KR102220365B1 - 바이오잉크 기반 3d 프린팅을 이용한 복합조직 제조 방법 - Google Patents

바이오잉크 기반 3d 프린팅을 이용한 복합조직 제조 방법 Download PDF

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울산과학기술원
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Abstract

본 발명은 바이오잉크 기반 3D 프린팅을 이용한 복합조직 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 복합조직 제조 방법은 (a) 복합조직을 위한 제1 영역에 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐 및 제1 줄기세포를 포함하는 제1 바이오잉크를 토출시키는 단계; 및 (b) 상기 복합조직을 위한 제2 영역에 미리 결정된 농도의 피브리노겐 및 제2 줄기세포를 포함하는 제2 바이오잉크를 토출시키는 단계;를 포함할 수 있다.

Description

바이오잉크 기반 3D 프린팅을 이용한 복합조직 제조 방법{A manufacturing method for composite tissue using bio-ink based 3D printing}
본 발명은 복합조직 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바이오잉크 기반 3D 프린팅을 이용한 복합조직 제조 방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 수많은 사람들이 치아 손실(tooth loss)로 고통 받고 있다. 이러한 치아 손실의 치료를 위하여 비생체학적(non-biological), 인공 치아(artificial tooth)인 치아 임플란트(dental implant)가 가장 일반적으로 사용되고 있다.
이 접근 방법은 치아 기능의 빠른 회복이 가능하며, 미관의 우수성과 사용이 편리하다는 장점을 가지고 있다. 그러나 치아 임플란트와 실체 치아 사이의 물리적/생리적 특성의 차이는 치조골 붕괴(alveolar bone loss)를 동반한 임플란트 주위염(peri-implantitis)을 빈번히 발생시키고 있다. 치아 임플란트 이식 후 2달 이내에 약 64%의 피이식자가 치조골 붕괴를 겪었다.
이러한 문제점을 해결하고자, 최근 조직공학기술을 이용하여 실제 치아와 유사한 생리적/물리적 특성을 가진 바이오공학 기반 치아 재생이 새로운 대안으로 고려되고 있다.
많은 연구자들이 치아 유래 세포를 하이드로젤 혹은 다공성 스캐폴드(scaffold)에 배양하여 치아 조직을 재생하려는 다수의 시도도 소개되었다. 하지만 기존의 접근 방법으로는 환자 맞춤형 외형과 복합 조직으로 구성된 치아를 동시에 구현하는 데에는 여러가지 한계가 있었다. 스캐폴드를 기반으로 하는 접근 방법은 정밀한 외형의 구현은 가능하지만, 다종의 세포를 스캐폴드 내부에 정밀하게 위치시킬 수 없어 복합 치아 조직의 재생에는 적합하지 못하다.
따라서, 기존의 접근 방법으로 펄프(pulp), 덴틴(dentin) 및 법랑질(enamel) 등 여러 개의 조직으로 구성되어 있는 치아 복합 조직을 재생하기에는 적절하지 못하는 문제점이 있다.
[비특허문헌 1] Smith, E.E., et al., Developing a biomimetic tooth bud model. J Tissue Eng Regen Med, 2017. 11(12): p. 3326-3336
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로, 바이오잉크 기반 3D 프린팅을 이용한 복합조직 제조 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 줄기세포의 분화를 피브리노겐의 농도에 따라 조절가능한 바이오잉크를 영역별도 프린팅함으로써, 지역적으로 다른 분화 양상을 가진 복합조직을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 목적들을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 복합조직 제조 방법은 (a) 복합조직을 위한 제1 영역에 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐 및 제1 줄기세포를 포함하는 제1 바이오잉크를 토출시키는 단계; 및 (b) 상기 복합조직을 위한 제2 영역에 미리 결정된 농도의 피브리노겐 및 제2 줄기세포를 포함하는 제2 바이오잉크를 토출시키는 단계;를 포함할 수 있다.
실시예에서, 상기 미리 결정된 농도의 피브리노겐은, 1mg/ml 이상 내지 5mg/ml 이하 농도의 피브리노겐을 포함할 수 있다.
실시예에서, 상기 복합조직 제조 방법은 상기 (a) 단계 이전에, 상기 복합조직을 위한 제3 영역에 PCL(polycaprolactone) 및 생분해성 합성 폴리머 중 적어도 하나를 토출시키는 단계;를 더 포함하고, 상기 제3 영역은, 상기 제1 영역 및 제2 영역의 외부에 위치할 수 있다.
실시예에서, 상기 제1 줄기세포는, 상기 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐에 따라 분화가 활성화되고, 상기 제2 줄기세포는, 상기 미리 결정된 농도의 피브리노겐에 따라 분화가 비활성화될 수 있다.
실시예에서, 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 내부에 위치할 수 있다.
실시예에서, 상기 제1 바이오잉크 및 제2 바이오잉크는, 젤라틴, 히알루론산 및 글리세린 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
실시예에서, 상기 복합조직 제조 방법은 상기 (a) 단계 이전에, 상기 제1 줄기세포 및 상기 제2 줄기세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 제1 줄기세포를 상기 제1 바이오잉크와 혼합하고, 상기 배양된 제2 줄기세포를 상기 제2 바이오잉크와 혼합하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
실시예에서, 상기 제1 바이오잉크와 제2 바이오잉크는, 시린지(syringe) 펌프를 통해 토출될 수 있다.
실시예에서, 상기 PCL은, 공압(pneumatic pressure) 펌프를 통해 토출될 수 있다.
실시예에서, 상기 복합조직 제조 방법은 상기 (b) 단계 이후에, 상기 토출된 제1 바이오잉크와 제2 바이오잉크를 분화 배지에서 배양하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기한 목적들을 달성하기 위한 구체적인 사항들은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술될 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.
그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구성될 수 있으며, 본 발명의 개시가 완전하도록 하고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하, "통상의 기술자")에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해서 제공되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 줄기세포의 분화를 피브리노겐의 농도에 따라 조절가능한 바이오잉크를 영역별도 프린팅함으로써, 지역적으로 다른 분화 양상을 가진 복합조직을 제조하여, 환자 맞춤형 외형을 구성하면서도 다종의 세포를 복합조직 내부에 정밀하게 위치시킬 수 있다.
본 발명의 효과들은 상술된 효과들로 제한되지 않으며, 본 발명의 기술적 특징들에 의하여 기대되는 잠정적인 효과들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합조직 제조 방법을 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체 제조 과정을 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합조직 제조를 위한 바이오 프린팅 장치를 도시한 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크의 SEM 이미지를 도시한 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크의 압축탄성률 그래프를 도시한 도면이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 분해속도 그래프를 도시한 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 생존율 그래프를 도시한 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 증식률 그래프를 도시한 도면이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 형광 이미지를 도시한 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 흡광도 그래프를 도시한 도면이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 치성 분화 그래프를 도시한 도면이다.
도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 다른 치성 분화 그래프를 도시한 도면이다.
도 7d는 본 발명의 일 실시예에 따른 광학 세포 이미지를 도시한 도면이다.
도 7e는 본 발명의 일 실시예에 따른 다른 광학 세포 이미지를 도시한 도면이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크의 점도 그래프를 도시한 도면이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 피브리노겐의 농도에 대한 프린팅 선 폭 그래프를 도시한 도면이다.
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따른 토출 속도에 대한 프린팅 선 폭 그래프를 도시한 도면이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크 프린팅의 예를 도시한 도면이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 생존율 그래프를 도시한 도면이다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 증식률 그래프를 도시한 도면이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 분화의 예를 도시한 도면이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 분화의 다른 예를 도시한 도면이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체를 도시한 도면이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체의 수평 단면을 도시한 도면이다.
도 11c는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체의 수직 단면을 도시한 도면이다.
도 11d는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체의 다른 수직 단면을 도시한 도면이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고, 여러 가지 실시예들을 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 이를 상세히 설명하고자 한다.
청구범위에 개시된 발명의 다양한 특징들은 도면 및 상세한 설명을 고려하여 더 잘 이해될 수 있을 것이다. 명세서에 개시된 장치, 방법, 제법 및 다양한 실시예들은 예시를 위해서 제공되는 것이다. 개시된 구조 및 기능상의 특징들은 통상의 기술자로 하여금 다양한 실시예들을 구체적으로 실시할 수 있도록 하기 위한 것이고, 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 개시된 용어 및 문장들은 개시된 발명의 다양한 특징들을 이해하기 쉽게 설명하기 위한 것이고, 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우, 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 바이오잉크 기반 3D 프린팅을 이용한 복합조직 제조 방법을 설명한다. 본 발명의 다양한 실시예에 따른 복합조직은, 예를 들어, 치아, 연골, 뼈, 유방 등 다양한 조직을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합조직 제조 방법을 도시한 도면이다.
도 1을 참고하면, S101 단계는 복합조직을 위한 제1 영역에 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐 및 제1 줄기세포를 포함하는 제1 바이오잉크를 토출시키는 단계이다. 예를 들어, 복합조직이 치아 복합조직인 덴틴-펄프 복합체(dentin-pulp complex)인 경우, 제1 영역은 덴틴 영역을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 제1 바이오잉크는, 젤라틴, 히알루론산 및 글리세린 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
S103 단계는 복합조직을 위한 제2 영역에 미리 결정된 농도의 피브리노겐 및 제2 줄기세포를 포함하는 제2 바이오잉크를 토출시키는 단계이다. 일 실시예에서, 미리 결정된 농도의 피브리노겐은, 1mg/ml 이상 내지 5mg/ml 이하 농도의 피브리노겐을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 제2 바이오잉크는, 젤라틴, 히알루론산 및 글리세린 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 각 바이오잉크에 포함된 피브리노겐의 농도에 따라, 제1 줄기세포는 분화가 활성화되고, 제2 줄기세포는 분화가 비활성화될 수 있다. 예를 들어, 제1 줄기세포는, 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐에 따라 분화가 활성화되고, 제2 줄기세포는, 미리 결정된 농도의 피브리노겐에 따라 분화가 비활성화될 수 있다.
예를 들어, 복합조직이 치아 복합조직인 덴틴-펄프 복합체인 경우, 제2 영역은 펄프 영역을 포함할 수 있다. 이 경우, 제1 줄기세포와 제2 줄기세포는 DPSC(dental pulp stem cell)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, S101 단계 이전에, 제1 줄기세포 및 제2 줄기세포를 배양할 수 있다. 이후, 배양된 제1 줄기세포를 제1 바이오잉크와 혼합하고, 배양된 제2 줄기세포를 제2 바이오잉크와 혼합할 수 있다.
일 실시예에서, S101 단계 이전에, 복합조직을 위한 제3 영역에 PCL(polycaprolactone) 및 생분해성 합성 폴리머 중 적어도 하나를 토출시킬 수 있다. 일 실시예에서, 제3 영역은, 프린팅 시 복합조직의 외형 구조를 유지시키기 위한 영역으로서, 상기 제1 영역 및 제2 영역의 외부에 위치할 수 있다. 일 실시예에서, 제2 영역은 제1 영역의 내부에 위치할 수 있다.
일 실시예에서, S103 단계 이후에, 토출된 제1 바이오잉크와 제2 바이오잉크를 분화 배지에서 배양할 수 있다.
일부 실시 예들에서, S101 단계와 S103 단계는 역순으로 수행될 수도 있고, 동시에 수행될 수도 있다. 다시 말해, 도 1은 S101 단계가 수행된 후, S103 단계가 수행되는 경우를 예시하고 있지만, 이는 설명을 위한 예시일 뿐, S101 단계와 S103 단계는 순서에 관계 없이 또는 동시에 수행될 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 복합조직 중 치아 복합조직인 덴틴-펄프 복합체의 제조 과정에 대하여 설명한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체 제조 과정(200)을 도시한 도면이다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체(236)를 도시한 도면이다.
도 2 및 3을 참고하면, 덴틴-펄프 복합체 제조 과정(200)은 PCL 프린팅 과정(212), 덴틴 영역 프린팅 과정(214), 펄프 영역 프린팅 과정(216) 및 적층 프린팅 과정(218)을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 덴틴-펄프 복합체 제조 과정(200)을 수행하기 이전에, 제1 바이오잉크(224)와 제2 바이오잉크(226)를 제조하는 과정이 수행될 수 있다.
예를 들어, 히알루론산을 용해 배지에 첨가한 후 균일하게 교반하여 용해시켜 히알루론산 용액을 제조할 수 있다. 그리고, 글리세롤, 젤라틴 및 피브리노겐을 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도와 1mg/ml 이상 내지 5mg/ml 이하 농도로 각각 히알루론산 용액에 넣은 후, 균일하게 교반하여 용해시켜 제1 바이오잉크(224) 및 제2 바이오잉크(226)를 제조할 수 있다. 제조된 제1 바이오잉크(224) 및 제2 바이오잉크(226)는 멤브레인(membrane)을 통해 살균 여과(sterile filtered)된 후 보관될 수 있다.
또한, 이와 별도로, DPSC를 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 이후, 배양된 DPSC를 인산 완충 생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척 한 후 분리(dissociation)시킬 수 있다. 예를 들어, DPSC를 원심분리(centrifuge)한 후, 배양 배지를 제거(aspirating)함으로써 DPSC를 분리할 수 있다.
그 후 DPSC를 제1 바이오잉크(224) 및 제2 바이오잉크(226) 각각과 균일하게 혼합시킴으로써, 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐 및 DPSC를 포함하는 제1 바이오잉크(224)와 1mg/ml 이상 내지 5mg/ml 이하 농도의 피브리노겐 및 DPSC를 포함하는 제2 바이오잉크(226)를 제조할 수 있다.
일 실시예에서, DPSC가 포함된 제1 바이오잉크(224) 및 제2 바이오잉크(226)는 각 바이오잉크에 내포된 젤라틴의 겔화(gelation)을 유도하기 위해 일정시간 동안 보관될 수 있다.
PCL 프린팅 과정(212)은 덴틴-펄프 복합체(236)의 외형 구조에 따라 PCL(222)을 토출시키는 과정을 포함할 수 있다. 여기서, PCL(222)은 치아 복합조직인 덴틴-펄프 복합체(236)의 구조를 유지시켜주기 위한 뼈대 골격(기둥)을 의미할 수 있다.
일 실시예에서, PCL(222)은 덴틴-펄프 복합체(236)의 외형 구조뿐만 아니라, 제1 바이오잉크(224)가 토출되는 덴틴 영역(232) 내부 사이사이에 토출될 수 있다. 이는 DPSC를 포함한 제1 바이오잉크(224)가 형태를 유지하기에 충분한 강성을 갖추지 못하기 때문에, 이를 보강하기 위함일 수 있다.
덴틴 영역 프린팅 과정(214)은 덴틴-펄프 복합체(236)의 덴틴 영역(232)에 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐 및 제1 줄기세포를 포함하는 제1 바이오잉크(224)를 토출시키는 과정을 포함할 수 있다.
펄프 영역 프린팅 과정(216)은 덴틴-펄프 복합체(236)의 펄프 영역(234)에 1mg/ml 이상 내지 5mg/ml 이하 농도의 피브리노겐 및 제2 줄기세포를 포함하는 제2 바이오잉크(226)를 토출시키는 과정을 포함할 수 있다.
적층 프린팅 과정(218)은 덴틴 영역 프린팅 과정(214)과 펄프 영역 프린팅 과정(216)을 반복하여, 제1 바이오잉크(224)와 제2 바이오잉크(226)를 적층함으로써, 덴틴-펄프 복합체(236)를 제조하는 과정을 포함할 수 있다.
일부 실시 예들에서, 도 2에서 설명된 덴틴 영역 프린팅 과정(214)과 펄프 영역 프린팅 과정(216)은 순서에 관계 없이 역순으로 수행될 수도 있고, 동시에 수행될 수도 있다. 또한, 일부 실시예에서, 도 2의 덴틴-펄프 복합체(236)를 제조하는 과정에서, 도 2에 설명된 과정들이 필수적인 것은 아니어서, 도 2에 설명된 과정들보다 많은 과정들을 가지거나, 일부 과정은 생략될 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 복합조직 제조를 위한 바이오 프린팅 장치(400)를 도시한 도면이다.
도 4를 참고하면, 바이오 프린팅 장치(400)는 시린지(syringe) 펌프(410), 공압(pneumatic pressure) 펌프(420), 3-축 스테이지(3-axis stage)(430) 및 제어부(440)를 포함할 수 있다.
PCL은 공압 압출 방식의 프린팅 헤드를 이용하여 패터닝될 수 있다. 시린지 히터(syringe heater)를 이용하여 열을 가하여 PCL을 녹인 후, PCL이 메탈 노즐과 일정 압력 조건하에서 프린팅될 수 있다. 즉, PCL은, 공압 펌프(420)를 통해 토출될 수 있다.
또한, 시린지 펌프(410)는 세포 프린팅을 위해 노즐이 장착될 수 있다. 이 경우, 제1 바이오잉크와 제2 바이오잉크는, 시린지 펌프(410)를 통해 토출될 수 있다. 토출된 제1 바이오잉크 및 제2 바이오잉크는 상온에서 트롬빈(thrombin)으로 처리되어 가교결합(crosslinking)이 유도될 수 있다.
3-축 스테이지(430)는 바이오 잉크의 패터닝 형태를 조절하기 위하여, 시린지 펌프(410)와 공압 펌프(420)의 위치를 이동시킬 수 있다.
일 실시예에서, 바이오 프린팅 장치(400)는 온도, 습도 및 청정도의 조절이 가능한 인클로저(enclosure)를 더 포함할 수 있다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크의 SEM 이미지를 도시한 도면이다. 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크의 압축탄성률 그래프를 도시한 도면이다. 도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 분해속도 그래프를 도시한 도면이다.
도 5a 내지 5c를 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크의 주성분인 피브리노겐의 농도에 따른 물리적 성질의 변화를 확인할 수 있다.
도 5a를 참고하면, 가교결합된(crosslinked) 바이오잉크의 단면 SEM 이미지에 의하면, 바이오잉크는 다양한 피브리노겐의 농도의 바이오잉크 그룹에서 모두 10~100μm의 기공(pore)이 관찰되었다. 예를 들어, 20mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제1 바이오잉크와 5mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오잉크 모두에서 기공이 관찰될 수 있다.
도 5b를 참고하면, 하이드로젤의 압축 탄성률(compressive modulus)은 바이오잉크 내 피브리노겐의 농도 증가와 함께 증가하는 것을 확인할 수 있다. 예를 들어, 20mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제1 바이오잉크의 압축 탄성률은 5mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오잉크에 비해 약 1.5배 높음을 확인할 수 있다.
도 5c를 참고하면, 피브리노겐의 농도가 바이오잉크의 분해 특성(degradation property)에도 영향을 미침을 확인할 수 있다. 구체적으로, 피브리노겐의 농도가 증가할수록 분해 속도는 감소하였다. 예를 들어, 20mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제1 바이오잉크의 분해 속도는 5mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오잉크에 비해 약 2.4배 감소하는 것을 확인할 수 있다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 생존율 그래프를 도시한 도면이다. 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 증식률 그래프를 도시한 도면이다. 도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 형광 이미지를 도시한 도면이다.
도 6a 내지 6c를 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크의 세포 적합성(compatibility)에 대한 평가 결과를 확인할 수 있다.
도 6a를 참고하면, 다양한 농도의 피브리노겐을 내포하는 바이오잉크들에 배양된 DPSC의 생존율을 확인할 수 있다. 배양 4일차에 모든 바이오 잉크 그룹에서 90% 이상의 세포 생존율을 확인할 수 있다.
도 6b를 참고하면, 배양 배지(growth medium)에서 지속적인 세포의 증식이 16일 동안 관찰되었다. 다만, 피브리노겐의 농도가 증가할수록 DPSC의 증식률이 감소를 확인할 수 있다. 예를 들어, 5mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오잉크에서 DPSC는 16일의 배양 기간 동안 약 12배 증식한 반면, 15mg/ml와 20mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제1 바이오잉크에서는 약 6배 정도의 증식만이 관찰되었다.
도 6c를 참고하면, 바이오잉크 내에 배양되는 DPSC의 형태(morphology)를 확인할 수 있다. DPSC는 임베딩(embedding)된 후 4일차에 모든 바이오 잉크 그룹에서 치성 간엽성 줄기세포(dental mesenchymal stem cell)의 전형적인 형상인 스트레칭된(stretched) 형태를 확인할 수 있다.
하지만, 바이오잉크 내 피브리노겐의 농도가 증가할수록 세포 형태가 스트레칭되는데 더 오랜 시간이 소요되었다. 5mg/ml의 피브리노겐 농도에서는 2일에 대부분의 세포들이 스트레칭된 형태를 확인할 수 있는 반면에, 20mg/ml의 피브리노겐 농도에서는 4일에 변화된 형태를 확인할 수 있다. 이를 통해, 바이오잉크의 피브리노겐의 농도가 세포 증식 및 활성에 영향을 주고 있다는 것을 확인할 수 있다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 흡광도 그래프를 도시한 도면이다. 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 치성 분화 그래프를 도시한 도면이다. 도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 다른 치성 분화 그래프를 도시한 도면이다. 도 7d는 본 발명의 일 실시예에 따른 광학 세포 이미지를 도시한 도면이다. 도 7e는 본 발명의 일 실시예에 따른 다른 광학 세포 이미지를 도시한 도면이다.
도 7a 내지 7e를 참고하면, 바이오잉크 내 피브리노겐의 농도가 DPSC의 치성 분화(odontogenic differentiation)에 미치는 영향을 확인할 수 있다.
도 7a를 참고하면, 알리자린 레드 스테이닝(alizarin red staining) 결과, 피브리노겐의 농도가 증가할수록, 미네랄 침착이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이는, 유전자 발현 결과와도 일치하였다.
도 7b 및 7c를 참고하면, RT-qPCR 결과에 따르면, 피브리노겐의 농도가 증가할수록, 치성 분화의 주요 마커인 DMP1과 DSPP의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 예를 들어, 20mg/ml의 피브리노겐 농도에서는 5mg/ml의 피브리노겐 농도에서 보다 DMP1와 DSPP 발현량이 각각 약 4배 및 3배 증가한 것을 확인할 수 있다.
즉, 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐을 포함하는 제1 바이오잉크에서는 줄기세포의 분화가 활성화되어 유전자 발현 및 미네랄 침착이 증가하고, 1mg/ml 이상 내지 5mg/ml 이하 농도의 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오잉크에서는 줄기세포의 분화가 활성화되지 않아 유전자 발현 및 미네랄 침착이 증가하지 않음을 확인할 수 있다.
일 실시예에서, 도 7a 내지 7c의 ‘Control’그룹은 분화 배지를 첨가하지 않고, 증식 배지를 첨가한 그룹을 의미할 수 있다. 이 경우, ‘Control’그룹을 제외한 다양한 농도의 피브리노겐 그룹은 분화 배지를 첨가한 그룹을 의미할 수 있다.
도 7d 및 7e를 참고하면, DPSC의 치성 분화 시 세포 형태와 인산 칼슘 결정(calcium phosphate crystal)의 구조를 확인할 수 있다. 도 7d에서 보이는 바와 같이, 바이오잉크에서 DPSC가 편향된 상아모세포(polarized odontoblast)의 일반적인 형태를 띄는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7e에서 보이는 바와 같이, DPSC의 미네랄 적층에서 주로 관찰되는 사각형 형태의 인산 칼슘 결정도 확인할 수 있다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크의 점도 그래프를 도시한 도면이다. 도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 피브리노겐의 농도에 대한 프린팅 선 폭 그래프를 도시한 도면이다. 도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따른 토출 속도에 대한 프린팅 선 폭 그래프를 도시한 도면이다.
도 8a 내지 8c를 참고하면, 피브리노겐의 농도가 바이오잉크의 점도와 인쇄적성(printability)에 미치는 영향을 확인할 수 있다.
도 8a를 참고하면, 유동성(rheology) 테스트 결과, 피브리노겐의 농도가 증가함에 따라 바이오잉크의 점도가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 피브리노겐의 농도의 변화에도 전단 속력(shear rate)의 증가에 따라 점도가 감소하는 바이오잉크의 전단 박화(shear thinning) 성질은 유지됨을 확인할 수 있다.
도 8b를 참고하면, 프린팅되는 선 폭(line width)은 피브리노겐의 농도와 관계 없이 일정하게 유지됨을 확인할 수 있다.
반면, 도 8c를 참고하면, 프린팅 시의 토출 속도, 즉, 이송 속도(feed rate)가 증가함에 따라 선 폭은 선형으로 감소함을 확인할 수 있다. 따라서, 프린팅 이송 속도의 조절을 통하여 프린팅되는 선 폭을 마이크로 스케일에서 정밀하게 조절할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크 프린팅의 예를 도시한 도면이다. 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 생존율 그래프를 도시한 도면이다. 도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 증식률 그래프를 도시한 도면이다.
도 9a를 참고하면, 살아있는 DPSC를 바이오프린팅하여 자유 마이크로 패턴의 제작이 가능함을 확인하기 위해, 약 200μm 선 폭으로 ‘UNIST’ 문자를 프린팅하였다. 그 결과, 살아있는 DPSC로 미리 지정된 패턴을 정밀하게 구현할 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 도 9b 및 9c를 참고하여, DPSC의 바이오 프린팅 공정이 DPSC의 생존률과 증식률 및 분화 특성에 미치는 영향을 확인할 수 있다. 도 9b를 참고하면, 프린팅 전후 세포 생존율을 확인할 수 있다. 그래프에서 보는 것과 같이 제어 그룹(control group)과 프린트 그룹(printed group) 모두에서 88% 이상의 유사한 세포 생존율을 확인할 수 있다. 이는 증식률 평가에서도 유사한 결과를 보여주었다.
도 9c를 참고하면, 5일 동안 두 그룹 모두에서 활성화된 세포 증식을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 바이오잉크와 프린팅 공정이 DPSC에 세포적합(cytocompatible)한 것을 확인 할 수 있다.
일 실시예에서, 도 9b 및 9c의 ‘Control’그룹은 분화 배지를 첨가하지 않고, 증식 배지를 첨가한 그룹을 의미할 수 있다. 이 경우, ‘Control’그룹을 제외한 다양한 농도의 피브리노겐 그룹은 분화 배지를 첨가한 그룹을 의미할 수 있다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 분화의 예를 도시한 도면이다. 도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 분화의 다른 예를 도시한 도면이다.
도 10a 및 10b를 참고하면, 덴틴-펄프 복합체의 지역적 분화(localized differentiation)를 제조하기 위해, DPSC의 분화를 영역에 따라 분리하는 것을 확인할 수 있다.
도 10a를 참고하면, 덴틴-펄프 복합체의 횡단면의 펄프와 덴틴 조직들을 간단히 제조한 2차원 프린팅 결과를 확인할 수 있다. 이 경우, 미네랄화되지 않은(Unmineralized) 펄프 제조를 위해 치성 분화를 억제하고, 미네랄화된(mineralized) 덴틴 제조를 위해 치성 분화를 활성화시킬 수 있는 바이오 잉크가 각각 사용되었다.
예를 들어, 펄프 영역에는 분화가 비활성화되는 5mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오잉크에 0.5x106의 세포를 내포하여 프린팅할 수 있다. 덴틴 영역에는 분화가 활성화 되는 20mg/ml 농도의 피브리노겐을 포함하는 제1 바이오잉크에 5x106의 세포를 내포하여 프린팅할 수 있다. 이 경우, 실제 치아와 같이 덴틴 영역에 세포가 밀도있게 존재하고 펄프 영역에 세포가 희소(sparse)하게 존재하는 것을 확인할 수 있다. 하지만 실제 덴틴 조직과 같이 세포가 배향되는 것은 관찰되지 않았다.
도 10b를 참고하면, 덴틴-펄프 복합체 분화 배지에 15일간 배양하였을 때, 덴틴 영역인 외곽에만 활성화된 미네랄 적층이 이루어진 것을 확인할 수 있었다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체를 도시한 도면이다. 도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체의 수평 단면을 도시한 도면이다. 도 11c는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체의 수직 단면을 도시한 도면이다. 도 11d는 본 발명의 일 실시예에 따른 덴틴-펄프 복합체의 다른 수직 단면을 도시한 도면이다.
도 11a를 참고하면, 덴틴-펄프 복합체의 프린팅 결과를 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 프린팅 공정에 따라, 살아있는 세포를 활용하여 실제 사람의 치아와 유사한 형태 및 크기의 제작이 가능함을 확인할 수 있었다.
도 11b를 참고하면, 분화 배지에서 15일 배양을 통하여 하나의 3차원 구조물에서 덴틴-펄프 복합체의 제작이 가능함을 인산 칼슘 염색을 통하여 확인할 수 있다. 3D 덴틴-펄프 복합체의 수평(horizontal) 면을 관찰 시, 분화가 진행됨에 따라 구조체 내 축적된 미네랄 양이 영역마다 다른 것을 확인할 수 있다.
구조체 외부에는 과량의 미네랄이 축적되어 덴틴 조직(dentin-like tissue)을 형성하였지만, 내부에는 미네랄 축적이 미미한 펄프 조직(pulp-like tissue)을 형성하였다. 이는 덴틴-펄프 복합체의 수직(vertical) 면에서도 동일한 결과를 확인할 수 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술적 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 통상의 기술자라면 본 발명의 본질적인 특성이 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변경 및 수정이 가능할 것이다.
따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 한정하기 위한 것이 아니라, 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예들에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 보호범위는 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
200: 덴틴-펄프 복합체 제조 과정
212: PCL 프린팅 과정
214: 덴틴 영역 프린팅 과정
216: 펄프 영역 프린팅 과정
218: 적층 프린팅 과정
222: PCL
224: 제1 바이오잉크
226: 제2 바이오잉크
232: 덴틴 영역
234: 펄프 영역
400: 바이오 프린팅 장치
410: 시린지 펌프
420: 공압 펌프
430: 3-축 스테이지
440: 제어부

Claims (10)

  1. (a) 복합조직을 위한 제1 영역에 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐 및 제1 줄기세포를 포함하는 제1 바이오잉크를 토출시키는 단계; 및
    (b) 상기 복합조직을 위한 제2 영역에 1mg/ml 이상 내지 5mg/ml 이하 농도의 미리 결정된 농도의 피브리노겐 및 제2 줄기세포를 포함하는 제2 바이오잉크를 토출시키는 단계;
    를 포함하고,
    상기 제1 줄기세포는, 상기 5mg/ml 초과 내지 20mg/ml 이하 농도의 피브리노겐에 따라 분화가 활성화되고,
    상기 제2 줄기세포는, 상기 1mg/ml 이상 내지 5mg/ml 이하 농도의 미리 결정된 농도의 피브리노겐에 따라 분화가 비활성화되는,
    복합조직 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계 이전에,
    상기 복합조직을 위한 제3 영역에 PCL(polycaprolactone) 및 생분해성 합성 폴리머 중 적어도 하나를 토출시키는 단계;
    를 더 포함하고,
    상기 제3 영역은, 상기 제1 영역 및 제2 영역의 외부에 위치하는,
    복합조직 제조 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 내부에 위치하는,
    복합조직 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제1 바이오잉크 및 제2 바이오잉크는, 젤라틴, 히알루론산 및 글리세린 중 적어도 하나를 더 포함하는,
    복합조직 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계 이전에,
    상기 제1 줄기세포 및 상기 제2 줄기세포를 배양하는 단계;
    상기 배양된 제1 줄기세포를 상기 제1 바이오잉크와 혼합하고, 상기 배양된 제2 줄기세포를 상기 제2 바이오잉크와 혼합하는 단계;
    를 더 포함하는,
    복합조직 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 바이오잉크와 제2 바이오잉크는, 시린지(syringe) 펌프를 통해 토출되는,
    복합조직 제조 방법.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 PCL은, 공압(pneumatic pressure) 펌프를 통해 토출되는,
    복합조직 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계 이후에,
    상기 토출된 제1 바이오잉크와 제2 바이오잉크를 분화 배지에서 배양하는 단계;
    를 더 포함하는,
    복합조직 제조 방법.
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