管电解得到双管径纳米管膜层，在加入锌离子的负载和抗菌肽的负载。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明载药体系的制备方法及药剂的负载方法简单、易于控制，工艺稳定制备载药体系的原料易得、价格低廉。
2.采用本发明制得的双管径纳米管膜层厚度为8～25微米，可根据需要通过控制处理时间来调节膜厚度；纳米管的表面管径大小和管长可通过调节阳极氧化电压和时间来控制；断面SEM形貌照片显示膜层上层为小管径的纳米管层，管径大小为30～60纳米，下层为大管径的纳米管层，管径大小为80～140纳米；PDA修饰纳米管后，纳米管的管状结构保留，PDA层的厚度为5～25纳米，可根据需要通过调节DA浓度和处理时间来调节PDA层厚度。
3.采用本发明在多孔钛表面制得的膜层，经PDA修饰后，该体系对抗菌肽(LL37)和金属锌离子具有pH响应型控释作用。
4.本发明的多孔钛基pH控制释放的载药体系的抗菌率可从单种药物负载时的80％提高到双药负载时的94％；相对间充质干细胞增殖率：单种药物负载时为100.4％～126％，双药负载时为114％～123％。双药负载能有效平衡载药双管径纳米管的高效抗菌与细胞成骨分化。相比之下，多孔钛基表面仅双管径纳米管结构负载LL37的抗菌率虽然达88％～95％，但相对细胞的增殖率仅为92％～98％。
附图说明
图1使用本发明的阳极氧化处理在多孔钛所得双管径纳米管膜层(实施例1膜层)的表面及截面形貌SEM照片。
图2使用本发明的阳极氧化处理所得双管径纳米管膜层(实施例1膜层)经PDA沉积后的表面形貌SEM照片。
图3使用本发明所得载药体系对抗菌肽和锌离子的pH响应型释放曲线(实施例1膜层)。
图4使用本发明所得载药体系负载双药后的抗菌效应(实施例1膜层)。
图5使用本发明所得载药体系负载双药后对小鼠骨髓间充质干细胞的细胞相对增殖率(实施例1、2膜层)。
图6使用本发明所得载药体系负载双药后促小鼠骨髓间充质干细胞生物矿化定量结果(实施例1膜层)。
图7使用本发明所得双管径纳米管结构对抗菌肽的控释效应(实施例2、3膜层)
图8使用本发明的阳极氧化处理在多孔钛所得双管径纳米管膜层(实施例3膜层)的表面及双管径界面处形貌SEM照片。
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
本发明实施例的结构包括PDA修饰的阳极氧化所得的双管径纳米管膜层，膜层厚度为8～25微米：上层为小管径层，管径大小为20～60纳米，用作与细胞相互作用的界面及药物释放的“阀门”；下层为大管径层，管径大小为80～140纳米用于装载药物；PDA层在纳米管内壁沉积，厚度为5～25纳米。其中药物模型为：抗菌肽LL37和锌离子。本发明的可控释药体系对药物可控释放至少28天，兼具良好的抗菌效应和促进骨髓间充质干细胞成骨分化能力。
采用氟离子沉降的三阶段阳极氧化方法在多孔钛表面制备双管径二氧化钛纳米管层；利用PDA自组装特性，在纳米管内表面沉积PDA层，并负载药物；其中药物为抗菌肽和生物活性金属锌离子。
制备过程：
制备双管径二氧化钛纳米管的方法为：配制氟化盐电解液用于多孔钛或多孔钛合金基体阳极氧化得到双管径纳米管膜层。其中，多孔钛或多孔钛合金采用3D打印技术获得。为改善膜层与基体的结合强度，在得到所需结构的纳米管层后，向电解液中添加镁盐溶液，用于沉降电解液中的氟离子；其中用于氟离子沉降的电解质为乙酸镁的乙二醇溶液。进一步，以上方法具体操作为：以多孔钛或多孔钛合金为阳极，石墨棒为阴极，阴阳极之间的距离为5厘米，所用电源为直流电源。在由氟盐、乙二醇、去离子水配制的电解液中，将阳极氧化过程分为三个阶段。第一阶段在较低的电压下(如5V～30V)阳极氧化处理1～8小时，形成小管径结构的纳米管；第二阶段，将电压以每分钟10～60伏特的速率升至80～140伏特，并在该电压下维持15～60分钟；第三阶段，以每秒5～50毫升的速率向电解液中添加镁盐溶液，每升电解液中添加镁盐的量为0.06摩尔，处理时间为60分钟。
制备药物可控释放体系的方法为：将上述方法所得的双管径二氧化钛纳米管浸于pH为8.5的含DA的Tris-HCl缓冲液之中，DA的浓度为1～8毫克每毫升，Tris-HCl浓度为10毫摩尔每升。在磁力搅拌下，DA发生氧化自聚合反应，搅拌速率为400转每分钟，反应时间为1～24小时，去离子水充分清洗后，真空干燥。
药物的负载方法为：本发明的药物模型为抗菌肽LL37和锌离子。无机抗菌剂锌不仅具有优异的抗菌性，且是骨代谢和骨再生过程中非常重要的元素；抗菌肽LL37是人体内表达的宿主防御肽，对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有明显的抗菌活性。(1)锌离子的负载。经PDA修饰的纳米管浸入硝酸锌的水溶液中，摇床震荡1～24小时，去离子水充分清洗后，室温真空干燥；其中硝酸锌溶液的浓度为0.5M。(2)抗菌肽的负载。用移液器移取80微升的抗菌肽LL37的磷酸盐缓冲液均匀涂覆在多孔样品表面，并使溶液充分浸润多孔内表面，室温静置30分钟后，将样品转移至真空干燥箱，室温真空干燥2小时，重复此步骤，使得抗菌肽的总理论负载量为200～400微克，最后一次负载干燥后，用1毫升的PBS快速清洗样品表面，以除去残留在纳米管表面的、多余的抗菌肽，清洗的溶液收集，并4摄氏度保存；其中抗菌肽LL37的浓度为5毫克每毫升。
具体实施例：
实施例1：
配制阳极氧化电解液：(1)250毫升含0.08M NH4F+2wt.％H2O的乙二醇溶液用于多孔钛基体阳极氧化得到双管径纳米管，配制电解液(2)50毫升含0.06M(CH3COO)2Mg用于氟离子沉降改善膜基结合强度。
配制DA溶液及药物溶液：(3)10毫升含10mM tris的水溶液，用盐酸调pH至8.5，得到tris-HCl溶液，(4)20毫克的DA溶于(3)溶液中，形成pH为8.5的2毫克每毫升的DA的tris-HCl溶液，用于在纳米管内表面沉积PDA。(5)配制0.5M的硝酸锌水溶液，用于锌离子的负载，(6)配制5毫克每毫升的抗菌肽LL37的PBS溶液，用于抗菌肽的负载，使理论负载量为400微克。
释放条件：将样品分别浸入到10毫升的PBS中，在37摄氏度摇床中进行释放；植入体植入体内后，骨愈合正常发生的过程中，体内微环境的pH呈现弱碱性(pH约为7.6-8.5)，而在感染部位，pH呈酸性，为此释放介质的pH为5.0、7.4和8.5；摇床速率为100转每分钟。在设定的时间点，各取出10毫升的溶液，并各加入10毫升新的PBS；在每个时间点，将每个试管中收集的溶液，立即密封保存在-20摄氏度。对抗菌肽用荧光分子FITC进行标记，并用荧光分光光度计测定释放到溶液中的抗菌肽的量，用原子吸收光谱测定释放到溶液中的锌离子的量。
抗菌实验：以金色葡萄球菌和大肠杆菌为目标菌种，采用常规的抗菌实验评价材料的抗菌效应。
细胞相容性实验：以大鼠骨髓间充质干细胞为目标细胞，采用MTT法测定细胞与材料共培养后的细胞活力，初步评价材料对成骨相关细胞的作用效应。
采用直流电源，以多孔钛为阳极、石墨棒为阴极，阴阳极板间距为5厘米，于电解液(1)中，在恒定电压为20伏特的条件下进行阳极氧化处理5小时；将电压以每分钟60伏特的速率升至80伏特，并在该电压下维持30分钟；以每秒50毫升的速率向电解液中添加溶液(2)，保压60分钟，在阳极氧化表面形成双管径纳米管，表面管径为30纳米，长度为2微米，底部大管径为140纳米，长度为8.0微米。其表面及截面微观形貌SEM照片参阅图1。所得双管径纳米管在溶液(3)中沉积时间为2小时，接着在溶液(5)中反应4小时，最后负载溶液(6)的抗菌肽。PDA在纳米管内表面的沉积厚度为5纳米，其表面微观形貌SEM照片参阅图2；该释药体系对抗菌肽和锌离子的pH响应性释放曲线参阅图3。其抗菌效应参阅图4，对小鼠骨髓间充质干细胞的细胞相容性参阅图5，促细胞生物矿化能力参阅图6。
实施例2：
配制阳极氧化电解液：(1)250毫升含0.08M NH4F+2wt.％H2O的乙二醇溶液用于多孔钛基体阳极氧化得到双管径纳米管，配制电解液(2)50毫升含0.06M(CH3COO)2Mg用于氟离子沉降改善膜基结合强度。
配制药物溶液：(3)配制5毫克每毫升的抗菌肽LL37的PBS溶液，用于抗菌肽的负载，使理论负载量为400微克。
释放条件：将样品分别浸入到10毫升的PBS中，在37摄氏度摇床中进行释放；释放介质的pH为7.4，摇床速率为100转每分钟。在设定的时间点，各取出1毫升的溶液，并各加入1毫升新的PBS；在每个时间点，将每个试管中收集的溶液，立即密封保存在-20摄氏度。对抗菌肽用荧光分子FITC进行标记，并用荧光分光光度计测定释放到溶液中的抗菌肽的量。
采用直流电源，以多孔钛为阳极、石墨棒为阴极，阴阳极板间距为5厘米，于电解液(1)中，在恒定电压为20伏特的条件下进行阳极氧化处理5小时；将电压以每分钟60伏特的速率升至80伏特，并在该电压下维持30分钟；以每秒50毫升的速率向电解液中添加溶液(2)，保压60分钟，在阳极氧化表面形成双管径纳米管，表面管径为30纳米，长度为2微米，底部大管径为140纳米，长度为8.0微米。其表面及截面微观形貌SEM照片参阅图1。所得双管径纳米管负载溶液(3)的抗菌肽。该释药体系对抗菌肽的释放曲线参阅图7，对小鼠骨髓间充质干细胞的细胞相容性参阅图5。
实施例3：
配制阳极氧化电解液：(1)250毫升含0.08M NH4F+2wt.％H2O的乙二醇溶液用于多孔钛基体阳极氧化得到双管径纳米管，配制电解液(2)50毫升含0.06M(CH3COO)2Mg用于氟离子沉降改善膜基结合强度。
药物溶液：(3)配制5毫克每毫升的抗菌肽LL37的PBS溶液，用于抗菌肽的负载，使理论负载量为400微克。
释放条件：将样品分别浸入到10毫升的PBS中，在37摄氏度摇床中进行释放；释放介质的pH为7.4，摇床速率为100转每分钟。在设定的时间点，各取出10毫升的溶液，并各加入10毫升新的PBS；在每个时间点，将每个试管中收集的溶液，立即密封保存在-20摄氏度。对抗菌肽用荧光分子FITC进行标记，并用荧光分光光度计测定释放到溶液中的抗菌肽的量。
采用直流电源，以多孔钛为阳极、石墨棒为阴极，阴阳极板间距为5厘米，于电解液(1)中，在恒定电压为60伏特的条件下进行阳极氧化处理2小时；将电压以每分钟10伏特的速率升至80伏特，并在该电压下维持15分钟；以每秒50毫升的速率向电解液中添加溶液(2)，保压60分钟，在阳极氧化表面形成双管径纳米管，表面管径为60纳米，长度为2微米，底部大管径为140纳米，长度为8微米。其表面及大小管径界面处微观形貌SEM照片参阅图8。所得双管径纳米管负载溶液(3)的抗菌肽，该释药体系对抗菌肽的释放曲线参阅图7。
实施例2可作为实施例1的反例，且实施例2和实施例3的双管径纳米管膜层均可用PDA进行修饰后载药，实现pH响应释药。在本发明提供的范围内，可以在多孔钛基表面构建以双管径二氧化钛纳米管为基础的可控释药体系，极大地提高了钛及其合金在硬组织植入及药物载体等方面的实际应用。

Claims (5)

1.一种3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系，其特征在于包括PDA修饰的阳极氧化所得的双管径纳米管膜层，膜层厚度为8～25微米：上层为细胞相互作用的界面及药物释放的“阀门”的小管径层，管径为20～60纳米，用作与细胞相互作用的界面及药物释放的“阀门”；下层为装载药物的大管径层，管径大小为80～140纳米；PDA层在纳米管内壁沉积，厚度为5～25纳米；所述药物为：抗菌肽LL37和锌离子。
2.根据权利要求1所述3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系，其特征在于：所述双管径纳米管采用多孔钛或多孔钛合金利用3D打印技术获得。
3.一种权利要求1或2所述3D打印多孔钛表面抗菌及促成骨的可控释药体系的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：采用多孔钛或多孔钛合金利用3D打印技术获得双管径纳米管；
步骤2：以多孔钛或多孔钛合金的双管径纳米管为阳极，石墨棒为阴极，电解液为氟盐、乙二醇和去离子水；电解时采用直流电源；所述电解液的比例为每份0.08M氟盐、250mL乙二醇(含50mL二乙二醇)和2wt.％去离子水；
对阳极的双管径纳米管氧化，得到双管径二氧化钛纳米管，过程为三个阶段：
第一阶段在如5V～30V电压下，阳极氧化处理1～8小时，形成小管径结构的纳米管；
第二阶段，将电压以每分钟10～60伏特的速率升至80～140伏特，并在该电压下维持15～60分钟；
第三阶段，以每秒5～50毫升的速率向电解液中添加镁盐溶液，每升电解液中添加镁盐的量为0.06摩尔，处理时间为30～120分钟；
步骤3：将双管径二氧化钛纳米管浸于pH为8.5的含DA的Tris-HCl缓冲液之中，在磁力搅拌下，DA发生氧化自聚合反应；搅拌速率为300～700转每分钟，反应时间为1～24小时；采用去离子水充分清洗后，真空干燥；所述DA的浓度为1～8毫克每毫升；所述Tris-HCl浓度为10毫摩尔每升；
步骤4：
锌离子的负载：将纳米管浸入硝酸锌的水溶液中，震荡1～24小时；采用去离子水充分清洗后，室温真空干燥；所述硝酸锌溶液的浓度为0.5M；
抗菌肽的负载：用移液器移取80微升的抗菌肽LL37的磷酸盐缓冲液均匀涂覆在纳米管表面，并使溶液充分浸润多孔内表面，室温静置30～60分钟后，将样品转移至真空干燥箱，室温真空干燥1～2小时，重复此步骤，使得抗菌肽的总理论负载量为200～400微克，最后一次负载干燥后，用PBS快速清洗样品表面，除去残留在纳米管表面的、多余的抗菌肽，清洗的溶液收集；并4摄氏度保存；所述抗菌肽LL37的浓度为5毫克每毫升。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述阴阳极之间的距离为5厘米。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述镁盐溶液的浓度为0.06M。
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