CN103894328B - 在Ti材料表面组装携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在Ti材料表面组装携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒的方法。首先制备出载Ln的Hep-PLL纳米颗粒。然后在心血管材料表面制备DM涂层，利用DM与氨基可发生麦克尔加成和西弗碱反应的特性，将含有氨基的纳米颗粒共价固定至样品表面。最后利用纳米颗粒中的肝素能够特异性结合SDF-1α的特性，将SDF-1α组装于纳米颗粒表面，从而构建具有抗凝、抗增生及诱导内皮再生的多功能生物化修饰表面。本发明在心血管材料表面构建具有抗凝血、抗增生和诱导内皮再生特性的纳米颗粒修饰层，显著改善了材料的血液相容性、内皮及内皮祖细胞相容性，增强了抑制平滑肌增生的能力。
Description
技术领域
本发明涉及纳米颗粒制备技术和无机材料表面改性技术，特别涉及心血管植入物材料的表面生物化改性方法。
背景技术
心血管材料植入体内后因直接与血液接触，因此需要具有优异的抗凝血能力。此外，对于特殊的心血管植入物如血管支架等，在良好的血液相容性的基础上，还应具有抑制血管内膜组织过度增生、促进内皮层快速修复的能力。
通过对心血管材料表面进行生物化改性，赋予材料良好的抗凝血能力和血管内皮再生能力是改善其生物相容性的有效方法。而心血管材料往往为无机材料，不具备直接和生物分子发生反应的特性。多巴胺（DM）作为一种生物体内的神经传导物质，能够通过配位反应和自聚反应在心血管金属材料如不锈钢、钛及钛合金等表面形成牢固的聚DM层，且得到的聚DM层具有与含氨基的生物分子发生西弗碱反应或麦克尔加成反应的特性，因而在表面生物改性领域得到了广泛的关注。但聚DM层仍存在着血液相容性不足的缺点，限制了其在心血管材料领域中的应用。
肝素（Hep）是一种临床常见的抗凝血药物，常用于材料表面的抗凝修饰。此外，肝素可与多种具内皮细胞友好性的生物因子及细胞外基质蛋白结合，延长这些蛋白质在体内的活性和半衰期，促进内皮损伤修复。其中Hep结合性层粘连蛋白（Ln）是血管内皮基底膜中所特有的基质蛋白，能有效促进内皮细胞的粘附、迁移和生长；Hep结合性间质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）则是一种对骨髓源内皮祖细胞具有强烈趋化作用的趋化因子，可以有效刺激内皮祖细胞向损伤位点处聚集，诱导内皮损伤修复。
Hep分子结构中几乎不含氨基，因而不能直接固定在聚DM层表面。利用Hep与Ln的特异性结合作用，以及Hep能够与多聚赖氨酸（PLL）通过静电交互作用形成具有3D结构的纳米颗粒的特性，可制备出载Ln的Hep-PLL纳米颗粒。纳米颗粒中PLL和Ln均富含氨基，有利于纳米颗粒在聚DM层表面的固定。利用SDF-1α与Hep间能发生特异性结合的特性，可进一步将SDF-1α装载于纳米颗粒表面。
这种组装了携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒的表面可有效改善材料的血液相容性，抑制平滑肌过度增生，同时促进内皮损伤修复。而目前尚无将载层粘连蛋白的Hep-PLL纳米颗粒和SDF-1α组装于钛材料表面的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在心血管材料表面组携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒的方法，通过该方法对心血管材料表面进行生物化改性可有效提高材料的血液相容性，增强内皮细胞相容性并抑制平滑肌增生。
本发明实现以上目的采用的技术方案是，一种在心血管材料表面组装携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒的方法，其步骤为：
A、聚多巴胺沉积在Ti表面沉积聚多巴胺涂层，37℃烘干；
B、载层粘连蛋白的纳米颗粒的制备将浓度为30-300μg/ml的层粘连蛋白溶液，等体积滴加至浓度为10-30mg/ml的肝素钠溶液中,37℃静置1-3h；然后在室温和磁力搅拌条件下，将肝素钠和层粘连蛋白混合液等体积滴加至浓度为0.3～1.0mg/ml的多聚赖氨酸（PLL，MW150-300KDa）溶液中；
C、纳米颗粒固定将A步骤中沉积有聚多巴胺的样品浸泡于B步骤获得的纳米颗粒悬液中，在15-50℃振荡条件下反应6-24小时，分别用磷酸盐缓冲液（PBS）和双蒸水漂洗，保存待用；
D、SDF-1α组装将C步骤获得的样品浸入50-500ng/ml的SDF-1α溶液中，在4℃条件下静置反应8～24小时，PBS漂洗后即得。
本发明的反应过程与机理主要分为两个部分。第一部分为载Ln的纳米颗粒的制备。利用Ln与Hep的相互作用，首先使Ln与Hep充分结合；其次在pH=7.4的PBS体系中，利用Hep与PLL可发生静电交互作用形成纳米颗粒的特性，制备得到载Ln的Hep-PLL纳米颗粒。第二部分为纳米颗粒和SDF-1α在材料表面的组装。首先将样品浸泡于DM的Tris溶液中，DM中的儿茶酚基团与金属表面形成配位结合，或与高分子表面形成共价键合，并在有氧条件下交联自聚，从而在材料表面形成一层牢固的DM层。得到的DM聚合层具有二次反应性，其氧化得到的邻二琨基团可与纳米颗粒中的伯氨基发生西弗碱和麦克尔加成反应，从而将纳米颗粒共价固定在DM表面；其次，利用SDF-1α能与纳米颗粒中的肝素发生特异性结合的特性，可将SDF-1α组装于纳米颗粒表面。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
一、创造性地制备出载Ln的Hep-PLL纳米颗粒，利用纳米颗粒表面暴露的氨基可与聚DM层发生共价反应的特性，以及纳米颗粒中的肝素可特异性结合SDF-1α的特性，可将载Ln的纳米颗粒和SDF-1α组装于心血管材料表面。通过该种方法，可以有效地将Hep和层粘连蛋白固定于聚DM层表面，控制Hep的长期有效释放，同时增强SDF-1α的活性和释放时间，促进其内皮损伤修复效果。
二、组装了载Ln的纳米颗粒和SDF-1α的表面具有合理的调控血管内应答时序的能力。首先，肝素化的表面能有效抑制血栓形成和平滑肌过度增生；其次，SDF-1α植入后立即开始持续释放，有助于诱导骨髓内皮祖细胞和周围内皮细胞的动员和迁移；最后，纳米颗粒中的Ln有助于捕获这些迁移过来的内皮细胞和内皮祖细胞，促进其粘附和增殖，并诱导内皮修复。
三、纳米颗粒的制备工艺及固定方法均简单易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，效果显著。
四、纳米颗粒和SDF-1α在材料表面的组装均采用浸泡方式进行，可保证材料各个部分能均匀地固定上纳米颗粒，也有利于实现各种结构复杂的心血管植入器械的表面修饰，适用范围广。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明的方法作进一步详细的说明。
图1为本发明方法中携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒在心血管材料表面组装的各步骤示意图。
图2为（A）携Ln的纳米颗粒粒径尺寸分布；（B）携Ln的纳米颗粒在DM涂层表面固定后的AFM形貌图。
图3为样品表面肝素和SDF-1α累积释放检测结果。（A）肝素释放；（B）SDF-1α释放。
图4为样品表面血小板粘附1小时的扫描电镜图，不锈钢作为阳性对照。
图5为样品表面内皮、内皮祖及平滑肌细胞生长1天后的荧光染色结果，不锈钢作为阳性对照。
具体实施方式
实施例一
参见图1，本发明的第一种具体实施方式是，一种在Ti材料表面组装载层粘连蛋白的纳米颗粒和SDF-1α的方法，其步骤为：
A、聚多巴胺沉积在心血管金属Ti材料表面沉积聚多巴胺涂层，37℃烘干；
B、载层粘连蛋白的纳米颗粒的制备将浓度为30μg/ml的层粘连蛋白溶液，等体积滴加至浓度为10mg/ml的肝素钠溶液中,37℃静置1h；然后在室温和磁力搅拌条件下，将肝素钠和层粘连蛋白混合液等体积滴加至浓度为0.3mg/ml的多聚赖氨酸（PLL，MW150-300KDa）溶液中；
C、纳米颗粒固定将A步骤中沉积有聚多巴胺的样品浸泡于B步骤获得的纳米颗粒悬液中，在50℃振荡条件下反应24小时，分别用磷酸盐缓冲液（PBS）和双蒸水漂洗，保存待用；
D、SDF-1α组装将C步骤获得的样品浸入50ng/ml的SDF-1α溶液中，在4℃条件下静置反应8小时，PBS漂洗后即得。
实施例二
一种在Ti材料表面组装载层粘连蛋白的纳米颗粒和SDF-1α的方法，其步骤为：
A、聚多巴胺沉积在金属Ti材料表面沉积聚多巴胺涂层，37℃烘干；
B、载层粘连蛋白的纳米颗粒的制备将浓度为300μg/ml的层粘连蛋白溶液，等体积滴加至浓度为30mg/ml的肝素钠溶液中,37℃静置3h；然后在室温和磁力搅拌条件下，将肝素钠和层粘连蛋白混合液等体积滴加至浓度为1.0mg/ml的多聚赖氨酸（PLL，MW150-300KDa）溶液中；
C、纳米颗粒固定将A步骤中沉积有聚多巴胺的样品浸泡于B步骤获得的纳米颗粒悬液中，在15℃振荡条件下反应6小时，分别用磷酸盐缓冲液（PBS）和双蒸水漂洗，保存待用；
D、SDF-1α组装将C步骤获得的样品浸入500ng/ml的SDF-1α溶液中，在4℃条件下静置反应24小时，PBS漂洗后即得。
实施例三
一种在Ti材料表面组装载层粘连蛋白的纳米颗粒和SDF-1α的方法，其步骤为：
A、聚多巴胺沉积在金属Ti材料表面沉积聚多巴胺涂层，37℃烘干；
B、载层粘连蛋白的纳米颗粒的制备将浓度为200μg/ml的层粘连蛋白溶液，等体积滴加至浓度为20mg/ml的肝素钠溶液中,37℃静置2h；然后在室温和磁力搅拌条件下，将肝素钠和层粘连蛋白混合液等体积滴加至浓度为0.5mg/ml的多聚赖氨酸（PLL，MW150-300KDa）溶液中；
C、纳米颗粒固定将A步骤中沉积有聚多巴胺的样品浸泡于B步骤获得的纳米颗粒悬液中，在37℃振荡条件下反应12小时，分别用磷酸盐缓冲液（PBS）和双蒸水漂洗，保存待用；
D、SDF-1α组装将C步骤获得的样品浸入200ng/ml的SDF-1α溶液中，在4℃条件下静置反应12小时，PBS漂洗后即得。
Claims (2)
1.一种在Ti材料表面组装携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒的方法，其步骤为：
A、聚多巴胺沉积在心血管Ti材料表面沉积聚多巴胺涂层，37℃烘干；
B、携层粘连蛋白的纳米颗粒的制备将浓度为30-300μg/ml的层粘连蛋白溶液，等体积滴加至浓度为10-30mg/ml的肝素钠溶液中,37℃静置1-3h；然后在室温和磁力搅拌条件下，将肝素钠和层粘连蛋白混合液等体积滴加至浓度为0.3～1.0mg/ml的重均分子量为150-300KDa的多聚赖氨酸溶液中；
C、纳米颗粒固定将A步骤中沉积有聚多巴胺的样品浸泡于B步骤获得的纳米颗粒悬液中，在15-50℃振荡条件下反应6-24小时，分别用磷酸盐缓冲液PBS和双蒸水漂洗，保存待用；
D、SDF-1α组装将C步骤获得的样品浸入50-500ng/ml的SDF-1α溶液中，在4℃条件下静置反应8～24小时，PBS漂洗后即得。
2.根据权利要求1所述的在Ti材料表面组装携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒的方法，其特征在于：所述C步骤中的保存方法为表面湿润条件下，4℃冷藏保存。
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