CN111544648B - 一种蛋白修饰的plga微球及其构建的组织工程化神经 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白修饰的PLGA微球及以此构建的组织工程化神经。本发明将微球负载治疗周围神经损伤的活性物质并与组织工程化神经结合，研究显示，所制得的组织工程化神经能有效促进周围神经损伤后的神经再生。

Description

一种蛋白修饰的PLGA微球及其构建的组织工程化神经
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种蛋白修饰的PLGA微球及其构建的组织工程化神经，可用于周围神经缺损修复。
背景技术：
周围神经损伤是临床常见病，通常导致麻痹、瘫痪乃至丧失对相应身体部位的自主控制，严重影响了患者的生活质量。目前通过单纯缝合断端神经的外科手术修复效果并不令人满意，并且作为修复周围神经缺损金标准的自体神经移植，由于自体神经供体来源困难，移植造成二次损伤等诸多因素，临床应用受到限制。因此，构建合适的组织工程化神经以替代自体神经修复周围神经缺损，具有广阔的应用前景。
组织工程化神经一般由神经导管支架，结合应用多种生长因子或种子细胞等因素构成。而种子细胞常有来源困难，或者同种异体产生免疫原性等诸多问题，临床应用受到限制；将生长因子添加到支架材料中，需考虑根据各自理化特性维持稳定性和效率等问题。
因此开发新的具有修复神经损伤的生物活性物质，并将其与组织工程化神经结合，具有更广泛的临床应用价值。
发明内容
本发明前期研究(申请号为2020103158417的中国专利申请)公开了一种鸦胆子脂溶性提取物，研究显示鸦胆子脂溶性提取物能促进周围DRG神经元神经突起生长，以及促进周围神经系统胶质细胞施万细胞的分裂增殖，具有促进周围神经再生的作用。本发明在此基础上设计了一种蛋白修饰的PLGA微球，以鸦胆子脂溶性提取物作为活性物质，应用于组织工程化神经的构建。本发明将鸦胆子脂溶性提取物与层粘连蛋白修饰PLGA微球结合，制备具有缓释效果的层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物微球，该微球能显著促进体外周围DRG神经元突起生长。进一步地将含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球结合到丝素蛋白神经导管内的丝素蛋白纤维上，构建含层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物微球的组织工程化神经，体内实验证明该组织工程化神经能有效促进周围神经损伤后再生神经的髓鞘形成，为临床治疗周围神经损伤提供新的选择。
本发明具体技术方案如下：
一种蛋白修饰的PLGA微球，将PLGA与胶原蛋白、纤维连接蛋白、丝素蛋白、层粘连蛋白中的一种或几种通过交联剂交联。所述交联剂为化学交联剂或生物交联剂，优选生物交联剂，如京尼平、EDC/NHS碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、海藻酸钠等，优选京尼平。
优选的，所述蛋白与PLGA的质量比为1:1-10。更优选为1:3。
优选的，所述鸦胆子脂溶性提取物与PLGA的质量比为1-10:1。更优选为3-5:1。
本发明一个优选的方案为层粘连蛋白修饰的PLGA缓释微球。
本发明所述微球可负载治疗周围神经损伤的活性物质。所述活性物质选自细胞、多糖、多肽、蛋白、核酸、化合物或者天然提取物中的一种或几种。如神经营养因子类物质、细胞生长因子类物质、细胞外基质类物质、银杏提取物、天麻提取物、鸦胆子脂溶性提取物中的一种或几种。
本发明一个具体的示例，选择鸦胆子脂溶性提取物作为活性物质。优选采用鸦胆子脂溶性提取物为采用无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液提取得到，无水乙醇的体积百分为45％～85％。更优选混合溶液中无水乙醇的体积百分为75％。进一步的，可采用超声波提取。优选超声波频率20kHz，功率为750W，时间为60min，料液比为1∶5g/mL。
本发明所述微球表面光滑、粒径均一(bar＝5μm)；微球直径多集中在2.5μm。
本发明另一目的在于提供所述的蛋白修饰的PLGA微球在制备治疗周围神经缺损药物或者组织工程化神经中的应用。本发明将通过使用活性蛋白修饰PLGA，不仅能够提高PLGA缓释微球生物相容性和材料生物活性，所制得的微球具有很好的缓释能力，还能够促进神经细胞粘附生长。
本发明考察了使用不同浓度层粘连蛋白制备的层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球对体外培养DRG神经元突起生长的影响。结果显示使用1～3mg/ml层粘连蛋白制得的缓释微球能够促进DRG神经元突起生长，且使用1mg/ml层粘连蛋白制得的缓释微球促进DRG神经元突起生长的效果最好，显著优于较高浓度的9mg/ml，以及较低浓度的0.33mg/ml和0.11mg/ml的层粘连蛋白。
本发明另一目的在于提供一种负载蛋白修饰的PLGA微球的组织工程化神经，将负载治疗周围神经损伤的活性物质的蛋白修饰的PLGA微球采用吸附、涂覆、混合、包埋、交联剂交联、三维打印、静电纺丝中的一种或几种方式将负载于组织工化程神经内/外表面或内部。
所述组织工程化神经可采用现有技术下常规使用的材料，如丝素蛋白、壳聚糖、聚乙醇酸、聚己内酯、胶原、聚乳酸、明胶中的一种或几种，可采用现有技术下常规使用的形状，如导管，支架、手术缝线等，进一步的，组织工程化神经具有一定孔隙或内部具有模拟神经纤维。
优选的，本发明所述组织工程化神经为丝素蛋白神经导管，更进一步的，导管内还具有纤维。
本发明一个优选的方案：将层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球，通过生物交联剂京尼平固定到丝素蛋白纤维上，得到层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的丝素蛋白纤维。将含层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球的丝素纤维装配进入丝素蛋白神经导管中，丝素蛋白神经导管长度10mm，外径约为2.2mm，内径约为1.5mm。通常每根丝素蛋白神经导管中平行装入10根含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的丝素纤维，构建得到含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的组织工程化神经。
本发明将构建的含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的组织工程化神经，应用于修复大鼠坐骨神经缺损模型，术后12周观察再生神经髓鞘形成。结果显示将10mL浓度为10mg/mL鸦胆子脂溶性提取物负载于微球制得的微球实验组，髓鞘厚度优于阴性对照组；将10mL浓度为50mg/mL鸦胆子脂溶性负载于微球制得的微球实验组，轴突直径和髓鞘厚度与阴性对照未负载鸦胆子脂溶性提取物的层粘连蛋白PLGA缓释微球组相比，均有显著性差异。
本发明优点：
1.本发明使用分子量较大的50-75kDa PLGA制作微球，较大分子量能获得较长释放周期，适合周围神经再生初始关键阶段的需要，并且通过应用天然高分子蛋白或细胞外基质类蛋白修饰PLGA，利用这些蛋白自身的性质，促进神经损伤修复，制得的微球还具有缓释的效果，特别是层粘连蛋白修饰的PLGA微球缓释周期长，缓释效果最好。
2.本发明前期研究发现，通过特定比例无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液结合超声波的方法，提取制备的鸦胆子脂溶性提取物，能显著促进周围DRG神经元突起生长，以及促进周围胶质施万细胞分裂增殖，提示鸦胆子脂溶性提取物具有促进周围神经再生的作用。本发明将鸦胆子脂溶性提取物与层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球相结合，制备得到层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球，该微球具有生物相容性好，易修饰改性等优点，并且粒径均一，形态规则，能达到有效的缓释效果，释放周期较长。进一步将层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球结合到丝素蛋白神经导管内的丝素蛋白纤维上，成功构建含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的组织工程化神经，体内实验发现该组织工程化神经能有效促进周围神经损伤后再生神经的髓鞘形成。
附图说明
图1为CCK8检测鸦胆子脂溶性提取物的细胞毒性。
图2免疫组化检测鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的作用。(图2A不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的免疫组化染色形态图；图2B不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长长度的柱形统计结果图)。
图3EdU染色检测鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用。(图3A不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用的EdU染色形态图；图3B不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞增殖作用的柱形统计结果图)。
图4大鼠坐骨神经缺损模型应用鸦胆子脂溶性提取物后的坐骨神经功能指数。
图5HPLC检测不同蛋白修饰PLGA缓释微球鸦胆子脂溶性提取物的释放效应。
图6电镜观察微球与不同浓度层粘连蛋白修饰缓释微球对DRG神经突起生长的影响(图6A层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的透射电镜代表图；图6B层粘连蛋白-
PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球直径的柱形统计图；图6C为免疫荧光细胞化学染色柱形统计图)。
图7神经三色染色观察组织工程化神经修复后的再生神经髓鞘形成情况。(图7A神经三色染色的代表图；图7B神经三色染色统计结果)。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1鸦胆子脂溶性提取物的制备
鸦胆子脂溶性提取物参照CN2020103158417的公开的方法制得。
苦木科鸦胆子购自南通市中医院中药房，用去离子水洗净，烤箱60-65℃干烤2d后碾成粉末(300g)。精确称取鸦胆子干粉50g装入提取器皿中，室温(22℃)下，在不同浓度的无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液中浸泡48h。分组：95％无水乙醇+5％乙酸乙酯；85％无水乙醇+15％乙酸乙酯；75％无水乙醇+25％乙酸乙酯；65％无水乙醇+35％乙酸乙酯；55％无水乙醇+45％乙酸乙酯；45％无水乙醇+55％乙酸乙酯；35％无水乙醇+65％乙酸乙酯；25％无水乙醇+75％乙酸乙酯；15％无水乙醇+85％乙酸乙酯；5％无水乙醇+95％乙酸乙酯。分别将不同浓度的浸泡液进一步超声波辅助提取，超声波频率20kHz，功率为750W，时间为60min，料液比为1∶5g/mL。所得溶液用Whatman1号滤纸滤过。经过旋转蒸发仪(Buchi rotavaporR-124)在减压下进行旋蒸，40℃浓缩，将大部分溶剂除去后得到不同提取溶液提取的鸦胆子种子的提取物fraction A(约18-23g)，-20℃冰箱保存备用。
实施例2不同浓度的无水乙醇与乙酸乙酯混合溶液的提取效果
为了检测不同浓度的无水乙醇与乙酸乙酯提取得到的鸦胆子脂溶性混合物对神经细胞生长的作用，实验以神经细胞株PC12细胞为观察模型。
PC12细胞用DMEM完全培养基(含10％马血清，5％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养皿中培养，置于5％CO2、37℃培养箱内培养。每两天换一次液，待细胞生长至80％融合时传代。实验取对数生长期的PC12细胞，以5×104/ml接种细胞于24孔培养板中，每孔400μl。24h后换成含1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基。实验分别设阴性对照组即1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基，和分别用不同浓度的无水乙醇与乙酸乙酯混合溶液的提取物100ng/mL处理的实验组。提取物培养3d后，倒置显微镜下观察PC12细胞的形态学变化，每组随机取50个细胞，测量其阳性细胞率，突起长度和突起数目。
表1结果显示，在用不同浓度无水乙醇与乙酸乙酯混合溶液制备的鸦胆子脂溶性提取物，处理PC12细胞3d后，75％无水乙醇+25％乙酸乙酯的组合制备的提取物对阳性细胞率，突起长度和突起数目，与Control阴性对照组即1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基组比具有最为显著的促进神经细胞生长分化的作用(**p<0.01*p<0.05)。提示75％无水乙醇+25％乙酸乙酯是最佳的提取浓度组合。
表1不同浓度无水乙醇与乙酸乙酯混合溶液制备的提取物对PC12细胞作用
实验分组 阳性细胞率/％ 突起长度/μm 突起数量
Control 0.08±0.05 7.50±0.82 0.61±0.30
95％无水乙醇+5％乙酸乙酯 0.09±0.02 7.81±0.98 0.82±0.11
85％无水乙醇+15％乙酸乙酯 0.22±0.08 9.22±1.42 1.21±0.12*
75％无水乙醇+25％乙酸乙酯 0.85±0.09** 22.48±2.05** 2.82±0.31**
65％无水乙醇+35％乙酸乙酯 0.42±0.11* 12.34±1.64* 0.93±0.28
55％无水乙醇+45％乙酸乙酯 0.23±0.13 10.52±1.67 0.91±0.25
45％无水乙醇+55％乙酸乙酯 0.21±0.12 8.98±1.32 0.89±0.32
35％无水乙醇+65％乙酸乙酯 0.17±0.06 8.21±1.42 0.81±0.15
25％无水乙醇+75％乙酸乙酯 0.13±0.07 7.98±0.95 0.79±0.23
15％无水乙醇+85％乙酸乙酯 0.11±0.07 7.62±1.12 0.71±0.23
5％无水乙醇+95％乙酸乙酯 0.06±0.05 7.55±0.92 0.51±0.38
实施例3鸦胆子脂溶性提取物的细胞毒性检测
将实施例1制得的鸦胆子脂溶性提取物冻干过夜(EYELA FDU-1200,Tokyo)，制得的粉末装入15ml离心管中，4℃保存。用无菌去离子水配制10μg/mL的溶液，8000g离心10min，然后将溶液配制成实验所需的各浓度，之后用0.2mm nylon syringe filter(Millipore,USA)过滤除菌，用于培养的PC12细胞株中进行细胞毒性测试。CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所。
取对数生长期的PC12细胞消化计数重悬，调整细胞密度为5×105/mL，按每孔100μL接种于96孔板中；待细胞贴壁后，弃去培养基，0.01MPBS洗5min×2次。阴性对照组为1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基组，各实验组分别加入不同浓度20ng/mL，100ng/mL和500ng/mL的鸦胆子脂溶性提取物，分别在培养细胞24h，48h和72h。轻柔弃去培养基，加入10％CCK8培养基混合液，每孔100μL CCK8(即每100μl体积培养基加入10μl的CCK8)继续培养2h。酶标仪450nm，测定各组吸光度OD值，按下列公式计算相对存活率(％)＝[(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)]×100％，每组设8个复孔。
图1为CCK8检测鸦胆子脂溶性提取物的细胞毒性结果。CCK8检测结果显示：鸦胆子脂溶性提取物低浓度20ng/mL和中浓度100ng/mL在实验观察的72h内都没有明显的细胞毒性作用，而鸦胆子脂溶性提取物高浓度500ng/mL从实验观察时间点24h即与低浓度20ng/mL和中浓度100ng/mL培养相比呈现显著的细胞毒性，提示高浓度的鸦胆子脂溶性提取物对神经细胞有细胞毒性。纵坐标显示的为实验组各浓度鸦胆子脂溶性提取物培养PC12细胞的细胞活力，均为与阴性对照组为1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基组培养的PC12细胞活力的百分比。**p<0.01。
实施例4鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元的促轴突生长作用
取孕15天SD大鼠，10％水合氯醛(0.2mL/100g)腹腔注射麻醉，备皮，75％的酒精喷洒消毒。将胚胎从子宫取出放入盛有预冷D-Hank’s液的无菌皿中，置于冰上，解剖显微镜下取出背根神经节，尽可能剥除神经节表面的筋膜。将背根神经节用眼科剪剪碎至约0.5mm3大小，0.25％的胰蛋白酶37℃消化15min，血清终止消化，离心后单细胞悬液以5×105/mL的细胞密度种在放有圆玻片并预先包被PDL的24孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱，用含有10％FBS和90％DMEM培养。待细胞贴壁后换成阴性对照组为97％Neurobasal+2％B27+1％GluMAX培养基，各实验组分别加入不同浓度20ng/mL，100ng/mL和500ng/mL的鸦胆子脂溶性提取物，继续培养DRG神经元72h。
DRG神经元按上法培养72h后，吸去培养液，用0.01MPBS洗涤一次，加入4％多聚甲醛500μL，室温下固定30min，去除固定液，用0.01M PBS室温下洗涤10min×3次。用含10％羊血清、0.3％Triton X-100的0.01M PBS液在37℃条件下封闭60min，吸去封闭液。荧光免疫细胞化学分析：滴加一抗(goat anti-GAP-43polyclonal antibody，1:200)，4℃放置过夜，0.01M PBS洗涤10min×3次。滴加二抗(FITC donkey anti-goat IgG，1:200)，以Hoechst33342(5μg/ml)标记细胞核，室温、避光放置1h，0.01M PBS洗涤10min×3次。实验中设不加一抗的空白对照组，除步骤(3)以0.01M PBS代替goat anti-GAP-43polyclonalantibody，其余步骤同上。在激光共聚焦显微镜下(FITC激发波长：488nm，观察波长：500-535nm；Hoechst33342亚离子Ar激发波长：353-364nm，观察波长：460-480nm)，观察免疫荧光细胞化学检测结果。
图2为免疫组化检测鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的作用。(图2A不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的免疫组化染色形态图；图2B不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长长度的柱形统计结果图)。图2结果显示，与阴性对照组为97％Neurobasal+2％B27+1％GluMAX培养基以及低浓度提取物培养的DRG神经元相比，浓度为100ng/ml鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元GAP-43标记的轴突数量明显增加，长度明显增长。而高浓度500ng/ml鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元并没有促进作用，并且生长作用甚至于不及低浓度20ng/ml鸦胆子脂溶性提取物。提示合适浓度中浓度100ng/ml鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长有明显的促进作用。(**p<0.01*p<0.05)。
实施例5鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的促增殖作用
1.施万细胞的培养和纯化
取新生1-2天SD大鼠，冰冻麻醉后75％酒精消毒，经股骨后外侧肌间隙暴露分离取出坐骨神经，置于预冷HBSS溶液。解剖显微镜镜下仔细剔除神经外膜，放入200μl 1mg/ml胶原酶中剪碎，37℃消化30min，去除胶原酶加入0.125％胰酶37℃消化12min，终止消化，离心弃上清，以1×106细胞密度种至预先用PDL包被的培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中24h内换成加含有阿糖胞苷(1:1000)培养液，待细胞长至80％融合时，纯化细胞。用0.125％的胰酶消化成细胞悬液，血清终止消化后加入anti-thy1.1(1:1000)冰上孵育2h,离心弃上清，加入含有250μl rabbit complement和750μl DMEM培养液(1:3)的混合液37℃1h,重悬后以3×105细胞密度种至预先用PDL包被的培养皿中，同时在皿中加入2μM forsokolin和10ng/ml HRG，每3天换一次液。
2.EdU检测细胞增殖
不同浓度20ng/mL，100ng/mL和500ng/mL鸦胆子脂溶性提取物处理96孔板中施万细胞24h，广州锐博公司Cell-LightTM EdU DNA细胞增殖试剂盒检测，实验操作按说明书步骤操作。将细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；每孔加入100μL 50μM EdU培养基37℃孵育2h，弃培养基，PBS清洗5min×3次；每孔加入50μL4％多聚甲醛室温固定细胞15min，弃固定液；每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸孵育5min，弃甘氨酸溶液，PBS清洗5min×3次；每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)孵育10min，PBS清洗5min×3次；每孔加入100μL的
Figure BDA0002491737590000081
染色反应液，避光、室温孵育30min，弃染色反应液；加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗10min×3次，弃渗透剂；每孔每次加入100μL甲醇清洗5min×3次；加入5μg/mL Hoechst 33342反应液孵育30min后，弃染色反应液，PBS清洗10min×3次；每个样本随机选取5个20倍镜头下的低倍视野，Leica DC 300采集图像Leica QWin分析软件分析。
图3为EdU染色检测鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用。(图3A不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用的EdU染色形态图；图3B不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞增殖作用的柱形统计结果图)。结果显示不同浓度鸦胆子脂溶性提取物处理原代培养的施万细胞，与阴性对照组和低浓度20ng/ml相比，浓度为100ng/ml鸦胆子脂溶性提取物能显著促进施万细胞的增殖；而浓度为500ng/ml时反而对施万细胞增殖起明显的抑制作用，提示鸦胆子脂溶性提取物在合适的浓度100ng/ml能显著促进施万细胞的增殖(Scale bar 20μm)。(**p<0.01*p<0.05)。
实施例6鸦胆子脂溶性提取物促进大鼠坐骨神经缺损模型的神经功能恢复
动物实验及分组：SD大鼠随机分为4组(每组9只)：阴性对照生理盐水Control组，实验组为不同剂量鸦胆子脂溶性提取物5mg/kg，15mg/kg，30mg/kg和45mg/kg。模型制备与药物处理：复合麻醉剂(0.2-0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，左股骨部手术区域常规备皮、消毒、铺巾。取左股后正中切口，依次切开皮肤和筋膜，游离充分暴露坐骨神经行成10mm缺损，用硅胶管桥接坐骨神经。分别在硅胶管内加入Control阴性对照组即生理盐水，以及各实验组分别加入不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物5mg/kg，15mg/kg，30mg/kg和45mg/kg，常规缝合关闭切口。模型制备以及其后的饲养观察均在SPF级屏障系统内进行。
坐骨神经功能指数(sciatic nerve function index,SFI)是评价坐骨神经再生及神经功能恢复的一个直观且可靠的指标。分别于术后4W、8W和12W行足迹实验。将大鼠放置于宽约15cm，高约15cm，长约80cm的通道中，将白色宣纸折叠成与通道等长、等宽，置于木盒通道底部。大鼠双侧后足蘸红色印油后即放入到通道的一端，待其自行走向通道的另一端，宣纸上每侧足留下4-5个足印，选取清晰的正常侧与术侧的足印，测量足趾宽度(normaltoe spread,NTS；experimental toe spread,ETS)；足印长度(normal print length,NPL；experimental print length,NPL)；中间足趾宽度(normal intermediary toe spread,NIT；experimental intermediary toe spread,EIT)。SFI以0为正常值，－100为神经完全断离的指标。SFI计算公式如下：
SFI＝-38.3×[(EPL-NPL)/NPL]+109.5×[(ETS-NTS)/NTS]+13.3×[(EIT-NIT)/NIT]-8.8
图4为大鼠坐骨神经缺损模型在应用不同浓度的鸦胆子脂溶性提取物后的坐骨神经功能指数。结果显示，在低剂量5mg/kg时已开始显示对神经功能恢复有促进作用，在中剂量15mg/kg时具有最为显著的促神经功能恢复的作用，在剂量为30mg/kg时仍在最佳剂量范围之内，均显著优于阴性对照生理盐水组。然而，高剂量45mg/kg与阴性对照组生理盐水相比无显著差异。本发明所述鸦胆子脂溶性提取物的体内最佳促周围神经再生剂量为15mg/kg。(**p<0.01*p<0.05)。
实施例7不同蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的制备
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，乳酸：乙醇的摩尔比为53:47，分子量[MW]50-75kDa，Sigma)。将100mg的PLGA溶于1mL二氯甲烷，形成油相；将PLGA油相乳化形成3mL 7％(w/v)多聚聚乙烯醇(PVA)水溶液，超声1min制成乳液I。通过两步乳化法进一步将乳液I加入50mL的1％(w/v)多聚聚乙烯醇(PVA)水溶液(含2％异丙醇)，超声3min，制成乳液II。室温下缓慢搅拌过夜，13,000rpm，5min，4℃离心沉淀得到PLGA微球。
取适量胶原蛋白(Collagen)，纤维连接蛋白(Fibronectin)，丝素蛋白(Silkfibroin)和层粘连蛋白(Laminin)溶解于无菌纯水中，分别得到浓度为1mg/ml的胶原蛋白(Collagen)，纤维连接蛋白(Fibronectin)，丝素蛋白(Silk fibroin)和层粘连蛋白(Laminin)水溶液。室温边搅拌边缓慢加入制备好的0.4mL PLGA微球水溶液(10mg/mL)，同时加入5ml 0.8mg/ml京尼平作为辅助交联剂，持续反应90min。然后，将10mL浓度为10mg/mL鸦胆子脂溶性提取物分别加入到20mL浓度为1mg/ml上述四种蛋白修饰PLGA微球水溶液中充分混匀，4℃持续搅拌过夜，分别形成浅蓝色，不同蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球。
高效液相色谱法检测不同蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球，释放鸦胆子脂溶性提取物的释放效率。室温，分别于0，1，4，7，10和14天收集各组微球浸出液，并贮存于-20℃，待全部检测时间点收集齐后一起检测。色谱条件：岛津LC-6AD液相仪，检测溶液加入2mL去离子水:甲醇(4:6，v/v)中。色谱柱X酰胺柱，内壁直径150mm×4.6mm，颗粒直径5μm，孔直径
Figure BDA0002491737590000101
流动相I水，流动相II乙腈，流动相III甲酸铵水溶液(100mM，pH3.2)。检测参数设置如下：室温22℃，以甲醇:水＝6:4(v/v)为流动相，进行梯度洗脱，检测波长为266nm，加样量为20μL，设定流速为1mL/min。结果如图1所示。
图5HPLC检测结果显示，胶原蛋白(Collagen)和纤维连接蛋白(Fibronectin)修饰的PLGA微球在4d时释放效果即出现明显下降，丝素蛋白(Silk fibroin)修饰的PLGA微球在4-7d出现瀑布式释放，以上3种蛋白修饰的PLGA微球缓释效果较弱。层粘连蛋白(Laminin)修饰的PLGA微球释放鸦胆子脂溶性提取物，释放速率呈现缓慢均匀梯度释放，7d时能到达79％，在14d时仍有43％，缓释周期较长。结果表明层粘连蛋白修饰的PLGA微球缓释鸦胆子脂溶性提取物的效果最好，缓释效果更为理想。
实施例8不同浓度层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球对体外培养DRG神经元突起生长的影响
孕15天SD大鼠，常规10％水合氯醛(0.2mL/100g)腹腔麻醉。将胎鼠取出置于预冷D-Hank’s液中，解剖显微镜下取出背根神经节(DRGs)，用0.25％胰蛋白酶37℃消化15min，含血清培养基终止消化，离心后调整细胞密度5×105/mL接种在包被PDL的24孔板中，37℃，5％CO2培养箱，用含10％FBS的DMEM完全培养基培养。待细胞贴壁后换成97％Neurobasal+2％B27+1％GluMAX神经元培养基，阴性对照即用神经元培养基培养未加入缓释微球的Control组，各实验组为参照实施例7的方法(采用50mg/mL鸦胆子脂溶性提取物进行制备)分别采用0.11mg/ml，0.33mg/ml，1mg/ml，3mg/ml和9mg/ml层粘连蛋白制得的层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球，继续培养DRG神经元72h。
DRG神经元按上述方法分别培养72h后，吸去培养液，用0.01MPBS洗涤一次，加入4％多聚甲醛500μL，室温下固定30min，去除固定液，用0.01M PBS室温下洗涤10min×3次。用含10％羊血清、0.3％Triton X-100的0.01M PBS液在37℃条件下封闭60min，吸去封闭液。荧光免疫细胞化学分析：滴加一抗(goat anti-NF-H polyclonal antibody，1:250)，4℃放置过夜，0.01M PBS洗涤10min×3次。滴加二抗(FITC donkey anti-goat IgG，1:200)，以Hoechst33342(5μg/ml)标记细胞核，室温、避光放置1h，0.01M PBS洗涤10min×3次。实验中设不加一抗的空白对照组，除步骤(3)以0.01M PBS代替goat anti-NF-H polyclonalantibody，其余步骤同上。在激光共聚焦显微镜下(FITC激发波长：488nm，观察波长：500-535nm；Hoechst33342亚离子Ar激发波长：353-364nm，观察波长：460-480nm)，观察免疫荧光细胞化学染色结果，ImageJ软件测量DRG神经突起，One-way ANOVA统计并作图。
图6显示透射电镜观察微球形态，以及不同浓度层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球对DRG神经突起生长的影响。图6A为层粘连蛋白-PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的透射电镜代表图，结果表明制得的缓释微球表面光滑、粒径均一(bar＝5μm)；图6B为缓释微球直径统计柱形图，显示微球直径多集中在2.5μm；图6C为免疫荧光细胞化学染色柱形统计图，结果显示，采用1mg/ml层粘连蛋白制备的缓释微球组DRG神经突起长度达到3.8μm，与未加入缓释微球的Control组相比有显著性差异(**p<0.01)；采用3mg/ml层粘连蛋白制备的微球组，DRG神经突起长度为2.2μm，与未加入缓释微球的Control组相比，差异有显著性(*p<0.05)；均明显优于较高浓度的9mg/ml，以及较低浓度的0.11mg/ml和0.33mg/ml的层粘连蛋白制备的缓释微球组。提示使用1mg/ml层粘连蛋白修饰的PLGA缓释微球缓释鸦胆子脂溶性提取物的作用效果最好。
实施例9构建含鸦胆子脂溶性提取物的组织工程化神经
Bombyx mori蚕丝经0.05M Na2CO3水溶液煮沸30min×2次，充分脱丝胶，去离子水洗涤，室温晾干后即得丝素纤维(Silk Fibroin)，丝素纤维直径10-30μm，高温高压灭菌后备用。应用生物相容性优良的京尼平(genipin)作为交联剂，通过双官能团分别与丝素蛋白和PLGA侧链氨基作用，参照实施例7的方法(采用1mg/ml层粘连蛋白进行制备)分别制备阴性对照组即未负载鸦胆子脂溶性提取物的层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球以及不同浓度鸦胆子脂溶性提取物2mg/mL，10mg/mL，50mg/mL和250mg/mL制得的层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球。分别将10mL各组缓释微球固定到丝素蛋白纤维上，得到负载不同剂量鸦胆子脂溶性提取物的层粘连蛋白修饰PLGA微球的丝素蛋白纤维。
同时，将脱胶的丝素蛋白纤维溶解在三元溶剂体系CaCl2/H2O/EtOH溶液(摩尔比1:8:2)，80℃溶解1h。置纤维素管(截留分子量：12,000-14,000)用蒸馏水透析，室温，放置3d。透析所得溶液用旋转式蒸发器真空条件40℃浓缩。采用不锈钢铸型模具进行丝素蛋白导管成型，模具由套管和其内的支柱组成，套管和内柱之间的距离决定导管壁厚度。制得的丝素蛋白神经导管长度10mm，外径约为2.2mm，内径约为1.5mm。将该含层粘连蛋白修饰PLGA-鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的丝素纤维，装配进入丝素蛋白神经导管中，通常每根丝素蛋白神经导管中平行装入10根含鸦胆子脂溶性提取物缓释微球的丝素纤维，构建得到含鸦胆子脂溶性提取物的组织工程化神经。
实施例10含鸦胆子脂溶性提取物的组织工程化神经应用于修复大鼠坐骨神经缺损模型
动物实验及分组：SD大鼠随机分为5组(每组6只)：阴性对照Control组为未负载鸦胆子脂溶性提取物的层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球的组织工程化神经，实验组为实施例3制得的负载不同剂量鸦胆子脂溶性提取物的层粘连蛋白修饰PLGA缓释微球的组织工程化神经(分别选择2mg/mL，10mg/mL，50mg mL和250mg/mL的鸦胆子脂溶性提取物进行制备)。模型制备与药物处理：复合麻醉剂(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，左股骨部手术区域常规备皮、消毒、铺巾。取左股后正中切口，依次切开皮肤筋膜，游离并充分暴露坐骨神经行成10mm缺损。分别用阴性对照组以及各实验组的组织工程化神经组分别桥接断端坐骨神经，常规缝合关闭切口。模型制备以及其后的饲养观察均在SPF级屏障系统内进行。
术后12w，进行神经三色染色观察。需要配置以下染色试剂：(1)harris苏木素：将0.5g苏木素精加入5ml无水乙醇中溶解，将10g硫酸铝钾加入100m1双蒸水中溶解，将两种溶液混匀后加热至沸.即加入0.25g黄色氧化汞。待溶解后在冰水中冷却。过滤后加入5ml冰醋酸；(2)三色液：将0.3g固绿FCF，0.6g变色素2R及0.6g磷钨酸依次加入100m1双蒸水中溶解，再加入2m1冰醋酸，调节pH值至3.4；(3)0.3％冰醋酸溶液，在临用前配制。参照Meyer等实验方法并加以适当改良：(1)切片常规脱蜡至ddH2O(2)harris苏木素液染5分钟；(3)双蒸水冲洗5分钟，显微镜下控制蓝化程度；(4)三色液染30分钟；(5)0.3％冰醋酸冲洗2次，每次20秒钟；流水冲洗5-10分钟。至切片组织不脱色为止；(7)脱水、透明、中性树胶封片。神经三色染色形态计量分析的数据用STATA7统计分析软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若组间差异有统计学意义(p＜0.05)，进一步采用Turkey’s法进行两两比较，所得结果表示均数±标准差(X±SD)。
图7显示神经三色染色观察组织工程化神经修复后的再生神经髓鞘形成情况。图7A所示各组神经三色染色结果的代表图，其中a为Control组，实验组b为2mg/mL，c为10mg/mL，d为50mg mL和e为250mg/mL鸦胆子脂溶性提取物制备的组织工程化神经组(bar＝5μm)。图7B神经三色染色统计结果显示，使用浓度为10mg/mL鸦胆子脂溶性提取物制得的组织工程化神经，再生神经髓鞘厚度优于阴性对照Control组(**p<0.01)，使用浓度为50mg/mL鸦胆子脂溶性提取物制得的组织工程化神经，再生神经的轴突直径和髓鞘厚度与阴性对照Control组相比均有显著性差异(**p<0.01，*p<0.05)。

Claims (9)

1.一种蛋白修饰的PLGA微球，其特征在于PLGA与层粘连蛋白通过交联剂交联。
2.如权利要求1所述的微球，其特征在于所述层粘连蛋白与PLGA的质量比为1:1-10。
3.如权利要求2所述的微球，其特征在于所述层粘连蛋白与PLGA的质量比为1:3。
4.如权利要求1所述的微球，其特征在于所述微球负载有治疗周围神经损伤的活性物质。
5.如权利要求4所述的微球，其特征在于所述活性物质选自细胞、多糖、多肽、蛋白、核酸或者天然提取物中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的微球，其特征在于所述活性物质选自神经营养因子类物质、细胞生长因子类物质、细胞外基质类物质、银杏提取物、天麻提取物、鸦胆子脂溶性提取物中的一种或几种。
7.如权利要求1-6任一项所述的蛋白修饰的PLGA微球在制备治疗周围神经损伤药物或者组织工程化神经中的应用。
8.一种负载蛋白修饰的PLGA 微球的组织工程化神经，其特征在于将权利要求1-6任一项所述的蛋白修饰的PLGA微球负载于组织工程化神经内/外表面或内部。
9.如权利要求8所述的组织工程化神经，其特征在于采用吸附、涂覆、混合、包埋、交联剂交联、三维打印、静电纺丝中的一种或几种方式将蛋白修饰的PLGA微球负载于组织工化程神经内/外表面或内部。
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