CN102058901B - 表面功能化钛材及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学材料领域,涉及一种表面功能化钛材,钛材表面具有管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列,TiO2纳米管阵列表面还固定有血管内皮细胞生长因子(VEGF);其制备方法是先采用阳极氧化法在钛材表面制备管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列,再对TiO2纳米管阵列表面进行硅烷化处理,通过化学反应在其表面引入羧基,利用碳二亚胺和琥珀酰亚胺使羧基活化,再通过接触反应将VEGF固定在具有活化羧基的TiO2纳米管阵列表面,即得;本发明利用VEGF和管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列结构协同提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标如前列环素的表达,能实现钛基材血管支架表面的快速内皮化。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料领域,涉及一种表面功能化的钛材,还涉及该钛材的制备方法。
背景技术
钛材不仅有良好的抗疲劳、抗腐蚀及生物相容性,而且有较小的磁性及透射性,是制备血管支架的优良材料。近年来,血管支架广泛地应用于心血管疾病的治疗,用于支撑狭窄甚至阻塞的冠状动脉血管,保证血液的流通。但钛基材血管支架在临床应用过程中也暴露出一些问题,如支架植入后易导致血栓、支架再狭窄及炎症反应等。
有研究表明,在血管支架表面预先进行内皮细胞化,可以改善支架与血管间的炎症反应,改变血管畅通率,且细胞可以在支架表面形成完整内膜层,对于抑制其植入后再狭窄有一定作用。目前,已有利用表面涂层、覆膜,固定生物活性分子,内皮种植与内皮祖细胞捕获等方法来实现支架表面内皮化的研究报道,如层层自组装壳聚糖和肝素提高冠状支架的内皮化和抗凝性质;肝素-胶原多层膜上原位交联抗CD34抗体促进血管内皮细胞粘附、生长,且保持天然血管内皮细胞的特异功能;钛氧薄膜表面固定层粘连蛋白和/或纤连蛋白提高其表面内皮化能力等。这些方法在一定程度上提高了血管支架的血液相容性、支架表面内皮细胞的生长及内皮祖细胞捕获等能力,但效果仍不理想。此外,有研究表明,表面具有纳米纹理及纳米管阵列的钛材可以提高成骨细胞的吸附、碱性磷酸酶的合成、钙沉积及胶原的分泌。但迄今为止,国内外尚未见纳米结构和生物活性分子协同提高钛材表面内皮化功能的研究报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种表面功能化钛材,利用纳米结构和生物活性分子协同提高钛材表面的内皮化功能。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
表面功能化钛材,钛材表面具有管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列,所述TiO2纳米管阵列表面还固定有血管内皮细胞生长因子(VEGF)。
本发明的目的之二在于提供所述表面功能化钛材的一种制备方法,操作简便易行,周期短,成本低。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
表面功能化钛材的制备方法,包括以下步骤:
a、将钛材按照常规方法进行预处理;
b、采用阳极氧化法在步骤a预处理后的钛材表面制备管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列;
c、对步骤b制得的TiO2纳米管阵列表面进行硅烷化处理,再通过化学反应在TiO2纳米管阵列表面引入羧基,再利用碳二亚胺和琥珀酰亚胺使羧基活化;
d、通过接触反应将VEGF固定在步骤c制得的具有活化羧基的TiO2纳米管阵列表面,即制得表面功能化钛材。
进一步,所述步骤a是将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10~30分钟,干燥备用。
进一步,所述步骤b是以步骤a预处理后的钛材为阳极,铂电极为阴极,置氟化铵电解液中,在10~20V的恒电压下电解,将氧化后的钛材用去离子水洗涤,干燥,制得表面具有管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列的钛材。
进一步,所述步骤b是将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液,作为电解液;再以步骤a预处理后的钛材为阳极,铂电极为阴极,置上述氟化铵电解液中,在10~20V的恒电压下电解3小时,将氧化后的钛材用去离子水洗涤,干燥,制得表面具有管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列的钛材。
进一步,所述步骤c包括以下步骤:
c1、将步骤b制得的表面具有TiO2纳米管阵列的钛材置3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)溶液中反应,制得TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材;
c2、将步骤c1制得的TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材置丁二酸酐溶液中反应,制得TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材;
c3、将步骤c2制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材置1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的酸性或中性混合溶液中反应,使酐功能基团水解暴露出羧基并使羧基活化,制得TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材。
进一步,所述步骤c包括以下步骤:
c1、将APTES用无水己烷溶解制成浓度为0.01mol/L的溶液,将步骤b制得的表面具有TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中,室温下反应3小时,再用无水己烷洗涤,干燥,制得TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材;
c2、将丁二酸酐用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解制成浓度为0.1mol/L的溶液,将步骤c1制得的TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中,室温下反应24小时,再用DMF洗涤,干燥,制得TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材;
c3、将EDC和NHS用浓度为0.05mol/L、pH为5.5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/L EDC和5mmol/L NHS的溶液,将步骤c2制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材浸入上述EDC和NHS的酸性混合溶液中,室温下反应1小时,再用去离子水洗涤,干燥,制得TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材。
进一步,所述步骤d是将VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/ml的溶液,再将步骤c制得的TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中,4°C反应过夜,再用PBS洗涤,干燥,即制得表面功能化钛材。
本发明的有益效果在于:本发明提供了一种表面功能化钛材,利用VEGF和管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列结构协同提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标如前列环素(PGI2)等的表达,能实现钛基材血管支架表面的快速内皮化,以减少支架植入后造成的血栓、再狭窄及炎症反应等难题;而且,该表面功能化钛材的制备方法简便易行,周期短,成本低;因此,本发明的表面功能化钛材具有良好的应用前景。
附图说明
图1为表面具有管径为30nm的TiO2纳米管阵列的钛材的场发射扫描电镜(FE-SEM)图。
图2为表面具有管径为60nm的TiO2纳米管阵列的钛材的FE-SEM图。
图3为表面具有管径为100nm的TiO2纳米管阵列的钛材的FE-SEM图。
图4为钛材表面经各步骤处理后其化学组成的X射线光电子能谱(XPS)表征图,其中A为表面具有TiO2纳米管阵列的钛材,B为TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材,C为TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材,D为表面具有TiO2纳米管阵列和VEGF修饰的钛材。
图5为本发明的表面功能化钛材对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分泌PGI2的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1、表面功能化钛材(TiO
2
纳米管管径为30nm)的制备
包括以下步骤:
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10分钟,37℃烘干,备用;
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液,作为电解液;再以步骤a预处理后的钛材为阳极,铂电极为阴极,置上述氟化铵电解液中,在10V的直流电作用下电解3小时,将氧化后的钛材用去离子水浸泡2小时,再用去离子水洗涤5次,氮气吹干,制得表面具有管径为30nm的TiO2纳米管阵列的钛材(钛材表面的FE-SEM图如图1所示,XPS谱图如图4A所示);
c、将APTES用无水己烷溶解制成浓度为0.01mol/L的溶液,将步骤b制得的表面具有TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中,室温下反应3小时,再用无水己烷洗涤3次,真空干燥4小时,制得TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材(钛材表面的XPS谱图如图4B所示);
将丁二酸酐用DMF溶解制成浓度为0.1mol/L的溶液,将制得的TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中,室温下反应24小时,再用DMF洗涤6次,真空干燥4小时,制得TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材;
将EDC和NHS用浓度为0.05mol/L、pH为5.5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/L EDC和5mmol/L NHS的溶液,将制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材浸入上述EDC和NHS的酸性混合溶液中,室温下反应1小时,再用去离子水浸泡1小时,之后用去离子水洗涤3次,干燥,制得TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材(钛材表面的XPS谱图如图4C所示);
d、将VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/mL的溶液,将步骤c制得的TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中,4℃反应过夜,再用PBS洗涤5次,干燥,制得表面具有TiO2纳米管阵列和VEGF修饰的钛材,即本发明所述表面功能化钛材(TiO2纳米管管径为30nm)(钛材表面的XPS谱图如图4D所示)。
实施例2、表面功能化钛材(TiO
2
纳米管管径为60nm)的制备
包括以下步骤:
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10分钟,37℃烘干,备用;
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液,作为电解液;再以步骤a预处理后的钛材为阳极,铂电极为阴极,置上述氟化铵电解液中,在20V的直流电作用下电解3小时,将氧化后的钛材用去离子水浸泡2小时,再用去离子水洗涤5次,氮气吹干,制得表面具有管径为60nm的TiO2纳米管阵列的钛材(钛材表面的FE-SEM图如图2所示);
c、将APTES用无水己烷溶解制成浓度为0.01mol/L的溶液,将步骤b制得的表面具有TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中,室温下反应3小时,再用无水己烷洗涤3次,真空干燥4小时,制得TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材;
将丁二酸酐用DMF溶解制成浓度为0.1mol/L的溶液,将制得的TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中,室温下反应24小时,再用DMF洗涤6次,真空干燥4小时,制得TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材;
将EDC和NHS用浓度为0.05mol/L、pH为5.5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/L EDC和5mmol/L NHS的溶液,将制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材浸入上述EDC和NHS的酸性混合溶液中,室温下反应1小时,再用去离子水浸泡1小时,之后用去离子水洗涤3次,干燥,制得TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材;
d、将VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/mL的溶液,将步骤c制得的TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中,4℃反应过夜,再用PBS洗涤5次,干燥,制得表面具有TiO2纳米管阵列和VEGF修饰的钛材,即本发明所述表面功能化钛材(TiO2纳米管管径为60nm)。
实施例3、表面功能化钛材(TiO
2
纳米管管径为100nm)的制备
包括以下步骤:
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10分钟,37℃烘干,备用;
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液,作为电解液;再以步骤a预处理后的钛材为阳极,铂电极为阴极,置上述氟化铵电解液中,在25V的直流电作用下电解3小时,将氧化后的钛材用去离子水浸泡2小时,再用去离子水洗涤5次,氮气吹干,制得表面具有管径为100nm的TiO2纳米管阵列的钛材(钛材表面的FE-SEM图如图3所示);
c、将APTES用无水己烷溶解制成浓度为0.01mol/L的溶液,将步骤b制得的表面具有TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中,室温下反应3小时,再用无水己烷洗涤3次,真空干燥4小时,制得TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材;
将丁二酸酐用DMF溶解制成浓度为0.1mol/L的溶液,将制得的TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中,室温下反应24小时,再用DMF洗涤6次,真空干燥4小时,制得TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材;
将EDC和NHS用浓度为0.05mol/L、pH为5.5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/L EDC和5mmol/L NHS的溶液,将制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材浸入上述EDC和NHS的酸性混合溶液中,室温下反应1小时,再用去离子水浸泡1小时,之后用去离子水洗涤3次,干燥,制得TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材;
d、将VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/mL的溶液,将步骤c制得的TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中,4℃反应过夜,再用PBS洗涤5次,干燥,制得表面具有TiO2纳米管阵列和VEGF修饰的钛材,即本发明所述表面功能化钛材(TiO2纳米管管径为100nm)。
实施例4、表面功能化钛材对HUVEC分泌PGI
2
的影响
无菌条件下获得离体4小时内的健康新生儿脐带,用Hank’s 液冲洗脐带外表面至无血丝残留,向脐带静脉管腔中注入NaCl溶液冲洗至洗出液无色,再向静脉管腔中注入质量分数为0.1%的Ⅱ型胶原酶消化液,两端结扎,37℃消化10分钟,收集消化液,1000r/min离心5分钟,弃上清,向沉淀中加入培养液,吹打10分钟至细胞悬浮均匀,获得原代HUVEC。将原代HUVEC进行传代培养,取第3代HUVEC,以细胞密度为1×104/cm2分别接种到实施例1~3制得的表面功能化钛材的表面,同时设置表面未处理的钛材、表面VEGF修饰的钛材、以及表面具有不同管径的TiO2纳米管阵列的钛材为对照,用RPMI 1640完全培养液在温度为37℃、CO2气体体积分数为5%的条件下孵育24小时,再将完全培养液更换成RPMI 1640不完全培养液(无酚红、无血清),继续培养24小时,收集不完全培养液,离心取上清,采用人PGI2酶联免疫吸附测定试剂盒测定HUVEC分泌的PGI2含量。
结果如图5所示,表面VEGF修饰的钛材相比表面未处理的钛材,表面功能化钛材相比表面具有TiO2纳米管阵列的钛材,其表面种植的HUVEC分泌的PGI2含量显著提高(P<0.01),说明在钛材表面单独引入VEGF可以提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标的表达;表面具有管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列的钛材相比表面未处理的钛材,其表面种植的HUVEC分泌的PGI2含量显著提高(P<0.05),说明在钛材表面单独引入管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列也可以提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标的表达;TiO2纳米管管径为30~60nm的表面功能化钛材与表面具有相应管径TiO2纳米管阵列的钛材之间的PGI2含量差值,明显高于表面VEGF修饰的钛材与表面未处理的钛材之间的PGI2含量差值(P<0.05),说明在钛材表面同时引入管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列和VEGF可以协同提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标的表达。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (2)
1.表面功能化钛材,其特征在于:钛材表面具有管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列,所述TiO2纳米管阵列表面还固定有血管内皮细胞生长因子即VEGF。
2.权利要求1所述表面功能化钛材的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10~30分钟,干燥备用;
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液,作为电解液;再以步骤a预处理后的钛材为阳极,铂电极为阴极,置上述氟化铵电解液中,在10~20V的恒电压下电解3小时,将氧化后的钛材用去离子水洗涤,干燥,制得表面具有管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列的钛材;
c、对步骤b制得的TiO2纳米管阵列表面进行硅烷化处理,再通过化学反应在TiO2纳米管阵列表面引入羧基,再利用碳二亚胺和琥珀酰亚胺使羧基活化;具体如下:
c1、将3-氨基丙基-三乙氧基硅烷即APTES用无水己烷溶解制成浓度为0.01mol/L的溶液,将步骤b制得的表面具有TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中,室温下反应3小时,再用无水己烷洗涤,干燥,制得TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材;
c2、将丁二酸酐用N,N-二甲基甲酰胺即DMF溶解制成浓度为0.1mol/L的溶液,将步骤c1制得的TiO2纳米管阵列表面硅烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中,室温下反应24小时,再用DMF洗涤,干燥,制得TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材;
c3、将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺即EDC和N-羟基琥珀酰亚胺即NHS用浓度为0.05mol/L、pH为5.5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/L EDC和5mmol/L NHS的溶液,将步骤c2制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材浸入上述EDC和NHS的酸性混合溶液中,室温下反应1小时,再用去离子水洗涤,干燥,制得TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材;
d、将VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/ml的溶液,再将步骤c3制得的TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中,4℃反应过夜,再用PBS洗涤,干燥,即制得表面功能化钛材。
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