CN106046340B - 一种聚合物、含有该聚合物的水凝胶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚合物、含有该聚合物的水凝胶及其应用。本发明聚合物的结构如式(Ⅰ)所示，其中，m与n的比值为6：2.4；本发明的水凝胶含有本发明的聚合物。本发明的水凝胶表面呈现疏松多孔结构，孔隙较为均匀且相互连通，满足支架材料的生物学要求；另外，本发明的水凝胶具有良好的生物相容性、安全、方便，可负载神经干细胞，用来修复脊髓损伤。

Description

一种聚合物、含有该聚合物的水凝胶及其应用
技术领域
本发明涉及一种聚合物、含有该聚合物的水凝胶及其应用，具体涉及一种可负载神经干细胞修复脊髓损伤的聚合物、含有该聚合物的水凝胶及其应用。
背景技术
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的神经系统损伤性疾病，以高致残率(美国全瘫占67％)、高耗费(美国为5～7万美元/患者/年)、低死亡率(<5％)为特点，严重威胁人类健康，给社会和家庭带来了沉重的负担[1]。目前针对SCI的治疗手段主要是激素和手术，这些疗法对SCI所引起的多种神经功能障碍无明显效果。因此，针对SCI的预防、治疗和康复仍是当今医学界的一大难题，许多研究都在该领域进行了不懈的探索。
干细胞治疗脊髓损伤曾一度取得了可喜成绩。相关研究已经证实，神经干细胞(NSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)、雪旺式细胞(Schwann cells)、嗅鞘胶质细胞(OECs)、胚胎干细胞(ESCs)等均可作为种子细胞治疗脊髓损伤。其中，NSCs作为神经元和神经胶质细胞的共同前体细胞，是神经系统发育的基础，理论上是最理想的治疗脊髓损伤的种子细胞。但是应用不论哪类干细胞移植修复SCI的治疗策略，虽然在一定程度上能够修复SCI，但临床实际应用的效果却并不显著。究其原因，主要是由于SCI后，一连串的病理生理过程“瀑布”样爆发，包括血管崩解、水肿、免疫细胞的渗透、炎症介质的参与、髓鞘抑制因子的释放、胶质疤痕的产生等，形成了损伤局部复杂恶劣的微环境。再者，损伤可持续激活免疫细胞，包括小胶质细胞，淋巴细胞和巨噬细胞等，继而产生次级损害。以上因素，均会对移植进入的干细胞的存活造成不利影响，进而影响SCI的修复。因此，改变损伤周围的微环境(细胞外基质成分)，使干细胞更易于存活以及向神经元方向分化，将是SCI治疗中的新策略。
近年来，随着医学、材料科学、组织工程学的发展，以生物材料、种子细胞和生长因子为基本要素的神经组织工程策略，将有望克服单纯干细胞移植方法的缺点，实现真正意义上的脊髓损伤修复与重建，是SCI治疗研究中的最新热点，而水凝胶就是其中的典型代表。水凝胶作为一种生物材料，其合成原料主要有两类：一类是天然来源，比如蚕丝蛋白、壳聚糖等，具有来源广泛、成本低、良好的生物相容性并富含生物活性靶点，但是由于其力学性能差、生物降解速率快以及潜在的免疫原性等缺陷，限制其广泛使用；另一类为化学合成的水凝胶，由于是人工合成，所以可以根据移植的靶器官的力学性能，很方便的对合成的各个环节进行调控，直到其与靶器官的机械性能完全适配。化学合成的材料最大的缺点是毒性比较大，植入人体会产生一些毒性作用，但就这一点，就会使得其所有的优点黯然失色。我们的主要研究目的，是尝试寻找一种水凝胶，使它既具有天然原材料的生物相容性，又具有合成材料的机械性能，使之优势互补。PEG材料的水凝胶因其优异的生物相容性、力学性能与微观形貌可控性而被广泛研究。不过，由于PEG是一种相对惰性的聚合物材料，细胞不能黏附，不能发挥细胞与材料之间的相互作用，必须对PEG材料进行改性后才能有效利用。对PEG的改性多是共价结合一些生物活性分子包括短肽、细胞外基质来源的蛋白等。
本课题前期研究，单纯应用干细胞移植及将PF-127水凝胶作为慢病毒载体治疗脊髓损伤受到了一定效果。但是该水凝胶仅仅负载病毒，不能负载细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种聚合物和具有良好生物相容性、安全、方便的含有该聚合物的水凝胶。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述聚合物的水凝胶的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种聚合物，其结构如式(Ⅰ)所示：
其中，m与n的比值为6：2.4。式(Ⅰ)所示聚合物的制备方法为：将三亚甲基碳酸酯(TMC)、丙烯酰氯(Ac)和聚乙二醇(PEG)加入二氯甲烷溶剂中，以高活性的强碱—1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)为催化剂，于28℃的温度下反应10h。本制备方法以大分子引发剂—聚乙二醇引发三亚甲基碳酸酯和丙烯酰氯发生开环聚合反应，同时该方法采用了强碱性催化剂DBU。该制备方法以二氯甲烷作为溶剂，可防止丙烯酰氯单体中的双键在聚合过程中发生交联。在所述条件下，聚合反应具有可控性，制得的共聚物具有比较窄的分子量分布系数(约为1.24)。优选地，所述聚乙二醇为PEG10K。
本发明的聚合物表面呈现疏松多孔结构，孔隙较为均匀且相互连通，满足支架材料的生物学要求。
作为本发明所述聚合物的优选实施方式，所述聚合物的分子量为12000～13000。分子量即指相对分子质量。
另外，本发明还提供了一种含有上述聚合物的水凝胶。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述水凝胶还含有短肽，所述短肽与所述聚合物中全部双键的摩尔比为(10～30)：100。研究表明，用短肽进行修饰时，随着水凝胶中短肽浓度的增高，神经干细胞黏附的数目也逐渐增多，但是，水凝胶的黏弹力相对比较低(这可通过水凝胶的黏弹力测试证实)，故细胞培养液中的营养成分在短肽含量较高的水凝胶中不能很好的流通，细胞代谢废物也不能很好的排出，故细胞在该水凝胶孔隙中的新陈代谢会受到一些不良影响，结果就会导致一些活力比较差的细胞出现死亡。综合考虑细胞粘附量与细胞存活率，我们将短肽与聚合物中全部双键的摩尔比选择为(10～30)：100。
上述含有短肽的水凝胶的制备方法为：(1)将聚合物溶解于1×PBS(PH＝7.4)中，配置成5％的聚合物溶液；(2)加入短肽，搅拌均匀，反应30min，紫外光照消毒30min；(3)加入经过滤物理方法除菌消毒后的DTT。
作为本发明所述水凝胶的更优选实施方式，所述短肽为RGD肽。RGD肽是一类广泛存在于生物体内的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，它可以作为整合素与其配体相互作用的识别位点来介导细胞与细胞外基质以及细胞与细胞之间的相互作用，同时还具有信号传导功能。RGD肽兼有神经干细胞增殖分化的起点的角色，是当前促进细胞黏附最有效的多肽序列。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述短肽与所述聚合物中全部双键的摩尔比为30：100。神经干细胞在所述水凝胶中的黏付数量较高。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述水凝胶还含有透明质酸，且所述水凝胶中，聚合物、短肽的质量之和与透明质酸质量的比为1:1～2:1。小分子的透明质酸(HA)作为细胞外基质的主要组分之一，其参与细胞内外电解质的调控，发挥着物理和分子信息过滤器的作用；并且，透明质酸对细胞迁移、增殖、分化及吞噬功能有一定的促进作用。本发明的水凝胶由于含有透明质酸，其使神经干细胞的存活率得到提高。但由于透明质酸是带负电荷的，这与正常情况下细胞膜表面的电荷相斥，所以水凝胶含有透明质酸后会导致细胞黏附数量减少。当聚合物、短肽、透明质酸选择所述特定的质量比时，神经干细胞在水凝胶中的黏附数量稍微减少，但是存活率提高的比例程度更高，故在水凝胶中真正存活的能用于分化的有效细胞数还是增多的。
上述含有透明质酸的水凝胶的制备方法为：按照所述质量比，将透明脂酸加入含有短肽和聚合物的水凝胶中，混匀。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述水凝胶中，短肽与聚合物中全部双键的摩尔比为30：100，且聚合物、短肽的质量之和与透明质酸质量的比为2:1。大量研究表明，在所述特定含量的水凝胶中，神经干细胞的黏付量多、细胞存活率高；该特定含量的水凝胶更有利于神经干细胞向神经元方向分化且其毒性低。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述水凝胶中，短肽与聚合物中全部双键的摩尔比为30：100，且聚合物、短肽的质量之和与透明质酸质量的比为1:1。
最后，本发明还提供了上述水凝胶在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的应用。本发明的水凝胶可负载神经干细胞，用于修复脊髓损伤。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的水凝胶表面呈现疏松多孔结构，孔隙较为均匀且相互连通，满足支架材料的生物学要求。另外，本发明的水凝胶具有良好的生物相容性、安全、方便，可负载神经干细胞，用来修复脊髓损伤。
附图说明
图1为本发明采用核磁共振波普表征实施例1所述聚合物的结果图；
图2为本发明采用凝胶渗透色谱分析实施例1所述聚合物的结果图；
图3为本发明水凝胶的扫描电子显微镜图；
图4为本发明采用扫描电子显微镜观察水凝胶的数据结果图；
图5为本发明神经干细胞黏付在不同水凝胶上的显微镜图；
图6为本发明每单位面积水凝胶上黏付的神经干细胞的计数统计结果图；
图7为本发明大鼠神经干细胞在不同水凝胶上活死染色的荧光显微镜图；
图8为本发明大鼠神经干细胞在不同水凝胶上活死比例图；
图9为本发明大鼠神经干细胞在水凝胶中的的活力检测结果；
图10为本发明大鼠神经干细胞在不同水凝胶表面分化的荧光显微镜图；
图11为本发明大鼠神经干细胞在不同水凝胶表面的分化比例图；
图12为本发明大鼠神经干细胞在不同时间取出的Gel 1浸提液中成球的显微镜图；
图13为本发明在不同时间取出的Gel 1浸提液中每10000个细胞所形成的细胞球数量的计数图；
图14为本发明实施例14所述斑马鱼胚胎的照片图；
图15为本发明实施例14所述对斑马鱼的胚胎进行拍照后的统计分析结果图；
图16为本发明实施例16所述HE染色后镜下观察大鼠的肝肾的结构图；
图17为本发明实施例16所述用Luxol Fast Blue对实验组进行染色并且用HE和曙红复染的显微镜图；
图18为本发明应用神经轴突的特异性染色marker NF200对脊髓切片进行染色观察的照片图；
图19为本发明应用神经轴突的特异性染色marker NF200对脊髓切片进行染色观察的结果图；
图20为本发明用TUNEL法检测凋亡细胞的结果图；
图21为本发明凋亡细胞的计数结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例中，所用到的材料如下：
聚乙二醇(PEG10000)：AR，Fluka，使用前120℃，真空脱水2h；三亚甲基碳酸酯(TMC,分子量为102)：广东惠州华阳医疗器械有限公司，使用前乙酸乙酯重结晶；1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU，99％，分子量152.2)、1,1,1-三羟甲基乙烷(97％，分子量120)、丙烯酰氯(96％，分子量90.5)、二硫苏糖醇(DTT，99％，分子量154.2)，上海晶纯实业有限公司；氯甲酸乙酯(98％，分子量108.5)，上海安耐吉试剂公司；考马斯亮蓝(G-250)，百灵威科技有限公司；丝裂霉素C(MMC，德国罗氏诊断有限公司)；牛血清蛋白(BSA)；嗜热丝孢菌脂肪酶(hermomyces lanuginosus lipase,10万U/g，降解液浓度3.3万U/g)，sigma；2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，商品名IrgAcure 2959(I2959，纯度99.9％)，巴斯夫中国有限公司；透明质酸(山东福瑞达医药集团公司)。
实施例中，TMC表示三亚甲基碳酸酯、Ac表示丙烯酰氯，PEG表示聚乙二醇，DBU表示1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，HA表示透明质酸，NSCs表示神经干细胞
实施例1
本发明实施例的一种聚合物，本实施例所述聚合物的结构式为：
其中，m与n的比值为6：2.4，聚合物的分子量为12000～13000。
本实施例所述聚合物的制备方法为：将三亚甲基碳酸酯(TMC)、丙烯酰氯(Ac)和聚乙二醇(PEG10K)加入二氯甲烷中，以高活性的强碱—1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)为催化剂，于28℃的温度下反应10h。
我们采用核磁共振波普和凝胶渗透色谱表征了上述聚合物的结构，聚合物在CDCl3中的1H NMR谱如图1所示，聚合物的凝胶渗透色谱分析(以THF作为洗脱液)结果如图2所示，图2中，a表示本实施例的聚合物，b表示PEG10K。
图1中的a～f与上述结构式中的a～f相对应，对图1氢谱进行质子峰归属分析的结果为：化学位移在5.2～6.5ppm(a峰，m)归属于Ac链段侧基双键质子峰；化学位移在4.1ppm左右(c峰，s)归属于Ac链段上6个亚甲基质子峰；化学位移位移在1.1ppm左右(f峰，s)归属于Ac链段侧甲基质子峰；化学位移在4.3ppm左右(b峰，t)归属于TMC上直接与酯基相连的亚甲基质子峰；化学位移值在2.0～2.2ppm(e峰，m)归属于TMC链段中-CH2CH2CH2-亚甲基质子峰；化学位移在3.65ppm左右(d峰，s)归属于PEG中亚甲基质子峰。核磁共振波普进一步证明了在DBU催化下，大分子引发剂PEG成功地引发单体TMC和Ac开环聚合。通过谱图中各特征峰的积分面积可计算共聚物的数均分子量和聚合物中各单元摩尔比，计算可知聚合物的结构式中m与n的比值为6：2.4。
图2的凝胶渗透色谱分析结果表明，本实施例聚合物的流出时间比PEG10K短，表明其分子量比PEG10K明显增大，且为单峰，分子量分布窄，表明在DBU催化下，PEG10K成功引发了TMC和Ac开环聚合。
实施例2
本发明水凝胶的一种实施例，本实施例所述水凝胶为实施例1所述聚合物。
实施例3
本发明水凝胶的一种实施例，本实施例所述水凝胶含有实施例1所述聚合物和短肽，所述短肽为RGD肽，短肽与所述聚合物中全部双键的摩尔比为10％(即10:100)。
本实施例所述水凝胶的制备方法为：(1)将聚合物溶解于1×PBS(PH＝7.4)中，配置成5％的聚合物溶液；(2)加入短肽，搅拌均匀，反应30min，紫外光照消毒30min；(3)加入经过滤物理方法除菌消毒后的DTT。
实施例4
本发明水凝胶的一种实施例，本实施例所述水凝胶含有实施例1所述聚合物和短肽，所述短肽为RGD肽，短肽与所述聚合物中全部双键的摩尔比为20％(即20:100)。
本实施例所述水凝胶的制备方法同实施例3。
实施例5
本发明水凝胶的一种实施例，本实施例所述水凝胶含有实施例1所述聚合物和短肽，所述短肽为RGD肽，短肽与所述聚合物中全部双键的摩尔比为30％(即30:100)。
本实施例所述水凝胶的制备方法同实施例3。
实施例6
本发明水凝胶的一种实施例，本实施例所述水凝胶含有实施例1所述聚合物、短肽和透明质酸，所述短肽为RGD肽，短肽与所述聚合物中全部双键的摩尔比为30％(即30:100)，聚合物、短肽的质量之和与透明质酸质量的比为2:1。
本实施例所述水凝胶的制备方法为：按照所述质量比，将透明质酸加入含有短肽和聚合物的水凝胶中，混匀；其中含有短肽和聚合物的水凝胶的制备方法同实施例3.
实施例7
本发明水凝胶的一种实施例，本实施例所述水凝胶含有实施例1所述聚合物、短肽和透明质酸，所述短肽为RGD肽，短肽与所述聚合物中全部双键的摩尔比为30％(即30:100)，聚合物、短肽的质量之和与透明质酸质量的比为1:1。
本实施例所述水凝胶的制备方法同实施例6。
实施例8
本发明水凝胶的一种实施例，本实施例所述水凝胶含有实施例1所述聚合物、短肽和透明质酸，所述短肽为RGD肽，短肽与所述聚合物中全部双键的摩尔比为30％(即30:100)，聚合物、短肽的质量之和与透明质酸质量的比为1.5:1。
本实施例所述水凝胶的制备方法同实施例6。
实施例9 六种水凝胶的微观形貌
我们采用扫描电子显微镜考察了实施例2～实施例7所述6六种水凝胶的微观形貌，考察结果如图3～4所示。从图中可以看出水凝胶表面呈现疏松多孔结构，孔隙较为均匀且相互连通。由此结果表明，利用DTT交联机理制备的本发明的水凝胶具有较为均匀的多孔结构，满足支架材料的生物学要求。
图3和图4中，A表示实施例2所述水凝胶；B表示实施例3所述水凝胶；C表示实施例4所述水凝胶；D表示实施例5所述水凝胶；E表示实施例6所述水凝胶；F表示实施例7所述水凝胶。
实施例10 大鼠NSCs在不同水凝胶上的黏附
a.大鼠NSCs的培养：实验前一天准备高压好无菌手术器械(手术弯盘两个，显微剪1把、眼科剪2把、止血钳4把、手术剪3把、200目滤网一个)，60度烤箱烤干备用，高压消毒好PBS。实验动物由中山大学医学院实验动物中心提供)。孕14天的SD大鼠，10％水合氯醛麻醉后75％的酒精浸泡除菌，生物安全柜内操作剪开腹部皮肤及肌肉，取出胚胎置入1×PBS液体中。取出胚胎脑组织在PBS中漂洗，剥离脑膜及血管，剪碎成约0.2mm×0.2mm大小的碎片，200目铜网过滤，以1000rpm离心5min，弃上清。加入DMEM/F12(1:1)、B27(1:50)、bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，反复轻柔吹打多次成单细胞悬液，接种于25cm培养瓶中后放入37℃、5％CO2的培养箱中培养。3～4d半量加液1次，1周左右时间传代，常规倒置显微镜观察细胞的生长状态。
b.大鼠NSCs的鉴定：
(1)实验前一天，用75％酒精处理玻片，之后放入12孔板中，并用多聚赖氨酸包被。
(2)取P2代的培养3天的神经球，接种在多聚赖氨酸预处理的玻片上。
(3)4小时后，加入新鲜配置的4％多聚甲醛固定细胞10min，PBS洗片5min×3次，弃去PBS。
(4)加入0.3％的Triton X-100对细胞进行透化处理20min，PBS洗片5min×3次，弃去PBS。
(5)应用5％的BSA封闭30min，PBS洗片5min×3次，弃去PBS。
(6)稀释一抗Nestin(巢蛋白)(1:300鼠来源)，滴到玻片上，4℃冰箱湿盒内孵育过夜。
(7)PBS洗片3次，每次5min，弃去PBS。
(8)加入荧光二抗(1:500goat anti mouse)，PBS洗片5min×3次。
(9)加入1μg/ml的DAPI染核15min，1×PBS洗片3次，每次5min。
(10)避光晾干玻片，滴加抗淬灭荧光封片剂封片。
(11)荧光显微镜下观察，拍照。
c.大鼠NSCs在不同水凝胶上的黏附、增殖:
因为细胞黏附是细胞生长的最基本的前提，为了让细胞在水凝胶中更好的生长，所以我们首先研究NSCs在哪中水凝胶上黏附的数量较多。考察大鼠NSCs在不同水凝胶上的黏附的步骤为：
(1)取P2代的NSCs，制成单细胞悬液。
(2)应用活死染色试剂将细胞染成绿色(具体步骤见活死染色实验步骤)，以106/ml的细胞密度接种到六种水凝胶的表面。
(3)4h后用PBS将凝胶表面的细胞冲洗一遍，未黏附的细胞被冲洗下来。
(4)显微镜下观察凝胶上细胞的黏附数量，随机选取5个视野进行拍照。
(5)进行细胞计数统计，以均数±标准差(Mean±SD)表示。
将NSCs接种在实施例2～实施例7所述6种不同的水凝胶表面，其中，实施例2所述水凝胶表示为单纯PTAE组、实施例3所述水凝胶表示为
PTAE+10％Peptide组、实施例4所述水凝胶表示为PTAE+20％Peptide组、实施例5所述水凝胶表示为PTAE+30％Peptide组、实施例6所述水凝胶表示为Gel 1组、实施例7所述水凝胶表示为Gel 2组。
上述步骤(4)显微镜下观察的结果如图5所示(图5中A表示实施例2所述水凝胶；B表示实施例3所述水凝胶；C表示实施例4所述水凝胶；D表示实施例5所述水凝胶；E表示实施例6所述水凝胶；F表示实施例7所述水凝胶)，上述步骤(5)进行细胞计数统计的结果如图6(比例尺为50μm)所示。
结果显示，NSCs在实施例2～实施例7所述6种不同的水凝胶中的黏附数量依次为2003±165/cm2，4001±173/cm2，6000±140/cm2，8120±124/cm2，7649±185/cm2，7536±179/cm2，结果表明神经干细胞在实施例5所述水凝胶(PTAE+30％Peptide组)中黏附数量比实施例2所述水凝胶(单纯PTAE组)、实施例3所述水凝胶(PTAE+10％Peptide组)、实施例4所述水凝胶(PTAE+20％Peptide组)增高(P<0.01)；PTAE+30％Peptide组的水凝胶组细胞的黏附数量与实施例6所述水凝胶(Gel 1组)、实施例7所述水凝胶(Gel 2组)相比稍微增多(P<0.05)，Gel 1、Gel 2组间比较并没有明显的差异(P>0.05)。
实施例11 大鼠NSCs在水凝胶中的活死染色实验
在水凝胶细胞黏附结果的基础之上，实验选定黏附细胞数量比较高的三组水凝胶(实施例10所述PTAE+30％Peptide组、Gel 1组和Gel 2组)进行了细胞的活死染色检测，大鼠NSCs在水凝胶中的活死染色步骤如下：
(1)取定量聚合物溶于1×PBS(PH＝7.4)中，配置成5％的聚合物溶液；
(2)加入定量短肽(RGDC/IKVAVC＝1：1，[peptide]：[Ac]＝30:100，短肽的最终浓度为5.89mmol/L)，搅拌均匀，反应30min，紫外光照消毒30min；
(3)加入定量的过滤物理方法除菌消毒后的DTT([DTT]：[Ac]＝70:100)；
(4)取300μl的聚合物溶液放入48孔板中，同时加入500μl的106/ml的细胞悬液，37℃无菌环境下反应30min，形成水凝胶3D负载NSCs的状态；
(5)将实施例2所述水凝胶设置为对照组；
(6)细胞在水凝胶中存活72h之后，换液，加入活死染色试剂，荧光显微镜下进行细胞活死情况的观察；
(7)荧光显微镜分别在372nm激发光(蓝色通道)、488nm激发光(绿色通道)和550nm激发光(红色通道)三个模式下进行拍照，然后用显微镜自带的软件将对应通道图片进行叠加；
(8)对于活死细胞染色，图片上如果显示绿色的话表示细胞存活，如果显示红色的话则表示细胞死亡。我们对活细胞和死细胞分别进行计数，然后计算出细胞存活率，其计算公式为：细胞存活率＝活细胞个数/总的细胞个数×100％。或者计算活死比例。细胞活死比＝活细胞个数(绿)/死的细胞个数(红)×100％。
大鼠神经干细胞在不同水凝胶上活死染色的荧光显微镜图见图7；在不同水凝胶上大鼠神经干细胞活死比例见图8。
在细胞在水凝胶中生存72h之后，荧光显微镜下进行观察，活细胞被成功染成了绿色，红细胞被染成红色。统计分析显示：在Gel 1中，NSCs的活死存活率93±0.23％，含30％Peptide的水凝胶和Gel 2中NSCs的存活率分别为77±0.21％，和83±0.33％在Gel 1中NSCs的活细胞的比例最高(P<0.05)。
实施例12 大鼠NSCs在水凝胶中的的活力检测
大鼠NSCs在水凝胶中的的活力检测的步骤如下：
(1)将细胞接种在实施例2～实施例7所述6种不同的水凝胶中；
(2)细胞在水凝胶中存活24h、48h、72h后应用PBS将细胞冲洗出来，收集含有细胞的PBS；
(3)将收集的含有细胞的PBS离心，用完全培养基重悬后接种在96孔板上，每孔90μL的细胞悬液；并设置空白对照孔(只含有培养基和CCK-8试剂而没有细胞)和0加药对照孔(只有正常细胞和CCK8溶液)。
(4)在96孔板中每孔加入10μL的CCK-8试剂；37度培养箱中孵育4h；
(5)将96孔板置于酶标仪内，450nm处检测细胞的吸光度值；
(6)按照CCK-8试剂盒的检测说明书进行数据分析。
细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100％；
A(加药)：具有水凝胶中生长的细胞、CCK8溶液的孔的吸光度；
A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度；
A(0加药)：具有CCK8溶液、正常细胞的孔的吸光度。
大鼠NSCs在水凝胶中的的活力检测结果如图9所示(图9中A表示实施例2所述水凝胶；B表示实施例3所述水凝胶；C表示实施例4所述水凝胶；D表示实施例5所述水凝胶；E表示实施例6所述水凝胶；F表示实施例7所述水凝胶)，由图可见，在实施例2～实施例7所述6种不同的水凝胶的检测结果较空白对照具有统计显著性。
实施例13 大鼠NSCs在水凝胶表面的分化实验
水凝胶中NSCs活死染色实验结果的基础之上，为了进一步研究存活细胞的分化方向，本课题设计进行不同水凝胶上NSCs的分化实验。
(1)将大鼠的NSCs制成105/ml的单细胞悬液，平均接种在3种水凝胶表面；
(2)细胞黏附后在水凝胶表面生长，每3天更换一次分化培养基，代细胞长到低14天时进行免疫荧光染色；
(3)免疫荧光的染色应用的抗体一抗β3-tublin(标记神经元)和GFAP(标记星型胶质细胞)。
(4)荧光显微镜下拍照，ImageJ图片分析软件进行图片分析。
大鼠神经干细胞在不同水凝胶表面分化的荧光显微镜图如图10所示；大鼠神经干细胞在不同水凝胶表面的分化比例图如图11(*表示P<0.05，比例尺：25mm)所示。
研究结果表明：标记神经元的β3-Tublin在PTAE+30％Peptide组、Gel 1组和Gel 2组三种水凝胶上的分化比例分别为22.38％±0.21、43.74％±0.42、26.85％±0.30，而标记星胶质细胞的GFAP在PTAE+30％Peptide组、Gel 1组和Gel 2组三种水凝胶上的分化比例分别为：71.56％±0.51、56.42％±0.86、63％±0.45。统计结果显示：β3-Tublin在Gel 1上表达比在PTAE+30％Peptide的水凝胶和Gel 2上的表达高(P<0.05)，相应的GFAP在Gel 1上表达就比在含PTAE+30％Peptide的水凝胶和Gel 2上的表达低(P<0.05)。这些实验结果证明水凝胶在含PTAE+30％Peptide水凝胶、Gel 1和Gel 2三种水凝胶上均可以分化，但是向神经元以及神经胶质细胞分化的比例不同，Gel 1是最利于NSCs向神经元方向分化的水凝胶。由于神经元是脊髓损伤治疗中需要补充的细胞，而新型胶质细胞主要形成胶质疤痕，应该越少越好，这些结果证明：Gel 1是治疗脊髓损伤的理想水凝胶。
实施例14 Gel 1(实施例6所述水凝胶)对NSCs的成球能力检测
(a)Gel 1浸提液的提取
(1)将实施例6所述水凝胶5mL置于无菌的45个离心管内，分为1d组，7d组，14d组，28d组，100d组，其中每组9只；
(2)每个离心管用75％的酒精5ml浸泡30min×5次，然后在每个含有水凝胶的离心管内加入无菌的人工脑脊液(ACSF)5ml，无菌封口膜密封离心管后，置于37℃恒温箱中；
(3)对照组设为DMSO；
(4)分别在接下来第1天，7天，14天，28天和100天数取出对应离心管中的浸提液，每个离心管取出2mL；
(5)为了消除组内降解液之间的差异，将组内各管中的浸提液混匀之后放在一个离心管中，并做好标记。
(b)Gel 1浸提液对NSCs的成球能力检测
(1)将P2代的NSCs重悬之后，细胞计数板下计数，调整细胞密度均匀一致；
(2)将细胞接种在12孔板内，每孔1mL，接种24h后在每孔中加入0.2mL的浸提液，观察24h、48h、72h后NSC的成球情况；
(3)显微镜下计数任意5个视野下的细胞球数量，计数每10000个细胞所形成的细胞球的数量。
观察72小时后，NSCs在不同时间取出的Gel 1浸提液中成球的显微镜图见图12，在不同时间取出的Gel 1浸提液中每10000个细胞所形成的细胞球的数量如图13所示。图12和图13中，A表示对照组，B表示第1天取出浸提液，C表示第7天取出浸提液，D表示第14天取出浸提液,E表示第28天取出浸提液，F表示第100天取出浸提液。
Gel 1的浸提液对NSCs成球能力检测结果为：水凝胶的浸提液加入NSC的培养基之后，各组NSC细胞均生长状态良好，细胞与对照组相比，均有一定的成球生长趋势，而且随着时间点的推迟，神经球的体积不断增大，24h、48h、72h显微镜下计数，任意5个视野下的细胞球数量与对照组相比统计无明显差异。
实施例15 Gel 1(实施例6所述水凝胶)浸提液对斑马鱼胚胎形成的作用研究
(1)将实施例6所述水凝胶(Gel 1)分别置于PBS中，浸泡1天、7天、14天、28天和100天，得到5份Gel 1浸提液；
(2)配置5组分别含上述5份Gel 1浸提液的斑马鱼营养水，每组营养水中浸提液的含量分别为10％，20％，30％，同时将DMSO作为阳性对照；
(3)每组挑选30个斑马鱼卵，将斑马鱼卵置于各组斑马鱼营养水中，同时将斑马鱼卵置于PEG提取物中，以作对比；
(4)分别在斑马鱼胚胎形成后(hpf)24hpf,48hpf,72hpf和96hpf对斑马鱼胚胎进行拍照后进行统计分析。
分别在24hpf,48hpf,72hpf和96hpf对斑马鱼的胚胎进行观察，斑马鱼胚胎在5组含Gel 1浸提液的营养水和PEG提取物中拍照图片如图14所示，对斑马鱼的胚胎进行拍照后的统计分析结果如图15所示。图14和图15中，A表示浸泡1天所得浸提液，B表示浸泡7天所得浸提液，C表示浸泡14天所得浸提液，D表示浸泡28天所得浸提液，E表示浸泡100天所得浸提液；图14中F表示PEG提取物。
由图可见，Gel 1的浸提液的三个浓度组队斑马鱼的胚胎形成几乎没有影响，各组当中斑马鱼死亡数量为0-1个，甚至到其胚胎形成时(96hpf)，各组的死亡数均不超过3个；而在阳性对照组，斑马鱼的胚胎却在形成早期就出现了畸形不生长。到96hpf时，30个胚胎几乎全部死亡。由图14中F可知，PEG提取物导致斑马鱼的胚胎死亡，这种材料存在毒性。
实施例16 Gel 1植入脊髓损伤的大鼠体内之后对大鼠的肝、肾毒性的作用研究
(1)首先制作大鼠脊髓损伤模型，将水凝胶负载神经干细胞联合移植至脊髓损伤模型动物体内，具体方法为：购买雌性SD大鼠(中山大学实验动物中心)，体重180g-220g，施行T9-10脊髓全横断手术。大鼠随机分组，每组12只：对照组(PBS对照组)；单纯NSC组；单纯水凝胶(Gel)组；Gel+NSC组(Gel 1+NSC或Gel 2+NSC)。动物手术前用10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔进行麻醉，无菌条件下一次切开皮肤，皮下组织，分离肌肉，解剖显微镜下切除锥板，打开硬脊膜，暴露T9-10脊髓，以T10为中心，头向及尾向均切除1mm脊髓组织，使脊髓纵向形成约2mm长的损伤裂隙。用无菌棉球充分止血，在脊髓裂隙中用微量注射器分别植入PBS、NSC、Gel 1+NSC或Gel 2+NSC，各组移植总量均为20μL。植入后解剖显微镜下依次缝合硬脊膜，肌肉和皮肤，无菌敷料包扎切口。术后一日两次人工协助膀胱排尿排便，直至大鼠的膀胱自主排尿功能恢复。其他照常规喂饲。
(2)移植后1周、4周、8周取大鼠腹腔静脉血，检测动物的肝肾功能；
(3)对大鼠肝肾进行取材后进行切片的HE常规染色，观察动物肝及肾的结构，HE染色的步骤为：取致死剂量的水合氯醛麻醉动物；快速打开胸腔，暴露心脏，剪去右心耳，采取左心室至升主动脉灌注；先快速灌注37℃生理盐水100mL；继续灌注4℃保存的含4％多聚甲醛300m1，先快后慢，共约1h；取大鼠脊髓，4％多聚甲醛后固定过夜；30％高糖溶液脱水冷藏保存；组织用OCT包埋，冰冻切片机切取10μm纵切或横切标本。所有标本冻存于-20℃直至使用。(体内试验时用)各组的脊髓节段标本进行常规HE染色，标本在光学显微镜下观察。纵切矢状面的脊髓标本应用尼氏染色进行神经元计数，每只大鼠随机取8-10张切片行细胞计数。
上述步骤(3)中对大鼠进行多聚甲醛灌注后，肝肾进行取材后行切片的HE染色，镜下观察Gel+NSC组大鼠的肝(A-C)肾(D-F)结构如图16所示。研究发现大鼠的肝肾功能的化验指标均在正常的范围之内，大鼠的肝脏可以看见完整的肝小叶，肾小球的结构也比较完整。说明移植该水凝胶之后再至少8W内没有对大鼠的肝肾功能有不良的影响。
联合移植减小脊髓损伤面积的研究：联合移植8W后处死动物，取出脊髓进行HE切片染色，四组大鼠的脊髓损伤部位均有不同程度的恢复。用Luxol Fast Blue对实验组进行染色并且用HE和曙红复染的显微镜图如图17(比例尺为200mm)所示。其中，A表示对照组，B表示单纯NSCs组，C表示Gel 1+NSCs组；D表示Gel 2+NSCs组。对脊髓中央空洞的面积进行测量后，发现Gel 1+NSCs组脊髓损伤断面处的空洞面积最小，平均为223336.96±123μm2(P<0.05)，Gel 2+NSCs组脊髓损伤断面处的空洞面积243653.47±146μm2，单纯NSCs组大鼠236843.87±184μm2，较Gel 2联合NSCs组还更好(P<0.05)。对照组脊髓损伤断面处的空洞面积最大为249589.52±198μm2(P<0.05)，由上述数据可以得知，Gel 1联合NSCs(Gel 1+NSCs组)移植对脊髓损伤的修复效果最好。
联合移植促进神经纤维的贯通(NF200)的研究：由于脊髓损伤功能的恢复的一个有力的证据就是神经轴突的恢复生长，为了进一步观察脊髓损伤端段周围神经轴突是否恢复，实验设计应用神经轴突的特异性染色marker NF200对脊髓切片进行染色观察，NF200的免疫荧光结果如图18和图19所示。图18和图19中，control表示对照组。四组(对照组、单纯NSC组、单纯水凝胶组；Gel+NSC组)中NF200的阳性细胞数目分别为38.8±3.2％；43.3±5.3％；70.3±2.5％；57.8±4.5％。四组之间的统计学均有差异(P<0.05)。此实验说明，联合移植治疗脊髓损伤的策略能使脊髓损伤局部的神经轴突的结构恢复。
联合移植减少损伤部位细胞的凋亡的研究：我们设计了将不同组的水凝胶移植进入大鼠脊髓损伤的模型，结果表明SCI大鼠的结构和功能均得到了好的修复。为了进一步阐明SCI移植后的修复机制，我们对不同处理组的SCI大鼠8W后的脊髓切片进行了凋亡检测。脊髓的凋亡细胞采用Promega Dead End Tunel System试剂盒进行分析与计数。用TUNEL法检测的冰冻脊髓切片均是在脊髓损伤5天后取材的，具体按照按说明书的步骤进行，在荧光显微镜观察，观察的结果如图20。TUNEL阳性细胞的计数比照尼氏染色法中涉及到的方法进行。凋亡细胞的计数结果如图21所示。结果发现：对照组(图中用contol表示)、单纯NSC组、Gel 1+NSCs组、Gel2+NSCs组脊髓切片细胞的凋亡率分别为：11％±0.041；5.2％±0.032；2.5％±0.014；3％±0.023。其中，对照组与其他三组相比凋亡率最高(P<0.01)，单纯NSC组与Gel 1+NSCs、Gel 2+NSCs组比较凋亡率增高(P<0.05)，而Gel 1+NSCs组、Gel 2+NSCs组的凋亡率并没有明显的差异(P>0.05)。该实验结果表明：移植NSCs、Gel 1+NSCs、Gel 2+NSCs均能减少SCI区域的细胞凋亡数，均对SCI具有一定的修复效果，以水凝胶Gel 1+NSCs移植效果最为显著。
实施例17 BBB评分及电生理检测
(a)BBB评分：大鼠脊髓横断模型制作成功后，按照BBB评分标准对大鼠肢体功能恢复情况进行评估。记录时要将大鼠置于开放区域、容许大鼠自行活动，寻找2名完全不知情实验分组的人员观察大鼠的躯干、尾巴及后肢的行为表现进行打分，自手术第二天开始记录，以1w为周期，连续观察8w。
(b)脊髓诱发电位(SCEP)
(1)采集SCEP信号时的参数设置为：电刺激器输出刺激脉冲间隙50μs，频率为5HZ，电流为10mA。
(2)脊髓全横断3w后，用10％水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉大鼠，立体定位仪进行固定。完全暴露T1-L1椎体，将刺激电极插入到T6-7的棘间韧带，引导电极插入到T12-L1的棘间韧带，参比电极置于皮下。每只大鼠取100次SCEP反应的平均值。
(3)按以上设置的参数用AD-board(PCI-6221)对SCEP负波的幅度进行检测和记录。
联合移植促进大鼠的功能恢复和电生理指标进一步证明联合移植治疗脊髓损伤的策略不仅能使脊髓损伤局部的神经轴突的结构恢复，功能也有一定的恢复。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种水凝胶，其特征在于：所述水凝胶含有聚合物和短肽，所述聚合物的制备方法为：将三亚甲基碳酸酯、丙烯酰氯和聚乙二醇加入二氯甲烷溶剂中，以高活性的强碱1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯为催化剂，于28℃的温度下反应10h；所述短肽为RGD肽,所述短肽与所述聚合物中全部双键的摩尔比为30：100；所述水凝胶还含有透明质酸，且所述水凝胶中，聚合物、短肽的质量之和与透明质酸质量的比为2:1。
2.如权利要求1所述的水凝胶，其特征在于：所述聚合物的分子量为12000～13000。
3.如权利要求1～2任一项所述的水凝胶在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的应用。
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