CN115382020A - 基于人源脱细胞基质的生物墨水及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于人源脱细胞基质的生物墨水及其制备方法与应用，属于3D打印生物墨水制备领域。所述生物墨水由以下组分组成：脱细胞基质，4％～15％；明胶，8％～17.5％；壳聚糖，0.1％～3.5％；琼脂，0.5％～3.5％；余量为水。本发明还公开了该生物墨水的制备方法，以及在制备生物支架中的应用。本发明的生物墨水，将脱细胞基质经过冻干研磨成细粉，作为生物墨水成分直接加入，不需要加入胃蛋白酶等外来物，不需要进行消化处理，粘度适合、可打印性较好。利用本发明的生物墨水制备生物支架时不需要使用光固化打印方式，因此不需要用到有毒的光引发剂，且打印支架经冻干后机械性能较好。具有较好的作为植入性组织工程支架的潜力。

Description

基于人源脱细胞基质的生物墨水及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种基于人源脱细胞基质的生物墨水及其制备方法与应用，属于3D打印生物墨水制备领域。
背景技术
3D打印技术因其快速高效、个性化生产等优势，正逐渐受到生物医药行业的关注。3D生物打印技术作为智能制造和生物组织工程领域的交叉应用，在组织、器官修复方面展现了良好的应用前景。
脱细胞基质材料是将生物组织通过脱细胞的方法获得的低免疫排斥性的组织工程材料。去除能够引起免疫排斥反应的抗原成分，同时完整地保留细胞外基质的三维空间结构及一些对细胞分化有重要作用的生长因子，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子等。经过处理的细胞外基质材料具有良好的机械力学性能，组织相容性好，植入体内没有免疫排斥现象，在体内起着支持、连接细胞的作用，同时其三维的空间结构及细胞因子有利于细胞的黏附和生长，具有良好的应用前景。脱细胞基质具有保留完整的胶原纤维成分和组织基本结构的优点。同种异体脱细胞基质材料相比异种材料具有更低的传染病感染风险和更低的免疫原性。
3D生物打印的技术难点在于生物墨水的制备和固化方法。生物墨水一般是生物相容性较好的水凝胶，生物墨水在3D打印的过程中，生物墨水在料筒内处于凝胶态，且需要具有适宜打印的黏度。打印后需要进行固化处理。使3D打印后的支架具有一定的强度。目前应用较多的3D生物打印的固化方式主要有光固化打印、温敏固化打印、低温沉积等方式。
基于脱细胞基质的生物墨水具有诸多优势，使用光固化打印方式是最常见的，但光固化打印过程中均会使用光引发剂，而光引发剂普遍存在细胞毒性。例如：中国发明专利CN113403267A公开了一种生物墨水及其制造方法，以及使用生物墨水通过3D打印制造的生物支架，该生物墨水包含明胶或明胶衍生物、透明质酸或透明质酸衍生物、脱细胞基质、和外泌体。该发明专利使用了光固化的打印方式，且生物墨水中包含了一定比例的光引发剂。
在3D生物打印中，基于脱细胞基质的生物墨水大多采用酸性胃蛋白酶溶液消化的方式进行溶液制备，例如：中国发明专利申请CN 112755248 A公开了一种基于卵巢或阴道脱细胞基质的生物墨水的制备方法，该方法包含以下步骤：将预先制备的卵巢或阴道脱细胞基质粉末加入到胃蛋白酶溶液中进行消化。在所得的脱细胞基质溶液中滴加碱液，使PH为7.0～7.3，从而得到流动态的脱细胞基质溶液。又例如：中国发明专利CN 105169483 A公开了一种脱细胞基质凝胶的制备方法及其脱细胞基质凝胶，制备方法包含以下步骤：脱细胞基质冷冻干燥，打碎成粉末，制得脱细胞基质粉末，用胃蛋白酶的盐酸溶液消化脱细胞基质粉末6～48h，将消化脱细胞基质粉末后所得的消化液进行超速离心，取上清液低温储存待用，获得的上清液即为脱细胞基质预凝胶溶液。用NaOH溶液调节脱细胞基质预凝胶溶液至中性。这存在以下不足之处：1、脱细胞基质的优势在于具有三维的空间结构及细胞因子有利于细胞的黏附和生长；但使用胃蛋白酶消化脱细胞基质制备预凝胶溶液的过程会将蛋白质等结构消化分解为肽链甚至是氨基酸等，从而会将脱细胞基质的三维结构破坏掉。2、过程中添加的胃蛋白酶可能会在溶液中残留，残留的胃蛋白酶对细胞生长繁殖会有一定的影响。3、需要使用NaOH溶液调节溶液至中性，特别是对于粘度较大的溶液，调节pH过程会增加了操作的复杂性。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种基于人源脱细胞基质的生物墨水及其制备方法以及在制备生物支架中的应用。本发明的生物墨水具有较好的可打印性能，可打印形状较为复杂的三维支架。本发明的制备方法制备过程简单，粘度适宜，流变性能较好。本发明不使用胃蛋白酶进行消化，不需要进行pH的调节，不会破坏脱细胞基质的三维结构，利于细胞的生长，不含胃蛋白酶残留，避免了安全隐患。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于人源脱细胞基质的生物墨水，由以下重量份的组分组成：脱细胞基质，4％～15％；明胶，8％～17.5％；壳聚糖，0.1％～3.5％；琼脂，0.5％～3.5％；余量为水。
进一步地，所述脱细胞基质是来源于人源的组织或器官通过脱细胞方法制备得到的，所述组织或器官选自胎盘、真皮、脐带、羊膜、小肠粘膜、血管、外周神经、脂肪、肝脏、肾脏、心脏、脑组织、脊髓、肺、软骨、骨、肌腱、肌肉组织、角膜等中的任意一种或两种以上，优选胎盘脱细胞基质。
进一步地，所述胎盘脱细胞基质，是通过以下方法制备得到的：
(1)组织预处理：取胎盘组织，剪成小块(长宽各1～2厘米)，用蒸馏水反复清洗，以去除血液成分；匀浆得组织匀浆；使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，离心(转速3200r/min,离心10分钟；以下如无特殊说明，离心设置与此相同)后弃上清液。
(2)灭菌及病毒灭活：将上述清洗后的组织匀浆加入到0.2％～0.5％(质量百分数)过氧乙酸溶液中，振动浸泡2～4小时，取出，生理盐水反复冲洗3～5次，离心去上清液。
(3)去除组织DNA：向组织匀浆中加入DNA酶，37℃处理18～24小时；用含1％青霉素或链霉素的PBS洗涤3次，每次0.5小时；再用生理盐水反复冲洗3～5次，离心去上清液。
(4)去除细胞成分：组织匀浆置于1％十二烷基磺酸钠(SDS)的PBS溶液(PBS缓冲液中加入0.1％的SDS)中，搅拌60～80h(恒温震荡100r，37℃)，溶液每24小时更新一次。再置于0.1％乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS(w/v)溶液(PBS缓冲液中加入0.1％的乙二胺四乙酸)中，处理18～30h(恒温震荡100r，37℃)；生理盐水反复冲洗3～5次，离心去上清液。
(5)组织匀浆与适量生理盐水混合，匀浆至稳定的水凝胶状悬浮液，制得基质凝胶。
(6)基质凝胶静置，让水凝胶状胎盘组织基质重新纤维化，冷冻干燥，得脱细胞基质海绵。
(7)将脱细胞基质海绵研磨为颗粒直径不大于200目的粉末状材料。
所述基于人源脱细胞基质的生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
(1)将琼脂加入水中，在98～100℃下搅拌至彻底溶解，得琼脂溶液；
(2)待琼脂溶液冷却至50～70℃时，加入明胶和壳聚糖，搅拌至完全溶解；
(3)待上述溶液冷却至40～50℃时，加入脱细胞基质，混合均匀；即得。
所述基于人源脱细胞基质的生物墨水在制备生物支架中的应用。具体应用时，包括以下步骤：
(1)将本发明的生物墨水水浴加热至40～50℃，加入到3D生物打印机喷头内；
(2)将打印机喷头温度调至10～20℃，静置10～15min至温度均一；
(3)调整打印速率至6～10mm/s，喷头挤出速率0.5～1.5mm3/s；
(4)进行打印目标的设置，根据实际需要设置层高、丝间距等参数；进行打印；
(5)打印结束后，使用交联剂浸泡20～60min；
所述交联剂选自以下物质的溶液：甲醛、乙二醛、戊二醛、京尼平、1,6-己二异氰酸酯、丁二烯二环氧化物、顺丁烯二酸酐、多巴胺盐酸盐；优选0.5％～10％(质量体积比，单位g/mL)的戊二醛溶液；
(6)使用纯水进行冲洗，将残留的交联剂清洗干净，得到湿态生物支架；
(7)使用冻干机冻干处理，得到干态生物支架。
一种生物支架，制备方法同上。所述生物支架制备或作为植入性组织工程支架的用途。
本发明的基于人源脱细胞基质的生物墨水，具有以下有益效果：
(1)本发明的生物墨水具有适宜的粘度和可打印性。能够根据患者组织缺损处的尺寸形状个性化定制打印生物支架。
(2)本发明的生物支架的制备方法，不需要使用光引发剂，从而避免了光引发剂普遍存在的细胞毒性。
(3)本发明克服了脱细胞基质难以根据患者缺损部位个性化定制的缺点。
(4)本发明克服了现有的脱细胞基质生物墨水制备过程中采用胃蛋白酶消化后破坏脱细胞基质三维结构的缺点。
(5)本发明克服了脱细胞基质粘性较差、打印性差、打印支架力学性能不足的缺点。
本发明的基于人源脱细胞基质的生物墨水，将脱细胞基质经过冻干研磨成细粉，作为生物墨水成分直接加入，不需要加入胃蛋白酶等外来物，不需要进行消化处理，粘度适合、可打印性较好。利用本发明的生物墨水制备生物支架时不需要使用光固化打印方式，因此不需要用到有毒的光引发剂，且打印支架经冻干后机械性能较好。具有较好的作为植入性组织工程支架的潜力。
附图说明
图1：生物支架的宏观外形图1。
图2：生物支架的宏观外形图2。
图3：生物支架的宏观外形图3。
图4：扫描电镜下生物支架的形貌图1。
图5：扫描电镜下生物支架的形貌图2。
图6：生物墨水的粘度-剪切速率曲线示意图。
图7：生物墨水的温度-模量曲线示意图。
图8：生物墨水的温度-粘度曲线示意图。
图9：拉伸极限测试的照片(测试中、测试后)。
图10：拉伸极限测试的结果示意图(拉伸力)。
图11：生物墨水的细胞存活率示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1制备基于人源脱细胞基质的生物墨水
由以下组分组成：胎盘脱细胞基质，6.4g；明胶，8g；壳聚糖，0.2g；琼脂，0.8g；水，80ml。
制备方法为：
(1)将琼脂加入水中，在100℃下搅拌至彻底溶解，得琼脂溶液；
(2)待琼脂溶液冷却至60℃时，加入明胶和壳聚糖，搅拌至完全溶解；
(3)待上述溶液冷却至45℃时，加入胎盘脱细胞基质粉末，混合均匀；即得。
所述胎盘脱细胞基质，通过以下方法制备：
(1)组织预处理：取胎盘组织，剪成长宽各1～2厘米的小块，用蒸馏水反复清洗，以去除血液成分；使用GM300匀浆机，打碎4000r/12s，重复进行5次，得组织匀浆；使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，设置离心机转速3200r/min，离心10分钟。离心后弃上清液，以下如无特殊说明，离心设置与此相同。
(2)灭菌及病毒灭活：将上述清洗后的组织匀浆加入到0.4％(质量百分数)过氧乙酸溶液中，振动浸泡3小时，取出，生理盐水反复冲洗4次，离心去上清液。
(3)去除组织DNA：向组织匀浆中加入600U/mL的DNA酶，37℃处理22小时；用含1％青霉素的PBS洗涤3次，每次0.5小时；再用生理盐水反复冲洗4次，离心去上清液。
(4)去除细胞成分：组织匀浆置于1％十二烷基磺酸钠的PBS溶液(PBS缓冲液中加入0.1％的SDS)中，搅拌72h(恒温震荡100r，37℃)，溶液每24小时更新一次。再置于0.1％乙二胺四乙酸的PBS溶液(PBS缓冲液中加入0.1％的乙二胺四乙酸)中，处理24h(恒温震荡100r，37℃)；生理盐水反复冲洗4次，离心去上清液。
(5)组织匀浆与适量生理盐水混合，调至所需要浓度(体积比4％)，用高速匀浆仪在液体温度低于25℃下匀浆至稳定的水凝胶状悬浮液，制得基质凝胶。
(6)基质凝胶静置2小时，让水凝胶状胎盘组织基质重新纤维化，冷冻干燥，得脱细胞基质海绵。
(7)使用低温研磨机将脱细胞基质海绵研磨为颗粒直径不大于200目的粉末状材料。
实施例2利用基于人源脱细胞基质的生物墨水制备生物支架。
步骤如下：
(1)将本发明的生物墨水水浴加热至40～50℃，取5ml，装入无菌料筒(规格5ml)，针直径23G(0.33mm)，将料筒固定至低温喷头内，并安装到生物打印机上；
(2)将打印机喷头温度调至18℃，静置15min至温度均一；
(3)调整打印速率至8mm/s，喷头挤出速率1.0mm3/s；
(4)进行打印目标的设置，根据实际需要设置层高0.2mm，丝间距0.2mm；进行打印；
(5)打印结束后，使用5％戊二醛溶液浸泡30min；
(6)使用纯水进行冲洗，将残留的戊二醛清洗干净，得到湿态生物支架；
(7)使用冻干机冻干处理24小时，得到干态生物支架，冻干程序为：
1.使用冻干机预冷3小时，预冷至-10℃。抽真空至真空度0.3mbar。
2.stage1——降温至-30℃。持续时间6.0小时；降温速率2.0℃/Min，真空度0.3mbar。
3.stage2——1℃/min升温至10℃，持续时间8.0小时，真空度0.3mbar。
4.stage3——1℃/min升温并保持在25℃，总共时间8.0小时，真空度0.3mbar。
测试例1扫描电镜观察冻干3D生物打印支架的形貌
生物支架的宏观外形图如图1、图2、图3所示。对其断面进行sem扫描电镜观察，形貌如图4、图5所示，其断面具有均匀细腻的网络状结构，具有较好的交联情况。
测试例2流变性能测试
1.使用流变仪进行生物墨水(实施例1制备)的流变性能测试。测试生物墨水室温下不同样品粘度与剪切速率的变化关系。剪切速率范围为0.01～100S-1。
2.测试不同样品的储能模量(G’)和(G”)随温度的变化。温度范围设置为15～40℃。2.5℃记录一个点。振动幅度1％，振动频率设置为1HZ约等于6.28rad/s。升温速率：0.5℃/min。
3.测试样品在不同温度下的粘度，温度选择15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃。
测试结果如图6、图7、图8所示。
结果表明：随着剪切速率的增加，粘度在降低，具有3D生物墨水必须具有的剪切变稀特性。
生物墨水在25℃的储能模量G'快速降低，在27.5℃左右储能模量与耗能模量数值G”相等，结果表明，生物墨水在25℃粘度急剧降低，27.5℃转变成粘度较低的液体。
温度粘度曲线表明，生物墨水在25℃的粘度出现快速降低。生物墨水在打印过程中为了维持较好的粘性必须保持温度低于25℃。
测试例3 3D生物打印支架拉伸性能测试
配制生物墨水后，进行3D生物打印。打印尺寸为宽10mm*长32mm*高3mm。打印速率为6mm/s,挤出速率为1.5mm3/s。打印平台温度：室温(25℃)。打印后使用5％戊二醛溶液浸泡20min。
使用超纯水反复冲洗3次，冲洗掉戊二醛残留，放置于塑料培养皿中，准备冷冻干燥。使用冷冻干燥机进行冻干处理，冻干处理24小时。
冻干程序为：
1.使用冻干机预冷3小时，预冷至-10℃。抽真空至真空度0.3mbar。
2.stage1——降温至-30℃。持续时间6.0小时；降温速率2.0℃/Min，真空度0.3mbar。
3.stage2——1℃/min升温至10℃，持续时间10.0小时，真空度0.3mbar。
4.stage3——1℃/min升温并保持在25℃，总共时间8.0小时，真空度0.3mbar。
冻干结束后，卸真空，将试样从冻干机中取出。使用万能拉伸试验机将3D打印支架夹持固定好。填写原始尺寸，测试温度。进行拉伸极限测试，拉伸速率2mm/min。
测试照片如图9所示。3D生物支架经冻干处理，测试结果如图10所示，结果表明，拉伸最大力为73.31N，最大形变4.71mm，断裂伸长率13.08％，拉伸强度0.46N/mm2，表明该支架相对于一般的软组织生物材料具有较好的力学性能。可以应用于需要承受较大力的场景。
测试例4细胞毒性实验
首先将生物墨水从冷藏室(4℃)中取出。然后进行水浴溶解为液态，使用DMEM培养基将生物墨水按照倍比稀释，稀释10个浓度梯度(生物墨水的浓度依次为：100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％)，备用。
使用小鼠成纤维细胞L929培养在DMEM培养基中，分成12组，包括空白对照组、阴性对照组、10个浓度的生物墨水溶液组(生物墨水的浓度依次为：100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％)。其中，空白对照组：不接种细胞，加入培养基100μL。阴性对照组：接种5000个细胞，加入培养基100L，不加生物墨水溶液。生物墨水组：接种5000个细胞，分别加入10个浓度梯度的生物墨水溶液100μL。细胞置于37℃的5％CO2细胞培养箱中培养24小时后，加入10μL CCK8溶液检测细胞存活率。轻轻摇晃均匀后放入培养箱中孵育，每隔1h将培养板取出观察颜色变化情况，孵育3h后使用酶标仪在450nm滤光片下检测吸光度值，计算生物墨水溶液对细胞毒性作用，并使用Graphpad软件计算对细胞作用的IC50浓度。
测试结果如图11所示(图中没有空白对照，空白对照无细胞，因此无细胞存活率)，使用Graphpad软件计算对细胞作用的IC50浓度，结果表明，生物墨水对L929细胞的IC50＞100％，几乎没有表现出任何细胞毒性。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种基于人源脱细胞基质的生物墨水，其特征在于，由以下重量份的组分组成：脱细胞基质，4％～15％；明胶，8％～17.5％；壳聚糖，0.1％～3.5％；琼脂，0.5％～3.5％；余量为水。
2.根据权利要求1所述的基于人源脱细胞基质的生物墨水，其特征在于：所述脱细胞基质是来源于人源的组织或器官通过脱细胞方法制备得到的，所述组织或器官选自胎盘、真皮、脐带、羊膜、小肠粘膜、血管、外周神经、脂肪、肝脏、肾脏、心脏、脑组织、脊髓、肺、软骨、骨、肌腱、肌肉组织、角膜中的任意一种或两种以上。
3.根据权利要求2所述的基于人源脱细胞基质的生物墨水，其特征在于：所述脱细胞基质为胎盘脱细胞基质，是通过以下方法制备得到的：
(1)组织预处理：取胎盘组织，剪成小块，用蒸馏水清洗；匀浆得组织匀浆；磷酸盐缓冲液冲洗，离心弃上清液；
(2)灭菌及病毒灭活：将组织匀浆加入到过氧乙酸溶液中，振动浸泡2～4小时，取出，生理盐水冲洗，离心去上清液；
(3)去除组织DNA：向组织匀浆中加入DNA酶，处理18～24小时；用含青霉素或链霉素的PBS溶液洗涤；用生理盐水冲洗，离心去上清液；
(4)去除细胞成分：组织匀浆置于十二烷基磺酸钠的PBS溶液中，搅拌60～80h；再置于乙二胺四乙酸的PBS溶液中，处理18～30h；生理盐水冲洗，离心去上清液；
(5)组织匀浆与生理盐水混合，匀浆至稳定的水凝胶状悬浮液，制得基质凝胶；
(6)基质凝胶静置，让水凝胶状胎盘组织基质重新纤维化，冷冻干燥，得脱细胞基质海绵；
(7)将脱细胞基质海绵研磨为颗粒直径不大于200目的粉末状材料。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的基于人源脱细胞基质的生物墨水，其特征在于，由以下组分组成：胎盘脱细胞基质，6.4g；明胶，8g；壳聚糖，0.2g；琼脂，0.8g；水，80ml。
5.权利要求1～4中任一项所述的基于人源脱细胞基质的生物墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将琼脂加入水中，在98～100℃下搅拌至彻底溶解，得琼脂溶液；
(2)待琼脂溶液冷却至50～70℃时，加入明胶和壳聚糖，搅拌至完全溶解；
(3)待上述溶液冷却至40～50℃时，加入脱细胞基质，混合均匀；即得。
6.权利要求1～4中任一项所述的基于人源脱细胞基质的生物墨水在制备生物支架中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：具体应用时，包括以下步骤：
(1)将权利要求1～4中任一项所述的生物墨水水浴加热至40～50℃，加入到3D生物打印机喷头内；
(2)将打印机喷头温度调至10～20℃，静置10～15min至温度均一；
(3)调整打印速率至6～10mm/s，喷头挤出速率0.5～1.5mm3/s；
(4)进行打印目标的设置，进行打印；
(5)打印结束后，使用交联剂浸泡20～60min；
(6)用水进行冲洗，将残留的交联剂清洗干净，得到湿态生物支架；所述交联剂选自以下物质的溶液：甲醛、乙二醛、戊二醛、京尼平、1,6-己二异氰酸酯、丁二烯二环氧化物、顺丁烯二酸酐、多巴胺盐酸盐；
(7)冻干处理，得到干态生物支架。
8.一种生物支架，其特征在于，通过以下方法制备得到：
(1)将权利要求1～4中任一项所述的生物墨水水浴加热至40～50℃，加入到3D生物打印机喷头内；
(2)将打印机喷头温度调至10～20℃，静置10～15min至温度均一；
(3)调整打印速率至6～10mm/s，喷头挤出速率0.5～1.5mm3/s；
(4)进行打印目标的设置，进行打印；
(5)打印结束后，使用交联剂浸泡20～60min；
(6)用水进行冲洗，将残留的交联剂清洗干净，得到湿态生物支架；
(7)冻干处理，得到干态生物支架。
9.根据权利要求8所述的生物支架，其特征在于：所述交联剂选自以下物质的溶液：甲醛、乙二醛、戊二醛、京尼平、1,6-己二异氰酸酯、丁二烯二环氧化物、顺丁烯二酸酐、多巴胺盐酸盐。
10.权利要求8或9所述的生物支架制备或作为植入性组织工程支架的用途。
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