CN110975010A - 一种胎盘组织基质材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胎盘组织基质材料，是以胎盘组织为原料，通过组织保存、组织处理、灭菌和病毒灭活等技术制备形成的、保留了天然基质结构和基本生物学特性的胎盘细胞外基质，该细胞外基质特别保留了多种活性因子的受体，其制备方法包含以下步骤：组织预处理；灭菌及病毒灭活；去除组织DNA；脱细胞；根据临床具体需求，将脱细胞基质制成凝胶、海绵或粉末等多种形态。本发明的脱细胞基质，是一种具有活性因子受体的特殊支架材料，能主动吸引活体中活性成分到材料中，有助于细胞活性成分聚积，支持细胞迁移、附着、增生和分化，可加速受损伤组织修复，加速局部组织重建。

Description

一种胎盘组织基质材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种胎盘组织基质材料及其制备方法，属于涉医用生物材料以及人体组织工程领域。
背景技术
组织器官的修复与重建一直是组织工程学、生物学、医学领域的研究热点，随着技术的发展，组织工程产品逐渐成为临床上重要的手术修复和替代物，成为目前临床手术治疗及意外等导致的人体组织器官缺失和各种损伤的重要治疗措施。组织工程材料是该种产品研究和开发的基础，可以独立或联合干细胞种子，成为临床上首选的手术修复和替代物。
目前组织工程材料大多以人工合成的和天然的高分子材料作为主要组成成分，其中天然高分子材料(如胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖等)具有更好的生物兼容性，生物活性较高；但这些传统的组织工程材料也存在许多缺点，有些与机体组织整合差，有些力学性能不足，有些在体内降解速率与组织重建不匹配，关键是它们都不能在机体内原位诱导新组织再生。于是，利用物理、化学和生物处理技术(如脱细胞技术、体外酶修饰技术和细胞基因编辑技术等)去除同种异体和异种组织中会引起各种免疫答应反应组成成分后制备获得的组织细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在组织工程和临床再生医学领域起到了显著的作用。
以组织细胞外基质为主要成分构成的组织工程支架材料已广泛应用于人体组织器官修复重建和其它再生医学领域，如心脏瓣膜、血管、神经、肌腱、骨、软骨、皮肤、食道、气管、腹壁、以及许多其它组织。组织细胞外基质是由各种复杂的结构蛋白质和功能蛋白质构成的三维立体框架，主要成分包括胶原纤维、糖蛋白、黏蛋白等，其他成分有氨基葡聚糖(透明质酸、硫酸软骨素)等糖类、一些脂质和生长因子。完整的天然细胞外基质的特点在于其三维结构和组成与体内细胞生长的天然环境接近，既有物理支架材料的作用，又因包含多种活性因子，因此携带诸多细胞生长分化所需的物理、化学和生物信号，提供优良的微环境从而能原位诱导和促进组织修复和重建。天然细胞外基质在原位诱导组织修复再生的过程中重塑整合进入机体，无异物存留；在植入宿主后，基质材料提供初始的生物力学支持，通过与宿主细胞相互作用来调节细胞的行为(如粘附，迁移，增殖和分化)，随着宿主细胞的长入，组织器官基质本身逐步降解和转化成新的组织。
国内外已有不少脱细胞组织基质(acellular tissue matrix,ACTM)材料，其来源包括取自捐献的人遗体和猪羊牛等动物皮肤、脂肪、小肠粘膜、膀胱、前胃、心包膜、隔膜、韧带，心脏瓣膜、血管、神经、肌腱、韧带、骨、软骨、半月板、输尿管、胎盘、羊膜、食道和气管等组织器官。目前全世界已有超过30种脱细胞组织基质产品已上市应用，临床适应症多达80种。
脱细胞组织基质的制备涉及到一系列物理、化学和生物处理工艺步骤，流程复杂。制备的步骤包括组织收集、消毒、保存、脱细胞、去抗原、病毒灭活、终端清洗和灭菌等过程。一般来说，每个处理工艺步骤都会对组织材料产生不同程度的改变，这些变化最终将影响到脱细胞组织基质的结构、组成和性能。比如，在对收集的组织原料做消毒、病毒灭活和预灭菌处理时，化学试剂可能严重地改变组织基质材料的生物化学组成，破环组织基质材料的结构和降低其生物力学性能，影响宿主对植入脱细胞组织基质材料的反应，可致使组织基质产品临床效果难以达到人体组织修复重建的要求。组织材料的消毒、灭菌和病毒灭活的方法有多种，可通过冲洗和稀释来减低细菌、真菌病毒和支原体的数量，采用无菌环境作业防止再次感染；也可在制备溶液中加入抗生素或/和专门的杀菌剂或病毒灭活试剂，对产品做终端灭菌处理。脱细胞组织基质制备过程中的杀菌常用化学氧化剂(过氧乙酸、次氯酸钠、双氧水或碘溶液等)，酒精，酸碱处理(醋酸、盐酸、氢氧化钠)，这些化学试剂对组织基质材料的生物化学组成和结构影响较大。脱细胞和去抗原的方法也有多种，按其作用原理可分为物理、化学和酶解方法。物理和化学处理相结合方法用的较多，如用超声波、增压、冰冻和震荡来破坏细胞，再用洗涤剂清洗细胞成分。酶解的处理方法，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、DNAse和alpha-半乳糖苷酶，可松驰组织紧密度，切断细胞表面和组织胞外基质的联接，去除抗原表位。不同脱细胞和去抗原方法，脱细胞效果和对组织基质的影响或损伤也不一样。从组织原料收集至终端组织基质产品，在整个工艺过程中还存在着另一极为重要的组织材料在保存和运输期间的保鲜问题。组织材料离开机体后很容易降解腐败，如细胞死亡释放出的各种蛋白酶会破坏组织基质材料。方法有冷链储运和保存在含有蛋白酶抑制剂(如苯甲磺酰氟和N-乙基马来酰亚胺)的溶液中。
大量的临床前动物试验和人类临床应用数据表明，不同的组织脱细胞基质产品之间在组织修复和再生性能方面的差异很大，制备过程中组织基质材料特性的改变是导致各种产品临床效果差异的最主要原因。在组织工程科学和生物材料科学领域还有待解决的课题之一是如何在保存、消毒灭菌、脱细胞和去抗原制备时完好地保留组织细胞外基质原有的天然结构和关键生物化学组成成分，使制备的组织基质材料能与宿主机体组织完美整合、诱导新组织产生和组织功能重建。
公开号为CN 107007885A的中国发明专利公开了一种胎盘细胞外基质的制备方法，通过对胎盘组织碎块的去细胞、病毒灭活和冻干处理得到细胞外基质。但其组织碎块大小为0.1mm～2mm，粒径不均匀易造成基质交联不完全，自然状态下无法成胶；且冻干前将组织碎块预先放置在-20℃～-80℃环境中过夜，过快的冷却导致基质内部与表面冻结不同步，会造成冻干后不能形成稳定的多孔结构、物料断裂等不良现象。
发明内容
针对上述现有技术，针对目前组织工程材料与机体组织整合差、降解速率与组织重建不匹配等局限性，本发明提供了一种利用人体胎盘组织制备而成的医用生物材料胎盘组织基质材料。本发明的胎盘组织基质材料不含异体组织的免疫抗原，保留了胎盘组织细胞外基质中的多种活性因子的受体，形态多样(如颗粒，凝胶和多孔支架)。本发明的胎盘组织基质材料可植入到体内组织缺损和创伤处，有助于细胞活性成分聚积，支持细胞迁移、附着、增生和分化，可加速受损伤组织修复。本发明还公开了其制备方法，通过组织保存、脱细胞、病毒灭活、冻干磨粉处理将临床遗弃的胎盘组织去除免疫原性，保留细胞外基质的活性；利用低温研磨和冷冻干燥等处理得到颗粒、凝胶和多孔支架多种形态，能满足不同部位、不同形状的临床需要。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种胎盘组织基质材料，是以胎盘组织为原料，通过组织保存、组织处理、灭菌和病毒灭活等技术制备形成的、保留了天然基质结构和基本生物学特性的胎盘细胞外基质，该细胞外基质特别保留了多种活性因子的受体。该胎盘细胞外基质的制备方法如下：
(1)组织预处理：取胎盘组织，切成组织块(以长宽高各0.2～2cm为宜)，清洗(用生理盐水)(以去除血迹)，然后置于含EDTA的PBS缓冲液(EDTA的浓度为2～10mM)中，摇床震荡清洗(震荡清洗1～6小时，转速100rpm/min)；震荡清洗后做匀浆处理，间歇打碎(10000rpm/min，10s×3次)，得匀浆液，用含EDTA的PBS缓冲液(EDTA的浓度为2～10mM)适当稀释，分装到离心管中，离心(500～2000×g，10min)，得组织沉淀；重复震荡清洗2～3遍，得组织颗粒；
所述胎盘组织，可以是新鲜的胎盘组织，也可以是暂存的胎盘组织，也可以是解冻的冻存胎盘组织；
所述暂存的胎盘组织或冻存胎盘组织，是通过以下方式处理得到的：收集分娩后的新鲜胎盘组织，切成小块(以长宽高各1～5cm为宜)，用生理盐水冲洗，然后浸入含有2～10mM的乙二胺四乙酸钠盐(EDTA钠盐)和2％～10％甘油的磷酸盐平衡的缓冲保护液(pH7.4±0.2)中，或浸入含有抗生素(如庆大霉素、青霉素或链霉素)的磷酸盐平衡的缓冲保护液(pH 7.4±0.2)中；浸泡在该溶液中的胎盘材料可放置在1～15℃中暂存和运输；在该溶液中浸泡2小时后，可将胎盘材料放置在-20℃以下长期保存；
(2)灭菌及病毒灭活：将组织颗粒置于灭菌和病毒灭活溶液中处理(室温下摇床持续震荡0.5～4小时，转速100转/分)；所述灭菌和病毒灭活溶液为含过氧乙酸和乙醇的水溶液，或2％～5％(w/w)的过氧化氢溶液；
优选的，所述灭菌和病毒灭活溶液由以下组分组成：0.05％～0.5％(w/w)过氧乙酸溶液，无水乙醇，水，三者体积比1：1：2；每1千克组织颗粒加入2～10升灭菌和病毒灭活溶液；
(3)去除灭菌和病毒灭活溶液残留：将上述灭菌和病毒灭活过后的组织颗粒离心沉降，倒去上清液，用无菌生理盐水重新悬浮，再次离心沉降进行清洗；
(4)去除组织DNA：将上述清洗后的组织颗粒置于含脱氧核糖核酸酶(DNase I)的溶液中处理(在室温下处理8～24小时，摇床转速100转/分)，以降解DNA大分子，使DNA片段小于200bp；处理后用含EDTA的PBS缓冲液(EDTA的浓度为2～10mM)清洗，再用水清洗；
所述含脱氧核糖核酸酶的溶液中脱氧核糖核酸酶活性为500～10000U/L；
所述组织颗粒与含脱氧核糖核酸酶的溶液的用量比为1：3(g：ml)；
(5)去除细胞成分：将上述DNase处理后的组织颗粒置于洗涤剂中处理(摇床震荡清洗2～6小时，然后500～2000×g离心10min沉降清洗，倒去上清液)，以去除组织细胞；
所述洗涤剂由以下组分组成：5～10mM的HEPES，2～10mM的EDTA钠盐，质量浓度为0.5％～2％的Triton X100或/和脱氧胆酸钠或/和十二烷基磺酸钠，余量为水；
(6)去除洗涤剂残留：用无菌生理盐水重新悬浮上述沉降下来的组织颗粒，再次离心沉降清洗；反复清洗2～3次，沉降得到纯净的胎组织颗粒，即为胎盘组织基质材料。
进一步地，还包括以下步骤：
(7)将所制备的胎盘组织基质与适量生理盐水混合，调至所需要浓度，用高速匀浆仪在液体温度低于25℃下匀浆至稳定的水凝胶状悬浮液，制得基质凝胶，并静置1～3小时让水凝胶状胎盘组织基质重新纤维化，经冷冻干燥，得脱细胞基质海绵；或：将沉降得到纯净的胎盘组织基质直接冻干后研磨成粉，得脱细胞基质粉末。
进一步地，所述基质凝胶中，胎盘组织基质的浓度为1％～8％(体积比)。
进一步地，冷冻干燥的具体程序为：以每分钟0.1～0.5℃程序降温至-40℃，在-40℃预冷1～3小时后，启动真空，将样品架温度升高至-15℃，冻干机箱体压力调至5-50Pa，冻干20～30小时，得到脱细胞基质海绵。
进一步地，研磨成粉的具体方式为：用低温高速研磨仪以10000～20000r/min研磨成粉，过100目筛。
所述新鲜胎盘组织，可通过以下方式获得：
a.组织的采集：采集人员根据供者筛选情况填写《胎盘供者信息调查表》，产妇签订《胎盘捐献知情同意书》，采集前严格核对产妇的姓名、年龄、身份证号码等信息，确认产妇无乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等感染性疾病；
b.胎盘娩出后用0.9％生理盐水冲洗，清除表面血液、羊水及胎粪等污物，置于装有组织储存液(2～10mM乙二胺四乙酸钠盐和2～10％医用甘油的PBS缓冲液，pH 7.4)的无菌采集袋中，4～10℃条件下运送至实验室。
上述方法制备得到的胎盘组织基质材料，较完好的保留了多种活性因子受体。作为再生组织支架材料，它能主动吸引活体中活性成分到材料中，促使细胞活性成分聚积，增进细胞附着、浸润生长、增生和分化，加速局部组织重建。具体应用时，可通过不同处理方式形成基质凝胶、基质海绵和基质粉末三种不同形态。
本发明以临床遗弃的婴儿胎盘组织(包括相连脐带和羊膜附属组织)为原料，制备出了一种新的功能性医用生物材料，该功能性材料不含异体组织的免疫抗原，保留了胎盘组织细胞外基质中的多种细胞生长因子和活性因子受体，且形态多样(可用于不同临床需求的凝胶、微粒和多孔支架等)；植入到体内组织缺损和创伤处，有助于细胞活性成分聚积，支持细胞迁移、附着、增生和分化，可加速受损伤组织修复。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：组织暂存液中的微生物菌落数统计示意图。
图2：溶液中蛋白质分解酶活性检测结果。
图3：冰晶含量结果示意图，其中，左图为结冰量，右图为含水量。
图4：胎盘组织颗粒粒径分布示意图。
图5：胎盘脱细胞基质凝胶的注射实验结果示意图。
图6：胎盘脱细胞基质的HE染色结果示意图，其中，左图为正常胎盘组织，右图为本发明制备的胎盘脱细胞基质。
图7：脱细胞基质海绵的含水量测定结果示意图。
图8：脱细胞基质海绵的电镜扫描示意图。
图9：脱细胞基质海绵的热稳定性结果示意图。
图10：脱细胞基质生物相容性实验结果示意图，其中，A为脱细胞基质海绵移植后1周，B为脱细胞基质海绵移植后2周，C为脱细胞基质海绵移植后4周，D为脱细胞基质海绵移植后8周。
图11：动脉止血时间对比示意图。
图12：肝脏止血时间对比示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1胎盘组织的预处理
步骤如下：
从医院收集的人体胎盘组织(包括附属的脐带和羊膜组织)，如果没有特殊保护措施组织中的细胞会很快开始凋亡，细胞死亡过程中释放出各种蛋白质分解酶，可能对组织细胞外基质产生不良影响；胎盘及其附属组织富含营养物质，在转运时微生物容易滋生，增加产品污染风险。此外，收集的胎盘组织如果不能立刻用于细胞外基质制备，还需要低温冻存，低温冻存对胎盘组织也会有破坏作用。因此，对收集的胎盘组织需要立刻做预处理以保证组织原料的质量。
(1)在用0.9％(w/v)生理盐水冲洗胎盘组织血迹后，将组织保存在以下三种溶液中：
a)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，每升溶液中含有0.24克磷酸二氢钾(KH2PO4)，1.44克磷酸氢二钠(Na2HPO4)，8.0克氯化钠(NaCl)和0.2克氯化钾(KCl)。
b)用上述磷酸盐缓冲液配制的甘油和乙二胺四乙酸二钠溶液中，其中乙二胺四乙酸二钠浓度为5mM和甘油浓度为6％(w/v)。
c)用上述磷酸盐缓冲液配制的甘油和乙二胺四乙酸二钠溶液中，其中乙二胺四乙酸二钠浓度为2mM，甘油浓度为12％(w/v)。
胎盘组织的预处理方法是新鲜胎盘组织放入溶液b)和溶液c)中，然后用冷链(2～10℃)或常温暂存和运输。
(2)微生物检验和蛋白质分解酶检验
为了检验甘油和乙二胺四乙酸二钠溶液抑制胎盘组织中微生物滋生的效果，将胎盘切碎，分别按50克新鲜胎盘组织加入200mL上述三种溶液，储存温度包括在2～8℃冰箱和20～26℃室温，存放时间为4，24和48小时。
在胎盘组织存放4，24和48小时后，将各组样品的溶液稀释1000倍，吸取100微升稀释液用于微生物培养实验，在37℃下用胰蛋白胨大豆琼脂培养基培养3天，计算组织暂存液中的微生物菌落数，如图1所示，在磷酸盐缓冲液中胎盘组织样品中的微生物数量随着时间增加；但是在5mM乙二胺四乙酸二钠+6％(w/v)甘油溶液和2mM乙二胺四乙酸二钠+12％(w/v)甘油溶液中，微生物数量没有随着时间增加，说明用乙二胺四乙酸二钠和甘油配制的溶液可以有效抑制胎盘组织中微生物的活动，有利于胎盘组织保存。
为了检验甘油和乙二胺四乙酸二钠溶液降低胎盘细胞死亡过程中释放的蛋白质分解酶或微生物释放的蛋白质分解酶的效果，在胎盘组织存放4，24和48小时后，吸取预处理溶液用0.2微米过滤器过滤。过滤后的溶液用于蛋白质分解酶活性检测。
溶液中蛋白质分解酶活性的检测采用荧光素标记的Ⅰ型胶原结合物作为底物，用分子探针公司(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oregon,USA)EnzChek Gelatinase-Collagenase试剂盒进行。缓冲液为50mM Tris-HCl溶液，含有150mM氯化钠，5mM氯化钙和0.2mM氮化钠(pH 7.6)。检测时反应溶液包括2.0毫升缓冲液，0.5毫升Ⅰ型胶原结合物底物(10毫克/毫升)，和0.5毫升过滤后的溶液，用485-495nm激发光波长和515-525nm发射光波检测过滤后溶液中的蛋白质分解酶活性。蛋白质分解酶活性与荧光物增加速度之间是双对数关系，如图2所示，在磷酸盐缓冲液中，蛋白质分解酶活性显著高于在5mM乙二胺四乙酸二钠+6％(w/v)甘油溶液和2mM乙二胺四乙酸二钠+12％(w/v)甘油溶液中，说明用乙二胺四乙酸二钠和甘油配制的溶液可以有效降低蛋白质分解酶活性，避免胎盘组织细胞外基质受到蛋白质分解酶的破坏。
(3)甘油溶液预处理对胎盘组织冻存时结冰量和组织脱水程度的影响
将胎盘组织放入含有5mM乙二胺四乙酸二钠和5，10和13％(w/w)的甘油溶液中预处理3小时。处理后用差示扫描量热仪测定来经过不同浓度甘油溶液处理后的胎盘组织在低温冻存时的结冰量和组织脱水程度。每分钟1.5℃将胎盘组织从20℃降到-80℃，在每分钟5℃升温时测量冰晶含量。如图3所示，随着预处理浓液中甘油浓度的增加，处理后胎盘组织的结冰量下降，在低温保存是组织中含水量较高，冻存时组织脱水较少，降低结冰带来的组织破坏。
实施例2胎盘脱细胞基质凝胶的制备
步骤如下：
(1)组织预处理：取新鲜的胎盘组织，切成组织块(长宽高各0.2～2cm)，清洗(用生理盐水)(以去除血迹)，然后置于含EDTA的PBS缓冲液(EDTA的浓度为5mM)中，摇床震荡清洗(震荡清洗4小时，转速100rpm/min)；震荡清洗后做匀浆处理，间歇打碎(10000rpm/min，10s×3次)，得匀浆液，用含EDTA的PBS缓冲液(EDTA的浓度为5mM)适当稀释，分装到离心管中，离心(1000×g，10min)，得组织沉淀；重复震荡清洗3遍，得组织颗粒；
(2)灭菌及病毒灭活：将组织颗粒置于灭菌和病毒灭活溶液中处理(室温下摇床持续震荡2小时，转速100转/分)；所述灭菌和病毒灭活溶液为含过氧乙酸和乙醇的水溶液；
所述灭菌和病毒灭活溶液由以下组分组成：0.3％(w/w)过氧乙酸溶液，无水乙醇，水，三者体积比1：1：2；每1千克组织颗粒加入5升灭菌和病毒灭活溶液；
(3)去除灭菌和病毒灭活溶液残留：将上述灭菌和病毒灭活过后的组织颗粒离心沉降，倒去上清液，用无菌生理盐水重新悬浮，再次离心沉降进行清洗；
(4)去除组织DNA：将上述清洗后的组织颗粒置于含脱氧核糖核酸酶(DNase I)的溶液中处理(在室温下处理16小时，摇床转速100转/分)，以降解DNA大分子，使DNA片段小于200bp；处理后用含EDTA的PBS缓冲液(EDTA的浓度为5mM)清洗，再用水清洗；
所述含脱氧核糖核酸酶的溶液中脱氧核糖核酸酶活性为8000U/L；
所述组织颗粒与含脱氧核糖核酸酶的溶液的用量比为1：3(g：ml)；
(5)去除细胞成分：将上述DNase处理后的组织颗粒置于洗涤剂中处理(摇床震荡清洗4小时，然后1000×g离心10min沉降清洗，倒去上清液)，以去除组织细胞；
所述洗涤剂由以下组分组成：8mM的HEPES，5mM的EDTA钠盐，质量浓度为1％的Triton X100，余量为水；
(6)去除洗涤剂残留：用无菌生理盐水重新悬浮上述沉降下来的组织颗粒，再次离心沉降清洗；反复清洗3次，沉降得到纯净的胎组织颗粒，即为胎盘组织基质材料；
(7)将所制备的胎盘组织基质与适量生理盐水混合，调至所需要浓度(体积比4％)，用高速匀浆仪在液体温度低于25℃下匀浆至稳定的水凝胶状悬浮液，制得基质凝胶。
所述新鲜胎盘组织，通过以下方式获得：
a.组织的采集：采集人员根据供者筛选情况填写《胎盘供者信息调查表》，产妇签订《胎盘捐献知情同意书》，采集前严格核对产妇的姓名、年龄、身份证号码等信息，确认产妇无乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等感染性疾病；
b.胎盘娩出后用0.9％生理盐水冲洗，清除表面血液、羊水及胎粪等污物，置于装有组织储存液(2～10mM乙二胺四乙酸钠盐和2～10％医用甘油的PBS缓冲液，pH 7.4)的无菌采集袋中，4～10℃条件下运送至实验室。
胎盘脱细胞基质凝胶的质量评价：
(1)经检测，步骤(1)高速匀浆得到的胎盘组织颗粒的粒径达到10～200μm，粒径分布见图4。
(2)胎盘组织颗粒离心后使用梅特勒-托利多(METTLER TOLEDO)HC103卤素水分测定仪(失重法)测定沉降胎盘组织的含水量，含水量为87.8％，胎盘组织颗粒浓度达到11.2％(w/v)。
(3)按照QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒说明书方法提取胎盘组织颗粒样品中残留的DNA，用PicoGreen试剂定量检测DNA含量，胎盘组织颗粒中残留的DNA含量为9.5±0.8ng/mg胎盘组织(干重)。未处理的新鲜胎盘组织中DNA含量大于4000ng/mg胎盘组织(干重)，结果显示胎盘组织中DNA已清除99.5％以上。
(4)胎盘组织水凝胶中硫酸粘多糖(sGAG)和透明质酸(HA)含量：使用BioColor公司(County Antrim,UK)的BlyscanTM sGAG试剂盒测定，样品中的硫酸粘多糖含量为43.3±4.4ng/mg胎盘组织(干重)。透明质酸含量为415.8±14.2ng/mg胎盘组织(干重)。
(5)经检测本发明的脱细胞基质仍保留多种细胞生长因子，见表1。
(6)将胎盘脱细胞基质凝胶装入注射器，试用不同型号的针头，浓度6％(w/v)的胎盘组织水凝胶可轻松通过欧标21G(中标8号)针头(内径0.56mm)。临床中可用注射方式使用胎盘组织水凝胶，见图5。
表1
Figure BDA0002286650200000091
Figure BDA0002286650200000101
实施例3胎盘脱细胞基质海绵的制备
步骤如下：实施例2所得基质凝胶，静置2小时让水凝胶状胎盘组织基质重新纤维化，经冷冻干燥，得脱细胞基质海绵。冷冻干燥的具体程序为：以每分钟0.1～0.5℃程序降温至-40℃，在-40℃预冷2小时后，启动真空，将样品架温度升高至-15℃，冻干机箱体压力调至40Pa，冻干25小时，得到脱细胞基质海绵。
胎盘脱细胞基质海绵的质量评价：
(1)将脱细胞的胎盘基质与正常胎盘组织分别进行石蜡包埋，切片行HE染色，显微镜下观察脱细胞的胎盘组织未见明显蓝染的细胞核，见图6。
(2)胎盘脱细胞基质海绵呈乳白色，海绵状，具有弹性，比重为每立方厘米68mg。用梅特勒-托利多(METTLER TOLEDO)HC103卤素水分测定仪测定含水量(失重法)，冻干海绵的含水量为6.2％(w/w)。将脱细胞基质海绵放入生理盐水中复水，样品不散落，挤压出样品中水分后再次放入溶液中，样品能完整地回复原有形状，保持完整的立体结构，见图7。
(3)经测定，本发明的胎盘脱细胞基质海绵吸水率为1140％±121.26，孔隙率为80.84％。脱细胞基质海绵电镜扫描为多孔材料，在不用化学交联或热处理的情况下也能拥有完整和稳定的立体结构，见图8。
(4)胎盘脱细胞基质海绵用生理盐水复水后，密封在坩埚中，用差示扫描量热仪检测样品的热收缩温度。测的时以每分钟2℃的速度从10℃至125℃升温扫描，胎盘组织样品的热变性开始为57.2℃，峰值为60.9℃(见图9)。胎盘组织的热稳定性与新鲜胎盘组织相似。
(5)蛋白质谱分析：为了对胎盘脱细胞基质海绵基因和蛋白功能进行限定和描述，采用GO(gene ontology)数据库在生物学过程(Biological Process,BP)、细胞定位(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function，MF)方面进行归类分析，发现脱细胞的胎盘组织基质保留结构分子活性、细胞粘附分子、生长因子等多种活性分子，存在蛋白耦联型受体、酶耦联型受体等多种受体能够介导细胞间信号转导、细胞间黏合、细胞迁移等生物学过程，特异性修复受损组织，见表2～4。
表2
Figure BDA0002286650200000102
Figure BDA0002286650200000111
表3
Figure BDA0002286650200000112
表4
Figure BDA0002286650200000113
实施例4胎盘组织基质的生物学实验评价
1、细胞毒性试验：
根据GB/T-16886及ISO-10993相关标准，将无菌的组织脱细胞基质海绵浸入α-MEM完全培养液(含10％胎牛血清、10g/L青链霉素)中，于37℃条件下浸提24h获得浸提液。将浸提液与脐带间充质干细胞共培养。培养24h后采用CCK-8法检测细胞毒性，于酶标仪450nm波长处检测OD值。计算细胞相对增殖率(RGR)，RGR＝98.45％，毒性等级为1级，表明组织脱细胞基质海绵无明显细胞毒性。
2、组织再生性能检验：
用前述制备的胎盘组织基质海绵移植到SD大鼠皮下，分别于移植后1周、2周、4周、8周处死后取材，通过外观及组织学观察评价基质海绵材料的组织再生性能(宿主细胞浸入生长和基质海绵重新血管化)。术后1天、3天、7天、14天随机取血进行血常规检测分析，就白细胞总数、淋巴细胞总数、单核细胞总数、粒细胞总数进行分析，实验组未见明显炎性反应，无免疫排斥。通过组织切片HE染色观察到移植后1周基质海绵中即有少量细胞长入，4周可见在基质海绵有新生血管生成，8周已与周围组织融合，见图10。
实施例5胎盘脱细胞基质海绵的止血效果评价
步骤如下：取4只健康成年(2.5～3.0kg)的新西兰白种兔。分别在每只兔耳中央动脉和两片肝叶制造出血创面，采用胎盘脱细胞基质海绵(湿态，使用时挤干，放在生理盐水中吸胀后，再挤干，剪成相应尺寸)及对照胶原蛋白海绵产品(迈科唯公司的胶原海绵，批次201806070104)进行创面止血，分别记录止血时间。
结果显示使用迈科唯公司的胶原海绵对耳动脉切口止血时间是136±19.1s(N＝4)，胎盘组织基质的止血时间是35.3±29.4s(N＝4)。使用迈科唯公司的胶原海绵对肝切口创面止血时间是70.5±31.5s(N＝4)，胎盘组织基质的止血时间是51.5±29.4s(N＝4)。胎盘组织基质止血效果明显优于上市产品迈科唯公司的胶原海绵(P＜0.05)，见图11、图12。
综上所述，采用本发明方法得到的胎盘脱细胞基质去细胞化完整、无异体组织抗原残留、有良好的生物相容性，且能制成粉末状、凝胶状、海绵状等剂型，可满足临床不同部位、不同形状的需要。其保留细胞外基质活性成分，具有多种活性因子受体的，能主动吸引活体中活性成分到材料中，加速局部组织重建，特异性修复受损伤组织、填充组织缺损处，促进组织再生。该发明得到的脱细胞基质可应用于烧伤整形、医学美容、糖尿病足等领域，应用前景良好。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

Claims (10)

1.一种胎盘组织基质材料的制备方法，其特征在于：以胎盘组织为原料制备，包括以下步骤：
(1)组织预处理：取胎盘组织，切成组织块，清洗，然后置于含EDTA的PBS缓冲液中，摇床震荡清洗；震荡清洗后做匀浆处理，间歇打碎，得匀浆液，用含EDTA的PBS缓冲液稀释，分装到离心管中，离心，得组织沉淀；重复震荡清洗2～3遍，得组织颗粒；
(2)灭菌及病毒灭活：将组织颗粒置于灭菌和病毒灭活溶液中处理；所述灭菌和病毒灭活溶液为含过氧乙酸和乙醇的水溶液，或2％～5％的过氧化氢溶液；
(3)去除灭菌和病毒灭活溶液残留：将上述灭菌和病毒灭活过后的组织颗粒离心沉降，倒去上清液，用无菌生理盐水重新悬浮，再次离心沉降进行清洗；
(4)去除组织DNA：将上述清洗后的组织颗粒置于含脱氧核糖核酸酶的溶液中处理，以降解DNA大分子；处理后用含EDTA的PBS缓冲液清洗，再用水清洗；
(5)去除细胞成分：将上述DNase处理后的组织颗粒置于洗涤剂中处理，以去除组织细胞；
(6)去除洗涤剂残留：用无菌生理盐水重新悬浮上述沉降下来的组织颗粒，再次离心沉降清洗；反复清洗2～3次，沉降得到纯净的胎组织颗粒，即为胎盘组织基质材料。
2.根据权利要求1所述的胎盘组织基质材料的制备方法，其特征在于：所述胎盘组织，选自新鲜的胎盘组织或暂存的胎盘组织，或解冻的冻存胎盘组织。
3.根据权利要求2所述的胎盘组织基质材料的制备方法，其特征在于：所述暂存的胎盘组织或冻存胎盘组织，是通过以下方式处理得到的：收集分娩后的新鲜胎盘组织，切成小块，用生理盐水冲洗，然后浸入含有2～10mM的乙二胺四乙酸钠盐和2％～10％甘油的磷酸盐平衡的缓冲保护液中，或浸入含有抗生素的磷酸盐平衡的缓冲保护液中；浸泡在该溶液中的胎盘材料可放置在1～15℃中暂存和运输；在该溶液中浸泡2小时后，可将胎盘材料放置在-20℃以下长期保存。
4.根据权利要求1所述的胎盘组织基质材料的制备方法，其特征在于：所述灭菌和病毒灭活溶液由以下组分组成：0.05％～0.5％过氧乙酸溶液，无水乙醇，水，三者体积比1：1：2；。
5.根据权利要求1所述的胎盘组织基质材料的制备方法，其特征在于：还包括以下步骤：
(7)将所制备的胎盘组织基质与适量生理盐水混合，调至所需要浓度，用高速匀浆仪在液体温度低于25℃下匀浆至稳定的水凝胶状悬浮液，制得基质凝胶，并静置1～3小时让水凝胶状胎盘组织基质重新纤维化，经冷冻干燥，得脱细胞基质海绵；或：将沉降得到纯净的胎盘组织基质直接冻干后研磨成粉，得脱细胞基质粉末。
6.根据权利要求5所述的胎盘组织基质材料的制备方法，其特征在于：所述基质凝胶中，胎盘组织基质的浓度为1％～8％；
或：研磨成粉的具体方式为：用低温高速研磨仪以10000～20000r/min研磨成粉，过100目筛。
7.根据权利要求5所述的胎盘组织基质材料的制备方法，其特征在于：冷冻干燥的具体程序为：以每分钟0.1～0.5℃程序降温至-40℃，在-40℃预冷1～3小时后，启动真空，将样品架温度升高至-15℃，冻干机箱体压力调至5-50Pa，冻干20～30小时，得到脱细胞基质海绵。
8.根据权利要求1所述的胎盘组织基质材料的制备方法，其特征在于：所述含EDTA的PBS缓冲液中，EDTA的浓度为5～10mM；
或：所述含脱氧核糖核酸酶的溶液中，脱氧核糖核酸酶浓度为1000～10000U/L；
或：所述洗涤剂由以下组分组成：5～10mM的HEPES，2～10mM的EDTA钠盐，质量浓度为0.5％～2％的Triton X100或/和脱氧胆酸钠或/和十二烷基磺酸钠，余量为水。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的胎盘组织基质材料的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)组织预处理：取新鲜的胎盘组织，切成组织块，清洗，然后置于含EDTA的PBS缓冲液(EDTA的浓度为5mM)中，摇床震荡清洗(震荡清洗4小时，转速100rpm/min)；震荡清洗后做匀浆处理，间歇打碎(10000rpm/min，10s×3次)，得匀浆液，用含EDTA的PBS缓冲液(EDTA的浓度为5mM)适当稀释，分装到离心管中，离心(1000×g，10min)，得组织沉淀；重复震荡清洗3遍，得组织颗粒；
(2)灭菌及病毒灭活：将组织颗粒置于灭菌和病毒灭活溶液中处理(室温下摇床持续震荡2小时，转速100转/分)；所述灭菌和病毒灭活溶液为含过氧乙酸和乙醇的水溶液；
所述灭菌和病毒灭活溶液由以下组分组成：0.3％过氧乙酸溶液，无水乙醇，水，三者体积比1：1：2；每1千克组织颗粒加入5升灭菌和病毒灭活溶液；
(3)去除灭菌和病毒灭活溶液残留：将上述灭菌和病毒灭活过后的组织颗粒离心沉降，倒去上清液，用无菌生理盐水重新悬浮，再次离心沉降进行清洗；
(4)去除组织DNA：将上述清洗后的组织颗粒置于含脱氧核糖核酸酶的溶液中处理(在室温下处理16小时，摇床转速100转/分)，以降解DNA大分子，使DNA片段小于200bp；处理后用含EDTA的PBS缓冲液(EDTA的浓度为5mM)清洗，再用水清洗；
所述含脱氧核糖核酸酶的溶液中脱氧核糖核酸酶活性为8000U/L；
所述组织颗粒与含脱氧核糖核酸酶的溶液的用量比为1：3；
(5)去除细胞成分：将上述DNase处理后的组织颗粒置于洗涤剂中处理(摇床震荡清洗4小时，然后1000×g离心10min沉降清洗，倒去上清液)，以去除组织细胞；
所述洗涤剂由以下组分组成：8mM的HEPES，5mM的EDTA钠盐，质量浓度为1％的TritonX100，余量为水；
(6)去除洗涤剂残留：用无菌生理盐水重新悬浮上述沉降下来的组织颗粒，再次离心沉降清洗；反复清洗3次，沉降得到纯净的胎组织颗粒，即为胎盘组织基质材料；
(7)将所制备的胎盘组织基质与适量生理盐水混合，调至所需要浓度，用高速匀浆仪在液体温度低于25℃下匀浆至稳定的水凝胶状悬浮液，制得基质凝胶；基质凝胶，静置2小时让水凝胶状胎盘组织基质重新纤维化，经冷冻干燥，得脱细胞基质海绵。冷冻干燥的具体程序为：以每分钟0.1～0.5℃程序降温至-40℃，在-40℃预冷2小时后，启动真空，将样品架温度升高至-15℃，冻干机箱体压力调至40Pa，冻干25小时，得到脱细胞基质海绵。
10.利用权利要求1～9中任一项所述的胎盘组织基质材料的制备方法制备得到的胎盘组织基质材料或基质凝胶或脱细胞基质海绵。
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