CN104955465A - 使用胎盘细胞外基质治疗口腔病变 - Google Patents
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Abstract
本文提供包括细胞外基质(ECM)的组合物和包括ECM组分的组合物在治疗非牙科口腔病变中的用途。
Description
本申请要求2012年12月7日提交的美国临时申请号61/734,665的优先权,所述美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
1.技术领域
本文提供包括细胞外基质(ECM)的组合物和包括ECM组分的组合物在治疗非牙科口腔病变中的用途。
2.发明背景
胶原蛋白是一种细胞外基质蛋白质组分,其在包括支撑皮肤和内脏的腱、骨骼、牙齿和层片的主体中形成许多结构。本领域仍然需要胶原蛋白组合物用于治疗口腔病变。
3.发明概述
在一个方面,本文提供治疗具有口腔病变(例如,不是由牙科程序导致的口腔病变)的个体的方法,包括向所述个体施用包括细胞外基质(ECM)(例如人胎盘ECM)的组合物或包括一种或多种ECM组分的组合物。在某些实施方式中,该组合物直接被施用至所述口腔病变。在其他的实施方式中,该组合物被施用至该口腔病变的至少一部分的相邻处或其周围。在某些实施方式中,该组合物作为糊剂被施用。在某些其他的实施方式中,该组合物以喷雾或气溶胶的形式被施用。在某些其他的实施方式中,该组合物以溶液(例如,以漱口剂)的形式被施用。在某些其他的实施方式中,该组合物作为薄片(sheet)或贴片剂被施用。
在一个实施方式中,该口腔病变由移植物抗宿主病所引起或与其相关联。在另一实施方式中,该口腔病变是、起因于脱屑或与其相关联,例如,是一种脱屑口腔病症。在另一具体的实施方式中,该口腔病变是口疮性溃疡。在具体的实施方式中,该口疮性溃疡由白塞氏病所引起或是该病的一部分。在另一具体的实施方式中,该口疮性溃疡是自发性的。
在某些实施方式中,具有所述口腔病变的所述个体正在经历或已经历造血干细胞治疗。在另一具体的实施方式中,所述个体正在接受或已接受骨髓移植。在更具体的实施方式中,所述造血干细胞治疗包括部分或完全的造血消融。在具体的实施方式中,所述消融包括局部或全身辐射。在另一具体的实施方式中,具有该口腔病变的个体正在经历或已经历头部或颈部放疗。
在另一实施方式中,该口腔病变由化疗(例如,已被施用至该个体以治疗肿瘤、血癌或其他类型的癌症的化疗)所引起或与其相关联。在具体的实施方式中,该口腔病变由具有该口腔病变的该个体使用化疗药物(例如,烷化剂,如氮芥烷基化剂,如美法仑)所引起或与其相关联。在另一具体的实施方式中,该口腔病变是化疗后口腔粘膜炎或化疗引起的口腔粘膜炎。在另一具体的实施方式中,该口腔病变是或被诊断为口疮性口炎,例如,特发性口疮性口炎。在具体的实施方式中,该口腔病变由具有该口腔病变的该个体使用mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)抑制剂所引起或与其相关联。在另一具体的实施方式中,该口腔病变由具有该口腔病变的该个体使用5-氟尿嘧啶所引起或与其相关联。在另一具体的实施方式中,所述个体内所述口腔病变的发展(其中所述个体正在接受或已经接受一种疗程,例如化疗)已经引起了所述疗程的过早终止。在此背景下,“过早终止”是指在为所述个体开具的疗程完成之前,部分或全部地作为所述口腔病变的结果,该疗程终止。
在另一实施方式中,该口腔病变由向所述个体施用抗体所引起或与其相关联。在某些具体的实施方式中,该抗体是抗-CD20抗体。在更具体的实施方式中,该抗体是利妥昔单抗(例如,)、奥法木单抗(例如,)、维妥珠单抗或奥瑞珠单抗。在另一具体的实施方式中,该抗体是抗肿瘤坏死因子抗体。在更具体的实施方式中,该抗体是阿达木单抗(例如,)、依那西普(例如,)、英夫利昔单抗(例如,)、赛妥珠单抗(例如,)、那他珠单抗(例如,)或戈利木单抗(例如,)。在另一具体的实施方式中,所述个体内所述口腔病变的发展(其中所述个体正在接受或已经接受一种抗体疗程)已经引起了所述抗体疗程的过早终止。在此背景下,“过早终止”是指在为所述个体开具的抗体疗程完成之前,部分或全部地作为所述口腔病变的结果,该抗体疗程终止。
在一个实施方式中,使用世界卫生组织口服毒性(WHO-OT)评分对具有口腔病变的该个体进行诊断或评价。在具体的实施方式中,所述施用ECM至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该WHO-OT评分从4级到3级、从3级到2级、从2级到1级、从4级到2级、从4级到1级或从3级到1级的下降。
在另一实施方式中,使用针对口腔粘膜炎的国家癌症研究所常见毒性标准(NCI-CTC)评分对具有口腔病变的该个体进行诊断或评价。在具体的实施方式中,所述施用ECM至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该NCI-CTC评分从4级到3级、从3级到2级、从2级到1级、从1级到0级、从4级到2级、从4级到1级、从4级到0级、从3级到1级、从3级到0级或从2级到0级的下降。
在另一实施方式中,使用口腔粘膜炎评估量表(OMAS)对具有口腔病变的该个体进行诊断或评价,其中所述OMAS包括平均粘膜炎评分、加权平均粘膜炎评分、粘膜炎程度评分和最严重部位评分。在具体的实施方式中,所述施用ECM至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该平均粘膜炎评分、该加权平均粘膜炎评分、该粘膜炎程度评分或该最严重部位评分至少1、至少2、至少3、至少4或至少5分的减少。见Sonis等人,Cancer 85(10):2103-2113(1999)。
在另一实施方式中,使用西方财团癌症护理研究(WCCNR)评分对具有口腔病变的该个体进行诊断或评价。在具体的实施方式中,所述施用ECM至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该WCCNR评分从3级到2级、从3级到1级、从3级到0级、从2级到1级、从2级到0级或从1级到0级的下降。
在另一实施方式中,使用(针对粘膜的)放射治疗肿瘤组(RTOG)评分对具有口腔病变的该个体进行诊断或评价。在具体的实施方式中,所述施用ECM至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该(针对粘膜的)RTOG评分从4级到3级、从3级到2级、从2级到1级、从1级到0级、从4级到2级、从4级到1级、从4级到0级、从3级到1级、从3级到0级或从2级到0级的下降。
在另一实施方式中,该口腔病变由所述个体内颚骨坏死所引起或者与其相关联。在某些具体的实施方式中,所述个体正在接受或已接受双膦酸盐治疗。
在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物包括ECM,例如,来源于人胎盘的ECM。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物由ECM(例如,来源于人胎盘的ECM)组成。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物包括一种或多种ECM组分,例如胶原蛋白,如端肽胶原(即包括一个或多个端肽区的胶原蛋白)、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和/或糖胺聚糖。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物由一种或多种ECM组分,例如胶原蛋白,如端肽胶原(即包括一个或多个端肽区的胶原蛋白)、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和/或糖胺聚糖组成,即,该组合物由一种或多种分离/纯化的ECM组分,例如胶原蛋白组成。
在一个实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物包括胶原蛋白(如端肽胶原)以及基本上不含细胞碎片、亚细胞碎片、其他ECM蛋白(如纤连蛋白和/或层粘连蛋白)、细胞因子和/或生长因子。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物包括相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的总胶原蛋白。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物包括相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),介于75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-98%或98%-99.5%之间的总胶原蛋白。
在某些实施方式中,本文提供的组合物包括胶原蛋白但基本上缺少其他ECM组分,如层粘连蛋白和纤连蛋白。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的包括胶原蛋白的组合物包括相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),少于1%、少于0.5%、少于0.1%、少于0.05%或少于0.01%的层粘连蛋白;或包括介于0.01%-0.05%、0.05%-0.1%、0.1%-0.5%或0.5%-1.0%之间的层粘连蛋白。在某些实施方式中,本文提供的包括胶原蛋白的组合物包括相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),少于1%、少于0.5%、少于0.1%、少于0.05%或少于0.01%的纤连蛋白;或包括介于0.01%-0.05%、0.05%-0.1%、0.1%-0.5%或0.5%-1.0%之间的纤连蛋白。
在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物包括胶原蛋白(如端肽胶原)和弹性蛋白,但基本上缺少其他ECM成分,如层粘连蛋白和纤连蛋白。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物包括相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的弹性蛋白或介于1-5%、5-10%或10-15%之间的弹性蛋白,以及包括少于1%、少于0.5%、少于0.1%、少于0.05%或少于0.01%的层粘连蛋白或包括介于0.01%-0.05%、0.05%-0.1%、0.1%-0.5%或0.5%-1.0%之间的层粘连蛋白;和/或少于1%、少于0.5%、少于0.1%、少于0.05%或0.01%的纤连蛋白或包括介于0.01%-0.05%、0.05%-0.1%、0.1%-0.5%或0.5%-1.0%之间的纤连蛋白。在具体的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物包括相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),大于80%的胶原蛋白、介于10-15%之间的弹性蛋白、少于0.01%的层粘连蛋白和少于0.01%的纤连蛋白。
在某些实施方式中,在本文所述方法中使用的组合物中的ECM(或ECM组分)经洗涤剂处理。在某些实施方式中,在本文所述方法中使用的组合物中的ECM(或ECM组分)经碱处理。在某些实施方式中,在本文所述方法中使用的组合物中的ECM(或ECM组分)经洗涤剂处理并经碱处理。在某些实施方式中,在本文所述方法中使用的组合物中的ECM(或ECM组分)经洗涤剂处理,但不经碱处理。在某些实施方式中,在本文所述方法中使用的组合物中的ECM(或ECM组分)经碱处理,但不经洗涤剂处理。
在某些实施方式中,在本文所述方法中使用的组合物进一步包括多种干细胞,例如,治疗有效量的干细胞的。在各种不同的实施方式中,该干细胞是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、间质干细胞、骨髓源性干细胞、胎盘干细胞、造血祖细胞(如来自外周血、胎儿血、胎盘血、脐带血、胎盘灌洗液等的造血干细胞)、成体干细胞、神经干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、内皮干细胞、心脏干细胞、肌干细胞、脂肪干细胞以及诸如此类。
在具体的实施方式中,该干细胞是胎盘干细胞。在更具体的实施方式中,所述胎盘干细胞为CD34-和/或CD200+。在具体的实施方式中,该胎盘干细胞为CD34-、CD10+、CD105+和CD200+。在某些具体的实施方式中,所述胎盘干细胞表达CD10、CD73、CD105、CD200和/或OCT-4的一种或多种以及不表达CD34、CD38、CD45和/或HLA-G的一种或多种。在某些其他具体的实施方式中,该胎盘干细胞也可以表达HLA-ABC(MHC-1)以及不表达HLA-DR。在另一具体的实施方式中,该胎盘干细胞为CD200+和HLA-G-。在另一具体的实施方式中,该胎盘干细胞为CD73+、CD105+和CD200+。在另一具体的实施方式中,该胎盘干细胞为CD200+和OCT-4+。在另一具体的实施方式中,该胎盘干细胞为CD73+、CD105+和HLA-G-。在另一具体的实施方式中,该胎盘干细胞为CD73+和CD105+,并且当在胎盘细胞群中时,在允许形成胚样体的条件下促进一种或多种胚样体的形成。在另一具体的实施方式中,该胎盘干细胞为OCT-4+,并且当在胎盘细胞群中时,当在允许形成胚样体的条件下培养时,促进包括所述干细胞的分离的胎盘干细胞群中一种或多种胚样体的形成。
在另一具体的实施方式中,例如,当所述组合物是薄片、贴片剂或糊剂形式时,该干细胞粘附于该组合物。在任何上述实施方式的具体的实施方式中,当与该组合物接触时,例如,当该干细胞粘附于该组合物时,该干细胞分泌IL-6、IL-8和/或MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)。
在另一个方面,本文提供用于将包括ECM和/或ECM组分的组合物施用至具有口腔病变的个体的试剂盒。该试剂盒典型地将包括ECM和/或ECM组分的组合物包含在便于分配给本领域技术医师的包装件中。
4.附图说明
图1:示例性用于分离细胞外基质(ECM)的方法的流程图示。
图2A:通过各种方法制备的包括ECM的组合物上生长的胎盘干细胞的IL-6的分泌。横坐标:按组合物类型和组合物上细胞的生长时间的特定生长条件。纵坐标:pg/ml/1000ECM-结合的细胞。NC=无细胞。Purecol=纯化的胶原蛋白。TCPS=组织培养聚苯乙烯。
图2B:通过各种方法制备的包括ECM的组合物上生长的胎盘干细胞的IL-8的分泌。横坐标:按组合物类型和组合物上细胞的生长时间的特定生长条件。纵坐标:pg/ml/1000ECM-结合的细胞。NC=无细胞。Purecol=纯化的胶原蛋白。TCPS=组织培养聚苯乙烯。
图2C:通过各种方法制备的包括ECM的组合物上生长的胎盘干细胞的MCP-1的分泌。横坐标:按组合物类型和组合物上细胞的生长时间的特定生长条件。纵坐标:pg/ml/1000ECM-结合的细胞。NC=无细胞。Purecol=纯化的胶原蛋白。TCPS=组织培养聚苯乙烯。
5.发明详述
5.1使用ECM治疗口腔病变的方法
在本文所述方法中使用的包括ECM和/或ECM组分(例如胎盘ECM或其组分)的组合物,在一个方面,被用于治疗口腔病变,其中所述病变不是由牙科程序或由口腔手术引起的。在某些实施方式中,本文提供一种治疗具有口腔病变的对象的方法,包括向该个体施用,例如,向口腔病变施用,本文所述的治疗有效量的组合物。在此背景下,“治疗有效量”是指起作用以减少或消除该口腔病变的至少一种症状或方面的包括ECM和/或ECM组分的组合物的量。例如,该组合物可以被施用于对象,以修复该病变;或者可以作为姑息剂,例如,以减少由该口腔病变引起的或与其相关联的疼痛或炎症。如本文所使用的,术语“对象”和“个体”是指动物,例如哺乳动物,包括但不限于灵长类(如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方式中,该对象/个体是人。
在某些实施方式中,包括ECM和/或ECM组分的组合物被直接施用至对象的口腔病变。在其他的实施方式中,包括ECM和/或ECM组分的组合物被施用至对象的口腔病变的至少一部分的相邻处或其周围。这种施用可以是,例如,通过将已被配制为薄片的包括ECM和/或ECM组分的组合物放置在该口腔病变的至少一部分或全部之上。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物作为糊剂被施用至口腔病变。在某些其他的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物以喷雾或气溶胶的形式被施用至口腔病变。在某些其他的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物以溶液(例如,以漱口剂)的形式被施用至口腔病变。在某些其他的实施方式中,在本文所述方法中使用的组合物作为基质、凝胶、薄片或贴片剂被施用至口腔病变。
在具体的实施方式中,根据本文所述的方法治疗的口腔病变是、起因于脱屑或与其相关联,例如是脱屑口腔病症。在另一具体的实施方式中,根据本文所述的方法治疗的口腔病变是口疮性溃疡。在具体的实施方式中,该口疮性溃疡由白塞氏病所引起或是该病的一部分。在另一具体的实施方式中,该口疮性溃疡是自发性的。
在某些实施方式中,具有根据本文所述的方法治疗的口腔病变的对象正在经历或已经历造血干细胞治疗。在另一具体的实施方式中,所述对象正接受或已接受骨髓移植。在某些实施方式中,该口腔病变由移植物抗宿主病所引起或与其相关联。在具体的实施方式中,该口腔病变由具有该口腔病变的该个体使用化疗药物(例如,烷化剂,如氮芥烷基化剂,如美法仑)所引起或与其相关联。在更具体的实施方式中,所述造血干细胞疗法或骨髓移植包括部分或完全的造血消融。在具体的实施方式中,所述消融包括局部或全身辐射。
在另一实施方式中,具有根据本文所述的方法治疗的口腔病变的对象正在经历或已经历头部或颈部放疗。
在另一实施方式中,根据本文所述的方法治疗的口腔病变由化疗(例如,已被施用至该个体以治疗肿瘤、血癌或其他类型的癌症的化疗)所引起或与其相关联。在具体的实施方式中,该口腔病变由化疗后口腔粘膜炎或化疗引起的口腔粘膜炎所引起。在另一具体的实施方式中,该口腔病变是或被诊断为口疮性口炎,例如,特发性口疮性口炎。在具体的实施方式,其中该口腔病变由化疗所引起或与其相关,例如,由化疗剂的使用所引起或与其相关联,该化疗剂是,例如,烷基化剂(例如,白消安、顺铂、卡铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、异环磷酰胺、氮芥或美法仑);抗代谢物(例如,5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷或氟达拉滨);具有抗肿瘤效果的抗生素(例如,博莱霉素、更生霉素、柔红霉素、阿霉素或伊达比星);或有丝分裂抑制剂(例如,紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、长春碱、长春新碱或长春瑞滨)。在具体的实施方式中,该口腔病变由具有该口腔病变的该个体使用mTOR(“雷帕霉素的哺乳动物靶标”)抑制剂所引起或与其相关联。在另一具体的实施方式中,该口腔病变由具有该口腔病变的该个体使用5-氟尿嘧啶所引起或与其相关联。
在另一实施方式中,根据本文所述的方法治疗的口腔病变由向对象施用抗体所引起或与其相关联。在某些具体的实施方式中,该抗体是抗-CD20抗体。在更具体的实施方式中,该抗体是利妥昔单抗(例如,)、奥法木单抗(例如,)、维妥珠单抗或奥瑞珠单抗。在另一具体的实施方式中,该抗体是抗肿瘤坏死因子抗体。在更具体的实施方式中,该抗体是阿达木单抗(例如,)、依那西普(例如,)、英夫利昔单抗(例如,)、赛妥珠单抗(例如,)、那他珠单抗(例如,)或戈利木单抗(例如,)。在另一具体的实施方式中,所述个体内所述口腔病变的发展(其中所述个体正在接受或已经接受一种抗体疗程)已经引起了所述抗体疗程的过早终止。在此背景下,“过早终止”是指在为所述个体开具的抗体疗程完成之前,部分或全部地作为所述口腔病变的结果,该抗体疗程终止。
在某些实施方式中,根据本文所述的方法治疗的对象体内口腔病变的进展(其中所述对象正在接受或已经接受一个疗程,例如,放疗、化疗或抗体施用)已经导致或者预期导致所述疗程的过早终止。在此背景下,“过早终止”是指在为所述对象开具的疗程完成之前,部分或全部地作为所述口腔病变的结果,该疗程终止。
在一个实施方式中,使用世界卫生组织口服毒性(WHO-OT)评分对具有口腔病变的该个体进行诊断或评价。在具体的实施方式中,所述施用ECM至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该WHO-OT评分从4级到3级、从3级到2级、从2级到1级、从4级到2级、从4级到1级或从3级到1级的下降。
在另一实施方式中,使用针对口腔粘膜炎的国家癌症研究所常见毒性标准(NCI-CTC)评分对具有根据本文所述的方法治疗的口腔病变的个体进行诊断或评价。在具体的实施方式中,本文所述的施用组合物(即包括ECM(例如,胎盘ECM)或ECM组分的组合物)至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该NCI-CTC评分(针对口腔炎/咽炎[口腔/咽黏膜炎])从4级到3级、从3级到2级、从2级到1级、从1级到0级、从4级到2级、从4级到1级、从4级到0级、从3级到1级、从3级到0级或从2级到0级的下降。
在另一实施方式中,使用口腔粘膜炎评估量表(OMAS)对具有根据本文所述的方法治疗的口腔病变的个体进行诊断或评价,其中所述OMAS包括平均粘膜炎评分、加权平均粘膜炎评分、粘膜炎程度评分和最严重部位评分。在具体的实施方式中,本文所述的施用组合物(即包括ECM(例如,胎盘ECM)或ECM组分的组合物)至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该平均粘膜炎评分、该加权平均粘膜炎评分、该粘膜炎程度评分或该最严重部位评分的一种或更多种的至少1、至少2、至少3、至少4或至少5分的减少。见Sonis等人,Cancer 85(10):2103-2113(1999)。
在另一实施方式中,使用西方财团癌症护理研究(WCCNR)评分对具有根据本文所述的方法治疗的口腔病变的个体进行诊断或评价。在具体的实施方式中,本文所述的施用组合物(即包括ECM(例如,胎盘ECM)或ECM组分的组合物)至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该ACCRN评分从3级到2级、从3级到1级、从3级到0级、从2级到1级、从2级到0级或从1级到0级的下降。
在另一实施方式中,使用(针对粘膜的)放射治疗肿瘤组(RTOG)评分对具有根据本文所述的方法治疗的口腔病变的个体进行诊断或评价。在具体的实施方式中,本文所述的施用组合物(即包括ECM(例如,胎盘ECM)或ECM组分的组合物)至所述个体导致例如在施用后1、2、3、4、5、6或7天内该(针对粘膜的)RTOG评分从4级到3级、从3级到2级、从2级到1级、从1级到0级、从4级到2级、从4级到1级、从4级到0级、从3级到1级、从3级到0级或从2级到0级的下降。
在另一实施方式中,根据本文所述的方法治疗的口腔病变由对象体内颚骨坏死所引起或者与其相关联。在具体的实施方式中,所述对象正在接受或已接受双膦酸盐治疗。
5.2细胞外基质组合物
本文提供可用于本文所提供的治疗方法(即治疗口腔病变的方法)的包括细胞外基质(ECM)和/或ECM组分的组合物。用于本文所述的方法中的该组合物的该ECM和ECM组分可以,在某些实施方式中,从哺乳动物源(如人、牛、羊、绵羊、大鼠源)中获得。用于本文所述的方法中的该组合物的该ECM和ECM组分可以从有袋动物(如袋鼠)中获得。在某些实施方式中,用于本文所述的方法中的该组合物的该ECM和ECM组分从非哺乳动物源中获得,例如,该ECM从鱼中获得。
用于本文所述的方法中的该组合物的该ECM和ECM组分可以从它们所来源的源的任何部分中获得。在某些实施方式中,该ECM可以从,例如,牛皮、小牛皮、大鼠尾、袋鼠尾或鱼皮中获得。在具体的实施方式中,用于本文所述的方法中的该组合物的该ECM和ECM组分从胎盘中获得,例如,该ECM是牛胎盘ECM、羊胎盘ECM或人胎盘ECM。在具体的实施方式中,用于本文所述的方法中的该组合物的该ECM和ECM组分人胎盘中获得。
ECM(例如,人胎盘ECM)的主要组分是胶原蛋白。因此,在本文所述的方法中使用的包括ECM的组合物包括胶原蛋白,例如,端肽胶原和/或无端肽胶原。在具体的实施方式中,本文所述的包括ECM组分的组合物包括胶原蛋白。
在本文所述的方法中使用的该组合物中的该胶原蛋白可以是本领域技术人员已知的任何类型的胶原蛋白或这类胶原蛋白的混合物。在某些实施方式中,该胶原蛋白是包括一种或多种类型的胶原蛋白的胶原蛋白组合物的形式。特定的胶原蛋白包括,例如,I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白和IV型胶原蛋白。在一个实施方式中,在本文所述的方法中使用的包括胶原蛋白的组合物包括I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白,例如,该组合物中的大多数胶原蛋白是I型和IV型胶原蛋白。在某些实施方式中,可用于本文所提供的治疗方法的该组合物包括以干重计,介于1%和15%之间的IV型胶原蛋白、介于2%和13%之间的IV型胶原蛋白、介于3%和12%之间的IV型胶原蛋白或介于4%和11%之间的IV型胶原蛋白(即,该组合物包括ECM,其中该ECM包括这类胶原蛋白;和/或该组合物包括ECM组分,其中之一是这类胶原蛋白)。在某些实施方式中,可用于本文所提供的治疗方法的该组合物包括以干重计,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%或至少99%的I型胶原蛋白(即,该组合物包括ECM,其中该ECM包括这类胶原蛋白;和/或该组合物包括ECM组分,其中之一是这类胶原蛋白)。在某些实施方式中,可用于本文所提供的治疗方法的该组合物包括以干重计,介于70%和95%之间的I型胶原蛋白、介于74%和92%之间的I型胶原蛋白或介于80%至90%之间的I型胶原蛋白(即,该组合物包括ECM,其中该ECM包括这类胶原蛋白;和/或该组合物包括ECM组分,其中之一是这类胶原蛋白)。在某些实施方式中,可用于本文所提供的治疗方法的该组合物包括以干重计的III型胶原蛋白,例如高达1%、高达2%、高达3%、高达4%、高达5%、高达为6%或高达7%的III型胶原蛋白(即,该组合物包括ECM,其中该ECM包括这类胶原蛋白;和/或该组合物包括ECM组分,其中之一是这类胶原蛋白)。在某些实施方式中,可用于本文所提供的治疗方法的该组合物包括以干重计,介于2%和15%之间的IV型胶原蛋白、介于70%和95%的I型胶原蛋白以及高达6%的III型胶原蛋白(即,该组合物包括ECM,其中该ECM包括这类胶原蛋白;和/或该组合物包括ECM组分,其中之一是这类胶原蛋白)。
在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的包括胶原蛋白的组合物包括至少一种附加的ECM组分,例如,弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和/或糖胺聚糖。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的包括胶原蛋白的组合物缺乏或包括最小量的一种或多种通常与ECM相关联的组分,例如,包括ECM组分的组合物包括胶原蛋白,但缺乏(或包括最小量的)一种或多种弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和/或糖胺聚糖。在具体的实施方式中,在本文所述的方法中使用的包括胶原蛋白的组合物不包括可检测到的纤连蛋白;或不包括可检测到的层粘连蛋白;或不包括可检测到的层粘连蛋白或纤连蛋白。在具体的实施方式中,在本文所述的方法中使用的包括胶原蛋白的组合物不包括可检测到的葡萄糖胺聚糖。
在具体的实施方式中,在本文所述的方法中使用的包括胶原蛋白的组合物可以包括(i)相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),至少或约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的总胶原蛋白;或相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),介于75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-98%或98%-99.5%之间的总胶原蛋白;(ii)相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),少于1%、少于0.5%、少于0.1%、少于0.05%或少于0.01%的层粘连蛋白;或相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),介于0.01%-0.05%、0.05%-0.1%、0.1%-0.5%或0.5%-1.0%之间的层粘连蛋白;和/或(iii)相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),少于1%、少于0.5%、少于0.1%、少于0.05%或少于0.01%的纤连蛋白;或相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),介于0.01%-0.05%、0.05%-0.1%、0.1%-0.5%或0.5%-1.0%之间的纤连蛋白。在另一具体的实施方式中,该组合物包括相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),至少或约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的弹性蛋白;或相比于该组合物中的总蛋白量(如以干重计),介于1-5%、5-10%或10-15%之间的弹性蛋白。在另一具体的实施方式中,该组合物包括以干重计,约5%的弹性蛋白。在另一具体的实施方式中,该组合物包括以干重计,约10%的弹性蛋白。在另一具体的实施方式中,该组合物包括以干重计,不超过约5%的弹性蛋白。在另一具体的实施方式中,该组合物包括以干重计,超过约10%的弹性蛋白,例如,该组合物包括以干重计,11%、12%、13%、14%、15%或大于15%的弹性蛋白。
在某些实施方式中,在本文所述方法中使用的组合物的ECM和ECM组分可通过下述方法之一获得。
在某些实施方式中,本文所述的组合物中的胶原蛋白,例如本文所述的组合物的ECM中的胶原蛋白,是例如,用交联剂交联的。在某些实施方式中,该交联剂是戊二醛。见,例如,美国专利号4,852,640、5,428,022、5,660,692和5,008,116以及McPherson等人,1986,J.Biomedical MaterialsRes.20:79-92,其内容以引用方式被整体并入本文。进一步的示例性交联剂和交联胶原蛋白的方法被描述于美国专利号5,880,242和6,117,979以及Zeeman等人,2000,J Biomed Mater Res.51(4):541-8,van Wachem等人,2000,J Biomed Mater Res.53(1):18-27,van Wachem等人,1999,J Biomed MaterRes.47(2):270-7,Zeeman等人,1999,J Biomed Mater Res.46(3):424-33,Zeeman et al.,1999,Biomaterials 20(10):921-31,其内容以引用方式被整体并入本文。
在进一步的实施方式中,本文所述的组合物中的胶原蛋白,例如本文所述的组合物的ECM中的胶原蛋白,是用1,4-丁二醇二缩水甘油基醚交联的。在进一步的实施方式中,本文所述的组合物中的胶原蛋白,例如本文所述的组合物的ECM中的胶原蛋白,是用京尼平(一种无毒、天然存在的交联剂)交联的。京尼平可以从其母体化合物栀子苷中得到,栀子苷可以从栀子果实中分离得到。京尼平可以市购自嘉年生化产品有限公司(Challenge Bioproducts Co.,Ltd.),中国台湾台中自强街道404号63巷25弄7号,电话886-4-3600852。京尼平作为交联试剂的用途被广泛描述于美国专利申请公开号2003/0049301,其内容以引用方式被整体并入本文。
本文所述的组合物中的胶原蛋白,例如本文所述的组合物的ECM中的胶原蛋白,是用单一交联剂或用交联剂的混合物交联的。在某些实施方式中,本文所述的组合物中的ECM或本文所述的包括胶原蛋白的组合物中的胶原蛋白(即,包括ECM组分的组合物,其中至少一种组分是胶原蛋白)包括用戊二醛交联的经碱处理和/或经清洁剂处理的人胎盘胶原蛋白。在某些实施方式中,本文所述的组合物中的ECM或本文所述的包括胶原蛋白的组合物中的胶原蛋白(即,包括ECM组分的组合物,其中至少一种组分是胶原蛋白)包括用戊二醛交联的经碱处理,但未经清洁剂处理的人胎盘胶原蛋白。在某些实施方式中,本文所述的组合物中的ECM或本文所述的包括胶原蛋白的组合物中的胶原蛋白(即,包括ECM组分的组合物,其中至少一种组分是胶原蛋白)包括用戊二醛交联的经清洁剂处理,但未经碱处理的人胎盘胶原蛋白。在某些实施方式中,本文所述的组合物中的ECM或本文所述的包括胶原蛋白的组合物中的胶原蛋白(即,包括ECM组分的组合物,其中至少一种组分是胶原蛋白)包括用戊二醛交联的经碱处理并经清洁剂处理的人胎盘胶原蛋白。
本文所述的组合物中的胶原蛋白,例如本文所述的组合物的ECM中的胶原蛋白可以用本领域技术人员已知的任何酶介导的交联技术交联。例如,本文所述的组合物中的胶原蛋白,例如本文所述的组合物的ECM中的胶原蛋白可以例如,通过描述于例如,Orban等人,2004,J.Biomedical MaterialsRes.68(4):756-62中的方法,通过转谷氨酰胺酶交联。
5.3用于制备ECM的方法
在某些实施方式中,在本文所述的组合物中使用的ECM或衍生本文所述的包括ECM组分的组合物的ECM组分的ECM根据本文所述的方法从人胎盘中制备得到。胎盘组织可以来自胎盘的任何部分,包括羊膜(可溶性或不溶性或两者兼具)、绒毛膜、脐带;或来自整个胎盘。在某些实施方式中,该ECM从脐带之外的整个人胎盘中制备得到。在某些其他的实施方式中,该ECM从羊膜或脐带之外的整个胎盘中制备得到。
ECM来源的胎盘优选地在正常健康的婴儿正常分娩后或剖宫产分娩后尽快取用。有利的是,该胎盘是在无菌条件下收集的。该胎盘,在某些实施方式中,在任何进一步处理之前自分娩时间起被储存48小时。在其他的实施方式中,该胎盘在任何进一步处理之前自分娩时间起被储存长达5天。
可将该胎盘和可选地,脐带从分娩室或产房转运到另一个位置,例如,实验室,用于进一步处理。该胎盘可以在可选地绝热的无菌转运装置(诸如无菌袋或容器)中被转运。在一些实施方式中,该胎盘在室温下被储存,直到进一步处理。在其他的实施方式中,该胎盘被冷藏,即被储存在约2℃到8℃的温度下,直至进一步处理。该胎盘在进一步处理之前,可以在无菌条件下储存长达5天。该胎盘优选地在无菌条件下,如本领域技术人员所已知的,即在可以装备有HEPA过滤系统的实验室(由清洁室分类所定义,具有1000级或更高级别)中被处理和加工。
该胎盘优选地是放血的,即在获得ECM之前,完全耗尽分娩后残留的脐带血。在一些实施方式中,该胎盘是70%放血、80%放血、90%放血、95%放血或者99%或更高比例放血的。
可以使用本领域技术人员已知的标准技术,例如,遵循FDA法规,对准妈妈进行分娩前针对传染病(包括但不限于HIV、HBV、HCV、HTLV、梅毒、CMV)已知病原体以及已知污染胎盘组织的其他病毒性病原体的筛查。可以在分娩一个月之内,尤其在分娩两周内、分娩一周内或分娩时对准妈妈进行筛查(例如,血液取样用于诊断目的)。优选地,只有收集自对上述病原体测试阴性或非反应性的供体的组织被用于生产ECM。获取胎盘膜供体的全面的父系史、病史以及社会史(包括例如,详细的家族史)是有利的。
在某些实施方式中,使用本领域技术人员已知的标准的血清学和细菌学测试筛查供体。例如,供体筛查可以包括使用本领域技术人员已知的标准抗原检测技术,使用,例如抗体筛查(ATY);丙氨酸氨基转移酶筛查(ALT);乙型肝炎核心抗体(核酸和ELISA);乙肝表面抗原;丙型肝炎病毒抗体;HIV-1和HIV-2;HTLV-1和HTLV-2;梅毒试验(RPR);CMV抗体检测;和/或丙型肝炎和HIV测试。所使用的测定法可以是本领域技术人员已知的基于核酸的测定法或基于ELISA的测定法。
来自新生儿脐带的血液可使用本领域技术人员已知的标准技术测试(见,例如,Cotorruelo等人,2002,Clin.Lab.48(56):27181;Maine等人,2001,Expert Rev.Mol.Diagn.,1(1):1929;Nielsen等人,1987,J.Clin.Microbiol.25(8):140610)。在一个实施方式中,使用本领域技术人员已知的标准技术对来自新生儿脐带的血液进行细菌病原体(包括但不限于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌)和/或真菌测试。新生儿脐带血的血型和Rh因子可以使用本领域技术人员已知的标准技术来确定。在另一实施方式中,使用本领域技术人员已知的标准技术从来自新生儿脐带的血液中获得全血细胞分类计数(CBC)。在仍然另一实施方式中,使用本领域技术人员已知的标准方法从来自新生儿脐带的血液中获取需氧细菌培养物。只有收集自具有正常限制内(例如,无肉眼观察到的异常或偏离正常水平)的CBC,测试为血清学和细菌学阴性以及测试为传染病和污染阴性或无反应性的供体的组织被用来生产ECM。
一旦获得人胎盘组织,其可以,例如,根据以下步骤进行处理以制备ECM。虽然以下步骤顺次给出,本领域技术人员将会认识到的是,几个步骤的顺序可以互换。假设对本领域技术人员非常显而易见的技术,如缓冲液交换、沉淀、离心、再悬浮、稀释和蛋白质组合物浓缩,不必详细说明。示例性的制备在下文的实施例中说明。
该胎盘的任何部分或整个胎盘可以在本文所述的方法中使用。在某些实施方式中,ECM制备自整个胎盘或自该胎盘的绒毛膜或羊水部分。
脐带可分离自胎盘盘,并且羊膜可分离自绒毛膜。羊膜可以在切割胎盘膜之前分离自绒毛膜。羊膜自绒毛膜的分离可以从胎盘膜的边缘开始,并可以使用钝器解剖法,例如,用戴手套的手指从绒毛膜分离。羊膜自绒毛膜和胎盘盘分离之后,脐带残端可以,例如用剪刀切割并且从胎盘盘拆下。在某些实施方式中,当羊膜和绒毛膜的分离非撕裂组织不可时,羊膜和绒毛膜可作为单片切割自胎盘盘,然后将它们剥离开。
在用于本文所述的方法之前,羊膜、绒毛膜或整个胎盘可以储存起来。示例性的储存技术被描述于美国专利申请公开号2004/0048796和2003/0187515,其内容以引用方式被整体并入本文。
在获取ECM之前,胎盘组织可以进行脱细胞。胎盘组织可根据本领域中技术人员已知的任何技术(例如美国专利申请公开号2004/0048796和2003/0187515中所述的技术,其内容以引用方式被整体并入本文)来进行脱细胞。
在某些实施方式中,胎盘组织经受渗透压休克、洗涤剂处理和/或碱处理。虽然不希望受任何具体的操作理论的束缚,但据信该渗透压休克可以使该组织中的细胞爆炸,从而有利于去除细胞、细胞组分和血液组分。渗透压休克可以与任何其他澄清步骤一起或者其可以是唯一的澄清步骤。
该渗透压休克可以在本领域技术人员已知的任何渗透压休克条件下进行。这类条件包括:在高渗透势(osmotic potential)的或低渗透势的或高和低渗透势交替的溶液中孵育组织。高渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何高渗透势溶液,如包括NaCl(如0.2M至1.0M)、KCl(如0.2M到1.0M或2.0M)、硫酸铵、单糖、二糖(如20%的蔗糖)、亲水性聚合物(如聚乙二醇)、甘油等的一种或多种的溶液。在某些实施方式中,高渗透势溶液是氯化钠溶液。在一些实施方式中,该氯化钠溶液是至少0.25M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、1.75M、2M、2.25M或2.5M的NaCl。在一些实施方式中,该氯化钠溶液是约0.25M至5M、约0.5M至4M、约0.75M至3M、或约1.0M至2.0M的NaCl。
低渗透势溶液可以是本领域技术人员已知的任何低渗透势溶液,例如水(如根据技术人员已知的任何方法去离子的水)。在一些实施方式中,渗透压休克溶液包括渗透压休克势小于50mM NaCl的水。
在某些实施方式中,该渗透压休克使用氯化钠溶液,继之以水溶液来完成。在各种实施方式中,该氯化钠溶液是至少0.5M的NaCl、至少0.75M的NaCl、至少1.0M的NaCl、至少1.5M的NaCl或至少2.0M的NaCl。在某些实施方式中,一次0.5M NaCl处理之后是水洗。在某些实施方式中,两次连续的0.5M NaCl处理之后是水洗。在某些实施方式中,一次2M氯化钠处理之后是水洗。这些顺序可以根据本领域技术人员的判断被重复。
在某些实施方式中,用洗涤剂处理胎盘组织。在某些实施方式中,用洗涤剂处理该渗透压休克所产生的组合物。该洗涤剂可以是本领域技术人员的已知能够破坏细胞或亚细胞膜的任何洗涤剂。在某些实施方式中,该洗涤剂是离子的。例如,在某些实施方式中,该洗涤剂是脱氧胆酸盐、脱氧胆酸或十二烷基硫酸钠。在某些实施方式中,该洗涤剂是两性离子的。在某些实施方式中,该洗涤剂是非离子的。例如,在某些实施方式中,该洗涤剂可以是吐温洗涤剂(如吐温)或曲通X洗涤剂(如曲通X100)。该组合物可在据本领域技术人员判断,适用于从该组合物中去除不需要的组分的条件下与该洗涤剂接触。在下文的工作实施例中提供示例性条件。
在某些实施方式中,该洗涤剂处理于约0℃至30℃、约5℃至25℃、约5℃至20℃或约5℃至15℃下进行。在某些实施方式中,该洗涤剂处理于约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃或约30℃下进行。在具体的实施方式中,该洗涤剂处理于约5℃至15℃下进行。
在某些实施方式中,该洗涤剂处理可进行约1-24小时、约2-20小时、约5-15小时、约8-12小时或约2-5小时。
在某些实施方式中,胎盘组织用碱处理。在某些实施方式中,渗透压休克和/或洗涤剂处理所产生的组合物可以可选地用碱处理(例如,通过在碱性溶液中洗涤该ECM)一次或多次。用于碱处理的示例性碱包括生物相容性碱、挥发性碱或本领域技术人员已知容易且安全地从该ECM去除的碱。该碱可以是本领域技术人员已知的浓度为,例如0.2M至1.0M的任何有机或无机碱。在某些实施方式中,该碱是氢氧化铵、氢氧化钾或氢氧化钠,如氢氧化铵溶液、氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液。该氢氧化钠溶液可以是,如0.1M的NaOH、0.25M的NaOH、0.5M的NaOH或1M的NaOH。在具体的实施方式中,该碱处理在0.1M或0.5M的NaOH中进行。
在某些实施方式中,该碱处理于约0℃至30℃、约5℃至25℃、约5℃至20℃或约5℃至15℃下进行。在某些实施方式中,该碱处理于约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃或约30℃下进行。在具体的实施方式中,该碱处理于约5℃至15℃下进行。
在某些实施方式中,该碱处理可进行约1-24小时、约2-20小时、约5-15小时、约8-12小时或约2-5小时。
该洗涤剂和碱处理(如氢氧化钠)步骤的变体可用于生成最终ECM材料的许多变体,以用于在本文所述的方法中使用的组合物。例如,在某些实施方式中,含ECM的组织可以用约0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或约0.5M的NaOH处理约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或约24小时,以便生成具有不同量的某些组分的ECM。
在某些其他的实施方式中,存在于本文所述的组合物中的ECM未经碱处理而产生。在其中省略了碱处理步骤的实施方式中,所产生的ECM比使用除了包含碱处理之外相同的方法所产生的ECM包括更高量的弹性蛋白、纤连蛋白和/或层粘连蛋白。
在某些实施方式中,该ECM被干燥。干燥便于该ECM的储存和包装。干燥也使得细胞组分更容易从该ECM中去除。任何上述步骤后,例如,该ECM可以在后续步骤之前进行干燥。干燥可以根据对本领域技术人员来说显而易见的任何用于干燥的技术进行。有用的干燥技术被描述于美国专利公开号2004/0048796,其内容以引用方式被整体并入本文。示例性干燥技术包括,例如,冷冻干燥、真空干燥、加热(如低于约50℃)或冷冻干燥,如下文的工作实施例所示。
在某些实施方式中,ECM制备中的任何或所有步骤都在无菌条件下进行。在具体的实施方式中,碱处理以及所有后续步骤都是在无菌条件下进行的。在进一步的实施方式中,根据本文所述的方法制备的任何ECM组合物可根据对本领域技术人员来说显而易见的技术进一步灭菌。
在某些实施方式中,用于制备该ECM的方法包括按顺序进行的如上所述的渗透压休克、冷冻干燥、洗涤剂处理、第一水洗、冷冻干燥、碱处理、第二水洗和干燥步骤(如冷冻干燥)。在某些实施方式中,该洗涤剂是脱氧胆酸盐,如1%的脱氧胆酸盐。在某些实施方式中,该碱处理是达,如四小时的0.5N NaOH。在某些实施方式中,该第一水洗被重复(共两次第一洗涤)。在某些实施方式中,该第二水洗被重复两次(总共三次第二洗涤)。在某些实施方式中,该洗涤剂是1%的脱氧胆酸盐,该碱处理是达四小时的0.5N NaOH,该第一水洗被重复(共两次洗涤)以及第二水洗被重复两次(总共三次洗涤)。在某些实施方式中,这类方法可提供包括相比该组合物中的总蛋白(如以干重计),约0.5-0.7%(如0.59%糖胺聚糖)、约3-5%(如3.5%)弹性蛋白、很少或没有可检测到的纤连蛋白以及很少或没有可检测到的层粘连蛋白的组合物。
在某些实施方式中,包括ECM的组合物通过使组织(如胎盘组织)经受例如,如上述,渗透压休克、碱处理和水洗而获得。在某些实施方式中,这些步骤按顺序进行。在某些实施方式中,该碱处理是达,如四小时的NaOH,如0.5N NaOH。在某些实施方式中,这类制备所产生的包括ECM或ECM组分的组合物包括相比该组合物中的总蛋白(如以干重计),约0.2-0.4%或约0.28%至约0.38%的糖胺聚糖、约3-5%或约3.2%至约4.7%的弹性蛋白、很少或没有(如小于0.1%或小于0.01%)的纤连蛋白以及很少或没有(如小于0.1%或小于0.01%)的层粘连蛋白。
在某些实施方式中,包括ECM的组合物通过使组织(如胎盘组织)经受例如,如上述,渗透压休克、洗涤剂处理和水洗步骤而获得。在某些实施方式中,这些步骤按顺序进行。在某些实施方式中,该洗涤剂是脱氧胆酸盐,如1%的脱氧胆酸盐。在某些实施方式中,这类方法可提供包括ECM或ECM组分的组合物,其中所述组合物包括约0.3%-0.5%(如约0.4%)的糖胺聚糖、约10-15%(如约12%)的弹性蛋白、约0.2-1.0%(如约0.6%)的纤连蛋白以及约0.1-0.3%(如约0.16%)的层粘连蛋白。
5.4可选的进一步的处理
在某些实施方式中,本文提供的组合物的ECM中(或包括ECM组分的组合物中)的胶原蛋白包括端肽胶原,即ECM中的胶原蛋白包括端肽胶原。这类端肽胶原可以在某些实施方式中,被用作包括无端肽胶原(例如,已去除端肽的胶原蛋白)的组合物的来源。包括无端肽胶原的组合物可为了对本领域技术人员来说显而易见的任何目的,被用于无端肽胶原。
在这类实施方式中,这类组合物中包括端肽胶原的ECM可接触能够部分或完全地从其中所含的胶原蛋白中去除端肽的酶。该酶可以是本领域技术人员已知的能够从胶原蛋白去除端肽的任何蛋白水解酶。在某些实施方式中,该酶是胃蛋白酶或木瓜蛋白酶。一般地,该酶在本领域技术人员已知的合适于去除端肽的条件下接触该组合物。用酶处理包括端肽胶原的组合物以从这类胶原蛋白去除端肽的方法被描述于,例如,美国专利号4,511,653、4,582,640、5,436,135和6,548,077,其内容以引用方式被整体并入本文。
在某些实施方式中,该包括端肽胶原的组合物于约15℃至40℃、约20℃至35℃、约25℃至30℃、约20℃至30℃或约23℃至27℃接触胃蛋白酶。在具体的实施方式中,该包括端肽胶原的组合物于约23℃至27℃接触胃蛋白酶达足以去除端肽的时间。该组合物可以接触该酶达足以去除端肽的时间。在某些实施方式中,例如,该组合物接触胃蛋白酶达至少5、10、15、20、25或30小时。在某些实施方式中,该组合物接触胃蛋白酶达约5至30小时、约10至25小时或约20至25小时。在某些实施方式中,该组合物接触胃蛋白酶达约8、16、24或32小时。
该组合物,在某些实施方式中,按适用于从该ECM中的胶原蛋白基本上去除所有端肽的量接触该酶。在一些实施方式中,约0.1g、0.5g、1.0g、2.0g或5.0g胃蛋白酶/kg以干重计的ECM接触该包括端肽胶原的ECM。在其他的实施方式中,约0.1g、0.5g、1.0g、2.0g或5.0g的胃蛋白酶/胎盘接触该包括端肽胶原的ECM。在某些实施方式中,该组合物接触约0.1至10.0g/L、约0.5至5g/L、约1至2.5g/L或约0.5至1.5克/L的胃蛋白酶。在一些实施方式中,该组合物接触约0.1g/L、约0.2g/L、约0.5g/L、约1.0g/L、约2.0g/L、5g/L或10g/L的胃蛋白酶。在具体的实施方式中,该组合物于约23℃至27℃接触含于pH值约2-3的乙酸溶液的约0.5至1.0g/L的胃蛋白酶达约16-24小时。
该包括ECM和/或ECM组分的组合物可以接触酶,该酶含于与胎盘的体积比适用于从该组合物中的端肽胶原去除端肽的溶液。据观察,胃蛋白酶与胎盘的高体积比可以使胃蛋白酶的影响最大化。在某些实施方式中,使用约1、2、4或8体积的乙酸溶液/胎盘。在具体的实施方式中,使用约2体积的乙酸溶液/胎盘。
如果需要的话,该包括ECM和/或ECM组分的组合物可例如,如美国专利号4,511,653、4,582,640和5,436,135(其内容以引用方式被整体并入本文)中所述,通过纤维性颤动进一步处理。如果必要的话,该组合物可以在纤维性颤动之前根据标准的技术进行浓缩。
在需要时,该包括ECM和/或ECM组分的组合物的一种或多种组分(如胶原)可以是交联的。在某些实施方式中,该组合物在交联之前进行纤维性颤动。该交联可用本领域技术人员已知的任何交联剂(如上所述的交联剂)进行。在某些实施方式中,该交联剂是戊二醛,以及该交联可以根据本领域技术人员已知的胶原蛋白的戊二醛交联方法进行。在其他的实施方式中,该交联剂是1,4-丁二醇二环氧甘油醚或京尼平。
在一些实施方式中,本文所述的组合物中存在的交联剂和胶原蛋白之间的共价键可以被减少,例如以改善稳定性。还原可以通过,例如使该组合物中的胶原蛋白(例如,包括ECM的组合物的ECM中的胶原蛋白或包括ECM组分的组合物中的胶原蛋白,其中至少一种组分是胶原蛋白)接触本领域技术人员已知的任何还原剂而实现。在某些实施方式中,该还原剂是硼氢化钠、亚硫酸氢钠、β-巯基乙醇、巯基乙酸、巯基乙胺、苄基硫醇、甲苯硫酚、二硫苏糖醇或膦(如三丁基膦)。在某些实施方式中,该胶原蛋白在用该还原剂还原之前进行交联。胶原蛋白(如交联的胶原蛋白)的还原被描述于美国专利号4,185,011、4,597,762、5,412,076和5,763,579,其内容以引用方式被整体并入本文。
在某些实施方式中,该包括ECM和/或ECM组分的组合物可以根据本领域技术人员已知的方法通过机械剪切被进一步处理。示例性剪切技术被描述于美国专利号4,642,117,其内容以引用方式被整体并入本文。在某些实施方式中,该包括ECM和/或ECM组分的组合物用组织匀浆器进行剪切。
在某些实施方式中,可采取步骤以限制在本文所述的方法中使用的组合物中的天然蛋白酶活性。蛋白酶次优条件可通过将该组合物进行配制以消除或限制溶液中可用的钙和锌离子的量来实现。许多蛋白酶在钙和锌离子的存在下是有活性的而在不含钙和锌离子的环境中则失去其大部分活动。添加剂,例如金属离子螯合剂,如1,10-菲咯啉和乙二胺四乙酸(EDTA),因此创建不利于许多蛋白水解酶的环境。有利的是,用于本文所述的方法中的组合物可以通过选择pH的条件、降低的钙和锌离子的可用性、金属离子螯合剂的存在以及使用对胶原酶具有特异性的蛋白水解酶抑制剂而得以制备。例如,组合物可以包括不含钙和锌离子以及包括金属离子螯合剂(例如EDTA)的pH为5.5至8或pH为7至8的缓冲水溶液。此外,也可采用胶原组合物的处理过程中温度和时间参数的控制以限制蛋白酶的活性。
5.5该组合物的表征
5.5.1生化表征
本领域已知的以及本文所列举的基于生化的测定法可以被用于确定可用于本文所提供的方法中的组合物的生化成分。例如用于蛋白质含量的基于吸光度的测定法包括但不限于测量280nm处(见,例如,Layne,E,Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins,Methods in Enzymology 3:447-455,(1957);Stoscheck,C M,Quantitation ofProtein,Methods in Enzymology 182:50-69,(1990))、205nm处的吸光度以及基于样本的消光系数的测定法(见,例如,Scopes,R K,AnalyticalBiochemistry 59:277,(1974);Stoscheck,C M.Quantitation of Protein,Methods in Enzymology 182:50-69,(1990))。可以使用已知的测定法对组合物进行,例如,I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和/或糖胺聚糖的一种或多种的表征。
基于比色的测定法可以包括但不限于修饰的Lowry测定法、缩二脲测定法、Bradford测定法、二喹啉甲酸(史密斯)测定法(见,例如,Stoscheck,C M,Quantitation of Protein,Methods in Enzymology 182:50-69(1990))。
在具体的实施方式中,对本文所提供的组合物的总蛋白质含量的测量包括Bradford染料结合测定法(Bradford,M.,Analytical Biochemistry,72,248(1976),其内容以引用方式被整体并入本文)的使用。Bradford测定法可以,例如,使用通过美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的BIO-RAD可得的Bradford染料结合测定法进行。蛋白质测定法基于响应于不同浓度的蛋白质,染料考马斯亮蓝R-250的颜色变化。该测定法可涉及,例如,通过测量已知浓度的相关蛋白质(如胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等)的一系列人类标准的吸光度(在595纳米处)来制定标准校准曲线。例如,包括ECM和/或ECM组分的组合物(如羊膜样本)中的胶原蛋白浓度可通过参照标准曲线来确定。该测定法以允许0.2-1.4mg/mL范围内的蛋白质测量的标准格式被制定为测量浓度高达25μg的蛋白质的微测定法。对于标准的测定法,例如,将溶解于100mM柠檬酸(pH 2.4)的ECM按总体积为0.1mL,浓度为0.1-1mg/mL等分入1.5mL的微量离心管。向每个管中加入1mL的考马斯蓝染料。将样本涡旋并允许其在室温下静置10分钟。在595纳米(nm)处测量吸光度。对于微测定法,将溶解于100mM柠檬酸(pH 2.4)的ECM按总体积为0.1mL(2.5-30μg/mL)等分入96孔板的孔中。向每个孔中加入10μL染料试剂。将样本涡旋,在室温下孵育十分钟,然后于平板读数器中测量595nm处的吸光度。试验样本可以以一式三份进行测定。蛋白质浓度通过参考该标准曲线来确定。蛋白质浓度被计算为总干重ECM的百分比。在约10%的误差界限之内,每个ECM的蛋白质含量基本上是总干重ECM的95%或更多。水含量可能较低并在实验误差内(约10%)。
在本文所述的方法中使用的组合物中的ECM的总蛋白质含量(如总胶原蛋白含量)的估算可使用本领域技术人员已知以及本文所列举的方法来表征。在具体的实施方式中,ECM的胶原蛋白含量使用基于定量染料的检测试剂盒(如由英国Biocolor有限公司制造的SIRCOLTM试剂盒)进行测量。该测定法将天狼星红(或直接红80)用作特定的胶原蛋白结合染料。结合至胶原蛋白的染料在紫外-可见分光光度计中显示540nm处吸光度中浓度依赖性的增加。该测定法涉及通过测量已知浓度的一系列牛胶原蛋白标准的吸光度来制定标准校准曲线。试样(如羊膜样本)中的胶原蛋白的浓度通过参考该标准曲线来确定。在示例性测定法中,将胶原蛋白(1mg/mL)按从5到100μg/100μL的浓度等分入1.5mL的微量离心管中。用水将样本体积调整到100μL。在室温下向每个样本加入1mL SIRCOLTM染料试剂。将样本管加盖并允许在室温下利用机械振荡孵育30mm。然后将该样本以12,000Xg离心15分钟,并用移液器将液体排出。将每个管底部的微红沉淀物溶解在1mL的0.5M NaOH(氢氧化钠)中。使用,例如,Beckman DU-7400紫外-可见分光光度计测量该样本540nm处的紫外吸光度。使用每个样本中胶原蛋白的浓度与540nm处吸光度(OD)的对比绘制标准校准曲线。为了确定实验误差,该测定法可在单一低浓度的胶原蛋白标准(10μg/100μL)下重复进行(n=10)。该膜样本使用相同的协议进行测定,该样本按100μL的总体积被添加。
在仍然其他的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物中的胶原蛋白类型可使用本领域已知以及本文所列举的标准方法(如ELISA测定法)来确定。用于确定ECM中胶原蛋白类型(如I型、III型和IV型胶原蛋白)的示例性测定法包括使用夹心ELISA测定法,其例如,通过来自美国华盛顿雷德蒙Chondrex公司的I型胶原蛋白作为试剂盒被提供。对于III型和IV型的研究,一次(捕获抗体)和二次抗体(检测抗体)以及胶原蛋白标准可以从宾夕法尼亚州Gilbertsville的RocklandImmunochemicals处获得。该检测抗体是结合链霉抗过氧化物酶的人I型、III型或IV型胶原蛋白的生物素化抗体。显色底物和尿素以及H2O2的酶反应给出的颜色为黄色,其通过紫外-可见光谱在490nm处被测得。为了将胶原蛋白类型的量定量,用已知浓度的一系列人胶原蛋白标准的样本制定了标准校准曲线。羊膜试样中的胶原蛋白浓度通过参考该标准曲线来确定。测定方案依据ELISA试剂盒的建议进行制定。为了制定标准校准曲线,通过添加随该试剂盒一起提供的100μL 100X稀释的捕获抗体而将96孔托盘的10-12个孔涂覆以捕获抗体(未经共轭的抗人I型胶原蛋白抗体)。过夜孵育后,将该孔用洗涤缓冲液洗涤三次以去除未结合的抗体。然后按100μL的体积,以从0到5μg/mL的上升浓度将人I型胶原蛋白加入到该孔中。在室温下孵育两小时后,用洗涤缓冲液将该孔洗涤三次以去除未结合的胶原蛋白。然后按100μL的体积将生物素化的I型胶原蛋白抗体加入到该孔中的抗体-胶原蛋白复合物中,并允许在室温下结合两小时。用洗涤缓冲液洗涤三次以冲刷掉未结合的抗体。然后通过加入试剂盒提供的酶的200X-稀释的样本并允许其在室温下孵育一小时,使检测酶链霉抗过氧化物酶与抗体-胶原蛋白-抗体复合物相结合。将该96孔板重复(六次)洗涤以去除任何未结合的酶。按100μL的体积将发色底物+尿素/H2O2加入到每个孔中。使反应在室温下继续进行30分钟。通过加入50L的2.5N硫酸终止反应。测量490nm处的吸光度。
在仍然其他的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物中的总弹性蛋白含量可以使用本领域中已知的方法来完成。用于测量ECM的弹性蛋白含量的示例性测定法可以包括由英国Biocolor有限公司制造的基于染料的定量检测试剂盒(FASTIN)。该测定法将5,10,15,20-四苯基-21,23-卟啉(TPPS)用作特定的弹性蛋白结合染料(见,例如,Winkleman,J.(1962),Cancer Research,22,589-596)。结合至弹性蛋白的染料在紫外-可见分光光度计中显示513nm处吸光度中浓度依赖性的增加。该测定法涉及通过测量已知浓度的一系列牛弹性蛋白标准的吸光度来制定标准校准曲线。试样(如ECM样本)中的弹性蛋白的浓度通过参考该标准曲线来确定。将ECM(1mg/mL)按从5到100μg/100μL的浓度等分入1.5mL的微量离心管中。用水将样本体积调整到100μL。于4℃向每个样本加入1mL的弹性蛋白沉淀试剂(三氯乙酸+精氨酸)并在相同温度下储存过夜。过夜沉淀后,将该样本以12,000Xg离心15分钟,并用移液器将液体排出。向每个样本加入具有100μL 90%饱和硫酸铵的1mL FASTIN染料试剂(TPPS)。将样本管加盖并允许在室温下利用机械振荡孵育1小时。该硫酸铵用来沉淀弹性蛋白-染料复合物。在1小时的混合步骤后,将该样本以12,000Xg离心15分钟并用移液器将液体排出。将每个管底部的棕色沉淀物溶解到1mL的FASTIN分解试剂(其是胍-HCl的1-丙醇溶液)中。使用,例如,BeckmanDU-7400紫外-可见分光光度计测量该样本513nm处的紫外吸光度。使用每个样本中弹性蛋白的浓度与513nm处吸光度(OD)的对比绘制标准校准曲线。为了确定该测定法中的实验误差,该测定法可在单一低浓度的弹性蛋白标准(10μg/100μL)下重复进行(n=10)。该膜样本使用相同的协议进行测定,该样本按100μL的总体积被添加。每个样本以一式三份进行测定。
在仍然其他的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物中的总糖胺聚糖(GAG)含量可以使用本领域中已知的方法来确定。ECM中GAG的存在可以使用,例如,由英国Biocolor有限公司制造的基于染料的定量检测试剂盒(BLYSCAN)进行测量。该测定法将1,9-二甲基-亚甲基蓝用作特定的GAG结合染料。结合至GAG的染料在紫外-可见分光光度计中显示656nm处吸光度中浓度依赖性的增加。该测定法涉及通过测量已知浓度的一系列牛GAG标准的吸光度来制定标准校准曲线。羊膜试样中的GAG的浓度通过参考该标准曲线来确定。将牛GAG(0.1mg/mL)按从0.5到5μg/100μL的浓度等分入1.5mL的微量离心管中。用水将样本体积调整到100μL。在室温下向每个样本加入1mL的1,9-二甲基-亚甲基染料试剂。将样本管加盖并允许在室温下利用机械振荡孵育30mm。然后将该样本以12,000Xg离心15分钟,并用移液器将液体排出。将每个管底部的微红沉淀物溶解在1mL的染料分解试剂中。使用,例如,Beckman DU-7400紫外-可见分光光度计测量该样本656nm处的紫外吸光度。使用每个样本中GAG的浓度与540nm处吸光度(OD)的对比绘制标准校准曲线。为了确定该测定法中的实验误差,该测定法可在单一低浓度的GAG标准(1μg/100μL)下重复进行(n=8)。该膜样本使用相同的协议进行测定,该样本按100μL的总体积被添加。每个样本以一式三份进行测定。
在仍然其他的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物中的总层粘连蛋白含量可以使用本领域中已知的方法来测定。用于确定ECM中总层粘连蛋白含量的示例性测定法包括例如,夹心ELISA测定法,如日本滋贺县宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)提供的试剂盒(目录号MKIO7)。该试剂盒包括预涂覆有一次(捕获抗体)(其是一种人层粘连蛋白的鼠单克隆抗体)的96孔板。二次抗体(检测抗体)和人层粘连蛋白标准随该试剂盒一起提供。该检测抗体是与过氧化物酶共轭的人层粘连蛋白抗体。显色底物四甲基联苯胺和H2O2的酶反应给出的颜色为蓝色,其通过紫外-可见光谱在450nm处被测得。为了将层粘连蛋白的量定量,用已知浓度的一系列人层粘连蛋白标准(随该试剂盒一起提供)的样本制定了标准校准曲线。ECM试样中层粘连蛋白的浓度通过参考该标准曲线来确定。测定方案依据该试剂盒的建议进行制定。为了制定标准校准曲线,按100μL的最终体积,5ng/mL至160ng/mL的渐增浓度,将人层粘连蛋白标准加入到随该试剂盒一起提供的预涂覆有抗体的96孔托盘的各孔中。在室温下孵育一小时后,用洗涤缓冲液(含有0.05%吐温TM的PBS)将该孔洗涤3次以去除未结合的层粘连蛋白。然后按100μL的体积将过氧化物酶-共轭的层粘连蛋白抗体加入到该孔中的抗体-层粘连蛋白复合物中,并允许在室温下结合1小时。将96孔板洗涤4X以去除任何未结合的酶/抗体共轭物。按100μL的体积将发色底物+H2O2加入到每个孔中。使反应在室温下继续进行30分钟。通过加入100μL的2.5N硫酸终止反应。测量450nm处的吸光度。在1000ng/mL的浓度下测试经溶解的膜的样本。每个膜样本以一式三份进行测试。层粘连蛋白的浓度被表示为如下所示的总膜重量的浓度。
在仍然其他的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物中的总纤连蛋白含量可以使用本领域中已知和本文所列举的方法来测定。用于确定ECM中总纤连蛋白含量的示例性测定法包括例如如下:可以使用作为来自日本滋贺县宝生物工程株式会社的试剂盒(目录号MK115)被提供的夹心ELISA测定法。该试剂盒包括预涂覆有一次(捕获抗体)(其是一种人纤连蛋白的鼠单克隆抗体)的96孔板。二次抗体(检测抗体)和人纤连蛋白标准随该试剂盒一起提供。该检测抗体是与辣根过氧化物酶共轭的人纤连蛋白抗体。显色底物四甲基联苯胺和H2O2的酶反应给出的颜色为蓝色,其通过紫外-可见光谱在450nm处被测得。为了将纤连蛋白的量定量,用已知浓度的一系列人纤连蛋白标准(随该试剂盒一起提供)的样本制定了标准校准曲线。试样中纤连蛋白的浓度通过参考该标准曲线来确定。测定方案依据该ELISA试剂盒的建议进行制定。为了制定标准校准曲线,按100μL的最终体积,12.5ng/mL至400ng/mL的渐增浓度,将人纤连蛋白标准加入到随该试剂盒一起提供的预涂覆有抗体的96孔托盘的各孔中。在室温下孵育1小时后,用洗涤缓冲液(含有0.05%吐温TM的PBS)将该孔洗涤3次以去除未结合的纤连蛋白。然后按100μL的体积将过氧化物酶-共轭的纤连蛋白抗体加入到该孔中的抗体-纤连蛋白复合物中,并允许在室温下结合1小时。将96孔板重复洗涤(4X)以去除任何未结合的酶/抗体共轭物。按100μL的体积将发色底物+H2O2加入到每个孔中。允许反应在室温下继续进行30分钟。通过加入100μL的2.5N硫酸终止反应。测量450nm处的吸光度。在1000μg/mL的浓度下测试经溶解的膜的样本。每个膜样本以一式三份进行测试。本领域的技术人员将认识到,上述方法可用于测量在本文所述的方法中使用的组合物的其他组分,如这类组合物中弹性蛋白的量。
5.5.2生物相容性研究
可用于本文所提供的治疗方法的组合物是基本上非免疫原性的。因为非免疫原性人体组织固有地与其他人体组织生物相容,所以没有必要执行一些标准的生物相容性测试(如皮肤刺激性和致敏性,急性全身毒性)。如本文所用的生物相容性是指通过不在活组织中产生有毒、有害或免疫应答或拒绝而在生物学上相容的性质。在体内使用人造材料时,对未知材料的机体反应是主要的关注,因此在这类材料中,材料的生物相容性是一项重要的设计。生物相容性测定包括但不限于细胞毒性测定、兔眼刺激性测定、溶血测定和致热原性测定。可用于评估该组合物的生物相容性测定可以是基于细胞的或无细胞的。
该组合物的细胞毒性可以使用ISO MEM洗脱试验得以确定(见实施例5.4.2.2)。本研究的目的是评估组合物在经培养的小鼠成纤维细胞中引发细胞毒性应答的能力。在示例性测定法中,补充了5%胎牛血清(FBS)的伊格尔氏最低必需培养基(E-MEM)被用以提取试样。该培养基还补充有一种或多种下列物质:L-谷氨酰胺、HEPES、庆大霉素、青霉素、万古霉素和二性霉素B(两性霉素B)。培育L-929细胞(小鼠成纤维细胞)的培养物并在空气中在5±1%二氧化碳的潮湿气氛中于37±1℃下在一次性组织培养实验室器皿中将其用作单层。使用比例等效的120cm2样本和20ml-E-MEM加5%FBS完整地提取试样。在5±1%的二氧化碳中于37±1℃下在E-MEM加5%FBS中提取试样达24-25小时。提取期间后,将维持培养基从测试培养孔中去除并用掺有氯化镉的1ml试验培养基/提取物和对照培养基/提取物和阳性对照培养基替换。阳性、中性和阴性对照物与试样平行进行。掺有氯化镉的试验培养基/提取物和对照培养基/提取物和阳性对照培养基以一式三份被制成板并在空气中在5±1%二氧化碳的潮湿气氛中于37±1℃下被孵育72±4小时。通过在24、48和72±4小时孵育期间的显微镜观察来评价培养物的细胞毒性作用。用于评价细胞毒性的标准可以包括细胞的形态变化,如成粒、皱缩或变圆,以及通过裂解或脱离使单层损失活细胞。测试的有效性要求阴性对照培养物在整个测试期间保持健康正常的外观。毒性程度被评分如下:
0无:离散胞浆内颗粒;无细胞裂解
1轻微:不超过20%的细胞是圆形的、松散地附着并且没有胞浆内颗粒;偶尔存在裂解的细胞
2轻度:不超过50%的细胞是圆的并缺乏胞质内颗粒;没有广泛的细胞裂解和细胞之间的空白区
3中度:不超过70%的细胞层包含变圆的细胞和/或被裂解
4重度:细胞层几乎被完全毁坏。
根据USP,评分为“0”、“1”或“2”的试验制品将被认为是无毒的。评分为“3”或“4”的试验制品将被认为是有毒的。对于有效的测试来说,阳性对照样本必定有“3”或“4”的评分以及阴性对照样本必定有“0”的评分。
兔子的眼表已知比人的皮肤更敏感,因此兔眼刺激性研究被用于评估包括ECM和/或ECM组分的组合物的生物相容性。在示例性测定法中,对样本进行初级眼部刺激筛查。使用0.05%去氧胆酸一水合物钠盐(D-Cell)的水溶液清洗本文所述的包括ECM的组合物。该测试可根据联邦有害物质法(FHSA)规章16CFR 1500的指引进行。在示例性测定法中,对照兔子眼睛通过利用辅助光源的肉眼检查在临床上被判断为正常。为了检测到任何预先存在的角膜损伤,该眼睛用荧光染色处理,用0.9%USP生理盐水溶液(PSS)冲洗以及在暗室里用紫外光观察。按照标准技术将样本灌输到每只兔子的一只眼睛的下结膜囊内。每只兔子的另一只眼睛保持未处理并作为比较对照物。处理后使动物们返回它们的笼子。于给药后24、48和72小时,用辅助光源和适当的相对于未处理的对照眼睛倍率检查每只兔子的测试眼睛,并进行眼部刺激分级。为了检测或确认角膜损伤,该测试眼睛用荧光染色处理,用PSS冲洗以及在24小时时,于黑暗条件下用紫外线灯检查。按照FHSA改性的Draize评分标准对反应打分。三分之一的动物表现出显著的阳性反应是边界发现。三分之二的动物表现出显著的阳性反应是显著的阳性反应以及试验制品被认为是刺激物。
本文所述的组合物的溶血性质可以使用本领域已知和本文所列举的方法得以测定(见实施例5.4.2.4)。溶血描述了将接触血液的试样的溶血性质。在示例性测定法中,该程序涉及将测试材料暴露于血细胞悬浮液,然后确定所释放的血红蛋白的量。该测试通过测试组合物与人类血液的直接接触,在静态条件下运行。与阴性和阳性对照物同时,在转化为氰化正铁血红蛋白之后,在540nm处通过分光光度法测量由红血细胞释放的血红蛋白的量。该样本和对照物的溶血指数计算如下:
溶血指数=所释放的血红蛋白(mg/mL)X 100
存在的血红蛋白(mg/mL)
其中:所释放的血红蛋白(mg/mL)=(常数+X系数)X可选密度X16
存在的血红蛋白(mg/mL)=经稀释的血液10±1mg/mL
在本文所述的方法中使用的组合物的致热原性可以使用本领域已知和本文所列举的方法得以测定(见实施例5.4.2.5)。在一个实施方式中,组合物的致热原性通过使用,例如鲎变形细胞溶解物(LAL)试验来测量该组合物中细菌内毒素的存在而得以确定。这个试验是一种用于细菌内毒素的检测和定量的活体外测定法。在示例性测试中,对组合物(如包括ECM的组合物)的98个样本(每批n=1)(每个测量为1x2cm)分别进行测试以进行提取。通过在轨道摇床上利用间歇漩涡于37至40℃在30mL的提取流体中将各样本洗涤40至60分钟进行提取。各样本提取物的pH如用pH试纸所验证的,为6至8。通过具有0.05个内毒素单位(EU)/mL的测试灵敏度的动态浊度比色试验测量热原级别。每个样本的总内毒素水平通过将所检测到的内毒素值(EU/mL)乘以30mL(每个设备的提取量),再乘以24(以模拟6x8cm大小的设备)算得。
5.5.3微生物研究
在本文所述的方法中使用的组合物中微生物体(包括但不限于大肠杆菌、肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、白色念珠菌、普通变形杆菌、草绿色葡萄球菌和绿脓假单胞菌)的存在可通过本领域已知的方法来确定。这种方法可以被用于制备该组合物的任何步骤。在某些实施方式中,诸如脱细胞和漂洗的步骤起作用以减少在本文所述的方法中使用的组合物中微生物的数量。
在本文所述的方法中使用的组合物中的污染微生物的量(即该组合物的“生物负载”)在经历工业灭菌过程之前可以使用本领域公知的方法进行测定。在示范性方法中,确定将实现10-6灭菌保证级别的无菌情况的最小电子束辐射剂量。通过使用蛋白胨-吐温TM溶液浸泡和手动摇动来提取膜。电镀法是使用大豆-酪蛋白消化琼脂的膜过滤。对于需氧条件,于30-35℃下将板孵育4天,然后计数。对于真菌,于20-25℃下将板孵育四天,然后计数。对于产芽孢细菌,关于需氧细菌,提取物部分经热冲击、过滤并被制成板。于30-35℃下将板孵育4天,然后计数。对于厌氧菌,在厌氧条件下于30-35℃下将板孵育4天,然后计数。所利用的微生物可以包括,例如产芽孢梭菌、绿脓假单胞菌和萎缩芽孢杆菌。
在具体的实施方式中,对于需氧菌和真菌,ECM(如一克ECM)具有少于2个菌落形成单位(cfu);对于需氧菌和真菌,其具有小于1或零cfu。在仍然其他的实施方式中,该ECM具有小于5.1菌落形成单位(CFU),少于2,或小于1cfu对于厌氧菌和芽孢。
在具体的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物如使用本文所例举和本领域技术人员已知的方法确定的,是不抑菌或抑真菌的(见实施例5.4.3.2)。如本文所用,抑菌指试剂抑制细菌生长或繁殖,但不杀死细菌。如本文所用,抑真菌指试剂通过非杀真菌化学或物理介质的存在防止真菌的生长。
5.5.4组合物的储存和处理
在本文所述的方法中使用的组合物可以被储存于室温(如25℃)下。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物可以被储存于至少0℃、至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃或至少40℃、不超过4℃、不超过10℃、不超过15℃、不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃或不超过40℃的温度下。在一些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物不被冷藏。在一些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物可以被冷藏于约2至8℃的温度下。在其他的实施方式中,在本文所述方法中使用的组合物可以被储存于任何以上指明的温度下达延长的时间周期。在具体的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物被储存于无菌和非氧化条件下。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物可以被储存于任何指定的温度下达12个月或以上,而胶原蛋白组合物没有生物化学或结构完整性的改变(如无降解),没有任何生物化学或生物物理性质的改变。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物可以被储存几年,而胶原蛋白组合物没有生物化学或结构完整性的改变(如无降解),没有任何生物化学或生物物理性质的改变。在本文所述的方法中使用的组合物可以被储存在适用于长期储存的任何容器中。在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物可以被储存在无菌双剥离袋包中。
5.5.5灭菌
在本文所述的方法中使用的组合物可以根据本领域技术人员已知的用于为这类组合物灭菌的技术进行灭菌。在某些实施方式中,该组合物通过允许内毒素通过并将ECM保留在该组合物中或保留一种或多种期望的ECM组分的过滤器进行过滤。可以使用本领域技术人员已知的用于内毒素过滤的任何尺寸(如30kDa)的过滤器。在某些实施方式中,在允许内毒素通过该过滤器,同时保留该组合物的ECM或ECM组分的条件下使该组合物接触该过滤器。该条件可以是本领域技术人员已知的任何过滤条件,如离心或抽吸。该过滤器的尺寸应该保留胶原蛋白,同时允许内毒素通过该过滤器。在某些实施方式中,该过滤器介于5kDa和100kDa之间。在具体的实施方式中,该过滤器是约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、约30kDa、约40kDa、约50k Da、约60kDa、约70kDa、约80kDa、约90kDa或约100kDa。该过滤器可以由本领域技术人员已知的可与本文所述的组合物相容的任何材料(如纤维素、聚醚砜和对本领域技术人员来说显而易见的其他材料)制成。过滤可根据需要由本领域技术人员重复多次。内毒素可根据标准技术进行检测以监测清除率。
在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物可以被过滤以生成不含病毒颗粒或病毒颗粒减少的ECM。有利的是,该过滤器保留该组合物的ECM,,同时允许病毒颗粒通过。可以使用本领域技术人员已知的可用于清除病毒的任何过滤器。例如,1000kDa的过滤器可被用于细小病毒、甲型肝炎病毒和HIV的清除或减少。750kDa的过滤器可被用于细小病毒和甲型肝炎病毒的清除或减少。500kDa的过滤器可被用于细小病毒的清除或减少。
在本文所述的方法中使用的组合物可以通过一种方法得以制备,使得它们不含病毒颗粒或具有数目降低的病毒颗粒,该方法包括使该组合物接触过滤器的步骤,该过滤器的大小允许一种或多种病毒颗粒通过该过滤器同时在该组合物中保留ECM。在某些实施方式中,在允许一种或多种病毒颗粒通过该过滤器,同时保留该组合物的ECM或一种或多种所需的ECM组分的条件下使该组合物接触该过滤器。该条件可以是本领域技术人员已知的任何过滤条件,如离心或抽吸。该过滤器的尺寸应该保留ECM或所需的ECM组分,同时允许一种或多种内毒素通过该过滤器。在某些实施方式中,该过滤器介于500kDa和1000kDa之间。在具体的实施方式中,该过滤器是约500kDa、约750kDa或约1000kDa。该过滤器可以由本领域技术人员已知的可与本文所述的组合物相容的任何材料(如纤维素、聚醚砜和对本领域技术人员来说显而易见的其他材料)制成。过滤可根据需要由本领域技术人员重复多次。病毒颗粒可根据标准技术进行检测以监测过滤情况。
在本文所述的方法中使用的组合物的灭菌也可以使用本领域技术人员已知的方法(例如Gorham,D.Byrom(ed.),1991,Biomaterials,Stockton Press,New York,55-122)通过电子束照射进行。足以杀死至少99.9%的细菌或其他潜在的污染生物的任何辐射剂量在该方法的范围之内。在具体的实施方式中,至少18-25kGy的剂量被用来实现ECM的最终灭菌。
5.6制剂
在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物可以被配制在水或磷酸盐缓冲盐水中,例如,被配制为溶液或混悬液,如漱口剂。在具体的实施方式中,该组合物被配制在磷酸盐缓冲盐水中。ECM或ECM组分可以按对本领域技术人员有用的任意浓度存在于该溶液或混悬液中。在某些实施方式中,所提供的制剂包括0.1-100mg/ml、1-100mg/ml、1-75mg/ml、1-50mg/ml、1-40mg/ml、10-40mg/ml或20-40mg/ml ECM。在某些实施方式中,该溶液或混悬液包括约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或50mg/ml胶原蛋白。在具体的实施方式中,本文提供包括约35mg/ml ECM的制剂。
在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的包括ECM的组合物被配制成糊剂(通常,例如,使用本文所述的方法从人胎盘提取到的ECM是一种白色糊剂)。被配制成糊剂的在本文所述的方法中使用的包括ECM的组合物可以作为,如糊剂被用于本文提供的方法中;或者可以根据本领域中已知的任何用于这种材料成型的方法成型,例如,可以被成型以在治疗口腔病变的方法中填充口腔病变。例如,该组合物可以被形成到模具中或围绕模具形成,以产生特定的形状,以及被加热-干燥、真空-干燥或冷冻-干燥。该组合物还可以被摊薄以及,例如使用真空,于,例如凝胶烘干机上被干燥。该形状可以是包括薄片、管、栓、球等的任何有用的形状。在具体的实施方式中,该组合物被成型以适用于口腔病变。
在某些实施方式中,包括ECM和/或ECM组分的组合物可以包括用于治疗口腔病变的药学上或美容上可接受的载体。这类组合物的给药形式包括但不限于注射剂、溶液、霜剂、凝胶、植入物、泵、软膏、乳剂、混悬液、微球、颗粒、微粒、纳米颗粒、脂质体、糊剂、贴片剂、片剂、经皮递送设备、喷雾剂、气雾剂或本领域普通技术人员熟悉的其他手段。这类药学上或美容上可接受的载体为本领域普通技术人员所公知。药物制剂可以使用熟知且容易获得的成分,通过本领域中已知的程序来制备。例如,化合物可以与常用的赋形剂、稀释剂或载体一起进行配制,并被制成片剂、胶囊、混悬液、粉剂等。适用于这类制剂的赋形剂、稀释剂和载体的例子包括如下:填充剂和增量剂(如淀粉、糖、甘露醇和硅酸衍生物);结合剂(如羧甲基纤维素和其他纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯基-吡咯烷酮);保湿剂(如甘油);崩解剂(如碳酸钙和碳酸氢钠);阻滞溶解剂(如石蜡);吸收促进剂(如季铵化合物);表面活性剂(如鲸蜡醇、甘油单硬脂酸酯);吸附载体(如高岭土和膨润土);乳化剂;防腐剂;甜味剂;稳定剂;着色剂;芳香剂;调味剂;润滑剂(如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁);固体聚乙二醇;及其混合物。
本文中所用的术语“药学上或美容上可接受的载体”或“药学上或美容上可接受的溶媒”意指而不限于任何液体、固体或半固体,包括但不限于适用于用于接触活体动物或人体组织而不引起不良生理或美容反应,并且不以有害的方式与该组合物的其他组分相互作用的水或盐水、凝胶、霜剂、油膏、溶剂、稀释剂、流体软膏基质、软膏、糊剂、植入物、脂质体、微胶粒、巨胶束等。可以采用本领域技术人员已知的其他药学上或美容上可接受的载体或溶媒以制成用于递送分子的组合物。
在本文所述的方法中使用的组合物可被构成为它们仅仅或优选地在特定的位置,释放任何活性成分,例如除了该组合物中的ECM或ECM组分之外的活性成分,可能达一段时间。这类组合又提供了一种用于控制释放动力学的进一步机制。包衣、包膜和保护基质可以由,例如聚合物质或蜡制成。
在本文所述的方法中使用的包括ECM和/或ECM组分的组合物,以及特别适用于各种形式的可选的其他材料(如载体)的体内给药的方法包括但不限于口服(如口腔含化或舌下给药)、局部施用、气雾剂施用、经皮给药、皮内给药、皮下给药、肌肉内给药或病变位置的手术给药。可用于上述各种给药形式的技术包括但不限于局部施用、手术给药、注射、喷雾、经皮递送设备、渗透泵、直接电沉积于所需部位或本领域普通技术人员熟悉的其他装置。
在本文所述的方法中使用的组合物可以以霜剂、凝胶、溶液、混悬液、脂质体、颗粒的形式或本领域技术人员已知的其他配制和递送治疗和美容化合物的手段被施用。用于皮下给药的适当制剂的一些例子包括但不限于植入物、储库(depot)、针、胶囊和渗透泵。用于口服的适当制剂的一些例子包括但不限于:糊剂、贴片剂、薄片、液体、糖浆、混悬液、气雾剂和混合剂。因此,这类制剂,在某些实施方式中,根据本文所述的方法被用于治疗口腔病变。用于经皮给药的适当制剂的一些例子包括但不限于霜剂、糊剂、贴片剂、喷雾剂和凝胶。用于皮下给药的适当递送机制一些例子包括但不限于植入物、储库、针、胶囊和渗透泵。
其中组合物包括,例如一种或多种药学或美容上可接受的载体或赋形剂的实施例可以方便地以单位剂型呈现并且可以通过常规的制药技术来制备。这类技术包括将包含活性成分的组合物与一种或多种药物载体或赋形剂相结合的步骤。一般而言,制剂通过将活性成分与,例如液体载体均匀且紧密地相结合来制备。特定的单位剂量制剂是那些包含一份剂量或单位的所施用的成分或其适当部分的制剂。应当理解的是,除了以上特别提到的成分之外,包括本文所提供的组合物的制剂还可以包括本领域普通技术人员通常使用的其他试剂。给药量将取决于给药途径而变化。
在本文所述的方法中使用的组合物可以按将产生所需的生理或药理效果(如治疗口腔病变)的任何剂量范围被施用至人或动物。剂量将取决于所施用的一种或多种物质、所需的治疗端点、作用部位上或体液中所需的有效浓度和给药类型。关于适当物质剂量的信息为本领域普通技术人员已知并且可以被发现于诸如L.S.Goodman和A.Gilman,编辑,ThePharmacological Basis of Therapeutics,Macmillan Publishing,New York,以及Katzung,Basic&Clinical Pharmacology,Appleton&Lang,Norwalk,Conn.,(1995年第6版)的参考文献中。所需疗法的本领域熟练的临床医生可以如情况和待施用的物质所要求的,选择特定的剂量和剂量范围以及给药频率。
在本文所述的方法中使用的组合物可以包括非ECM或ECM组分(如胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白和/或糖胺聚糖)的一种或多种化合物或物质(如活性成分或活性剂)。例如,该组合物可以在生产过程中或准备手术过程中用生物分子浸渍。这类生物分子包括但不限于抗生素(如克林霉素、米诺环素、多西环素、庆大霉素);激素;生长因子;抗肿瘤剂;抗真菌剂;抗病毒剂;止痛药;抗组胺剂;抗炎剂;抗感染剂,包括但不限于银(如银盐,包括但不限于硝酸银和磺胺嘧啶银)、元素银、抗生素、杀菌酶(如溶菌酶);伤口愈合剂(如细胞因子,包括但不限于PDGF、TGF;胸腺素);作为伤口愈合剂的透明质酸;伤口密封剂(如有或无凝血酶的纤维蛋白);细胞引诱剂和支架试剂(如纤连蛋白)以及诸如此类。在具体的例子中,该组合物可以用至少一种生长因子,例如成纤维细胞生长因子、上皮生长因子等浸渍。该组合物也可以用小的有机分子(例如特定的生化过程的特异性抑制剂,如膜受体抑制剂、激酶抑制剂、生长抑制剂、抗癌药、抗生素等)浸渍。
在仍然其他的实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物可以与水凝胶组合。可以使用本领域技术人员已知的任何水凝胶,例如Graham,1998,Med.Device Technol.9(1):18-22;Peppas等人,2000,Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1):27-46;Nguyen等人,2002,Biomaterials,23(22):4307-14;Henincl等人,2002,Adv.Drug Deliv.Rev 54(1):13-36;Skelhorne等人,2002,Med.Device.Technol.13(9):19-23;或Schmedlen等人,2002,Biomaterials 23:4325-32中所披露的任何水凝胶组合物。在具体的实施方式中,如果该组合物被配制成固体形式,该水凝胶被施加到该组合物之上,即被排到该组合物的表面上。该水凝胶,例如可以被喷到该组合物之上,浸透该组合物的表面,用该组合物浸泡,用该组合物泡浴或被涂覆到该组合物的表面之上。可用于本文所提供的方法和组合物的水凝胶可以从本领域中已知任何水交互或水溶性聚合物(包括但不限于聚乙烯醇(PVA)、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、葡聚糖或其衍生物和类似物)制备得到。
在一些实施方式中,该组合物在与水凝胶组合之前被进一步用一种或多种生物分子浸渍。在其他的实施方式中,该水凝胶在与组合物组合之前被进一步用一种或多种生物分子浸渍。这类生物分子包括但不限于抗生素(如克林霉素、米诺环素、多西环素、庆大霉素);激素;生长因子;抗肿瘤剂;抗真菌剂;抗病毒剂;止痛药;抗组胺剂;抗炎剂;抗感染剂,包括但不限于银(如银盐,包括但不限于硝酸银和磺胺嘧啶银),元素银,抗生素,杀菌酶(如溶菌酶);伤口愈合剂(如细胞因子,包括但不限于PDGF、TGF;胸腺素);作为伤口愈合剂的透明质酸;伤口密封剂(如有或无凝血酶的纤维蛋白);细胞引诱剂和支架试剂(如纤连蛋白)以及诸如此类。在具体的例子中,该组合物或该水凝胶可以用至少一种生长因子(如成纤维细胞生长因子、上皮生长因子等)浸渍。有利的是,该生物分子可以是治疗剂。
在一些实施方式中,该水凝胶与包括该组合物的层压体组合。
在一些实施方式中,水凝胶/组合物被局部施用至对象,即于口腔粘膜的表面上,例如在病变部位。在一些实施方式中,该水凝胶被配制成是非生物降解的。在仍然其他的实施方式中,该水凝胶被配制成是可生物降解的。在具体的实施方式中,该水凝胶被配制成在施用至个体后数天内(如少于7天、少于14天、少于21天或少于28天)降解。在另一具体的实施方式中,该水凝胶组合物被配制成在施用至个体后数月内降解。
在一些实施方式中,本文所述的组合物包括细胞。例如,细胞可以被溶解于本文所述的组合物中;或者当本文所述的组合物为固体形式时,可以被填充于所述组合物上。可以在本文所述的组合物中使用的细胞包括但不限于干细胞(如人干细胞)、人分化成体细胞、全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、组织特异性干细胞、胚胎样干细胞、定型祖细胞、成纤维细胞等。
5.7干细胞
在某些实施方式中,在本文所述的方法中使用的组合物包括多个干细胞。该干细胞可以是适用于给定目的的任何干细胞,并且可以是全能或多能干细胞或者可以是祖细胞。优选地,该组合物包括胎盘干细胞,如那些被描述于美国专利号7,045,148;7,468,276;8,057,788和8,202,703(其公开的内容以引用方式被整体并入本文)的胎盘干细胞。然而,该组合物可以包括来自任何组织来源的干细胞或祖细胞,优选地哺乳动物干细胞或祖细胞,例如胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、间质干细胞、骨髓源性干细胞、造血祖细胞(如来自外周血、胎儿血、胎盘血、脐带血、胎盘灌注液等的造血干细胞)、成体干细胞、神经干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、内皮干细胞、心脏干细胞、肌干细胞、脂肪干细胞以及诸如此类。该组合物可以包括任何类型的干细胞的组合。在某些实施方式中,该干细胞是人干细胞,例如人胎盘干细胞。在具体的实施方式中,该细胞是该组合物来源的自体细胞,例如,该细胞是来自相同源(即胎盘)的胎盘干细胞,该组合物中的ECM或ECM组分从该源衍生而得。
在某些实施方式中,该组合物,当为固体形式时,与多个干细胞或祖细胞接触一段时间,该时间对多个所述干细胞或祖细胞来说足以附着到该组合物。在优选的实施方式中,该组合物在与该干细胞或祖细胞接触之前,被成型为有用的结构,例如薄片、栓、管或其他结构。该干细胞或祖细胞与该组合物的接触可以通过本领域已知的任何方法来实现,并且可以包括,例如将包括该干细胞或祖细胞的培养基分配于该组合物的表面之上;将该组合物的一部分或全部浸渍于该干细胞或祖细胞的悬浮液中;在该组合物的表面上培养多个该干细胞或祖细胞一段时间,该时间对该多个干细胞或祖细胞来说足以增殖以进行至少一次细胞分裂;以及诸如此类。该干细胞(优选地,胎盘干细胞)可以存在于该组合物上,例如该组合物表面的整体或一部分上的,例如该组合物的成型形式可以随机存在于该表面上,融合存在等。
与该组合物接触的干细胞或祖细胞的数量,在任何实施方式中,可以发生变化,但在各种实施方式中,可以是至少1X 106、3X 106、1X 107、3X 107、1X 108、3X 108、1X 109、3X 109、1X 1010、3X 1010、1X 1011、3X 1011或1X 1012;或可以是不多于1X 106、3X 106、1X 107、3X 107、1X 108、3X 108、1X 109、3X 109、1X 1010、3X 1010、1X 1011、3X 1011或1X 1012的干细胞或祖细胞。
在某些其他的实施方式中,该组合物包括干细胞或干细胞群沉积的一种或多种类型的细胞外基质蛋白。在一个实施方式中,例如,一种组合物通过如下被制成包括细胞外基质蛋白:使该组合物与多个干细胞接触;在该组合物上培养该干细胞一段时间,该时间对该干细胞来说足以沉积可检测量的至少一种类型的细胞外基质蛋白;以及将该组合物脱细胞以产生包括至少一种类型的细胞外基质蛋白的组合物。因此,在一个实施方式中,该组合物包括脱细胞的细胞外基质,其中该脱细胞的细胞外基质由干细胞沉积或产生。在各种实施方式中,该细胞外基质蛋白包括一种或多种胶原蛋白(如I、II、III和/或IV型胶原蛋白的一种或多种)、弹性蛋白和/或纤连蛋白。在另一实施方式中,该细胞外基质蛋白由增殖且未分化的多个干细胞产生。在另一实施方式中,该细胞外基质由分化的多个干细胞或者由已经分化自多个干细胞的多个细胞产生。
5.7.1胎盘干细胞
在一个实施方式中,该组合物包括多个CD34-胎盘干细胞。CD34-胎盘干细胞是可从胎盘组织获得的干细胞,其粘附于组织培养底物并具有分化成非胎盘细胞类型的能力。胎盘干细胞可以是胎儿或母体来源的(即可以有母亲或胎儿的基因型)。胎盘干细胞群或包括胎盘干细胞的细胞群可以包括单独的胎儿或母体来源的胎盘干细胞;或可以包括胎儿和母体两者来源的胎盘干细胞的混合群。该胎盘干细胞以及包括该胎盘干细胞的细胞群可以通过下文讨论的形态学、标记物和培养特性来识别和选择。
该胎盘干细胞,当被培养于原代培养物或细胞培养物中时,粘附于该组织培养底物,如组织培养容器表面(如组织培养塑料制品)。培养中的胎盘干细胞一般呈成纤维样、星状外观,具有从中央细胞体延伸出的大量胞质突。然而,该胎盘干细胞在形态学上可区分于在相同条件下培养的成纤维细胞,因为该胎盘干细胞比成纤维细胞表现出更大数量的这类胞质突。在形态学上,胎盘干细胞也可以区分于造血干细胞(其在培养中通常呈更圆或鹅卵石的形态)。
该胎盘干细胞一般表达标记物CD10、CD73、CD105、CD200、HLA-G和/或OCT-4以及不表达CD34、CD38或CD45。胎盘干细胞还可以表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。因此,在一个实施方式中,可以与该ECM组合的干细胞是CD200+或HLA-G+。在另一实施方式中,该胎盘干细胞是CD73+、CD105+和CD200+。在另一实施方式中,该胎盘干细胞是CD200+和OCT-4+。在另一实施方式中,该胎盘干细胞是CD73+、CD105+和HLA-G+。在另一实施方式中,该胎盘干细胞是CD73+和CD105+,以及当在胎盘细胞群中时,在允许形成胚样体的条件下促进一种或多种胚样体的形成。在另一实施方式中,该胎盘干细胞是OCT-4+以及,当在胎盘细胞群中时,当在允许形成胚样体的条件下培养时,促进包括所述干细胞的分离的胎盘干细胞群中一种或多种胚样体的形成。
在某些实施方式中,该分离的胎盘干细胞是分离的胎盘干细胞。在某些其他的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是分离的胎盘多潜能细胞。在一个实施方式中,该分离的胎盘干细胞(如PDACs)是如通过流式细胞计量术可检测的CD34–、CD10+和CD105+。在另一具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞具有分化成中性表型的细胞、成骨性表型的细胞和/或软骨形成性表型的细胞的潜能。在另一具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞附加地是CD200+。在另一具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞附加地是CD45–或CD90+。在另一具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞附加地是如通过流式细胞计量术可检测的CD45–和CD90+。在另一具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘细胞附加地是如通过流式细胞计量术可检测的CD90+或CD45–。在另一具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘细胞附加地是如通过流式细胞计量术可检测的CD90+和CD45–,即该细胞是CD34–、CD10+、CD45–、CD90+、CD105+和CD200+。在另一具体的实施方式中,所述CD34–、CD10+、CD45–、CD90+、CD105+、CD200+细胞附加地是CD80–和CD86–。
在某些实施方式中,所述胎盘干细胞是如通过流式细胞计量术可检测的CD34–、CD10+、CD105+和CD200+以及CD38–、CD45–、CD80–、CD86–、CD133–、HLA-DR,DP,DQ–、SSEA3–、SSEA4–、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、HLA-A,B,C+、PDL1+、ABC-p+和/或OCT-4+的一种或多种。在其他的实施方式中,上述CD34–、CD10+、CD105+细胞的任一项附加地是CD29+、CD38–、CD44+、CD54+、SH3+或SH4+的一种或多种。在另一具体的实施方式中,该细胞附加地是CD44+。在上述分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞的任一项的另一具体的实施方式中、该细胞附加地是CD117–、CD133–、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–或程序性死亡-1配体(PDL1)+的一种或多种或其任何组合。
在另一实施方式中,该CD34–、CD10+、CD105+细胞附加地是CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD62E–、CD62L–、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘蛋白低、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133–、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–或程序性死亡-1配体(PDL1)+的一种或多种或其任何组合。在另一实施方式中,该CD34–、CD10+、CD105+细胞附加地是CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62E–、CD62L–、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘蛋白低、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133–、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–和程序性死亡-1配体(PDL1)+。
在另一具体的实施方式中,本文所述的任何胎盘干细胞如通过流式细胞计量术可检测,附加地是ABC-p+;或如通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)所确定的,附加地是OCT-4+(POU5F1),其中ABC-p是胎盘特异性ABC转运蛋白(亦称乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和米托蒽醌耐药蛋白(MXR)),以及OCT-4是八聚体-4蛋白(POU5F1)。在另一具体的实施方式中,本文所述的任何胎盘干细胞附加地是如通过流式细胞计量术所确定的,SSEA3–或SSEA4–,其中SSEA3是阶段特异性胚胎抗原3以及SSEA4是阶段特异性胚胎抗原4。在另一具体的实施方式中,本文所述的任何胎盘干细胞附加地是SSEA3–和SSEA4–。
在另一具体的实施方式中,本文所述的任何胎盘细胞附加地是MHC-I+(如HLA-A,B,C+)、MHC-II–(如HLA-DP,DQ,DR–)或HLA-G–的一种或多种。在另一具体的实施方式中,本文所述的任何胎盘细胞附加地是MHC-I+(如HLA-A,B,C+)、MHC-IV(如HLA-DP,DQ,DR–)和HLA-G–的一种或多种。
本文还提供可用于本文披露的方法和组合物的分离的胎盘干细胞群或包括,如富集该分离的胎盘干细胞的细胞群,如胎盘细胞群。优选的包括分离的胎盘干细胞的细胞群,其中该细胞群包括,如作为CD10+,CD105+和CD34–的至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%分离的胎盘干细胞;也就是,所述群中至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%的细胞是作为CD10+、CD105+和CD34–的分离的胎盘干细胞。在具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘干细胞附加地是CD200+。在另一具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘干细胞附加地是如通过流式细胞计量术可检测的,CD90+或CD45–。在另一具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘干细胞附加地是如通过流式细胞计量术可检测的,CD90+和CD45–。在另一具体的实施方式中,上述任何分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘干细胞附加地是CD29+、CD38–、CD44+、CD54+、SH3+或SH4+的一种或多种。在另一具体的实施方式中,分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘干细胞或分离的CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘干细胞附加地是CD44+。在包括上述分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘干细胞的任何细胞群的具体的实施方式中,分离的胎盘干细胞附加地是CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54–、CD62E–、CD62L–、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘蛋白低、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133–、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–或程序性死亡-1配体(PDL1)+的一种或多种或其任何组合。在另一具体的实施方式中,该CD34–、CD10+、CD105+胎盘干细胞附加地是CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62E–、CD62L–、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘蛋白低、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133–、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–和程序性死亡-1配体(PDL1)+。
在某些实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3–、SSEA4–、OCT-4+和ABC-p+的一种或多种或全部,其中所述分离的胎盘干细胞通过物理和/或酶促破坏胎盘组织而获得。在具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+和ABC-p+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+和CD34–,其中所述分离的胎盘干细胞具有至少一种如下特性:CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3–和SSEA4–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+、CD34–、CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3–和SSEA4–。在另一实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+、CD34–、SSEA3–和SSEA4–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+和CD34–,以及SH2+或SH3+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+、CD34–、SH2+和SH3+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+、CD34–、SSEA3–和SSEA4–以及是SH2+或SH3+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+和CD34–,以及SH2+或SH3+,以及是CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SSEA3–或SSEA4–的至少一种。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+、CD34–、CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SSEA3–和SSEA4–,以及SH2+或SH3+。
在另一实施方式中,可用于本文所披露的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是SH2+、SH3+、SH4+和OCT-4+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、CD34–、CD45–、SSEA3–或SSEA4–。在另一实施方式中,该分离的胎盘干细胞是SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3–和SSEA4–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3–和SSEA4–、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、OCT-4+、CD34–或CD45–。
在另一实施方式中,可用于本文所披露的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+和SH4+;其中所述分离的胎盘干细胞附加地是OCT-4+、SSEA3–或SSEA4–的一种或多种。
在某些实施方式中,可用于本文所披露的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是CD200+或HLA-G–。在具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD200+和HLA-G–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞附加地是CD73+和CD105+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述胎盘干细胞是CD34–、CD38–、CD45–、CD73+和CD105+。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+或HLA-G–胎盘细胞在允许形成胚样体的条件下,促进包括该分离的胎盘干细胞的胎盘细胞群中胚样体的形成。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞与不是干细胞或多潜能细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞与不显示这些标记物组合的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的治疗方法和ECM组合物的细胞群是包括,如富集CD200+、HLA-G–胎盘干细胞的细胞群。在具体的实施方式中,所述群是胎盘细胞群。在各种实施方式中,所述细胞群中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞。优选地,所述细胞群中的至少约70%的细胞是分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞。更优选地,至少约90%、95%或99%的所述细胞是分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞。在该细胞群的具体的实施方式中,所述分离的CD200+,HLA-G–胎盘干细胞还是CD73+和CD105+。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞还是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞还是CD34–、CD38–、CD45–、CD73+和CD105+。在另一实施方式中,所述细胞群当在允许形成胚样体的条件下培养时产生一种或多种胚样体。在另一具体的实施方式中,所述细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是CD73+、CD105+和CD200+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是HLA-G–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD34–、CD38–、CD45–和HLA-G–。在另一具体的实施方式中,分离的CD73+、CD105+和CD200+胎盘干细胞,当包括该分离的胎盘干细胞的胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时,促进该群中一种或多种胚样体的形成。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞与不是该分离的胎盘干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群是包括,如富集分离的CD73+、CD105+、CD200+胎盘干细胞的细胞群。在各种实施方式中,所述细胞群中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是分离的CD73+、CD105+、CD200+胎盘干细胞。在另一实施方式中,所述细胞群中至少约70%的所述细胞是分离的CD73+、CD105+、CD200+胎盘干细胞。在另一实施方式中,所述细胞群中至少约90%、95%或99%的细胞是分离的CD73+、CD105+、CD200+胎盘干细胞。在所述群的具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是HLA-G–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–、CD45–和HLA-G。在另一具体的实施方式中,包括所述胎盘干细胞的所述细胞群当在允许形成胚样体的条件下培养时产生一种或多种胚样体。在另一具体的实施方式中,所述胎盘干细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述胎盘细胞群与不显示这些特性的胎盘细胞分离。
在某些其他的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH4+、SSEA3–、SSEA4–、OCT-4+、HLA-G–或ABC-p+的一种或多种。在具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3–、SSEA4–和OCT-4+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD45–、CD54+、SH2+、SH3+和SH4+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD45–、CD54+、SH2+、SH3+、SH4+和OCT-4+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、HLA-G–、SH2+、SH3+和SH4+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+和ABC-p+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是SH2+、SH3+、SH4+和OCT-4+。在另一实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+、CD34–、SSEA3–和SSEA4–。在具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+、CD34–、SSEA3–和SSEA4–胎盘细胞附加地是CD10+、CD29+、CD34–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+和SH4+。在另一实施方式中,该分离的胎盘干细胞是OCT-4+和CD34–,以及SH3+或SH4+。在另一实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD34–;以及CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+或OCT-4+。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是CD200+和OCT-4+。在具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是CD73+和CD105+。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞是HLA-G–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞是CD34–、CD38–、CD45–、CD73+、CD105+和HLA-G–。在另一具体的实施方式中,该分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞,当包括该分离的细胞的胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时,促进该群产生一种或多种胚样体。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞与不显示这些特性的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群是包括,如富集CD200+、OCT-4+胎盘干细胞的细胞群。在各种实施方式中,所述细胞群中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞。在另一实施方式中,至少约70%的所述细胞是所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞。在另一实施方式中,所述细胞群中至少约80%、90%、95%或99%的细胞是所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞。在该分离的群的具体的实施方式中,所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞附加地是CD73+和CD105+。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞附加地是HLA-G–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞附加地是CD34–、CD38–、CD45–、CD73+、CD105+和HLA-G–。在另一具体的实施方式中,该细胞群当在允许形成胚样体的条件下培养时产生一种或多种胚样体。在另一具体的实施方式中,所述细胞群与不是分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是CD73+、CD105+和HLA-G–。在另一具体的实施方式中,该分离的CD73+、CD105+和HLA-G–胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,该分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞附加地是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,该分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞附加地是OCT-4+。
在另一具体的实施方式中,该分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞附加地是CD200+。在另一具体的实施方式中,该分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–、CD45–、OCT-4+和CD200+。在另一具体的实施方式中,该分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞,当包括所述细胞的胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时,促进该群中胚样体的形成。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞与不是该分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群是包括,如富集分离的CD73+、CD105和HLA-G–胎盘干细胞的细胞群。在各种实施方式中,所述细胞群中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞。在另一实施方式中,所述细胞群中至少约70%的细胞是分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞。在另一实施方式中,所述细胞群中至少约90%、95%或99%的细胞是分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞。在上述群的具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞附加地是OCT-4+。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞附加地是CD200+。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–、CD45–、OCT-4+和CD200+。在另一具体的实施方式中,所述细胞群与不是所述CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是CD73+和CD105+以及当包括所述CD73+、CD105+胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时,促进所述群中一种或多种胚样体的形成。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞附加地是OCT-4+。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞附加地是OCT-4+、CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞与不显示这些特性的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群是包括,如富集作为CD73+、CD105+的分离的胎盘干细胞的细胞群以及当包括所述细胞的分离的胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时,促进所述群中一种或多种胚样体的形成。在各种实施方式中,所述细胞群中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞。在另一实施方式中,所述细胞群中至少约70%的细胞是所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞。在另一实施方式中,所述细胞群中至少约90%、95%或99%的细胞是所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞。在上述群的具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞附加地是OCT-4+。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞附加地是CD200+。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–、CD45–、OCT-4+和CD200+。在另一具体的实施方式中,所述细胞群与不是所述分离的CD73+、CD105+胎盘干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是OCT-4+以及当在允许形成胚样体的条件下培养时,促进包括所述细胞的分离的胎盘细胞群中一种或多种胚样体的形成。在具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD73+和CD105+。在另一具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD200+。在另一具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD73+、CD105+、CD200+、CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞与不是OCT-4+胎盘干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘细胞与不显示这些特性的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群是包括,如富集作为OCT-4+的分离的胎盘干细胞的细胞群以及当包括所述细胞的分离的胎盘细胞群在允许形成胚样体的条件下培养时,促进所述群中一种或多种胚样体的形成。在各种实施方式中,所述细胞群中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是所述分离的OCT-4+胎盘干细胞。在另一实施方式中,所述细胞群中至少约70%的细胞是所述分离的OCT-4+胎盘细胞。在另一实施方式中,所述细胞群中至少约80%、90%、95%或99%的细胞是所述分离的OCT-4+胎盘干细胞。在上述群的具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–或CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD73+和CD105+。在另一具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD200+。在另一具体的实施方式中,所述分离的OCT-4+胎盘干细胞附加地是CD73+、CD105+、CD200+、CD34–、CD38–和CD45–。在另一具体的实施方式中,所述细胞群与不是所述胎盘干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是分离的HLA-A,B,C+、CD45–、CD133–和CD34–胎盘干细胞。在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群是包括分离的胎盘干细胞的细胞群,其中所述细胞群中至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞是分离的HLA-A,B,C+、CD45–、CD133–和CD34–胎盘干细胞。在具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群与不是HLA-A,B,C+、CD45–、CD133–和CD34–胎盘干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞是非母体来源的。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞群基本上不含母体组分;如所述分离的胎盘细胞群中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞是非母体来源的。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是分离的CD10+、CD13+、CD33+、CD45–、CD117–和CD133–胎盘干细胞。在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群是包括分离的胎盘干细胞的细胞群,其中所述细胞群中至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞是分离的CD10+、CD13+、CD33+、CD45–、CD117–和CD133–胎盘干细胞。在具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群与不是所述分离的胎盘干细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的CD10+、CD13+、CD33+、CD45–、CD117–和CD133–胎盘细胞是非母体来源的,即具有胎儿基因型。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞群中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞是非母体来源的。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群与不显示这些特性的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是分离的CD10+、CD33–、CD44+、CD45–和CD117–胎盘干细胞。在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群是包括,如富集分离的胎盘干细胞的细胞群,其中所述细胞群中至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞是分离的CD10+、CD33–、CD44+、CD45–和CD117–胎盘干细胞。在具体的实施方式中,所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘干细胞群与不是所述细胞的胎盘细胞分离。另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞是非母体来源的。在另一具体的实施方式中,所述细胞群至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞是非母体来源的。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是分离的CD10+、CD13–、CD33–、CD45–和CD117–胎盘干细胞。在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群是包括,如富集分离的CD10+、CD13–、CD33–、CD45–和CD117–胎盘干细胞的细胞群,其中所述群至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞是CD10+CD13–、CD33–、CD45–和CD117–胎盘细胞。在具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞是非母体来源的。在另一具体的实施方式中,所述细胞群中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞是非母体来源的。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群与不显示这些特性的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是HLA A,B,C+、CD45–、CD34–和CD133–,以及附加地是CD10+、CD13+、CD38+、CD44+、CD90+、CD105+、CD200+和/或HLA-G–和/或CD117阴性的。在另一实施方式中,可用于本文所述的方法的细胞群是包括分离的胎盘干细胞的细胞群,其中所述群中至少约20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或约99%的细胞是分离的胎盘干细胞,其是HLA A,B,C+、CD45–、CD34–、CD133–,以及附加地是CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200阳性的;和/或CD117和/或HLA-G阴性的。在具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞是非母体来源的。在另一具体的实施方式中,所述细胞群中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞是非母体来源的。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群与不显示这些标记物的胎盘细胞分离。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是分离的胎盘干细胞,其如通过抗体结合所确定的,是CD200+和CD10+;以及如通过抗体结合或RT-PCR所确定的,是CD117–。在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是分离的胎盘干细胞,如胎盘干细胞或胎盘多潜能细胞,其是CD10+、CD29+、CD54+、CD200+、HLA-G–、MHC I类+和β-2-微球蛋白+。在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是胎盘细胞,其中至少一种细胞标记物的表达是间质干细胞(如骨髓源性间质干细胞)的至少两倍。在另一具体的实施方式中,所述分离的胎盘干细胞是非母体来源的。在另一具体的实施方式中,所述细胞群中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞是非母体来源的。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是分离的胎盘干细胞,如胎盘干细胞或胎盘多潜能细胞,其是CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62E–。CD62L–、CD62P–、CD80–、CD86–、CD103–、CD104–、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-钙粘蛋白低、CD184/CXCR4–、β-微球蛋白低、MHC-I低、MHC-II–、HLA-G低和/或PDL1低的一种或多种。在具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是至少CD29+和CD54+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是至少CD44+和CD106+。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘干细胞是至少CD29+。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的细胞群包括分离的胎盘干细胞,其中所述细胞群中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是分离的胎盘干细胞,其是CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62-E–、CD62-L–、CD62-P–、CD80–、CD86–、CD103–、CD104–、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-钙粘蛋白dim、CD184/CXCR4–、β-微球蛋白dim、HLA-Idim、HLA-II–、HLA-Gdim和/或PDL1dim的一种或多种。在另一具体的实施方式中,所述细胞群中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62-E–、CD62-L–、CD62-P–、CD80–、CD86–、CD103–、CD104–、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-钙粘蛋白dim、CD184/CXCR4–、β-微球蛋白dim、MHC-Idim、MHC-II–、HLA-Gdim和PDL1dim。在某些实施方式中,该胎盘细胞当受干扰素γ(IFN-γ)诱导时表达HLA-II标记物。
在另一实施方式中,可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘干细胞是分离的胎盘干细胞,其是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3–、SSEA4–、OCT-4+和ABC-p+的一种或多种或全部,其中ABC-p是胎盘特异性ABC转运蛋白(亦称乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和米托蒽醌耐药蛋白(MXR)),其中所述分离的胎盘干细胞通过,例如灌注哺乳动物(如人类)胎盘(其已经排干脐血并经灌注以去除残血)而获得。
在任何上述特性的另一具体的实施方式中,该细胞标记物(如分化抗原簇或免疫原标记物)的表达通过流式细胞计量术来确定;在另一具体的实施方式中,该标记物的表达通过RT-PCR来确定。
基因分析证实分离的胎盘干细胞和分离的胎盘干细胞群可区别于其他细胞,如间质干细胞,如骨髓源性间质干细胞。本文所述的该分离的胎盘干细胞可以基于一种或多种基因的表达而区别于,如间质干细胞,所述基因在该分离的胎盘干细胞中的表达显著高于在骨髓源性间质干细胞中的表达。具体地,可用于本文所提供的治疗方法的分离的胎盘干细胞可以基于一种或多种基因的表达而区别于间质干细胞,所述基因在该分离的胎盘干细胞中的表达显著高于(也就是,至少两倍)在同等数目的骨髓源性间质干细胞中的表达,其中当该细胞在同等的条件下培育时,该一种或多种基因是ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAM1、IER3、IGFBP7、ILIA、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A或任何上述的组合。见,如美国专利申请公开号2007/0275362,其披露内容以引用方式被整体并入本文。在某些具体的实施方式中,所述一种或多种基因的所述表达可通过,如RT-PCR或微阵列分析,如使用U133-A微阵列(Affymetrix)确定。在另一具体的实施方式中,当在培养基中培养达到若干群倍增(如从约3到约35个群倍增的任一处)时,所述分离的胎盘干细胞表达所述一种或多种基因,该培养基包括DMEM-LG(例如来自Gibco);2%胎牛血清(例如来自Hyclone Labs);1X胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS);1X亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA);10-9M地塞米松(例如来自Sigma);10-4M抗坏血酸2-磷酸盐(例如来自Sigma);表皮生长因子10ng/mL(例如来自R&D Systems);以及血小板源性生长因子(PDGF-BB)10ng/mL(例如来自R&D Systems)。在另一具体的实施方式中,该分离的胎盘细胞特异性基因是CD200。
2008年3月起,这些基因的特定序列可以按如下登录号在GenBank中找到:NM_001615(ACTG2)、BC065545(ADARB1)、(NM_181847(AMIGO2)、AY358590(ARTS-1)、BC074884(B4GALT6)、BC008396(BCHE)、BCO20196(C11orf9)、BCO31103(CD200)、NM_001845(COL4A1)、NM_001846(COL4A2)、BCO52289(CPA4)、BC094758(DMD)、AF293359(DSC3)、NM_001943(DSG2)、AF338241(ELOVL2)、AY336105(F2RL1)、NM_018215(FLJ10781)、AY416799(GATA6)、BC075798(GPR126)、NM_016235(GPRC5B)、AF340038(ICAM1)、BC000844(IER3)、BC066339(IGFBP7)、BC013142(IL1A)、BT019749(IL6)、BC007461(IL18)、(BC072017)KRT18、BC075839(KRT8)、BC060825(LIPG)、BC065240(LRAP)、BC010444(MATN2)、BC011908(MEST)、BC068455(NFE2L3)、NM_014840(NUAK1)、AB006755(PCDH7)、NM_014476(PDLIM3)、BC126199(PKP-2)、BC090862(RTN1)、BC002538(SERPINB9)、BCO23312(ST3GAL6)、BC001201(ST6GALNAC5)、BC126160or BC065328(SLC12A8)、BCO25697(TCF21)、BC096235(TGFB2)、BC005046(VTN)以及BC005001(ZC3H12A)。
在某些具体的实施方式中,当所述分离的胎盘干细胞在同等条件下培育时,该细胞以比同等数目的骨髓源性间质干细胞可检测的更高的水平表达如下每个:ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAM1、IER3、IGFBP7、ILIA、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN以及ZC3H12A。
在具体的实施方式中,该胎盘细胞以比同等数目的骨髓源性间质干细胞(BM-MSCs)可检测的更高的水平表达CD200和ARTS1(1型肿瘤坏死因子的氨肽酶调节剂);ARTS-1和LRAP(白细胞-衍生的精氨酸氨肽酶);IL6(白细胞介素-6)以及TGFB2(转化生长因子,β2);IL6和KRT18(角蛋白18);IER3(即早反应3),MEST(中胚层特异性转录同系物)和TGFB2;CD200和IER3;CD200和IL6;CD200和KRT18;CD200和LRAP;CD200和MEST;CD200和NFE2L3(核因子(红细胞-衍生的2)-样3);或CD200和TGFB2,其中所述骨髓源性间质干细胞在培养中已经经历了若干传代,其等同于所述分离的胎盘干细胞已经经历的传代数。在其他具体的实施方式中,该胎盘细胞以比同等数目的骨髓源性间质干细胞BM-MSCs可检测的更高的水平表达ARTS-1、CD200、IL6和LRAP;ARTS-1、IL6、TGFB2、IER3、KRT18和MEST;CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2;ARTS-1、CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2;或IER3、MEST和TGFB2,其中所述骨髓源性间质干细胞在培养中已经经历了若干传代,其等同于所述分离的胎盘干细胞已经经历的传代数。
上述提及的基因的表达可以通过标准技术进行评估。例如,基于一种(或多种)基因的序列的探针可以通过常规技术单独选择和构建。该基因的表达可以例如,在包括一种或多种基因探针的微阵列(如Affymetrix基因芯片TM人类基因组U133A2.0阵列或Affymetrix基因芯片TM人类基因组U133Plus 2.0(加利福尼亚州圣克拉拉))上进行评估。即使特定GenBank登录号的序列被修正,这些基因的表达也可以进行评估,因为特异于经修正的序列的探针可以使用公知的标准技术容易地产生。
这些基因的表达水平可以被用来确认分离的胎盘干细胞群的身份,以将细胞群识别为包括至少多个分离的胎盘干细胞,以及诸如此类。其身份得以确认的分离的胎盘干细胞群可以是例如,从单一的分离的胎盘细胞扩张的克隆的分离的胎盘干细胞群;或混合的干细胞群,例如,仅包括从多个分离的胎盘干细胞扩张的分离的胎盘干细胞的细胞群;或,包括如本文所述的分离的胎盘干细胞,以及至少一种其他类型的细胞的细胞群。
该胎盘干细胞可以通过灌注获得,例如根据一种方法生产,该方法包括灌注哺乳动物胎盘,其已经排干脐血并经灌注以去除残血;用灌注液灌注所述胎盘;以及收集所述灌注液,其中灌注后所述灌注液包括包含胎盘干细胞的胎盘细胞群;以及从所述细胞群分离多个所述胎盘干细胞。在具体的实施方式中,该灌注液通过脐静脉和脐动脉,并在排出该胎盘之后被收集。通过这种方法生产的胎盘干细胞群通常包括胎儿和母体细胞的混合物。在另一具体的实施方式中,该灌注液通过脐静脉并从脐动脉中收集;或通过脐动脉并从脐静脉中收集。通过这种方法生产的胎盘干细胞群通常基本上只是胎儿来源的;即,例如,该群中大于90%、95%、99%或99.5%的该胎盘干细胞是胎儿来源的。
在各种实施方式中,包含在灌注胎盘获得的细胞群内的该胎盘干细胞占所述胎盘细胞群的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或至少99.5%。在另一具体的实施方式中,通过灌注收集的该胎盘干细胞包括胎儿和母体细胞。在另一具体的实施方式中,通过灌注收集的胎盘干细胞含至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或至少99.5%的胎儿细胞。
胎盘干细胞也可以通过对器官或其一部分的物理破坏(如酶消化)而从哺乳动物胎盘中分离。例如,可以将该胎盘或其一部分,如粉碎、剪切、切碎、切块、剁碎、浸解或诸如此类,并且随后用一种或多种酶消化组织。也可以将该胎盘或其一部分物理破坏并用一种或多种酶消化,然后将所得材料再浸入或混入,如培养基或缓冲液中。可以使用任何物理破坏方法,只要该破坏方法在所述器官中留下通过,如台盼蓝排除法所确定存活的多个,更优选地多数,以及更优选地至少60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞。
该胎盘可以在物理破坏和/或酶消化和干细胞回收之前被分解为组分。例如,胎盘干细胞可以从羊膜、绒毛膜、脐带、胎盘绒毛叶或其任意组合中获得。通常情况下,胎盘干细胞可以通过破坏小的胎盘组织块来获得,如体积为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米的胎盘组织块。
可通过胎盘组织的灌注或物理/酶促破坏用于胎盘干细胞的一种干细胞收集组合物包括一种或多种组织破坏性酶,例如胶原酶、分散酶、透明质酸酶、LIBERASE(印第安纳州印第安纳波利斯的Boehringer MannheimCorp.)、木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶)或诸如此类。组织消化酶的任何组合都可以使用。组织消化酶的典型浓度包括,例如,对于胶原酶I和胶原酶IV,50-200U/mL;对于分散酶,1-10U/mL;以及对于弹性蛋白酶,10-100U/mL。蛋白酶可以组合使用,即,两种或更多种蛋白酶被用于同一消化反应中;或者可以顺次使用以释放胎盘干细胞。例如,在一个实施方式中,胎盘或其一部分首先用2mg/ml适量的胶原酶I消化30分钟,随后在37℃下用0.25%的胰蛋白酶消化10分钟。丝氨酸蛋白酶优选地在其他酶的使用之后连续使用。
在另一实施方式中,可以在用该干细胞收集组合物分离该干细胞之前,通过将螯合剂(如乙二醇双(2-胺基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA))加入到包括该干细胞的该干细胞收集组合物中或其中破坏和/或消化有组织的溶液中将该组织进一步破坏。
如果整个胎盘或胎盘的部分包括胎儿和母体细胞(例如,如果该胎盘的该部分包括绒毛膜或绒毛叶),所收集的胎盘干细胞将包括衍生自胎儿和母体来源的胎盘干细胞的混合物。如果该胎盘的部分不包括母体细胞(如羊膜)或者包括可忽略量的母体细胞,所收集的胎盘干细胞将包括几乎全部的胎儿胎盘干细胞。
5.7.2胎盘干细胞的分离和表征
来自哺乳动物胎盘的干细胞,无论是通过灌注或酶消化获得的,最初都可以通过,例如Ficoll梯度离心从其他细胞中纯化(即与其分离)。这类离心可以按照离心速度等的任何标准协议。在一个实施方式中,例如,通过在室温下按5000Xg离心15分钟从灌洗液中回收从该胎盘收集的细胞,这使得细胞与,例如污染碎片和血小板分离。在另一实施方式中,将胎盘灌注液浓缩至约200ml,在Ficoll之上轻轻成层并于22℃按约1100Xg离心20分钟,以及收集细胞的低密度界面层以用于进一步处理。
可将细胞沉淀重悬浮于新鲜的干细胞收集组合物或适用于干细胞维持的培养基(例如含有2U/ml肝素和2mM EDTA(纽约州GibcoBRL)的无IMDM血清的培养基)中。可,例如使用Lymphoprep(挪威奥斯陆的NycomedPharma),根据制造商推荐的程序将总的单核细胞组分分离。
可以使用,例如具有0.2%EDTA的0.05%胰蛋白酶溶液(密苏里州圣路易斯的Sigma),通过差别胰酶消化,对通过灌注或消化获得的胎盘细胞进行,例如进一步或最初的分离。差别胰酶消化是可能的,因为胎盘干细胞通常在约五分钟内从塑料表面脱离,而其他粘附群通常需要超过20-30分钟的孵育。脱离的胎盘干细胞可以使用,例如胰蛋白酶中和剂溶液(俄勒冈州波特兰的Cascade Biologies),按照胰蛋白酶化和胰蛋白酶中和作用收获。在粘附细胞的分离的一个实施方式中,将例如,约5-10X 106细胞的等分试样放置在若干T-75烧瓶(优选地涂覆有纤连蛋白的T75烧瓶)的每个中。在这类实施方式中,该细胞可以用,例如市售的间质干细胞培养基,如(加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华Stemcell Technologies)进行培养,并被置于组织培养孵化器(37℃,5%CO2)中。10-15天之后,通过用PBS洗涤从该烧瓶中去除非粘附细胞。然后用或类似的培养基代替该PBS。优选地每天对烧瓶进行各种粘附细胞类型存在(特别是成纤维细胞簇的识别和扩张)的检查。
可以,例如通过使用标准细胞检测技术,如流式细胞细胞计量术、细胞分选、免疫细胞化学(如用组织特异性或细胞-标记物特异性抗体染色)、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)来测量形态和细胞表面标志物的变化;通过使用光或共聚焦显微术的细胞形态检查;和/或通过使用本领域公知的技术(如PCR和基因表达谱)来测量基因表达的变化对从哺乳动物胎盘收集的细胞的数量和类型进行监测。这些技术也可以被用来识别对一种或多种特定的标记物呈阳性的细胞。例如,使用CD34抗体,我们可以使用上述技术来确定细胞是否包括可检测量的CD34;如果是,则该细胞是CD34+。同样地,如果细胞产生通过RT-PCR可检测的足够的OCT-4RNA或比成体细胞显著得多的OCT-4RNA,则该细胞是OCT-4+。细胞表面标记物(例如,CD标记物,如CD34)抗体和干细胞-特异性基因(如OCT-4)的序列为本领域所公知。
胎盘干细胞,尤其是已经通过Ficoll分离、差别粘附或两者的组合得以分离的细胞,可以使用荧光激活细胞分选仪(FACS)进行分选。荧光激活细胞分选(FACS)是一种公知的用于基于颗粒的荧光性质分离该颗粒(包括细胞)的方法(见,例如Kamarch,1987,Methods Enzymol,151:150-165)。单个颗粒中荧光部分的激光激发产生小的电荷,其允许正负颗粒从混合物中电磁分离。在一个实施方式中,用不同的荧光标记物标记细胞表面标记物-特异性抗体或配体。通过该细胞分选仪处理细胞,允许基于细胞结合所用抗体的能力将它们分离。可以将FACS分选的颗粒直接沉积到96孔或384孔板的单个孔中,以促进分离和克隆。连接于磁珠的抗体也可以用来分选细胞。
在一个分选方案中,基于标记物CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达来分选来自胎盘的细胞。这可以通过结合基于培养中干细胞的粘附性质来对它们进行选择的程序得以实现。例如,粘附选择干细胞可以在基于标记物表达的分选之前或之后完成。在一个实施方式中,例如,首先基于其CD34的表达对细胞进行分选;将CD34-细胞保留,并且将作为CD200+HLA-G–的细胞从所有其他CD34–细胞中分离。在另一实施方式中,来自胎盘的细胞基于其CD200的表达和/或HLA-G的表达缺乏;例如,将显示任一这些标记物的细胞分离以供进一步使用。可以,在具体的实施方式中,基于其CD73和/或CD105的表达;或抗体SH2、SH3或SH4识别的表位;或CD34、CD38或CD45表达的缺乏,将表达,例如CD200和/或缺乏HLA-G表达的细胞进行进一步的分选。例如,在一个实施方式中,通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或表达缺乏对胎盘细胞进行分选,以及将作为CD200+、HLA-G型、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-和CD45-的胎盘细胞从其他的胎盘细胞中分离以供进一步使用。
在另一实施方式中,磁珠可以被用于分离细胞。该细胞可以使用磁激活细胞分选(MACS)技术(一种用于基于颗粒结合磁珠(直径0.5-100μm)的能力对该颗粒进行分离的方法)进行分选。可以在磁性微球体上进行各种有用的修饰,包括对特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体的共价添加。然后将该珠与该细胞混合,以允许结合。然后使细胞通过磁场以分离出具有特定细胞表面标记物的细胞。在一个实施方式中,然后可以将这些细胞分离并且与耦合到另外的细胞表面标记物的抗体的磁珠再混合。使该细胞再次通过磁场,分离结合这两种抗体的细胞。然后可以将这类细胞稀释到不同的皿(如微量皿)中进行克隆分离。
可以使用本领域已知的标准技术,如台盼蓝排除测定法、荧光素二乙酸酯摄取测定法、碘化丙锭摄取测定法(以评估活力);以及胸苷摄取测定法、MTT细胞增殖测定法(以评估增殖)对胎盘干细胞进行活力、增殖潜力和寿命评估。寿命可以通过本领域中公知的方法,例如通过确定扩张培养物中群倍增的最大数量来确定。
也可以使用本领域已知的其他技术,例如,所需细胞的选择性培育(阳性选择)、不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择;例如用大豆凝集素,基于混合群中差别细胞凝集的分离;冻融程序;过滤;常规和区带离心;离心冲洗(反流离心);单位重力分离;逆流分配;电泳;以及诸如此类将胎盘干细胞从其他胎盘细胞中分离。
5.7.3.胎盘干细胞的培养
胎盘干细胞可以如上所述进行分离并且立即接触ECM。在接触ECM之前,胎盘干细胞还可以被培养,例如于细胞培养物中达多代。例如,分离的胎盘干细胞;或胎盘干细胞群;或培育胎盘干细胞的细胞或胎盘组织可以用于发起或接种细胞培养物。一般将细胞转移到未涂覆或涂覆有细胞外基质或配体(如层粘连蛋白、胶原蛋白(如天然或变性的蛋白质)、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻连蛋白和/或市售的胞外膜蛋白)的无菌组织培养容器中。
在某些实施方式中,在ECM(如本文提供的ECM)上培养该胎盘干细胞。在某些实施方式中,该ECM包括可检测量的纤连蛋白和层粘连蛋白。在其他的实施方式中,该ECM不包括可检测量的纤连蛋白或层粘连蛋白。在其他的实施方式中,该ECM包括以干重计,至少约5%或至少约10%的弹性蛋白。在另一实施方式中,该ECM包括以干重计,不超过约5%的弹性蛋白。
在某些实施方式中,培养胎盘干细胞以生产可从培养基中收集的特定的细胞因子。在具体的实施方式中,该细胞因子是IL-6、IL-8和/或单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)。在某些其他的实施方式中,培养该胎盘干细胞以生产纤连蛋白。在具体的实施方式中,在包括小于约5%纤连蛋白的ECM上培养该胎盘干细胞。
如上所述,ECM可以成型为任何可用的(如医学上可用的)形状。这些组合物,一旦成型和干燥,在水溶液中(如组织培养基或缓冲液)中一般是稳定的。因此,干细胞(如胎盘干细胞)可以直接在成型组合物上进行培养。这类培养可以在细胞培养皿或其他适用于细胞培养的液体容器(如烧瓶)中完成。
胎盘干细胞可以在本领域公认的用于干细胞培养的可接受的任何条件下,于任何培养基中进行培养。在某些实施方式中,该培养基包括血清,例如人血清或小牛血清/胎牛血清。在某些其他的实施方式中,该培养基是无血清的。胎盘干细胞可以培养在,例如包含ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、LA+BSA(亚油酸-牛血清白蛋白)、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1,以及青霉素/链霉素的DMEM-LG(Dulbecco氏改良必需培养基,低葡萄糖)/MCDB 201(鸡成纤维细胞基的培养基);包括10%胎牛血清(FBS)的DMEM-HG(高葡萄糖);包括15%FBS的DMEM-HG;包括10%FBS、10%马血清和氢化可的松的IMDM(Iscove氏改良Dulbecco氏培养基);包括10%FBS、EGF和肝素的M199;包括10%FBS、GLUTAMAX.TM.和庆大霉素的{umlaut over(.gamma.)}-MEM(基本必需培养基);包括10%FBS、GLUTAMAX.TM.和庆大霉素等的DMEM中。在一个实施方式中,该培养基是包括2%FBS、ITS、LA+BSA、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201。
可用于培养胎盘干细胞的其他培养基包括DMEM(高或低葡萄糖)、Eagle氏基础培养基、Ham氏F10培养基(F10)、Ham氏F-12培养基(F12)、Iscove氏改良Dulbecco氏培养基、间质干细胞生长培养基(MSCGM)、Liebovitz氏L-15培养基、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、高级DMEM(Gibco)、DMEM/MCDB201(Sigma)和CELL-GRO FREE。
该培养基可以补充有一种或多种组分,包括,例如血清(如胎牛血清(FBS),优选地约2-15%(v/v);马血清(ES);人血清(HS));β-巯基乙醇(BME),优选约0.001%(v/v);一种或多种生长因子,例如血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素(EPO);氨基酸,包括L-缬氨酸;以及控制微生物污染的一种或多种抗生素和/或抗霉菌剂,例如(作为举例)单独或组合的青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。
胎盘干细胞可以被培养在标准组织培养条件下,例如在组织培养皿或多孔平板中。胎盘干细胞还可以使用悬滴法培养。在这种方法中,胎盘干细胞以约1×104个细胞/mL被悬浮在约5mL培养基中,以及该培养基的一个或多个液滴被放置在组织培养容器(如100mL的陪替氏培养皿)的盖子的内部上。该液滴可以是来自,例如多通道移液器的,例如单个液滴或多个液滴。将盖子小心地倒置并放置在该皿底部的顶端,其包含一定体积的足以维持皿气氛下的水分含量的液体(如无菌PBS),以及培养干细胞。
一旦获得分离的胎盘干细胞;或包括胎盘干细胞的分离的干细胞群(例如,从至少50%胎盘细胞中分离的干细胞或干细胞群,在活体内该干细胞或干细胞群是通常与该胎盘细胞相关联的),该胎盘干细胞或细胞群可以在活体外增殖并扩张。例如,该胎盘干细胞可以被培养在组织培养容器(如皿、烧瓶、多孔板或诸如此类)中一段时间,该时间对该干细胞来说足以增殖至70-90%汇合率,也就是,直到该干细胞及其后代占据该组织培养容器的70-90%培养表面面积。
胎盘干细胞可以按允许细胞生长的密度被接种在培养瓶中。例如,该细胞可以按低密度(如约1,000至约5,000细胞/cm2)到高密度(如约50,000或更多细胞/cm2)不等被接种。在优选的实施方式中,在空气中约0至约5体积%CO2中培养该细胞。在一些优选的实施方式中,在空气中约2至约25%O2,优选地在空气中约5至约20%O2中培养该细胞。优选地于约25℃至约40℃,优选地37℃培养该细胞。优选地在孵化器中培养该细胞。培养基可以是静态的或,例如使用生物反应器进行搅拌。可以在低氧化应激下(如添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸或诸如此类)培育胎盘干细胞。
一旦获得70%-90%汇合率,可将该细胞传代。例如,可以使用本领域公知的技术将该细胞进行酶处理,例如胰蛋白酶消化,以将它们从组织培养表面分离。通过移液去除该细胞并对该细胞计数之后,将约20,000-100,000干细胞,优选地约50,000干细胞传代到含有新鲜培养基的新培养容器中。通常情况下,新的培养基与去除了该干细胞的培养基是相同类型。已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、或20次或更多的胎盘干细胞可以与ECM组合使用。
5.8非干细胞
在本文所述的方法中使用的组合物可以,在某些实施方式中,包括一种或多种类型的非干细胞。如本文所用,“非干细胞”是指末端分化细胞。例如,在一个实施方式中,组合物包括多个成纤维细胞。可与该组合物组合的非干细胞包括但不限于成纤维细胞或成纤维细胞样细胞、真皮细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、心肌细胞、胰腺细胞以及诸如此类。在某些其他的实施方式中,该组合物包括至少两种类型的干细胞和至少两种类型的非干细胞。
对于其中组合物与干细胞或非干细胞组合的任何上述实施方式,该细胞与该组合物可以,例如作为单一的组合物一起被施用至个体。例如,在一个实施方式中,该组合物可以包括干细胞,该干细胞在该组合物被施用至个体之前已经刚刚(如在10-20分钟内)与该组合物接触。在另一实施方式中,该干细胞可以在施用之前足以允许该干细胞粘附到该组合物的时间,通常在施用之前至少1小时与该组合物接触。在更具体的实施方式中,在施用之前的时间是在施用之前,对该干细胞来说足以附着和增殖的时间,通常至少24小时至48小时或更长。在另一更具体的实施方式中,该时间是对该干细胞来说附着到固体形成组合物以及在其上增殖,以及沉积可检测量的细胞外基质蛋白(如纤连蛋白)的时间。
该组合物,以及干细胞或非干细胞,也可以被单独施用至该个体。例如,在一个实施方式中,该组合物可以,例如在需要修复的伤口或组织的部位被施用给个体,并且该干细胞可随后被施用。在另一实施方式中,该干细胞与口腔病变的部位接触,以及该需要修复的伤口或组织随后与本文所述的组合物接触。
因此,在一个实施方式,本发明提供一种促进口腔病变的愈合的方法,包括使该病变与本文所述的包括干细胞(如胎盘干细胞)的组合物接触,其中该干细胞分泌IL-6、IL-8或MCP-1或其任何组合;或分泌纤连蛋白,进入该病变的至少一部分。其中,该干细胞将分泌纤连蛋白,优选的是该组合物包括不可检测量的纤连蛋白。在具体的实施方式中,该组合物被成型或形成为该口腔病变的大致形状。
5.9试剂盒
在另一方面,本文提供包括本文所述的组合物和另外的组件以促进口腔病变的治疗的试剂盒。在某些实施方式中,该试剂盒包括一个或多个包装件的本文所述的组合物,以供本领域的技术医师分配。该试剂盒可以包括具有关于将该组合物用于口腔病变治疗的说明书的标签或标贴。在某些实施方式中,该试剂盒可以包括可用于执行该方法的组件,例如用于施用胶原蛋白组合物(例如一个或多个喷雾瓶、镊子、刮铲(用于施加糊剂)、插管、导管等)的工具。在某些实施方式中,该试剂盒可以包括一种或多种组件,其可用于用于施用该组合物的工具的安全处置(如“尖锐件”容器)。在某些实施方式中,该试剂盒可以包括含于预填充注射器、单位剂量或单位使用量的包装件的组合物(如包括ECM和/或ECM组分的组合物)。
在某些其他的实施方式中,该试剂盒包括用于干细胞或非干细胞群的培养的本文所述的组合物以及一种或多种其他组件。例如,该试剂盒可以包括适用于干细胞(如胎盘干细胞)培养的一种或多种构型的本文所述的组合物,例如薄片、管、网状等形式的组合物。该试剂盒可以包括将被用于培养干细胞的一种或多种物品,例如在细胞培养期间能够包括本文所述的组合物的培养皿;塑料制品、注射器、移液枪头、细胞培养基、一种或多种细胞因子或生长因子、可置换件以及诸如此类。
在其他的实施方式中,该试剂盒可以包括促进从胎盘组织收集干细胞的一种或多种组件。在各种具体的实施方式中,该试剂盒包括促进胎盘灌注以收集干细胞的组件,例如灌注溶液;大小足以容纳胎盘的一种或多种托盘、用于灌注液收集的玻璃器皿或塑料制品;用于灌注液收集的一种或多种袋子、用于脐血管开凿的针具和/或插管;适用于组织消化的蛋白酶、用于浸解或以其他方式提供胎盘组织的工具,以及诸如此类。在其他具体的实施方式中,该试剂盒包括促进胎盘组织的酶消化以分离胎盘干细胞的一种或多种组件,例如一种或多种组织消化酶(如胰蛋白酶、糜蛋白酶或诸如此类);适用于细胞培养物的塑料制品(如培养皿、多孔培养板以及诸如此类)。
6.实施例
在下面的章节中,本领域的技术人员将认识到,短语“于大约23℃”可以指室温。
6.1实施例1:从胎盘中分离ECM
本实施例对从胎盘中分离ECM做出说明。
根据本文所述的方法获得冷冻胎盘。将该胎盘包裹在有水的Nalgene托盘中1-4小时解冻。然后将它们从塑料包裹物中移出并放置于水中以进一步解冻。
将解冻的胎盘放置在绞肉机的不锈钢托盘上。从每个胎盘中切下脐带片段,并且于大约23℃将每个胎盘切成约4条。于大约23℃将该条用该绞肉机绞碎。
渗透压休克:将所得的绞碎的胎盘加入到具有0.5M NaCl的Nalgene罐(5L/胎盘)中以及使用机动搅拌器按75-100rpm混合(于4-6℃24小时)。
24小时后,于大约23℃将该搅拌器停止,允许组织沉降到该搅拌器的底部。于大约23℃,使用具有#36TYGONTM管道的蠕动泵将组织和流体泵出并且通过#40筛过滤,以及将分离的组织放回混合罐中。
向该混合物中加入新鲜的0.5M NaCl(5L/胎盘)以及于4-6℃混合24小时(机动搅拌器,75-100rpm)。24小时后,使用上述方法将该组织分离。
将组织用水(5-L/胎盘)洗涤并于4-6℃混合24小时(机动搅拌器,75-100rpm)。24小时后,使用上述方法将该组织分离。
根据上述四段将该组织再次用0.5M NaCl,再次用0.5M NaCl以及然后用水进一步洗涤。
冷冻干燥:在冷冻干燥容器中按200-400g的量将所得样本去壳(shelled)并于-70℃冷冻1-2小时。在冷冻干燥器中将冷冻的样本冷冻干燥24-48小时,然后除去。在混合器中将冷冻干燥的样本混合到光滑粉末中,然后转移到干净的混合罐中。
洗涤剂处理:将1%脱氧胆酸溶液(IL/胎盘)加入到具有经混合、冷冻干燥的样本的混合罐中。于4-6℃将该样本和1%脱氧胆酸溶液混合24小时(机动搅拌器,75-100rpm)。24小时后,将该搅拌器停止,并且用如上所述的#40筛分离组织。
于4-6℃重复该洗涤剂处理达24小时(机动搅拌器,75-100rpm)。24小时后,将该搅拌器停止,并且用如上所述的#40筛分离组织。
水洗:用水(5L/胎盘)洗涤组织并于4-6℃混合24小时(机动搅拌器,75-100rpm)。24小时后,使用上述方法将该组织分离。
再次用水(5L/胎盘)洗涤组织并于4-6℃混合24小时(机动搅拌器,75-100rpm)。24小时后,使用上述方法将该组织分离。
再次用水(5L/胎盘)洗涤组织并于4-6℃混合24小时(机动搅拌器,150rpm)。24小时后,使用上述方法将该组织分离。
可选地,第四次用水(5L/胎盘)洗涤组织并于4-6℃混合24小时(机动搅拌器,150rpm)。24小时后,使用上述方法将该组织分离。
冷冻干燥:将所得的样本以200g量加入混合器中。向该样本中加入200mL去离子水,以及用该混合器将该样本混合成均匀的糊剂。使混合的样本入池并用水(1L/胎盘)漂洗。
将样本以200-400g的量加入到冷冻干燥容器中。将样本去壳并冷冻于-70℃。将去壳的样本冷冻干燥达24-48小时。
无菌碱处理:使冷冻干燥的样本入池。将氢氧化钠溶液(0.5M,IL)加入到高压灭菌的无菌瓶中。向入池的冷冻干燥的样本中加入低内毒素水(IL)。于大约23℃,在摇床上以250rpm将该样本和氢氧化钠溶液混合4小时。
无菌水洗:通过无菌#70过滤器过滤回收该样本并用1L无内毒素的水洗涤。加入无内毒素的水(1L),以及于大约23℃,在摇床上以250rpm将样本混合18-24小时。
通过无菌#70过滤器过滤回收该样本。加入无内毒素的水(1L),以及于大约23℃,在摇床上以250rpm将样本混合18-24小时。
通过无菌#70过滤器过滤回收该样本并用1L无内毒素的水洗涤。加入无内毒素的水(1L),以及于大约23℃,在摇床上以250rpm将样本混合18-24小时。
如果pH大于9,将该样本再次用不含内毒素的水洗涤,以及在摇床上以约250RPM将样本混合18-24小时。
如果pH小于或等于9,该样本备用于制剂。产率可以为10g/胎盘或更多。
所得的ECM可以冷冻干燥用于储存。在使用时,可在混合器中将该样本按300-1000mg/mL悬浮于磷酸盐缓冲盐水,以在,例如注射器中用作糊剂。该样本还可以按500-1000mg/mL在磷酸盐缓冲盐水经模制成型,用作,例如,薄片、管、栓或诸如此类。
6.2实施例2:包括端肽胶原的ECM的制备
根据实施例1的渗透压休克、冷冻干燥、洗涤剂处理、水洗、冷冻干燥、碱处理、水洗和冷冻干燥的步骤制备7.5g包括端肽胶原的ECM。
根据实施例1的渗透压休克、冷冻干燥、洗涤剂处理、水洗、碱处理、水洗和冷冻干燥的步骤制备11.8g包括端肽胶原的ECM。
根据实施例1的渗透压休克、冷冻干燥、洗涤剂处理、水洗、碱处理、水洗和冷冻干燥的步骤制备12.0g包括端肽胶原的ECM。
根据实施例1的渗透压休克、冷冻干燥、水洗、碱处理、水洗和冷冻干燥的步骤制备11.8包括端肽胶原的ECM。
6.3实施例3:生化分析
根据实施例1和2制备ECM。通过标准技术的生化分析显示以干重计,80.40%的胶原蛋白、1.00%的水以及少于0.01%的纤连蛋白、层粘连蛋白和糖胺聚糖。弹性蛋白含量未确定。
根据实施例1和2制备的样本的氨基酸分析显示34-35%的甘氨酸、约11%的羟脯氨酸和10-11%脯氨酸。
根据实施例1和2制备的样本的免疫分析显示在总胶原蛋白中,74-92%是I型胶原蛋白,4-6%是III型胶原蛋白以及2-15%是IV型胶原蛋白。
6.4实施例4:制造ECM,以及在该ECM上培养干细胞的替代方法
本实施例对制造ECM的替代方法做出说明,并提供了对由这些方法制造的材料的组合物的分析。
材料和方法
细胞外基质(ECM)的分离:ECM分离如下。简要地说,将冷冻的人胎盘在0.5M氯化钠中解冻,在绞肉机中绞碎以及于23℃,在孵化器摇床中于0.5M氯化钠和水中,接着用洗涤剂(如1%SDS或0.5%脱氧胆酸)反复洗涤。放血的胎盘组织用0.1-0.5N氢氧化钠处理3小时到24小时不等以溶解子叶组织,继之以用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗,以中和pH。如此产生的材料是一种稳定的糊剂并被储存于4℃。
生化分析:为了确定分离的ECM的生化成组分,将1g样本冷冻干燥并确定干重。ECM的溶解通过于70℃溶解于100mM HCl中或于23℃在10mM的HCl对该ECM进行胃蛋白酶处理(1mg/g)18小时进行。溶解于100mM HCl的组织被用来确定纤连蛋白、层粘连蛋白、GAG和弹性蛋白的含量。胃蛋白酶溶解的组织被用来确定胶原蛋白含量。
纤连蛋白和层粘连蛋白浓度使用夹心ELISA来确定。弹性蛋白和糖胺聚糖(GAG)含量使用基于染料的测定法测定。I型胶原蛋白含量的确定用夹心ELISA(Chondrex)进行。III和IV型胶原蛋白含量使用内部ELISA,使用针对II型和IV型胶原蛋白的一次抗体和HRP-共轭的二次抗体确定。
ECM构建体的制备:为了制备该ECM薄片,将水合的ECM糊剂层夹于两种医疗级TYVEKTM薄片之间。将这个构建体装载到凝胶干燥器中以及于23℃施加真空过夜,直至将ECM膜干燥。将薄片切割为用于细胞培养研究的适当大小。为了制备该ECM的3D结构,将ECM糊剂填充到各种模具中并冷冻干燥。为了研究该ECM薄片和3D模制品在培养基或水中的稳定性,于37℃在水、盐水或细胞培养基中将该构建体孵育长达1周。
细胞培养物:将胎盘干细胞亚培养于60%低葡萄糖DMEM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen)、40%MCDB-201(密苏里州圣路易斯的Sigma)、2%胎牛血清(犹他州洛根的Hyclone)、1X胰岛素-转铁蛋白-硒补充物(Invitrogen)、0.02%亚油酸/牛血清白蛋白(Sigma)、10ng/mL表皮生长因子(Sigma)、10ng/mL血小板源性生长因子(明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems)、0.05M地塞米松(Sigma)、0.1mM抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)和100U青霉素/1000U链霉素(Invitrogen)中。将胎盘干细胞(30,000/孔)接种到已被放置入24多孔簇板的ECM薄膜之上。还按同等的密度将胎盘干细胞接种于预涂覆有胶原蛋白(加州弗里蒙特的Inamed)的Labtek腔室载玻片(纽约罗切斯特的Nalgene Nunc International)上。于37℃孵育细胞达3和48小时,并进行处理以进行免疫荧光显微术。
免疫荧光显微术:使用ECM膜孵育3或48小时之后,将胎盘干细胞-ECM构建体用3.7%甲醛固定10分钟,并用0.5%的Triton-X 100透化20分钟。用AlexaFluor 488-共轭的鬼笔环肽孵育胎盘干细胞以使F-肌动蛋白可视化。为了纤连蛋白染色,在封闭缓冲液(3%牛血清白蛋白/1X磷酸盐缓冲盐水)中将样本用兔抗人纤连蛋白抗体(Sigma)孵育1小时,用磷酸盐缓冲盐水洗涤,并在封闭缓冲液中用AlexaFluor 594共轭的抗-兔抗体进一步孵育30分钟。用磷酸盐缓冲盐水再次洗涤样本,装到载玻片上并用荧光显微镜进行观察。
细胞因子分泌分析:在培养0、3、24和48小时时,将培养基样本(100μl)从包含胎盘干细胞的细胞培养ECM薄片,以及从包含胎盘干细胞的组织培养处理板中去除。将样本稀释到1mL的PBS中并进行细胞因子存在分析。从已知浓度的细胞因子的标准曲线图来计算出每种细胞因子的浓度。
结果
ECM的分离:对应于约300g/胎盘的湿重,胎盘的干重通常约为30g。如图1中所示,该渗透压休克步骤和洗涤剂洗涤步骤可以被用来去除相当量的非细胞外基质组织,最终残留重量约为10g。对利用NaOH和洗涤剂的溶解组合的使用导致残留重量进一步降低到约6g。据发现,暴露于NaOH的时间,以及NaOH的浓度影响了总该胎盘分离的ECM的总质量。本发明洗涤剂和NaOH洗涤步骤的变化被用于生成最终ECM材料的5种变体。通常,单个胎盘收获约6g至约10g的ECM材料。
ECM的生化组成。对该ECM的5种变体(命名为ECM-1至ECM-5)的生化分析显示,它们基本上由胶原蛋白组成;I型主要含胶原蛋白(约74%至约90%的总胶原蛋白),以及III型(约4%至约6%的总胶原蛋白)和IV型(约2%至约15%的总胶原蛋白)则为次要组分。在胎盘ECM中发现的其他主要的细胞外基质蛋白是弹性蛋白。如表1中所示,ECM-1至ECM-4的弹性蛋白占总干重的约3-5%。然而,没有使用NaOH而生成的ECM-5包含大约12%的弹性蛋白。虽然对通过所有五种方法制造的ECM中的糖胺聚糖进行了确认,干重的百分比似乎不受分离方法中对NaOH的使用的影响。相反地,重要的粘附蛋白纤连蛋白和层粘连蛋白的存在则对NaOH的使用显着敏感。纤连蛋白和层粘连蛋白没有在NaOH处理中存活,以及在ECM-1乃至ECM-4不能被发现。然而,没有使用NaOH而分离的ECM-5具有比粘附蛋白中丰富得多的组分(表1)。
表1由不同方法制造的胎盘胶原蛋白组合物中存在的细胞外基质组分.
细胞结合研究:接种后三小时,在所有ECM(#1-5)上观察到了胎盘干细胞相似的附着水平。与纯化的胶原蛋白上所观察到的相比,干细胞结合ECM的水平略低。此时纤连蛋白的免疫染色显示了丰富的细胞内染色,而没有可检测到的细胞外纤连蛋白。通过48小时的培养,观察到胎盘干细胞在数量上增加以及在纯化的胶原蛋白、ECM-2和ECM-4上采用类似的良好铺展的形态。与此相反,对ECM-1上培养的胎盘干细胞并未茁壮成长。不仅观察到的细胞少,而且他们的形态变圆以及并没有良好地铺展。ECM-5上的胎盘干细胞看起来比其他ECM或胶原蛋白上的胎盘干细胞更细长且更具极性。
对ECM-3上细胞附着的确定多少因干燥后材料表面的不均匀性受到损害。因为沿一个聚焦平面难以成像(image),开始时似乎很少有细胞附着;然而,在不同聚焦平面中的观察显示ECM-3上有些细胞附着。
在48小时时间点的纤连蛋白的免疫染色显示了ECM-1乃至ECM-4上细胞外纤连蛋白基质原纤维的广泛网络。这些纤连蛋白基质原纤维由胎盘干细胞聚集,因为其中ECM上没有培养胎盘干细胞的对照物并没有显示纤连蛋白原纤维的证据。与ECM-1乃至ECM-4形成对比的是,ECM-5和胶原蛋白没有支撑胎盘干细胞的纤连蛋白基质聚集;在这些表面上没有检测到细胞外原纤维状纤连蛋白。
细胞因子阵列研究:对作为结合和增殖的结果,ECM上胎盘干细胞对关键细胞因子/趋化因子的分泌进行了研究。将ECM上的细胞因子的分泌与于组织培养处理的细胞培养板上孵育的胎盘干细胞对细胞因子的分泌进行了比较。使用了包括若干白细胞介素和细胞因子(Biosource)的标准的25-多路细胞因子阵列。该细胞因子包括IL-1β、IL-IRa、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p40/p70、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-β、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、嗜酸细胞活化趋化因子、Rantes和MCP-1。在所研究的25种细胞因子中,当胎盘干细胞被培养于ECM薄片上时,观察到对3种细胞因子(IL-6、IL-8和MCP-1)的分泌增加,高于被培养于组织培养处理板上的胎盘干细胞的分泌。图2A-2C示出了五种ECM构建体上胎盘干细胞对细胞因子(IL-6、IL-8和MCP-1)分泌的时间依赖性增加。将所有的数据归一化为结合有1000个细胞/cm2。ECM-5是反常的,这是因为MCP-1分泌没有明显的增加,这表明当被培养于细胞外基质上时,胎盘干细胞的细胞生理学发生改变。如前所示,ECM-5不像ECM-1乃至ECM-4,不支持纤连蛋白的表达。有趣的是,要注意的是,ECM-5在没有使用NaOH而生成的唯一基质以及具有保持2种关键细胞粘附蛋白纤连蛋白和层粘连蛋白的生化组成。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请以引用方式被并入本文,如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指示,以引用方式被并入。虽然为了理解清楚的目的,上文已经通过说明和举例的方式以一些细节进行了描述,鉴于本文提供的教导,对本领域的普通技术人员来说非常显而易见的是,可以对其做出某些变化和修改而不脱离所附权利要求的精神或范围。
Claims (37)
1.治疗具有口腔病变的个体的方法,其中所述口腔病变不是由牙科程序引起的,该方法包括向该口腔病变施用治疗有效量的细胞外基质。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述细胞外基质是还没有经过化学修饰或与外源性蛋白酶接触的人胎盘细胞外基质。
3.如权利要求2所述的方法,其中在所述施用之前,所述人胎盘细胞外基质已经通过用洗涤剂但不用碱的处理得以制备。
4.如权利要求2所述的方法,其中在所述施用之前,所述人胎盘细胞外基质已经通过用洗涤剂并且用碱的处理得以制备。
5.如权利要求2所述的方法,其中所述人胎盘细胞外基质包括胶原蛋白以及层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖的一种或多种。
6.如权利要求2所述的方法,其中所述人胎盘细胞外基质中的胶原蛋白包括以干重计,介于74%和92%之间的I型胶原蛋白。
7.如权利要求2所述的方法,其中所述人胎盘细胞外基质中的胶原蛋白包括以干重计,介于4%至6%之间的III型胶原蛋白。
8.如权利要求2所述的方法,其中所述人胎盘细胞外基质中的胶原蛋白包括以干重计,介于2%至15%之间的IV型胶原蛋白。
9.如权利要求2所述的方法,其中所述人胎盘细胞外基质包括以干重计,小于0.01%的层粘连蛋白或0.01%的纤连蛋白。
10.如权利要求2所述的方法,其中所述人胎盘细胞外基质包括以干重计,介于3%和5%之间的弹性蛋白。
11.如权利要求2所述的方法,其中所述人胎盘细胞外基质中的胶原蛋白可通过包括按顺序的下列步骤的方法得以制备:(a)将胎盘组织浸解;(b)将该胎盘组织悬浮于低渗盐溶液中;(c)用洗涤剂处理该胎盘组织;以及(d)用碱处理该胎盘组织。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述碱是氢氧化铵、氢氧化钾或氢氧化钠。
13.如权利要求11所述的方法,其中所述高渗盐溶液包括氯化钠。
14.如权利要求11所述的方法,其中所述洗涤剂是或包括脱氧胆酸盐或脱氧胆酸。
15.如权利要求1所述的方法,其中所述口腔病变由施用化疗剂至所述个体所引起或与其相关联。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述化疗剂是烷化剂。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述烷化剂是美法仑、白消安、顺铂、卡铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、异环磷酰胺或氮芥的一种或多种。
18.如权利要求15所述的方法,其中所述化疗剂是抗代谢物。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述抗代谢物是5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷或氟达拉滨的一种或多种。
20.如权利要求15所述的方法,其中所述化疗剂是具有抗肿瘤效果的抗生素。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述具有抗肿瘤效果的抗生素是博来霉素、更生霉素、柔红霉素、阿霉素或伊达比星的一种或多种。
22.如权利要求15所述的方法,其中所述化疗剂是有丝分裂抑制剂。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述有丝分裂抑制剂是紫杉醇、多西他赛、依托泊苷、长春碱、长春新碱或长春瑞滨的一种或多种。
24.如权利要求15所述的方法,其中所述口腔病变或多个所述口腔病变已经引起或预期会引起包括所述化疗剂的疗程的过早终止。
25.如权利要求1所述的方法,其中所述口腔病变由施用抗体至所述个体所引起或与其相关联。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述抗体是利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、奥瑞珠单抗、阿达木单抗、依那西普、英夫利昔单抗、赛妥珠单抗、那他珠单抗或戈利木单抗的一种或多种。
27.如权利要求1所述的方法,其中所述口腔病变由向所述个体的造血干细胞移植或骨髓移植所引起或与其相关联。
28.如权利要求1所述的方法,其中所述口腔病变由所述个体内的移植物抗宿主病所引起或与其相关联。
29.如权利要求1所述的方法,其中所述口腔病变由已被施用至所述个体的辐射所引起或与其相关联。
30.如权利要求1所述的方法,其中所述口腔病变由脱屑口腔病症所引起。
31.如权利要求1所述的方法,其中所述口腔病变是口疮性溃疡。
32.如权利要求1-31任一项所述的方法,其中所述ECM包括多个干细胞。
33.如权利要求32所述的方法,其中所述干细胞为CD10+、CD34–CD105+、CD100+胎盘干细胞。
34.如权利要求1至33任一项所述的方法,其中所述ECM的所述施用在施用后7天内导致根据世界卫生组织口服毒性(WHO-OT)评分,所述口腔病变的至少一个等级的改进。
35.如权利要求1至33任一项所述的方法,其中所述ECM的所述施用在施用后7天内导致根据针对口腔粘膜炎的国家癌症研究所常见毒性标准(NCI-CTC),所述口腔病变的至少一个等级的改进。
36.如权利要求1至33任一项所述的方法,其中所述ECM的所述施用在施用后7天内导致口腔粘膜炎评估量表(OMAS)的任何分项分数中,所述口腔病变的至少1分的改进。
37.如权利要求1至33任一项所述的方法,其中所述ECM的所述施用在施用后7天内导致根据西方财团癌症护理研究(WCCNR)评分,所述口腔病变的至少一个阶段的改进。
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