KR20180049712A - 탈세포화 세포외 기질을 사용한 습식 3차원 세포 프린팅 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 3D 프린팅 장비를 사용하여 탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM) 기반의 바이오잉크를 습식환경 내에서 토출하여 3차원 구조체를 제작하는 3D 세포 프린팅 방식에 관한 것이다. 본 발명은 탈세포화된 세포외 기질 단독 또는 복수의 천연 또는 합성 물질과 목적하는 세포를 혼합하여 바이오 잉크 제형을 완성하고 수용액 또는 하이드로겔 기반 습식환경의 응고욕(coagulation bath)내로 미세 토출하여, 형상의 제한이 없고, 목적하는 형상을 정확하게 제작할 수 있으며, 구조체의 내부 기공의 형태와 크기를 제어할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 습식 3D 세포 프린팅 방식은 세포 친화적이며 제조된 다공성 구조체는 재생의료 또는 생체 외 모델(in vitro model) 연구를 위한 인공 조직 또는 장기로 활용될 수 있다.

Description

탈세포화 세포외 기질을 사용한 습식 3차원 세포 프린팅 {Wet 3D cell printing using decellularized extracellular matrix}
본 발명은 3D 프린팅 장비를 사용하여 세포와 탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)을 함유하는 바이오 잉크를 습식 응고욕에 토출하여 3차원 성형체를 제작하는, 습식 3D 세포 프린팅 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 세포와 탈세포화된 세포외 기질로 이루어지거나 복수의 천연 또는 합성 물질을 추가로 포함하는 바이오 잉크를, 3차원 프린터를 사용하여, 습식 환경의 응고욕(coagulation bath)에 미세 토출함으로써, 3차원 구조의 내부 기공의 형태와 크기를 자유롭게 조절할 수 있는, 습식 3D 세포 프린팅 방법에 대한 것이다.
3D 세포 프린팅은 컴퓨터 이미지를 바탕으로 살아있는 세포를 포함한 다양한 생체물질들을 정확하게 원하는 위치에 순차적으로 적층하여 실제 조직이나 장기와 유사한 3차원 인공 구조체를 제작하는 기술이다.
3D 세포 프린팅은 최근 조직 재생의학 연구의 핵심이 되는 기술이며, 의료용 인공장기 제작, 생화학 물질 분석과 신약개발, 기초연구를 위한 장기 모델의 제작 등에 이용 가능하므로 무궁한 잠재력을 가진 새로운 기술이다.
또한, 3D 세포 프린팅은 비교적 자유롭게 구조체 내부의 미세구조, 복잡한 형상, 규모 등을 효과적으로 제어할 수 있는 장점을 가지고 있다. 이러한 바이오 프린팅 기술은 잉크젯(inkjet bioprinting), 미세토출(microextrusion bioprinting), 레이저를 이용한 방식(laser-assisted bioprinting) 등으로 구분되며, 미세 토출 방식이 빈번하게 사용되고 있다(Murphy, S. V. 와 Atala, A. 2014, Vol.32, ISSN 1087-0156, 773785쪽).
미세 토출 바이오 프린팅은, 미세 노즐의 x, y, z축 움직임을 기계적으로 제어하면서, 정확한 위치에 점성을 갖는 바이오 잉크를 연속적인 필라멘트 형태로 토출하여, 순차적 적층을 통하여 최종 3차원 구조의 형상을 완성한다.
따라서, 3D 세포 프린팅에서 사용되는 바이오 잉크 재료는 당연히 세포 독성이 없어야 하며, 세포의 성장과 분화에 적합한 환경을 제공해야 하며, 인쇄적합pkrintability)이 좋아야 하며, 프린팅 후에는 실제 생체 조직과 유사한 기계적 강도를 나타내어야 한다.
현재까지 이러한 3D 세포 프린팅에 사용되는 바이오 잉크 재료는 수용성이고, 겔화(gelation) 시킬 수 있는 성질을 가지며, 천연과 합성 재료로 구분된다.
3D 세포 프린팅에 사용되는 바이오 잉크의 천연 재료로는, 알긴산(alginate), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin), 실크 단백질(silk protein), 조직/장기로부터 추출한 탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix; dECM) 등이 있다.
3D 세포 프린팅에 사용되는 잉크에 사용되는 합성 재료로는, polyethylene glycol(PEG), polyacrylamide (PAAm) 등이 있다(Dai, G. 와 Lee, V. 2015, Vol.1, ISSN 2350-269X, 23-35쪽).
세포외 기질(extracellular matrix)은 매우 다양한 종류의 다당류(polysaccharide)와 단백질(protein) 들로 이루어진 복합 물질이며 생체 조직 내에서 필수적인 세포의 주변 환경과 세포의 기능을 제어한다.
따라서 체외에서 제작되는 인공 조직이나 장기의 제작에 있어서는, 세포외 기질을 모사할 수 있는 3D 세포 프린팅에 사용되는 바이오 잉크 재료나 미세 성형 기술의 확보가 반드시 요구된다.
현재까지 공지된 3D 세포 프린팅에 사용되는 바이오 잉크에 첨가되는 천연 또는 합성 재료들 모두 인체의 조직이나 장기를 완전하게 모사하기에는 각기 고유한 한계를 갖고 있다.
이러한 공지의 재료들 중에서, 탈세포화된 세포외 기질은 최근에 들어서 천연의 성분과 구조를 가장 근접하게 모사할 수 있는 3D 세포 프린팅에 사용되는 잉크 재료로서 각광을 받고 있다.
심근, 연골, 지방조직에서 유래한 탈세포화된 세포외 기질을 각각의 해당 조직 세포 (심근세포, 연골세포, 지방세포)와 혼합하여 생분해성 합성 고분자인 polycaprolactone (PCL)과 동시에 프린팅 3D 세포 프린팅이 시도되었다(Pati, F. 외, 2014, Vol.5, ISSN (online) 2041-1723, 3935쪽; Pati, F. 외, 2015, Vol.62, ISSN 0142-9612, 164-175쪽).
그런데, 탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)자체로는 기계적 물성이 약해 형상을 유지하기 어렵기 때문에, 지지대 역할을 하도록 PCL을 사용하며 인체 조직의 3차원 형태를 성형하였다.
이렇게 PCL 구조체를 포함하고 있어도, 탈세포화된 세포외 기질의 생물학적 기능은 뛰어나서, 프린팅된 세포들에 적절한 환경을 제공하며 세포의 기능을 활성화하여 최종 조직으로의 분화를 유도하게 된다.
이러한 탈세포화된 세포외 기질의 기계적 물성을 증가시키기 위해, 자외선을 이용한 광가교(photo-crosslinking)방법이 시도되어, 인체 조직의 강도만큼 기계적 강도를 향상시키기도 하였다.
그러나, 탈세포화된 세포외 기질만으로는 3D 프린팅 방법으로 3차원 구조의 생체 조직을 형성시키는 것에는 여러 가지 문제점이 드러난다(Jang, J. 외, 2016, ISSN 1742-7061, 88-95쪽).
또한 탈세포화된 세포외 기질과 다양한 고분자(PEG, gelatin, hyaluronic acid)를 혼합함으로써 프린팅시 인쇄 적합성을 향상시킬 수는 있었지만, 특정 형상을 갖는 3차원 구조는 성형시키지 못했다(Skardal, A. 외, 2015, ISSN 1742-7061, 24-34쪽).
이렇듯 현재까지는, 탈세포화된 세포외 기질의 약한 기계적 물성으로 인하며, PCL과 같은 물성 강화 보조제의 사용 없이 탈세포화된 세포외 기질만을 세포 프린팅의 잉크 재료로 사용하여 순차적 적층을 통한 충분한 두께를 갖는 3차원 구조의 성형체를 제작하는 것에 실패하고 있다.
이러한 이유 때문에, 탈세포화된 세포외 기질은 뛰어난 생물학적 기능으로 인하여, 어떠한 재료보다도 더 효과적이고 우수한 세포 거주 환경을 제공할 수 있음에도 불구하고, 현재까지 당업계에 알려진 기술로는, 기계적 물성 강화용 보조제사용 없이 탈세포화 세포외 기질만을 사용하여서는 3D 프린팅을 통해 모든 형상의 3차원 구조물을 제한없이 제작하는 것이 불가능하였다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 탈세포화된 세포외 기질로 이루어진 바이오 잉크의 문제점 즉, 3차원 성형체의 기계적 강도가 취약하여 미세한 구조의 인체 조직 장기 모사체를 완전하기 만들기 어렵다는 종래 기술의 문제점을 해결하는 것이다.
이를 위하여 본 발명에서는, 탈세포화된 세포외 기질 기반의 바이오 잉크를 습식 응고욕으로 토출함으로써, 토출 직후부터 신속하게 습식 환경에서 응고가 이루어지면서 바이오 잉크가 인쇄된 층의 기계적 강도가 향상되도록 하여, 3차원으로 적층 형성되는 구조체 내부의 복잡하고 세밀한 형상과 크기를 자유롭게 조절할 수 있는, 새롭고 진보된 3D 프린팅 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다양한 조직이나 장기로부터 유래된 탈세포화된 세포외 기질을 기반으로 하며 살아있는 세포를 포함하는 바이오 잉크 조성물을 사용하여, 습식 응고욕(coagulation bath)에 미세 토출시키는 습식 프린팅 방식을 통하여, 지지 구조물 사용 없이 원하는 3차원 구조의 조직 성형체를 응고 욕조 내에서 직접 형성시키는, 습식 3D 세포 프린팅 방법을 제공한다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법은, 사람이나 동물의 조직 또는 장기로부터 유래된 탈세포화된 세포외 기질을 포함하며, 보다 구체적으로는 지방, 근육, 연골, 심장, 뼈, 피부, 혈관, 폐, 각막, 뇌, 점막 상피 조직, 방광, 간장, 신장, 식도, 정소, 자궁, 태반, 신경, 척수, 췌장, 비장, 창자 등에서 유래된 탈세포화 세포외 기질이 선택 될 수 있으며, 이들을 단독 또는 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법은, 세포와 탈세포화 세포외 기질만을 함유하는 바이오 잉크가 사용될 수도 있으나, 필요에 따라 즉, 인쇄 적합성과 기계적 강도를 향상시키기 위해 천연 또는 합성재료 또는 이들의 화학적 유도체를 바이오 잉크에 추가하여 사용할 수도 있다.
보다 구체적으로, 추가될 수 있는 천연 재료로는 알긴산(alginate), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin), 아가로오스(agarose), 실크단백질(silk protein), 헤파린(heparin), 헤파란황산(heparan sulfate), 케라탄황산(keratan sulfate), 데르마탄황산(dermatan sulfate), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 지방알코올(fatty alcohol), 지방산(fatty acid) 등이 있다.
본 발명의 습식 3D프린팅 방법에 사용되는 바이오 잉크에 추가될 수 있는 합성 재료로는, polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol (PPG), polyacrylamide (PAAm), polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), polyglycolic acid (PGA), polyvinyl alcohol (PVA), polyurethane (PU), polymethylmethacrylate (PMMA), polyhydroxybutyrate (PHB), polydioxanone (PDO), polyanhydride, polyvinylpyrrolidone (PVP), polyacrylic acid (PAA), 글리세롤(glycerol), 플루로닉(pluronic) 등이며, 이들의 화학적 유도체 중 단수 또는 복수 개를 포함하는 것이 추가로 사용될 수도 있다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 사용되는 바이오 잉크는 생체적합적이고 프린팅하기에 적절한 점도를 가지는 것이 바람직하며, 제작하고자 하는 조직 또는 장기 유래의 세포와 혼합을 통해 바이오 잉크로 사용된다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서는, 바이오 잉크 조성물이 수용성 응고욕 또는 하이드로젤 내에서 미세토출을 통하여 원통형 필라멘트 형상으로 응고되고, 침전되어 순차적으로 3차원으로 적층되며, 이렇게 형성된 3차원 형상은 응고욕 내의 부력, 점성, 지지력에 의해 유지되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법은 형성된 3차원 구조체를 생리적 온도에서 배양하여 추가적으로 바이오 잉크를 겔화(gelation)시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 사용되는 응고욕은 염(salt)을 포함하는 등장성(isotonic) 수용액을 기반으로 하며, 토출된 바이오 잉크의 강도와 형상 유지를 향상시킬 수 있도록 응고욕 조성물에 첨가제가 추가될 수도 있다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 사용되는 응고욕 조성물에는, 구체적으로는, 알긴산(alginate), 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin), 아가로오스(agarose), 실크단백질(silk protein), 헤파린(heparin), 헤파란황산(heparan sulfate), 케라탄황산(keratan sulfate), 데르마탄황산(dermatan sulfate), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 지방알코올(fatty alcohol), 지방산(fatty acid), 글리세롤(glycerol), 플루로닉(pluronic), polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol (PPG) 등을 포함할 수 있으며, 이들 중 한 가지 이상을 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 사용되는 응고욕 조성물에는, 돌출 구조나 대형 부피를 지탱하기 위해서, 상기 첨가제 또는 그것의 화학적 유도체들 간의 고분자 네트워크인 하이드로 겔이 첨가될 수도 있다.
이상과 같은 본 발명의 습식 3D 프린팅 방법은, 세포와 탈세포화된 세포외 기질만을 바이오 잉크로 사용하여서도, 필요로 하는 다공성의 3차원의 세밀한 형상을 가지는 인공 조직 또는 장기의 제작을 가능케 하는, 신규하고 진보적인 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법으로서, 탈세포화 세포외 기질을 사용한 습식 3차원 세포 프린팅 방법의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 탈세포화 기질을 사용한 기존의 대기 중 토출 방식(좌측)과 습식 토출 방식(우측)의 비교 사진이다. 습식 방식은 바이오 잉크를 안정적인 원통형 필라멘트 형태로 토출시키는 것을 가능하게 한다.
도 3은 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 습식 3D 프린팅 방식을 사용하여 노즐의 크기에 따라 프린팅된 필라멘트의 굵기 제어가 가능함을 보여준다.
도 4는 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 습식 3D 프린팅 방식을 사용하여 공압과 x-y축 이송 속도에 따른 토출된 필라멘트의 굵기 변화를 보여주는 3차원 그래프이다.
도 5는 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 습식 3D 프린팅 방식을 사용하여 x-y축의 이송 속도를 조절하여 격자 구조로 프린팅된 내부 구조의 공극이나 형태를 제어할 수 있음을 보여준다.
도 6은 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 습식 3D 프린팅 방식을 사용하여 적층 횟수에 따른 프린팅된 구조체의 두께 조절이 가능함을 보여준다.
도 7은 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법을 사용하여 다양한 형태의 구조체를 제작한 사진이다.
도 8은 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법으로 제작된 구조체내 세포의 생존율의 시간 변화에 따른 변동을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 특별히 달리 정의하지 아니하는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 탈세포화 세포외 기질을 이용한 습식 3D 세포 프린팅 방식에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 하나의 실시예에 따라, 탈세포화 세포외 기질 기반의 바이오 잉크를 사용하여 습식 3D 세포 프린팅에 의해 다공성 구조의 3차원 형상을 갖는 인공 조직 또는 장기를 제작할 수 있으며, 재생 의료나 체외 조직 또는 장기 제작 방법으로 활용될 수 있다.
본 발명의 습식 3D 세포 프린팅 방법의 구성을 도 1에 도시하고 있다. 도시된 프린팅 방식에서 탈세포화 기질을 기반으로 하는 바이오 잉크를 3D 프린팅 시스템을 사용하여 수용액 또는 하이드로겔 기반 응고욕(coagulation bath)으로 토출시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에 사용되는 바이오 잉크는, 사람이나 동물의 조직이나 장기로 부터 유래된 탈세포화된 세포외 기질을 포함하며, 지방, 근육, 연골, 심장, 뼈, 피부, 혈관, 폐, 각막, 뇌, 점막 상피 조직, 방광, 간장, 신장, 식도, 정소, 자궁, 태반, 신경, 척수, 췌장, 비장, 창자 등에서 유래된 탈세포화 세포외 기질이 선택 될 수 있으며 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 조직이나 장기는 상기에 예시된 것으로만 특별히 한정하는 것은 아니며 바람직하게는 인간과 가장 유사한 돼지로부터 유래된 탈세포화 기질도 포함된다.
본 발명의 하나의 실시 형태에서, 동결 건조된 탈세포화 기질은 바이오 잉크로 사용하기 위해 가용화(solubilization)시켜야 하며, 이 때 단백질 분해 효소를 포함하는 산성용액을 사용한다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서 사용될 수 있는 단백질 분해 효소는, 금속 단백분해효소(matrix metalloproteinase) 또는 펩신 중에 하나를 선택할 수 있으며, 아세트산이나 염산에 탈세포화 기질 대비 5중량% 내지 30중량%의 비율로 녹여 사용한다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법의 바이오 잉크에서의 상기 최종 탈세포화 기질 농도는, 1중량% 내지 5중량%로 가용화 시킬 수 있으며, 바람직하게는 2중량% 내지 3중량% 이다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서는, 성형을 목표로 하는 조직 또는 장기의 기계적, 생리적 특성에 대한 맞춤 제작을 위해 가용화된 세포외 기질에 수용성 천연고분자 또는 합성고분자를 혼합하여 바이오잉크로 사용할 수 있으며, 혼합 비율은 세포외 기질 대비 50중량% 이내로 사용할 수 있으며, 30중량% 이내로
사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서 인쇄 적합성(printability)을 향상시키기 위해 가용화된 탈세포화 기질에 수용성 단분자 또는 고분자 증점제(thickening agent)를 첨가할 수 있다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서 사용될 수 있는 고분자 증점제는, 구체적으로는 당알코올(sugar alcohol), 아르긴산계 고분자, 식물계 고분자, 미생물계 고분자, 동물계 고분자, 글리코사미노글리칸, 전분계 고분자, 비닐계 고분자, 폴리옥시에틸렌계 고분자, 아크릴계 고분자 및 무기계 수용성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종, 또는 2종이상의 조합을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 당알코올 또는 콜라겐을 10중량% 이내에서 첨가될 수 있다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서, 프린팅 된 3차원 구조의 성형체의 기계적 강도를 향상시키기 위해서, 가용화된 탈세포화 기질에 수용성 천연 또는 합성 물질, 또는 이들의 화학적 유도체를 혼합할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서는, 알긴산, 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 아가로오스, 실크단백질, 글리코사미노글리칸, 비닐계 고분자, 카르복시비닐계, 폴리옥시에틸렌계 고분자, 아크릴계 고분자, 셀룰로스, 펙틴 및 이들의 화학적 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종, 또는 2종이상의 조합을 사용할 수 있으나, 이들만으로 한정되는 것은 아니며, 50중량% 이내에서 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 30중량% 이내로 첨가된다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에서는, 상기 제조된 세포외 기질 용액 또는 혼합 용액을 1M 내지 10M NaOH를 첨가하여 pH 7 내지 pH 7.5로 중성화시킨 후 중성화된 용액에 목표하는 조직이나 장기에서 유래된 세포를 첨가하여 균일하게 혼합한다.
본 발명의 습식 3D 세포 프린팅 방법에서 사용될 수 있는, 세포와 혼합된 바이오 잉크의 점도는, 18℃ 전단율(shear rate) 1 s-1 에서 1 Pa·s 내지 100 Pa·s의 범위인 것을 사용할 수 있으며, 5 Pa·s 내지 50 Pa·s 인 것이 바람직하다.
본 발명의 습식 3D 세포 프린팅 방법에서 사용될 수 있는 바이오 잉크 조성물은 상기 첨가성분들 이외에도 소포제(antifoaming agent) 및 기타 첨가제 등을 세포 독성을 보이지 않는 범위에서 추가로 혼합 함유할 수 있다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서 사용될 수 있는 바이오 잉크 조성물은 그 제형이 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 탈세포화 기질을 기반으로 하는 생체적합적, 세포적합적, 생분해성 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 습식 3D 세포 프린팅은, 상기 제조된 바이오 잉크를 공압 또는 시린지 방식으로 토출 하였을 때, 도2 사진에서 확인할 수 있듯이 기존 대기 중 프린팅 방식에 비해 안정적인 원통형의 필라멘트를 형성시키며 굳어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 습식 3D 세포 프린팅에서 응고욕(coagulation bath)내로 토출된 바이오 잉크의 응고와 침전을 위해 응고욕에 염(salt)를 포함시키며 염의 농도는 10mM 내지 10M로 사용될 수 있고, 바람직하게는 10mM 내지 1M 이며, 좀더 바람직하게는, 인체 세포의 삼투질 농도와 같은 등장성(isotonic) 농도이다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서의 응고욕의 pH는 세포의 생존을 저해시키지 않는 범위에서 유지할 수 있으며 바람직하게는 pH 6.5 내지 pH 7.5이다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법의 응고욕에 포함되는 염의 종류는 무기염, 유기염 및/또는 유기-무기염으로부터 선택될 수 있다. 구체적인 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화마그네슘, 탄산수소나트륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 젖산칼슘 및 구연산칼슘 등으로부터 선택된 1종 또는 2종이상의 조합으로 사용될 수 있다.
이상에서 언급한 염들은 본 발명의 특정 실시예에 불과하며, 다양한 염 형태의 수용성 이온결합 화합물이 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서 사용될 수 있는조성물에 더 첨가될 수도 있다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 응고욕으로서, 세포 배양용 배지를 사용할 수 있다. 예를 들면, 상용화된 배양 배지인 DMEM, MEM, MEM alpha, RPMI-1640, 이글스 기본 배지 (eagle's basal medium), CMRL 배지, 글래스고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), 및 Ham's F-12 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지가 본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서의 사용될 수 있는 상기의 세포 배양용 배지에는 이들의 혼합물이 사용될 수도 있다. 상기 배지는 특별히 한정하는 것은 아니며, 바람직하게는 세포 적합적 조성을 가지고 등장성(isotonic)이며, pH 7~7.5인 배지는 모두 사용될 수 있다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서는 응고욕의 점성을 향상시키기 위해 증점제(thickening agent)를 첨가할 수 있다. 구체적으로는 당알코올(sugar alcohol), 아르긴산계 고분자, 식물계 고분자, 미생물계 고분자, 동물계 고분자, ECM 단백질(젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 피브리노겐, 피브린 및 프로테오글리칸), 글리코사미노글리칸, 전분계 고분자, 비닐계 고분자, 카르복시비닐계, 폴리옥시에틸렌계 고분자, 아크릴계 고분자 및 무기계 수용성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종이상의 조합이 상기 증점제로서 사용될 수 있고, 바람직하게는 아르긴산계 고분자나 글리코사미노글리칸이 첨가된다.
본 발명의 3D 세포 프린팅 방법에서, 프린팅 된 탈세포화 기질 구조의 안정성을 높이기 위해 하이드로겔이 응고욕으로 사용될 수 있다.
상기 하이드로겔 응고욕 조성물로는 알긴산, 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 피브린, 아가로오스, 실크단백질, 글리코사미노글리칸, 비닐계 고분자, 카르복시비닐계, 폴리옥시에틸렌계 고분자, 아크릴계 고분자, 셀룰로스, 펙틴 및 이들의 화학적 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 조합을 사용할 수 있으나, 이들만으로 제한되는 것이 아니며, 0.1중량% 내지 10중량%로 함유될 수 있으며 0.5중량% 내지 3중량% 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예의 범위로만 한정되는 것은 아니다.
실시예1: 탈세포화 세포외 기질의 조제
돼지의 대퇴부 뒤쪽 햄스트링(hamstring)으로부터 근육 조직을 분리하여 즉시 80 ℃에서 동결하였다. 동결된 조직을 근섬유의 직각방향으로 2~3 mm 두께의 박편으로 잘라내고 해동시킨 후 혈관과 지방 등 주변 조직을 제거하였다.
준비된 지방조직 절편을 인산 완충 식염수와 탈이온증류수로 12시간 이상 세정하고 잔류 지방을 제거하기 위해 이소프로판올에 2시간 처리하였다. 처리된 근육 조직을 100%, 70%, 50%, 30% 에탄올과 증류수에 순차적으로 담가 재수화(rehydration)시킨 후 0.5% SDS와 25 mM EDTA가 포함된 인산 완충 식염수로 2일 동안 처리하였다.
이렇게 탈세포화된 조직을 인산 완충 식염수와 탈이온증류수로 12 시간 세정하고 동결 건조하였다. 동결 건조된 조직은 제분기(milling machine)로 제분 후 사용 시까지 4℃로 보존하였다.
실시예2: 바이오 잉크의 조제
제분된 탈세포화 세포외 기질 분말을 2 mg/ml 펩신이 포함된 0.5 M 아세트산 수용액에 2~3중량% 농도로 5일 동안 충분히 녹여 액상으로 조제하였다. 가용화된 탈세포화 세포외 기질 용액에 3중량% 콜라겐, 1중량% 글리세롤, 0.1부피% 소포제(antifoam 204)를 첨가한 후 10N 수산화나트륨을 사용하여 pH 7 내지 pH 7.3으로 중화하였다.
중화된 탈세포화 기질 기반 복합 용액에 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells) 또는 C2C12 골격근 근육모세포(skeletal myoblasts)를 106 cells/ml의 농도로 균일하게 혼합하여 바이오 잉크를 완성하였다.
실시예3 : 수용액 또는 하이드로겔 기반 응고욕의 조제
수용액 기반 응고욕은 2.7 mM 염화칼륨, 1.5 mM 인산칼륨, 138 mM 염화나트륨, 8 mM 인산나트륨 및 5 mg/ml TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2- aminoethane sulfonic acid sodium salt) 등을 탈이온증류수에 녹인 수용액에 10중량% 폴리에틸렌글리콜(Mw 35,000), 0.5중량% 황산콘드로이틴 및 1중량% 알긴산 을 첨가한 후 1N 수산화나트륨과 1N 염산을 사용하여 pH 7.3로 조정하여 제조하였다. 이렇게 제조된 응고욕 수용액은 0.22 μm 진공 필터(bottle-top vacuum filters)를 사용하여 여과멸균 후 사용하였다. 하이드로겔 기반 응고욕은 138 mM 염화나트륨을 탈이온증류수에 녹인 수용액에 5중량% 내지 10중량% 폴리비닐알코올(Mw 31,000-50,000, 87-89% hydrolyzed)과 0.5중량% 황산콘드로이틴을 균일하게 혼합하고 0.5 mM borax(sodium tetraborate decahydrate)를 서서히 적하시켜 교반 후 원심분리하여 완성하였다.
실시예4: 습식 3D 프린팅
실시예2에서 조제된 바이오잉크를 3D 프린터를 이용하여 분사 노즐을 X-Y-Z축으로 자유롭게 구동시키며 실시예3에서 조제된 수용액 또는 하이드로겔 기반 응고욕으로 토출하여 반복적인 적층(layer by layer)을 통해 다공성의 일체화된 3차원 형상을 제작하였다.
도 3에 도시된 바와 같이 응고욕내로 토출된 필라멘트는 즉시 응고되어 안정적인 형태를 유지하며 사용된 노즐 직경에 따라 응고된 필라멘트의 직경이 제어 가능함을 확인하였다.
도 4에 도시된 바와 같이 프린팅 시 바이오잉크를 담는 용기에 가해지는 공압(pneumatic pressure)에 따라 분사 노즐로 토출되는 바이오잉크의 토출양과 속도를 조절할 수 있으며 노즐의 X-Y축 이송 속도에 따라 필라멘트의 직경이 제어될 수 있음을 확인하였다.
프린팅 된 3차원 형상 내부의 기공의 구조와 크기는 분사 노즐의 X-Y축 이송 속도에 따라 제어 가능하며 다양한 공극률을 갖는 구조물을 제작 가능하였다. (도 5) 도 6에 확인할 수 있듯이 토출된 필라멘트는 안정적으로 적층되며 적층된 층의 수와 비례하여 3차원 구조물의 높이도 증가하였다.
상기 프린팅 변수들을 정밀하게 제어하면 형상의 제한이 없이 목적하는 다양한 3차원 형상을 제작할 수 있으며 이는 도 7에서 확인할 수 있다.
실시예5: 세포 적합성 평가
바이오잉크에 함입되어 프린팅된 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)의 생존율(viability)을 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Molecular probes, L3224)으로 확인하였다.
상기 키트는 calcein AM과 ethidium homodimer (EthD-1)로 구성되며, calcein AM은 세포질에서 녹색 형광을 띠며 살아 있는 세포를 확인하는데 사용되고, EthD-1은 핵산과 결합하여 밝은 붉은색 형광을 띠며 죽은 세포를 확인하기 위하여 사용된다.
프린팅 구조물을 인산완충용액으로 세정하고 2μM Calcein AM 과 4μM EthD-1을 적용한 후 빛이 차단된 상태에서 45분간 37 ℃에서 배양하였다. 염색된 구조체는 도립형광현미경 (inverted fluorescence microscope)에 장착된 카메라로 이미지를 캡처하고 녹색과 붉은색의 세포수를 각각 측정하여 도 8에 도시된 생존율을 계산하였다.
프린팅 직후의 세포 생존율은 98%에 달하며 3일 동안 90% 이상의 높은 생존율을 유지하였고 이는 본 발명의 탈세포화 기질을 사용한 습식 3D 프린팅 방식이 세포 프린팅에 최적화되어있음을 의미한다.
이상, 본 발명을 상기의 실시 예들을 참고로 설명하였으나 이상의 실시예들은 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시가 가능하다는 점을 이해할 것이다.

Claims (17)

  1. 탈세포화 세포외 기질과 세포의 혼합물을 바이오 잉크로 사용하여 3D 프린팅 장비를 통하여 생체 조직이나 장기를 모사한 3차원 성형체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 바이오 잉크를 수용액 또는 하이드로 젤을 함유하는 응고욕으로 토출 시키면서 순차적으로 적층 (layer-by-layer)시켜서 3차원 다공성 구조의 성형체를 제작하는 것을 특징으로 하는, 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  2. 제1항의 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 상기 탈세포화 세포외 기질이, 사람이나 동물의 조직 또는 장기로 부터 추출된 것임을 특징으로 하는, 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  3. 제1항의 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 상기 탈세포화 세포외 기질이 지방, 근육, 연골, 심장, 뼈, 피부, 혈관, 폐, 각막, 뇌, 점막 상피 조직, 방광, 간장, 신장, 식도, 정소, 자궁, 태반, 신경, 척수, 췌장, 비장, 창자 등에서 유래된 탈세포화 세포외 기질 중에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것임을 특징으로 하는, 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  4. 제1항의 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 상기 바이오 잉크가 첨가제 사용없이 세포와 탈세포화 세포외 기질만으로 이루어지는 것임을 특징으로 하는, 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  5. 제1항의 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 상기 바이오 잉크가 수용성 증점제를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  6. 제5항의 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 상기 수용성 증점제가 당알코올(sugar alcohol), 아르긴산계 고분자, 식물계 고분자, 미생물계 고분자, 동물계 고분자, 글리코사미노글리칸, 전분계 고분자, 비닐계 고분자, 폴리옥시에틸렌계 고분자, 아크릴계 고분자 및 무기계 수용성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 조합에서 선택되는 것이며, 탈세포화 세포외 기질에 대하여 0.1 ~ 10중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  7. 제1항의 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 상기 바이오 잉크가, 알긴산, 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 아가로오스, 실크단백질, 글리코사미노글리칸, 비닐계 고분자, 카르복시비닐계, 폴리옥시에틸렌계 고분자, 아크릴계 고분자, 셀룰로스, 펙틴 및 이들의 화학적 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 조합을, 탈세포화 세포외 기질에 대하여 1중량% ~ 50중량% 첨가하여 구성되는 것을 특징으로 하는, 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  8. 제1항의 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 상기 바이오 잉크에 탈세포화 세포외 기질이 1∼5 중량%의 농도로 포함되는 것임을 특징으로 하는, 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  9. 제1항의 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 상기 바이오 잉크가 응고욕으로 토출되어 원통형 단면의 필라멘트로 응고되면서 순차적 적층 (layer-by-layer)이 이루어지는 것을 특징으로 하는, 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  10. 제1항의 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서, 상기 바이오 잉크가 응고욕으로 토출되어 원통형 단면의 필라멘트로 응고되고 응고욕 내에서 겔화(gelation)되는 것을 특징으로 하는 습식 3D 세포 프린팅 방법.
  11. 탈세포화 세포외 기질과 세포의 혼합물을 바이오 잉크로 사용하여 3D 프린팅 장비를 통하여 생체 조직이나 장기를 모사한 3차원 성형체를 제조하기 위하여, 상기 바이오 잉크를 수용액 또는 하이드로 젤을 함유하는 응고욕으로 토출 시키면서 순차적으로 적층 (layer-by-layer)시켜서 3차원 다공성 구조의 성형체를 제작하는 습식 3D 세포 프린팅 방법에 있어서,
    상기 탈세포화 세포외 기질이, 사람이나 동물의 조직 또는 장기로 부터 추출된 것임을 특징으로 하는, 바이오 잉크 조성물.
  12. 제11항의 바이오 잉크 조성물에 있어서, 상기 탈세포화 세포외 기질이 지방, 근육, 연골, 심장, 뼈, 피부, 혈관, 폐, 각막, 뇌, 점막 상피 조직, 방광, 간장, 신장, 식도, 정소, 자궁, 태반, 신경, 척수, 췌장, 비장, 창자 등에서 유래된 탈세포화 세포외 기질 중에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것임을 특징으로 하는, 바이오 잉크 조성물.
  13. 제11항의 바이오 잉크 조성물이 첨가제 사용없이 세포와 탈세포화 세포외 기질만으로 이루어지는 것임을 특징으로 하는, 바이오 잉크 조성물.
  14. 제11항의 바이오 잉크 조성물이 수용성 증점제를 추가로 더 포함하는 것임을 특징으로 하는, 바이오 잉크 조성물.
  15. 제15항의 바이오 잉크 조성물에 있어서, 상기 수용성 증점제가 당알코올(sugar alcohol), 아르긴산계 고분자, 식물계 고분자, 미생물계 고분자, 동물계 고분자, 글리코사미노글리칸, 전분계 고분자, 비닐계 고분자, 폴리옥시에틸렌계 고분자, 아크릴계 고분자 및 무기계 수용성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 조합에서 선택되는 것이며, 탈세포화 세포외 기질에 대하여 0.1 ~ 10중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크 조성물.
  16. 제11항의 바이오 잉크 조성물에 있어서, 상기 바이오 잉크가 알긴산, 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 아가로오스, 실크단백질, 글리코사미노글리칸, 비닐계 고분자, 카르복시비닐계, 폴리옥시에틸렌계 고분자, 아크릴계 고분자, 셀룰로스, 펙틴 및 이들의 화학적 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 조합을, 탈세포화 세포외 기질에 대하여 1중량% ~ 50중량% 추가하여 포함하는 것임을 특징으로 하는, 바이오 잉크 조성물.
  17. 탈세포화 세포외 기질과 세포의 혼합물을 바이오 잉크로 사용하여 3D 프린팅 장비를 통하여 수용액 또는 하이드로 겔을 함유하는 응고욕 조성물로 토출시키면서 순차적으로 적층시켜 3차원 다공성 구조의 성형체를 제작하는 습식 3D 세포 프린팅 방식으로 제조되는 다공성 3차원 구조체.
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