CN109971015B - 一种细菌纤维素膜的脱水方法及人造血管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细菌纤维素膜的脱水方法，将细菌纤维素膜放置于‑5~8℃的环境中。本发明的脱水方法能耗低，不涉及有机溶剂的使用，能同时大批量处理细菌纤维素膜，且脱水量可控，从而能够控制细菌纤维素膜的力学性能。本发明的人造血管抗血栓性能好，长期通畅性高，且制备方法简单。

Description

一种细菌纤维素膜的脱水方法及人造血管及其制备方法

技术领域

本发明具体涉及一种细菌纤维素膜的脱水方法及人造血管及其制备方法。

背景技术

由动脉粥样硬化引起的心血管疾病是目前发病率、死亡率最高的疾病之一，严重危害人类的健康。通常这些疾病需要采用血管置换或搭桥等外科手术进行治疗。据报道全球每年进行血管移植手术的患者达数百万例，因此临床上对血管替代材料的需求也越来越多。目前，应用合成高分子材料（如膨体聚四氟乙烯（ePTFE）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等）制备的大口径人工血管（内径>6 mm）已在临床上得到应用并取得较好疗效。然而，这些材料在替代小口径血管（内径< 6 mm，如冠状动脉血管）上仍存在很多问题，特别是材料的顺应性与人体自身血管的匹配性较差，以及血管移植后表面生成血栓或内膜增生导致通畅率较低等问题限制了它们的临床应用。

细菌纤维素（Bacterial cellulose, BC）是由微生物合成的纳米级天然高分子水凝胶。BC具有高持水性和透气性、良好的生物相容性和其它天然材料无法比拟的力学性能。除在造纸、食品领域，在附加值较高的骨支架、软骨支架、人工血管、人工皮肤等方面也得到了较好应用。BC 材料独特的三维网络结构能够为细胞向其内部生长与增殖提供空间，使其有望成为小口径人工血管的替代材料。目前，国外成功制备了BC 基小口径人工血管，并陆续将其植入到动物体内以替代动物的部分颈动脉（包括大鼠、猪和羊）。经过一段时间（3 个月到1 年不等）后，将移植的BC 血管取出并进行宏观和微观的分析，结果显示大部分BC 血管可以形成类似天然血管的三层结构。但是，BC 血管较低的通畅率限制了其在临床上的应用。

在过去的研究中，为解决异体材料植入生物体内所引起的血栓问题，研究者们发展了多种材料表面改性方法以提高材料的血液相容性从而抑制血栓的形成。其中，由内皮细胞形成的血管内壁是目前为止知道的唯一血液相容性材料；内皮细胞能够合成和分泌多种抗凝活性分子（如肝素），可有效阻止血栓的形成以及血管再狭窄的发生。因此，从仿生角度出发，原位诱导材料表面内皮化是解决血栓形成及内膜增生的一种有效方法，也是最终解决小口径人工血管植入后血栓形成问题、防止内膜增生和提高通畅率的根本途径。根据这一思路，研究者们通过多种方法在材料表面（如不锈钢血管支架、聚己内酯）固定了特异性生物功能分子（细胞特异性抗体（如抗CD34抗体）、生长因子（如血管内皮生长因子VEGF）、细胞黏附分子（如RGD多肽、REDV多肽等）），以促进内皮细胞或内皮祖细胞在其表面黏附、分化、增殖并形成功能性内膜。相比而言，通过对BC材料进行改性以提高其内皮化性能的研究较少，特别是关于修饰后的BC血管在体外、体内的抗凝血性能及其通畅率的研究目前尚无报道。

除抗凝血能力有待提高，BC的力学性能对最终其成功应用起重要作用。研究表明，BC的含水量越低，其纳米纤维相互平行排列，纤维之间将形成更多的氢键，这使得BC力学性能大幅度提高，即BC的力学性能受其含水量的影响。因此调控BC的含水量可以调整其力学性能，以应对人造血管领域对力学的要求。BC的含水量高达99%，其中约10%的水呈自由水状态，而其它大部分水都是以结合水状态存在，因此需要较大能耗脱除这些结合力较大的水。目前脱除BC水的方法有加热（40℃以上），机械挤压，离心，滤纸吸收，有机溶剂交换，冷冻干燥（-20℃以下）等方法。但上述的这些方法均需要较高的能耗，或一些特殊仪器，并对环境有污染，且无法大批量处理。

发明内容

发明人意外发现BC膜在-5~8℃下放置时能够很好的脱除水分，可能原因是温度降低后，细菌纤维素膜和水的相容性变差，从而使得两者相分离。该脱水方法能耗低，而且不涉及有机溶剂的使用，同时能大批量处理BC膜，并且能够通过调控处理时间来调控BC的含水量，进而对其性能特别是力学性能进行控制。

进一步地，发明人首先对BC材料本体进行部分脱水处理，以提高其力学性能；其次在处理的BC膜上进行表面改性，来促进其原位内皮化以提高其抗血栓性能，最终提高其长期通畅性。具体地，采用TEMPO法使BC膜表面富含-COOH，并将内皮细胞/内皮祖细胞的配体分子固定在改性后的材料表面。

因此，本发明所要解决的一个技术问题是提供一种能耗低的细菌纤维素膜的脱水方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种长期通畅性高的人造血管及其制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种细菌纤维素膜的脱水方法，将细菌纤维素膜放置于-5~8℃的环境中。

优选地，控制环境温度为-4~2℃。

进一步优选地，控制环境温度为-4~-1℃。

最为优选地，控制环境温度为-3℃。

本发明中，环境温度可以通过冰箱进行控制。

优选地，将所述的细菌纤维素膜置于密封容器中。

本发明中，可以通过控制放置时间来控制细菌纤维素膜的脱水程度，从而制备出不同含水量的细菌纤维素膜。其中，采用本发明的脱水方法，最高可脱除95%的水分。

优选地，所述的细菌纤维素膜由G. xylinus在Hestrin–Schramm培养基中，25~30℃下培养1~3天，然后通过双蒸水和0.05~0.15M的氢氧化钠水溶液在55~65℃下清洗3~5小时，再用质量浓度为1~3%的十二烷基硫酸钠溶液在55~65℃下清洗10~14小时，最后用Milli-Q水清洗得到。

进一步优选地，按质量百分含量计，所述的Hestrin–Schramm培养基的组成为：

葡萄糖 1.5~2.5%，

酵母提取物 0.3~0.6%，

柠檬酸 0.1~0.2%，

蛋白胨 0.3~0.6%，

磷酸氢二钠 0.1~0.5%，

水 96~97%。

本发明的另一个目的是提供一种人造血管，包括上述脱水方法制得的细菌纤维素膜、以及接枝在所述的细菌纤维素膜表面的内皮细胞配体分子和/或内皮祖细胞配体分子。

优选地，通过所述的细菌纤维素膜上的羧基与所述的内皮细胞配体分子和/或内皮祖细胞配体分子的氨基连接。

本发明的第三个目的是提供一种上述人造血管的制备方法，首先对所述的细菌纤维素膜的表面进行羧基化处理，然后接枝含有氨基的内皮细胞配体分子和/或内皮祖细胞配体分子，制得所述的人造血管。

优选地，通过TEMPO法将细菌纤维素自身大量的羟基改性为羧基。

优选地，所述的细菌纤维素膜的表面羧基化后，采用激活剂对羧基进行活化。

进一步优选地，所述的激活剂为碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。

优选地，含有氨基的内皮细胞配体分子和/或内皮祖细胞配体分子可以为REDV多肽、抗CD34抗体等。

本发明通过调控配体分子的浓度可以改变其在表面的固定数量。

由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的脱水方法能耗低，不涉及有机溶剂的使用，能同时大批量处理细菌纤维素膜，且脱水量可控，从而能够控制细菌纤维素膜的力学性能。

本发明的人造血管抗血栓性能好，长期通畅性高，且制备方法简单。

附图说明

图1为实施例1脱水前后的BC膜的SEM形貌图；

图2为实施例1脱水前后的BC膜的力学性能图；

图3为实施例1、对比例1、对比例2放置后的BC膜的正面照片；

图4为实施例1放置后的BC膜与冰进行分离的过程图；

图5为对比例1放置后的BC膜的立体图；

图6为对比例2放置后的BC膜的立体图；

图7为实施例2和对比例3的人造血管表面粘附的HUVEC细胞的结果图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可从商业途径获得。

实施例1

1. 制备BC膜

G. xylinus（ATCC 53582）在Hestrin–Schramm（HS）培养基，28℃培养。培养基组成：葡萄糖20克，酵母提取物5克，柠檬酸1.5克，蛋白胨5克，磷酸氢二钠2.7克，1升水。培养2天后，即可获得表面更加平滑的BC膜。通过双蒸水和0.1 M NaOH 水溶液在60℃清洗4小时以去除杂质。再用2% 十二烷基硫酸钠（SDS）在60℃下清洗12小时。最后用Milli-Q水清洗。

2. 低温脱水处理

将上述获得的BC膜36.99 g置于密封袋中，然后放置于冰箱中，调节冰箱温控约-3℃，放置12小时得到脱水后的BC膜1.87 g，经计算，脱水率为95%。

脱水前后的BC膜的SEM图如图1所示，其中，A为脱水前的BC膜，B为脱水后的BC膜。从图1可见，脱水后的BC膜表面纳米纤维形貌更加清晰、整齐。

通过万能拉伸试验机检测脱水前后的BC膜的力学性能，结果如图2所示，其中BC为脱水前的BC膜，BCd为脱水后的BC膜，从图2可见，脱水后BC膜的断裂拉应力由原来的1.88MPa提高到15.29 MPa。

对比例1

与实施例1基本相同，不同之处在于：将12.55 g BC膜在室温（约23℃）下放置12小时，放置后的BC膜的重量9.30 g，经计算，脱水率为26%。

对比例2

与实施例1基本相同，不同之处在于：将14.50 g BC膜在约-20℃下放置12小时，放置后的BC膜的重量13.01 g，经计算，脱水率为10%。

实施例1、对比例1、对比例2放置后的BC膜的正面照片如图3所示，实施例1放置后的BC膜与冰进行分离的过程图如图4所示，对比例1放置后的BC膜的立体图如图5所示，对比例2放置后的BC膜的立体图如图6所示；其中，对比例1的BC膜呈厚胶状，实施例1的BC膜呈薄膜状，对比例2的BC膜呈厚固态。

实施例2

1. 实施例1脱水后的BC膜的表面羧基化处理

首先将TEMPO （0.13 mmol）和NaBr（4.7 mmol）溶解于20 mL 水中，其次，向其中加入5.65 mmol的NaClO，并用1 N HCl调pH=10，最后将实施例1脱水后的BC膜置于此溶液中，反应2分钟后用乙醇淬灭反应。

2. BC材料表面接枝多肽

首先，将上述羧基化处理后的BC膜置于EDC（0.1 M）和NHS（0.4 M）的乙酸溶液（10mM，pH 4.5）进行活化，其次将活化膜取出并置于0.5 mg/mL REDV的PBS （pH 8.2）溶液当中制备REDV改性BC膜表面，最后用乙二胺 （1 M，pH 8.5）处理10分钟，以去除未反应完的NHS基团。

对比例3

基本与实施例2相同，不同之处在于：采用对比例2处理后的BC膜进行羧基化处理和表面接枝多肽。

首先，用75%乙醇分别灭菌实施例2和对比例3的人造血管20分钟，用PBS清洗3次，之后将人造血管分别浸泡在EGM-2 MV培养基中并于37℃培养箱中过夜。其次，将HUVEC细胞按每孔细胞的种植密度为5 x 10⁵个/孔，并在37℃培养箱中培养，第二天换半液，之后每天全部换液。培养三天后，取出培养基并依次进行PBS浸洗、4%多聚甲醛固定15分钟、0.5%Tritonx-100室温通透20分钟、5%BSA溶液封闭1小时；最后，向其中加入Phalloidin-FITC（1：300），避光孵育45分钟，用PBST（50 mL PBS + 50 μL Tween）浸洗后加入DAPI（1：300）避光孵育10分钟，用PBST浸洗。在荧光显微镜下观察并采集图像，对细胞形态及数量进行分析对比。

实施例2和对比例3的人造血管表面粘附的HUVEC细胞数量结果如图7所示，其中，BC-REDV为对比例3制得的人造血管，BCd-REDV为实施例2制得的人造血管，从图7可见，脱水后的细菌纤维素膜制成的人造血管粘附HUVEC细胞的数量有大幅度的提高。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (7)

1. 一种细菌纤维素膜的脱水方法，其特征在于：将细菌纤维素膜放置于-5~-1℃的环境中；所述的细菌纤维素膜由G. xylinus在Hestrin–Schramm培养基中，25~30℃下培养1~3天，然后通过双蒸水和0.05~0.15M的氢氧化钠水溶液在55~65℃下清洗3~5小时，再用质量浓度为1~3%的十二烷基硫酸钠溶液在55~65℃下清洗10~14小时，最后用Milli-Q水清洗得到。

2.根据权利要求1所述的细菌纤维素膜的脱水方法，其特征在于：控制环境温度为-4~-1℃。

3.根据权利要求2所述的细菌纤维素膜的脱水方法，其特征在于：控制环境温度为-3℃。

4.根据权利要求1所述的细菌纤维素膜的脱水方法，其特征在于：将所述的细菌纤维素膜置于密封容器中。

5.根据权利要求1所述的细菌纤维素膜的脱水方法，其特征在于：按质量百分含量计，所述的Hestrin–Schramm培养基的组成为：

葡萄糖 1.5~2.5%，

酵母提取物 0.3~0.6%，

柠檬酸 0.1~0.2%，

蛋白胨 0.3~0.6%，

磷酸氢二钠 0.1~0.5%，

水 96~97%。

6.一种人造血管，其特征在于：包括如权利要求1至5中任一项所述的脱水方法制得的细菌纤维素膜、以及接枝在所述的细菌纤维素膜表面的内皮细胞配体分子和/或内皮祖细胞配体分子，通过所述的细菌纤维素膜上的羧基与所述的内皮细胞配体分子和/或内皮祖细胞配体分子的氨基连接。

7.一种如权利要求6所述的人造血管的制备方法，其特征在于：首先对所述的细菌纤维素膜的表面进行羧基化处理，然后接枝含有氨基的内皮细胞配体分子和/或内皮祖细胞配体分子，制得所述的人造血管。

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