CN112704768A - 一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架及其制备方法与应用 - Google Patents

一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架及其制备方法与应用。本发明采用反应过程相对温和的还原胺化法实现硫酸软骨素和胶原蛋白之间的耦联，将化学耦联得到的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白作为支架的基础材料，聚己内酯作为力学增强材料，通过静电纺丝方法制备出一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架，该血管修复支架具有良好的抗血栓效果，并且可以实现快速的内皮化，有望作为血管修复的支架材料，应用于小血管的移植，修复与再生，治疗严重威胁人类健康的心血管疾病。

Description

一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架及 其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架及其制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。
背景技术
硫酸软骨素(CS)是一种广泛存在于哺乳动物细胞外基质中的糖胺聚糖，在维持组织细胞结构和功能完整性，调控细胞的粘附、分裂和分化等方面发挥重要作用。硫酸软骨素带有较多的负电荷，具有强的亲水性以及良好的生物相容性，使其在生物医学领域有广泛应用，特别是其糖链结构中带有的硫酸酯在抗血栓方面具有很好的利用前景；此外，硫酸软骨素还具备抗炎症，抗动脉硬化等生物活性，是制备组织工程化血管的理想材料。胶原蛋白是细胞外基质中主要的蛋白质成分，是由三条肽链形成的三螺旋结构的蛋白质，具有良好的生物相容性，在组织工程和生物医学领域具有广泛应用。单纯由胶原蛋白构建的组织工程支架很难实现预期的生物功能，甚至会产生一些不良的效果，比如胶原蛋白是体内引起血栓的主要触发物，由胶原蛋白构建的血管支架面临较大的血栓形成风险。对胶原蛋白进行功能化修饰在赋予其特定的生物活性的同时协同增益消除其可能存在的不良效果，为开发组织工程化支架材料提供了新的思路。
中国专利文献CN106943632A(申请号CN201710177742.5)公开了一种制备胶原/硫酸软骨素复合人工角膜的方法，将胶原蛋白溶解于咪唑类离子液体水溶液中制备得到1-30％的胶原溶液，将硫酸软骨素溶于水溶液中得到1-20mg/mL的硫酸软骨素水溶液，将这两种溶液按照一定比例进行混合均匀，添加生物相容性良好的天然交联剂(EDC/NHS)，制备出胶原蛋白/硫酸软骨素原位交联复合水凝胶；经浸泡凝固浴中定型再生，水洗除去溶剂，自然晾干即可得到胶原蛋白/硫酸软骨素复合膜。该专利文献通过EDC/NHS活化自由羧基与胶原蛋白上的氨基形成酰胺键从而实现交联复合，但是硫酸软骨素糖链中每个二糖重复单元都含有一个自由羧基，而且胶原蛋白分子本身也带有许多自由羧基，从而使上述的交联反应产生高度复杂的交联网络，形成胶原-硫酸软骨素-胶原、胶原-胶原等复合体，不利于后续的溶解、加工过程也可能导致硫酸软骨素化学结构和生物活性的改变。
随着组织工程研究的深入，目前人们逐渐认识到单由天然高分子制得的生物材料机械强度低，难以获得理想的组织工程血管支架应用于实际，因此将天然高分子和人工合成的高分子材料复合，结合不同材料的优势来构建组织工程血管修复支架。聚己内酯(PCL)是一种常用的合成高分子材料，具有良好的生物相容性和降解性，且降解产物对人体无毒害作用，目前广泛应用于生物医学材料领域。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架及其制备方法与应用。本发明通过将化学耦联得到的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白作为支架的基础材料，聚己内酯作为力学增强材料，然后通过静电纺丝方法制备出一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架，并对纤维支架的体内外抗血栓效果和内皮化性能进行研究，为制备兼具抗血栓活性和促进内皮化功能的新型支架材料用于血管修复与再生奠定基础。
术语说明：
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。
本发明的技术方案如下：
一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架，是以硫酸软骨素、胶原蛋白和聚己内酯为原料制备得到的空心纤维材料。
本发明上述血管修复支架，是在硫酸软骨素的还原端开环形成醛基，醛基与胶原蛋白的自由氨基缩合，最终以仲胺键相连，然后加入聚己内酯经静电纺丝制备得到。本发明采用反应过程相对温和的还原胺化法实现硫酸软骨素和胶原蛋白之间的耦联，所得的耦联产物易于溶解和后续的加工处理；其反应原理是硫酸软骨素还原末端开环形成醛羰基，与胶原蛋白上的氨基缩合形成席夫碱，在还原剂的作用下将席夫碱还原为稳定的碳氮键。由于每条硫酸软骨素末端只含有一个醛羰基，该反应只发生在硫酸软骨素的还原末端与胶原蛋白上的自由氨基耦联得到耦联产物，不涉及胶原蛋白的自交联，从而避免了过度交联导致的不利影响。
根据本发明优选的，所述硫酸软骨素为硫酸软骨素A钠盐；所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原，分子量为50～150kDa；所述聚己内酯的重均分子量为186～282kDa。
根据本发明优选的，所述空心纤维材料的内径为1～5mm，管壁厚度为100～250μm。
一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架的制备方法，包括步骤如下：
(1)在六氟异丙醇/NaHCO3溶液组成的油/水乳液体系中，加入硫酸软骨素和胶原蛋白，并加入还原剂，在室温条件下磁力搅拌反应得到反应液，除去反应液中未反应的硫酸软骨素，经洗涤、冷冻干燥后得到硫酸软骨素修饰的胶原蛋白；
(2)将步骤(1)得到的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白和聚己内酯溶于六氟异丙醇，室温下磁力搅拌制备纺丝液，经静电纺丝及熏蒸交联固定，制备得到硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述硫酸软骨素修饰的胶原蛋白中硫酸软骨素的质量含量百分比为4.06～22.68％。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述硫酸软骨素和胶原蛋白加入的质量比为1:(3～6)，胶原蛋白在油/水乳液体系中的浓度为20～25mg/mL，进一步优选为24mg/mL。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述六氟异丙醇和NaHCO3溶液的体积比(2～4):(1～3)，pH6.0～8.0，其中，NaHCO3溶液的浓度为0.05～0.2M；进一步优选的，所述六氟异丙醇和NaHCO3溶液的体积比3:2，pH 7.0，NaHCO3溶液的浓度为0.1M。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述还原剂为重结晶之后的氰基硼氢化钠。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述还原剂的加入量为硫酸软骨素质量的1～2倍；进一步优选为1.5倍。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述磁力搅拌的转速为200～500rpm；优选为300rpm。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述搅拌反应的时间为20～30h，进一步优选为24h。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述除去反应液中未反应的硫酸软骨素的方法为：将反应液与体积百分比浓度为5％的乙酸溶液按体积比1:4的比例混合，选择截留分子量为30kDa的超滤管，转速3500～4200r/min超滤离心20～30min，再用体积百分比浓度为5％的乙酸重悬，按以上步骤再进行超滤4～6次。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述硫酸软骨素修饰的胶原蛋白与聚己内酯的质量比为(4～6):(2～4)，两者在六氟异丙醇中总质量百分比浓度为8～10％，单位g/mL；进一步优选的，所述硫酸软骨素修饰的胶原蛋白与聚己内酯的质量比5:3，两者总质量百分比浓度为8％，单位g/mL。所得的纺丝液表现出明显的挂壁状态，粘度适合纺丝。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述静电纺丝过程是在通风橱中进行，温度20～30℃，环境湿度小于30％。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述静电纺丝的条件为：在15～25kV的高压静电场下，调节纺丝液的给液速度为0.6～1.2mL/h，纺丝液总体积为0.6～2.0mL，接收距离为12～18cm，制备血管支架的接收器为可旋转的不锈钢转轴，直径1～5mm，转速为200～1000rpm；进一步优选的，所述的静电纺丝条件为在20kV的高压静电场，给液速度为0.8mL/h，纺丝液总体积为1.8mL，接收距离为16cm，不锈钢转轴的直径为2mm，转速500rpm。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述熏蒸交联固定的方法为：在玻璃干燥器的底部放置含有质量体积百分比浓度为25％(g/mL)的戊二醛水溶液的培养皿，将硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架置于干燥器的托盘上，密封熏蒸，熏蒸交联12～48h；进一步优选的，熏蒸交联时间为24h。
上述硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架在制备抗血栓和促内皮化血管材料中的应用。
本发明未详尽说明的，均按本领域常规技术。
本发明的技术特点如下：
本发明在步骤(1)中通过还原胺化反应将硫酸软骨素与胶原蛋白实现化学耦联，在六氟异丙醇/NaHCO3溶液组成的油/水乳液体系中，硫酸软骨素还原端开环形成醛基与胶原蛋白的自由氨基缩合形成席夫碱，还原剂将上述不稳定的席夫碱还原为稳定的仲胺键，实现硫酸软骨素与胶原蛋白之间的耦联，得到硫酸软骨素修饰的胶原蛋白。
本发明采用的实现硫酸软骨素与胶原蛋白化学耦联的方法，反应原理如下：
Figure BDA0002806446460000041
本发明在步骤(2)中将制得的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白与具有较高机械强度的高分子材料聚己内酯按一定的质量比例共混制备纺丝液，来制备机械强度能够满足植入要求的血管修复支架，并采用交联剂对纤维材料进行交联固定以提高支架的稳定性。然后对得到的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架进行体外的血液相容性、细胞相容性、机械性能等研究以及体内的抗血栓和促内皮化效果的应用研究。
本发明的有益效果如下：
1.本发明中的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白是通过还原胺化法实现硫酸软骨素与胶原蛋白的耦联，反应条件温和，避免了由过度交联导致的硫酸软骨素化学结构和生物活性的改变，制备得到的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白，易于溶解，适合后续过程的加工处理。
2.本发明采用的化学耦联方法制得的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白，其中硫酸软骨素含量在4.06～22.68％之间，一方面可以从组分上充分模拟、构建与天然血管基质类似的仿生基质；另一方面可以实现对胶原蛋白的功能化修饰，以降低其单独作为血管修复材料时面临的血栓形成风险。
3.本发明选用聚己内酯作为力学填充材料，一方面是由于人工高分子材料机械强度明显高于天然材料，可以用来弥补天然材料在机械性能方面的不足，另一方面聚己内酯具有良好的生物相容性，是美国FDA认证批准的的生物医用可降解材料，产物无毒无害，在体内随着组织的再生修复而降解。本发明对聚己内酯的添加量进行了研究与优化，发现聚己内酯的添加量过少，制备得到的纤维材料无法达到移植所需的机械强度；由于聚己内酯为人工合成的高分子材料，其生物相容性略逊于天然高分子材料，添加量过多，会影响纤维材料的生物相容性；本发明制得的血管修复支架各项力学性能指标与正常大鼠颈动脉相比无明显差异，可以满足移植的需求。此外，通过静电纺丝制备的纤维可以从结构上充分模拟天然细胞外基质的纳米纤维网状结构。
4.硫酸软骨素和胶原蛋白都是来自机体组织本身的纯天然材料，本身具有很好的生物相容性，是用于诱导血管生成的理想材料，所用的硫酸软骨素还具有抗血栓、抗炎症等生物活性，硫酸软骨素修饰的胶原蛋白在具有良好生物相容性的基础上，还具备抗血栓和促进内皮化的功能；本发明将聚己内酯作为力学增强材料用于弥补天然材料在机械性能方面的不足，制备出硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架具有良好的抗血栓效果，并且可以实现快速的内皮化，有望作为血管修复的支架材料，应用于小血管的移植，修复与再生，治疗严重威胁人类健康的心血管疾病。
附图说明：
图1为实施例1硫酸软骨素修饰的胶原蛋白耦联产物的核磁图谱(A)和红外图谱(B)。
图2为实施例2硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纤维材料的扫描电镜照片。
图3为实施例2硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纤维材料的形貌照片；其中，A、B为数码相机照片，C、D、E、F分别为整体形貌、横截面、内表面和外表面的电镜照片。
图4为实施例2硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纤维材料的机械性能测试图；其中，A为应力-应变曲线图，B为弹性模量柱状图，C为伸长率柱状图，D为极限拉伸强度柱状图。
图5为血管内皮细胞在纤维材料上生长附着的细胞形貌图片。
图6为血管内皮细胞在纤维材料上的增殖率柱状图。
图7为血管内皮细胞在纤维材料上的分化因子表达水平柱状图。
图8为血管内皮细胞在纤维材料上的膜蛋白ICAM表达图片(A)和膜蛋白PECAM表达图片(B)。
图9为血小板的在纤维材料上的形貌照片。
图10为血小板的在纤维材料上的活性结果柱状图。
图11为体内移植一周后血管修复支架内表面的HE染色图片(A)和Masson染色图片(B)。
图12为体内移植一周后血管修复支架内表面的扫描电镜图片。
具体实施方式：
为了进一步阐明本发明所述的技术方案，下面结合实施例进行详细描述。应理解，本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例中所有的原料均为常规原料，市购产品。其中胶原蛋白：成都市科乐生物技术有限公司，猪来源的Ⅰ型胶原，分子量约为100kDa；硫酸软骨素A钠盐来源于牛气管，购自Sigma，CAS号：39455-18-0；聚己内酯购自济南岱罡生物工程有限公司，重均分子量186～282kDa。
实施例1：制备硫酸软骨素修饰的胶原蛋白
称取120mg胶原蛋白，撕碎后置于5mL体积比为3:2的六氟异丙醇/0.1M NaHCO3溶液组成的油/水乳液体系(pH 7.0)中，将硫酸软骨素以不同质量比(胶原蛋白：硫酸软骨素＝6:1，5:1，4:1，3:1)加入上述体系中，重结晶之后的氰基硼氢化钠以1.5倍于硫酸软骨素质量的用量加入上述体系中，室温下磁力搅拌300rpm、24h得到反应液；反应结束后，向反应瓶中加入4倍于反应液体积的5％(体积分数)的乙酸溶液；选取截留分子量为30kDa的超滤管，转速3500～4200r/min超滤离心20～30min；用5％(体积分数)的乙酸溶液重悬，按以上步骤再进行超滤，每次离心后检测产物中的硫酸软骨素含量，直至其质量比不再下降，确定产物中未偶联的硫酸软骨素被完全除去。将所得的耦联产物清洗后置于-80℃冰箱过夜，冷冻干燥，获得硫酸软骨素修饰的胶原蛋白。
本实施例制得的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白耦联产物，硫酸软骨素含量在4.06～22.68％之间，其核磁、红外图谱如图1A和图1B所示。
实施例2：硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纳米纤维的制备和交联
(1)制备硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纳米纤维
将实施例1制备的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白和聚己内酯加入到六氟异丙醇中，硫酸软骨素修饰的胶原蛋白与聚己内酯的质量比5:3，两者总质量百分比浓度为8％(g/mL)，室温下磁力搅拌至肉眼可观的挂壁纺丝液，进行静电纺丝；纺丝时纺丝设备置于室温下的通风橱内，温度20～30℃，环境湿度小于30％，用注射器吸取1mL纺丝液固定于微量注射泵中，并通过电源线将注射器金属针头与高压发生器相连；选取的注射器针头内径为0.46mm，接收器为不锈钢转轴，直径为2mm，转速500rpm，纺丝时电源电压设定为20kV，给液速度为0.8mL/h，纺丝液总体积为1mL，接收距离为16cm；纺丝完成后，将纤维材料置于真空干燥箱干燥。
(2)硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纳米纤维的交联
为了提高纳米纤维的耐水稳定性，需要对纳米纤维材料进行交联，具体过程为：选用内径为21cm的玻璃干燥器，底部放置盛有10mL 25％(g/mL)的戊二醛水溶液的培养皿，然后将干燥的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纳米纤维置于干燥器托盘上，密封熏蒸24h；交联完成后将纳米纤维置于真空干燥箱放置一周左右，除去残余的戊二醛，得到硫酸软骨素修饰的胶原蛋白的血管修复支架。
用扫描电镜观察制备得到的纤维材料的形貌，如图2所示，本实施例制得的纤维材料经交联后，为多孔微纳米结构，与天然细胞外基质的纳米纤维网络结构相似，初步达到了从结构上模拟天然组织细胞微环境的目的。
为了进一步观察纤维材料的微观形貌，分别用数码相机和扫描电镜对血管修复支架进行形貌观察。纤维材料的数码相机照片如图图3A和图3B所示，采用扫描电镜对纤维材料微观形貌观察时，将纤维材料剪成5mm长度的小段固定在样品架上，喷金时间200s，然后置于扫描电镜下观察，其整体形貌、横截面、内表面和外表面的电镜照片分别如图3C、图3D、图3E和图3F所示。由图3所示，本实施例制得的血管修复支架内径约为1～5mm，管壁厚度100～250μm，结构上与天然血管的细胞外基质网络结构相似，可以从结构上仿生模拟天然的血管。将本实施例制备得到的血管修复支架用于以下实施例。
实施例3：血管修复支架的机械性能的测定。
为了检测实施例2制得的血管修复支架的力学性能，使用GTM 8050S微机伺服控制电子万能材料试验机与电脑控制端联接，在湿润状态下将测试样本两端固定在力学测试仪夹具上，调节夹具间距，小心确保样品没有被拉伸，测量其有效长度。力学测试模式为管状物模式下，以10mm/min的恒定速度进行拉伸，直至样品断裂，记录应力-应变曲线(图4A)，弹性模量(图4B)，伸长率(图4C)和极限拉伸强度(图4D)。由图4可知，说明聚己内酯作为力学增强材料弥补了天然材料在机械性能方面的不足，实施例2制得的血管修复支架各项力学性能指标与正常大鼠颈动脉相比无明显差异，可以满足移植的需求。
实施例4：内皮细胞在纤维膜上的生长，增殖和分化情况
将覆盖有纤维材料的盖玻片(直径1.4cm)紫外杀菌1h，70％酒精浸泡3h，吸出酒精后晾干，用磷酸缓冲液(PBS)清洗浸泡3次，每次加1mL浸泡20min；然后将上述样品置于24孔培养板中用于细胞培养。将猪髋动脉内皮细胞(PIEC)种植在纤维材料上，细胞接种密度保持在1～5×104个/cm2，观察内皮细胞形貌、细胞增殖和分化情况。
(1)细胞形貌观察
取在纤维膜上生长3天的细胞，用PBS冲洗三遍后用4％(g/mL)的多聚甲醛溶液固定2h，随后依次用50％，70％，80％，90％，95％以及100％的乙醇进行梯度脱水，每个梯度脱水10min，将样品放在真空干燥箱保持，将样品喷金240s，在5kV加速电压下用扫描电子显微镜观察细胞形态，电镜扫描结果如图5所示。内皮细胞在纤维材料上表现为细长的梭形，细胞与细胞之间联系密切，且部分细胞表现出向材料内部生长迁移的状态，表明细胞在材料上能够正常的粘附、生长、迁移和增殖。
(2)细胞增殖和分化情况
选取在CO2培养箱中贴壁培养的细胞，吸去旧培养基，按照Edu细胞增殖(流式检测)使用说明书测定细胞在纤维材料上的增殖率，检测结果如图6。
由图6可知，比较不同含量的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纤维材料和组织培养板(blank)上细胞的增值情况，不同硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纤维材料上的细胞增值率基本都在细胞培养板的增值率以上，且高于胶原蛋白上的细胞增值率，结果表明不同组纤维材料上细胞增殖效果良好。
取在纤维材料上生长7天的细胞，提取总RNA，反转录为cDNA，以B2M为内参基因，用于消除RNA定量、加样以及PCR反应等过程产生的误差，用实时荧光定量RCR(RT-qPCR)通过荧光信号检测每次PCR循环后产物总量，以内参法定量分析待检样品中特定的基因序列。检测PIECs中细胞间粘附因子-1(ICAM-1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、以及血小板-内皮细胞粘附因子-1(PECAM-1)的mRNA水平的表达，检测结果如图7。
由图7可知，比较不同含量的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纤维材料和空白的组织培养板(blank)上增殖细胞中mRNA的表达水平，结果显示，在本发明的纤维材料上细胞的ICAM-1、PECAM-1均能够正常表达，PCNA表达量略有提高。
取培养3天的细胞，用PBS冲洗三遍后用4％(g/mL)的多聚甲醛溶液固定2h，然后用0.5％Triton X-100溶液透膜20min，PBS清洗3遍后加入2％血清白蛋白(BSA)封闭非特异性结合位点，然后加入含有0.1％血清白蛋白(BSA)的一抗(ICAM和PECAM，用PBS稀释1:100)孵育过夜，用PBS清洗3遍后加入Alexa Fluor 488标记的二抗(用PBS稀释1:100)室温孵育4h，用罗丹明标记的鬼笔环肽(用PBS稀释1:200)染色20min，PBS清洗3遍，用DAPI染色5min，PBS清洗3遍后，用激光共聚焦显微镜观察细胞并拍照，ICAM和PECAM两种膜蛋白的表达检测结果分别如图8A和图8B所示。ICAM和PECAM被认为是内皮细胞分化的两种标志性蛋白，在纤维材料上细胞免疫荧光染色，其中细胞核被DAPI染为蓝色，细胞骨架被染罗丹明染为红色，ICAM和PECAM两种蛋白被染为绿色，结果表明内皮细胞在纤维材料上的ICAM和PECAM蛋白具有较高的荧光强度，说明该纤维材料可以促进内皮细胞的分化。
通过对以上结果的检测和分析，表明细胞在该纤维材料上有较好的形貌和生长状况，有良好的促血管内皮化增殖和分化效果，有望作为血管修复的支架材料。
实施例5：血小板在纤维材料上的形貌观察和活性测定
将覆盖有纤维材料的盖玻片(直径1.4cm)置于24孔板，紫外杀菌1h，70％酒精浸泡3h，吸出酒精后晾干用磷酸缓冲液(PBS)清洗浸泡3次，每次加1mL浸泡20min；用无菌采血管采集家兔全血4mL，离心制备富血小板血清，每孔加入100μL的富血小板血清孵育2h后，收集样品用PBS轻轻清洗5遍后乙醇梯度脱水，用扫描电镜观察血小板的形貌，如图9，未激活的血小板变现为椭球形，激活的血小板伸出伪足，结果表明血小板与纤维材料接触后有不同程度的激活。
同时将孵育的样品PBS清洗后，每孔加入37℃预热的DMEM1640培养基(含10％的胎牛血清)200μL培养2h；然后弃掉培养基加入37℃预热的不含血清的DMEM1640培养基200μL，再加入37℃预热的MTT(5mg/mL溶于PBS中，pH 7.40)20μL，培养4h后在倒置相差显微镜下观察有紫色颗粒沉淀产生，吸出培养基及MTT，加入200μL的DMSO使沉淀溶解；取96孔板，每孔加入100μL在570nm处测得吸光度值，检测结果如图10。血小板在单纯的胶原蛋白纤维膜上表现出较高的活性，而在经硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纤维膜上活性有所降低，并且降低效果与硫酸软骨素的固定量有关，硫酸软骨素含量越高降低效果越明显。
通过对血小板在纤维支架上的形貌和活性测定，表明血小板在纤维材料上有一定程度的激活，用硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯可以明显的减弱血小板的激活，本发明的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯纤维材料有望作为缓解血栓形成的血管支架材料。
实施例6：体内移植一周后血管修复支架内表面的血栓形成情况和内皮化效果
选择2kg左右的新西兰大白兔作为实验动物，使用丙泊酚葡萄糖溶液在兔子耳缘静脉进行静脉点滴麻醉，使用利多卡因在手术部位进行局部麻醉，手术过程中低分子肝素(140IU)用于抗凝处理。切开兔子颈部皮肤，小心剥离出左侧颈动脉，用手术剪剪开一个T型切口将血管修复支架移植到左侧颈动脉中，并进行血管缝合。植入7天后，取出植入的血管修复支架，一部分做冷冻切片并进行HE染色和Masson染色，如图11A和图11B；另一部分沿着轴向剖开后使用4％多聚甲醛溶液在4℃环境下固定4h，PBS清洗3遍，依次用30％，50％，70％，80％，90％，95％和100％梯度乙醇脱水，每个梯度脱水10min；将样品固定在扫描电镜载物台导电双面胶上，血管内表面朝上，进行SEM观察，如图12。由图11和图12可知，本发明制得的血管修复支架在体内可以保持较高的通畅率，具有良好的抗血栓效果，并且可以实现快速的内皮化，表明该硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架具有可观的应用价值。

Claims (10)

1.一种硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架，其特征在于，是以硫酸软骨素、胶原蛋白和聚己内酯为原料制备得到的空心纤维材料。
2.如权利要求1所述的血管修复支架，其特征在于，所述硫酸软骨素为硫酸软骨素A钠盐；所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原，分子量为50～150kDa；所述聚己内酯的重均分子量为186～282kDa。
3.如权利要求1所述的血管修复支架，其特征在于，所述空心纤维材料的内径为1～5mm，管壁厚度为100～250μm。
4.权利要求1所述的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)在六氟异丙醇/NaHCO3溶液组成的油/水乳液体系中，加入硫酸软骨素和胶原蛋白，并加入还原剂，在室温条件下磁力搅拌反应得到反应液，除去反应液中未反应的硫酸软骨素，经洗涤、冷冻干燥后得到硫酸软骨素修饰的胶原蛋白；
(2)将步骤(1)得到的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白和聚己内酯溶于六氟异丙醇，室温下磁力搅拌制备纺丝液，经静电纺丝及熏蒸交联固定，制备得到硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述硫酸软骨素修饰的胶原蛋白中硫酸软骨素的质量含量百分比为4.06～22.68％；
优选的，步骤(1)中所述硫酸软骨素和胶原蛋白加入的质量比为1:(3～6)，胶原蛋白在油/水乳液体系中的浓度为20～25mg/mL；
优选的，步骤(1)中所述六氟异丙醇和NaHCO3溶液的体积比(2～4):(1～3)，pH6.0～8.0，其中，NaHCO3溶液的浓度为0.05～0.2M。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，满足以下条件之一项或多项：
i.步骤(1)中所述还原剂为重结晶之后的氰基硼氢化钠；
ii.步骤(1)中所述还原剂的加入量为硫酸软骨素质量的1～2倍；
iii.步骤(1)中所述磁力搅拌的转速为200～500rpm；
iv.步骤(1)中所述搅拌反应的时间为20～30h；
v.步骤(1)中所述除去反应液中未反应的硫酸软骨素的方法为：将反应液与体积百分比浓度为5％的乙酸溶液按体积比1:4的比例混合，选择截留分子量为30kDa的超滤管，转速3500～4200r/min超滤离心20～30min，再用体积百分比浓度为5％的乙酸重悬，按以上步骤再进行超滤4～6次。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述硫酸软骨素修饰的胶原蛋白与聚己内酯的质量比为(4～6):(2～4)，两者在六氟异丙醇中总质量百分比浓度为8～10％，单位g/mL。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述静电纺丝过程是在通风橱中进行，温度20～30℃，环境湿度小于30％；
优选的，步骤(2)中所述静电纺丝的条件为：在15～25kV的高压静电场下，调节纺丝液的给液速度为0.6～1.2mL/h，纺丝液总体积为0.6～2.0mL，接收距离为12～18cm，制备血管支架的接收器为可旋转的不锈钢转轴，直径1～5mm，转速为200～1000rpm。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述熏蒸交联固定的方法为：在玻璃干燥器的底部放置含有质量体积百分比浓度为25％(g/mL)的戊二醛水溶液的培养皿，将硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架置于干燥器的托盘上，密封熏蒸，熏蒸交联12～48h。
10.权利要求1所述的硫酸软骨素修饰的胶原蛋白/聚己内酯血管修复支架在制备抗血栓和促内皮化血管材料中的应用。
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