KR20170001444A - 바이오 잉크의 제조방법 및 3d 프린터 적용 - Google Patents

바이오 잉크의 제조방법 및 3d 프린터 적용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물 및 이의 제조방법, 이를 이용한 생체소재에 관한 것으로, (A) 제1액 및 (B) 제2액을 포함하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물로서,
(ⅰ) 상기 (A) 제1액은 제1 화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하고, 상기 (B) 제2액은 제2 화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하거나; 또는 (ⅱ) 상기 (A) 제1액은 제1 정전기적 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하고, 상기 (B) 제2액은 제2 정전기적 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하며,
상기 제1 화학 작용기와 상기 제2 화학 작용기는 서로 화학 반응을 일으켜 결합되고, 상기 제1 정전기적 작용기와 상기 제2 정전기적 작용기는 서로 정전기적 인력(electrostatic attraction)에 의해 물리적으로 결합되는 것을 특징으로 한다.

Description

바이오 잉크의 제조방법 및 3D 프린터 적용 {The method for preparing bio-ink and its application on 3D printing}
본 발명은 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물 및 이의 제조방법, 이를 이용한 생체소재에 관한 것이다.
고령화 사회가 도래함에 따라, 장기 수급 불균형의 문제는 사회 문제로까지 대두되고 있다. 해를 거듭할수록 장기 이식 대기자수는 증가하는 추세를 보이고 있으며, 반면 장기 기증자의 수는 답보 상태에 있다. 이러한 문제의 근본 해결책으로서 조직 및 장기의 재생을 가능케 하는 조직공학이 각광을 받고 있다.
조직공학을 이루는 주요 3 요소(세포, 지지체 및 생체활성분자) 중 지지체는 구성재료 선택과 구조제어 기술이 매우 중요하다. 즉, 지지체는 자가복구기능을 통해 손실한 조직을 재생시키기 위하여 조직과 조직을 이어주는 다리와 같은 역할을 하며, 이를 위하여 조직재생이 원활히 이루어지도록 세포친화성이 뛰어나야 한다. 또한, 세포가 3 차원 적으로 잘 자라며 영양분 및 배설물 등의 교환이 잘 이루어질 수 있도록 일정한 크기영역에서 3 차원적으로 잘 연결되어 있는 기공구조를 가지고, 조직의 재생속도에 맞추어 분해되어 없어지는 생분해성과 재생되는 동안 형태를 유지시켜줄 기계적 강도를 가져야하며, 생체안전성이 뛰어나야 한다. 특히, 뼈와 치아와 같은 경조직 재생에 있어서는 재생부위에 따른 기계적 물성확보가 중요하다.
구체적으로 조직 재생용 지지체는 첫째, 임플란트 부위에서 물리적으로 안정해야 하고, 둘째, 재생 효능을 조절할 수 있는 생리 활성을 나타내어야 하며, 셋째, 새로운 조직을 형성한 후에는 생체 내에서 분해되어야 하고 넷째, 분해산물이 독성을 갖지 않아야 한다.
종래의 지지체 제조법으로는 염 추출법, 입자추출, 가스 발포법 및 전기방사법등이 있으며, 이의 방법은 지지체 제조에 있어서 다공도 및 지지체의 형태를 제어하기 어려운 문제점이 존재한다. 따라서 조직/장기를 환자 맞춤형으로 프린팅하는 개념인 바이오 프린팅 기술이 많은 사람의 관심을 끌고 있는 분야이다. 허나 앞선 지지체의 조건인 물리적 안정성, 생리활성 인자 조절, 생분해성 및 생체적합성을 특징으로 하는 프린팅용 생채재료의 부족으로 바이오 프린팅 응용에 한계가 있다.
대한민국등록특허 제10-0947290호
본 발명은 종래기술의 문제점을 해결하고 생체에 적합한 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 상기 바이오 잉크 조성물에 세포, 유착 방지용 물질, 염료 또는 약물 등을 첨가하여 3D 생체용 소재를 제공함으로써 다양한 분야에 적용시킬 수 있는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 대표적인 일 측면에 따르면, (A) 제1액 및 (B) 제2액을 포함하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물로서,
(ⅰ) 상기 (A) 제1액은 제1 화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하고, 상기 (B) 제2액은 제2 화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하거나; 또는 (ⅱ) 상기 (A) 제1액은 제1 정전기적 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하고, 상기 (B) 제2액은 제2 정전기적 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하며,
상기 제1 화학 작용기와 상기 제2 화학 작용기는 서로 화학 반응을 일으켜 결합되며, 상기 제1 정전기적 작용기와 상기 제2 정전기적 작용기는 서로 정전기적 인력(electrostatic attraction)에 의해 물리적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 대표적인 일 측면에 따르면, 본 발명의 여러 구현예에 따른 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 3D 프린터용 2액형 카트리지, 3D 프린터, 또는 3D 생체소재에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대표적인 일 측면에 따르면, 상기 3D 생체소재를 포함하는 조직공학적 지지체, 약물 전달체, 또는 유착 방지제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대표적인 일 측면에 따르면, a) 생체 고분자에 제1 화학 작용기 또는 제1 정전기적 작용기를 포함하는 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계; 및
b) 생체 고분자에 제2 화학 작용기 또는 제2 정전기적 작용기를 포함하는 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계;를 포함하며,
상기 생체 고분자는 소장점막하 조직(SIS), 히알루론산(HA), 카복시메틸셀룰로스(CMC), 알지네이트(Alginate), 키토산(Chitosan), 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택된 1종이거나, 또는 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 여러 구현예에 따른 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물은 생체에 적합한 조성으로, 액상의 형태에서 화학적 또는 정전기적 결합을 통하여 고체상의 3D 생체소재를 제공하는데 탁월한 효과를 나타낸다.
또한, 상기 바이오 잉크 조성물에 세포, 유착 방지용 물질, 염료 또는 약물 등을 첨가하여 생체 조직 또는 장기 재생 등의 다양한 분야에 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 바이오 잉크 조성물을 3D 프린터로 프린팅 하는 것을 도시화한 모식도이다.
도 2는 실시예 1 내지 4에 따른 화학적 결합을 이용한 바이오 잉크 조성물을 3D 프린터로 프린팅 하는 과정을 도시화한 모식도이다.
도 3은 실시예 1을 3D 프린터로 프린팅한 생체소재의 지지체를 나타낸 사진이다.
도 4는 실시예 1 내지 28의 바이오 잉크 조성물을 나타낸 사진이다.
도 5는 실시예 1(SIS), 8(HA), 15(CMC) 및 22(Alginate)의 조성물에 세포를 혼합하여 3D 프린터로 프린팅한 지지체를 10일 동안 배양한 후, 상기 지지체의 세포를 형광현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 6의 (a)는 실시예 29 내지 33의 조성물을 3D 프린터로 프린팅한 지지체의 표면을 형광현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 사진이고, (b)는 위상차 사진과 형광사진을 병합한 사진이다.
도 7의 (a)는 실시예 1의 조성물을 3D 프린터로 프린팅한 지지체를 누드마우스에 이식한 사진이고, (b)는 상기 이식되었던 지지체를 적출한 사진이고, (c)는 적출된 지지체의 H&E 사진이다.
도 8은 실시예 34의 조성물을 3D 프린터로 프린팅한 지지체를 누드마우스에 이식한 후, 생체 내의 이미지를 FOBI(fluorescence-labeled organism bioimaging)을 통해 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 실시예 35의 조성물을 3D 프린터로 프린팅한 지지체를 누드마우스에 이식한 후, 생체 내의 이미지를 FOBI을 통해 시간별로 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 실시예 36 내지 39에 따른 정전기적 결합을 이용한 바이오 잉크 조성물을 3D 프린터로 프린팅 하는 과정을 도시화한 모식도이다.
도 11은 실시예 36의 바이오 잉크 조성물을 12well플레이트에 격자형태로 3D 프린팅한 결과를 나타낸 사진으로, (a)는 실시예 36의 조성물로 프린팅된 지지체이고, (b)는 실시예 37의 조성물을 프린팅한 지지체이고, (c)는 실시예 38의 조성물을 프린팅한 지지체이고, (d)는 실시예 39의 조성물을 프린팅한 지지체이다.
도 12의 (a)는 실시예 41의 바이오 잉크 조성물을 12well플레이트에 격자형태로 프린팅한 결과를 나타낸 사진이고, (b)는 실시예 41의 독성평가를 실시한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 실시예 41의 조성물을 3D 프린터로 프린팅한 지지체를 형광현미경을 통해 측정한 형광사진이다.
도 14는 실시예 40, 42 및 43의 조성물을 3D 프린터로 프린팅한 지지체를 형광현미경을 통해 측정한 형광사진이다.
도 15의 (a)는 실시예 36의 양이온성 또는 음이온성 용액을 나타낸 사진이고, (b)는 각각 curcumin(Cur) 약물을 phosphate buffer saline에 부유 시킨 용액과 curcumin 약물이 봉입된 마이크로 파티클을 phosphate buffer saline에 부유 시킨 용액, 실시예 44의 양이온성 또는 음이온성 혼합 용액을 나타낸 사진이고, (c)는 실린더에 투입된 모습을 나타낸 사진이다.
도 16의 (a)는 curcumin 약물이 투입된 누드마우스의 사진이며, (b)는 curcumin 약물이 봉입된 마이크로 파티클이 투입된 사진이며, (c)는 실시예 44의 curcumin의 시간의 흐름에 따라 약물이 방출된 사진이다.
도 17의 (a)는 실시예 45의 바이오 잉크 조성물을 누드 마우스에 직접적으로 투입하는 모습을 나타낸 사진이고, (b)는 실시예 45과 비교예로 A-253의 세포가 주입된 종양모델의 누드마우스에 대한 항암효과의 비교 결과를 나타낸 그래프이다. (Cur-M: curcumin 약물이 봉입된 마이크로 파티클, Cur-M-loaded CCH: curcumin이 봉입된 마이크로 파티클과 키토산/카복시메틸셀룰로스와 혼합된 바이오 잉크, repeat free Cur injection: curcumin을 반복 투여 한 것이며, single free Cur injection: curcumin을 초기 1회 투여 한 것이며, saline: saline 투여 한 것이다.)
도 18은 실시예 46 및 47을 FOBI을 통해 측정한 형광 사진이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현 예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (A) 제1액 및 (B) 제2액을 포함하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물로서, (ⅰ) 상기 (A) 제1액은 제1 화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하고, 상기 (B) 제2액은 제2 화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하거나; 또는 (ⅱ) 상기 (A) 제1액은 제1 정전기적 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하고, 상기 (B) 제2액은 제2 정전기적 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하며, 상기 제1 화학 작용기와 상기 제2 화학 작용기는 서로 화학 반응을 일으켜 결합되며, 상기 제1 정전기적 작용기와 상기 제2 정전기적 작용기는 서로 정전기적 인력(electrostatic attraction)에 의해 물리적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물이 개시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1 생체 고분자와 상기 제2 생체 고분자는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 소장점막하 조직, 히알루론산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트, 키토산, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택된 1종이거나, 또는 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
다른 구현예에 따르면, 상기 제1 화학 작용기, 상기 제1 정전기적 작용기, 상기 제2 화학 작용기, 상기 제2 정전기적 작용기는 상기 생체 고분자의 골격의 곁가지와 말단에 형성 되는 것을 특징으로 한다.
더욱 상세하게는, (상기 제1 화학 작용기, 상기 제2 화학 작용기)는 (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 싸이올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 싸이올기), (아크로일기, 아민기), (아크로일기, 싸이올기) 및 (테트라진, 사이클로옥텐) 중에서 선택되는 1종 이상의 조합인 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 작용기를 포함하는 물질로는 상기 제1 화학 작용기의 경우 amino-PEG4-alkyne(알카인기), alkyne-PEG5-acid(알카인기), alkyne-PEG-amine(알카인기) oxiranylamine(에폭시기), 2-oxiranyl-ethylamine(에폭시기), acrylamide(아크로일기), acrylic acid(아크로일기), acryloyl chloride(아크로일기), methyltetrazine-amine(테트라진), methyltetrazine-PEG4-amine(테트라진), methyltetrazine-propylamine(테트라진), tetrazine-PEG5-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-PEG4-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-silfo-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-PEG4-acid(테트라진), methyltetrazine-PEG12-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-acid(테트라진), tetrazine-acid(테트라진)를,
상기 제2 화학 작용기의 경우 azide-PEG4-amine(아자이드기), 3-amino-1-propanethiol(싸이올기), 11-mercaptoundecanoic acid(싸이올기), Amino-methanethiol(싸이올기), thiol PEG amine(싸이올기), ethylene diamine(아민기), PEG diamine(아민기), (S)-3-amino-2-(hydroxymethyl)propionic acid(아민기), amino-acetic acid(아민기), trans-cyclooctene-amine(사이클로옥텐), trans-cyclooctene-NHS ester(사이클로옥텐), trans cyclooctene-PEG-NHS ester(사이클로옥텐), trans cyclooctene-PEG4-acid(사이클로옥텐)를 사용할 수 있다.
상기 제1액과 제2액은 상술한 바와 같이 서로 다른 화학적 작용기를 포함하여 3D 프린터로 프린팅 시, 서로 다른 작용기와의 선택적인 결합을 통해 화학적 결합을 형성할 수 있는데, 이러한 화학적 결합으로 형성된 바이오 잉크 조성물은 수 초 이내로 반응시켜 고체화하는데 현저한 효과를 나타낸다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1 정전기적 작용기와 상기 제2 정전기적 작용기는 각각 양이온성 작용기와 음이온성 작용기이거나, 또는 각각 음이온성 작용기와 양이온성 작용기인 것을 특징으로 한다.
더욱 상세하게는, 상기 양이온성 작용기는 키토산, 폴리아크릴아미드 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드 중에서 선택된 1종 이상이고, 상기 음이온성 작용기는 카복시메틸셀룰로스, 히알루론산 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 양이온성 또는 음이온성 작용기를 가지는 바이오 잉크 조성물의 경우에도 서로 다른 정전기적 작용기를 포함하여 제1액과 제2용액의 혼합되는 순간부터 정전기적 인력을 통하여 물리적인 결합을 할 수가 있어, 짧은 시간 안에 고체화하는데 현저한 효과를 나타낸다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 생체 고분자와 화학 작용기는 1: 400 내지 600의 몰 비로 혼합되는 것이 바람직한데, 상기 범위가 1: 400 미만이면 기계적 강도가 낮아지는 문제점을 가지며, 1: 600을 초과하는 경우에는 기계적 강도가 지나치게 높아져 지나친 가교도에 의해 각종 물질의 이동이 제한될 수 있어 바람직하지 않으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 제1액과 제2액의 생체 고분자 농도는 1 내지 30wt%인 것이 바람직한데, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 높은 점도에 의해 바이오 잉크로서 사용할 수 없는 가능성이 우려되어 바람직하지 않으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 바이오 잉크 조성물은 아세트산, 증류수, 또는 완충용액의 용매를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 완충용액은 2-(n-morpholino)ethanesulfonic acid, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-tiazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride 및 Phosphate buffer saline 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 제1액 및 상기 제2액 중 하나 또는 모두는 세포, 유착 방지용 물질, 염료 및 약물 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포는 인간유래 줄기세포, 근육유래 줄기세포, 치수 줄기세포, 비갑개유래 중간엽 기질세포, 섬유아세포 및 평활근 세포 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 유착 방지용 물질을 넣어 유착방지제로 응용 할 수 있다. 또한, 상기 염료로는 FITC(Fluorescein isothiocyanate), rhodamine, IR 780, IR 783, PI(Propidium iodide)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 여러 구현예에 따른 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물을 포함하는 3D 프린터용 2액형 카트리지 또는 3D 프린터가 개시된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 여러 구현예에 따른 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물의 상기 제1액과 상기 제2액이 결합하여 형성된 것을 특징으로 하는 3D 생체 소재가 개시된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 3D 생체 소재를 포함하는 조직공학적 지지체, 약물 전달체, 또는 유착 방지가 개시된다. 상기 약물은 일반적으로 사용되는 항생제, 항암제, 소염진통제, 항바이러스제, 항균제, 단백질 및 펩타이드 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 관련하여, 도 8을 살펴보면 본 발명의 일 구현예에 따라 실시된 메소트렉세이트(항암제) 약물을 포함하는 지지체의 경우, 약물이 균일하게 혼합 분산되었음을 확인할 수 있으며, 상기 바이오 잉크 조성물을 포함하는 약물전달체가 생체 내에 원활하게 이식되었음을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, a) 생체 고분자에 제1 화학 작용기 또는 제1 정전기적 작용기를 포함하는 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계, 및 b) 생체 고분자에 제2 화학 작용기 또는 제2 정전기적 작용기를 포함하는 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계를 포함하며, 상기 생체 고분자는 소장점막하 조직, 히알루론산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트, 키토산, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택된 1종이거나, 또는 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물의 제조방법이 개시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1액과 제2액은 아세트산, 증류수 및 완충용액 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 더 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 구현예에 따르면, 상기 제1액 및 상기 제2액 중 하나 또는 모두는 세포, 유착 방지용 물질, 염료 및 약물 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 제1 화학 작용기를 포함하는 물질은 amino-PEG4-alkyne(알카인기), alkyne-PEG5-acid(알카인기), alkyne-PEG-amine(알카인기) oxiranylamine(에폭시기), 2-oxiranyl-ethylamine(에폭시기), acrylamide(아크로일기), acrylic acid(아크로일기), acryloyl chloride(아크로일기), methyltetrazine-amine(테트라진), methyltetrazine-PEG4-amine(테트라진), methyltetrazine-propylamine(테트라진), tetrazine-PEG5-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-PEG4-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-silfo-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-PEG4-acid(테트라진), methyltetrazine-PEG12-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-NHS ester(테트라진), methyltetrazine-acid(테트라진), tetrazine-acid(테트라진) 중에서 선택된 1종 이상이며, 상기 제2 화학 작용기를 포함하는 물질은 azide-PEG4-amine(아자이드기), 3-amino-1-propanethiol(싸이올기), 11-mercaptoundecanoic acid(싸이올기), Amino-methanethiol(싸이올기), thiol PEG amine(싸이올기), ethylene diamine(아민기), PEG diamine(아민기), (S)-3-amino-2-(hydroxymethyl)propionic acid(아민기), amino-acetic acid(아민기), trans-cyclooctene-amine(사이클로옥텐), trans-cyclooctene-NHS ester(사이클로옥텐), trans cyclooctene-PEG-NHS ester(사이클로옥텐), trans cyclooctene-PEG4-acid(사이클로옥텐) 중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직한데, 상기 생체 고분자의 말단에 결합되어 서로 다른 작용기를 가지는 생체 고분자와 결합할 수 있도록 하는데 효과적인 역할을 한다.
상기 제1 정전기적 작용기와 상기 제2 정전기적 작용기는 각각 양이온성 작용기와 음이온성 작용기이거나, 또는 각각 음이온성 작용기와 양이온성 작용기인 것이 바람직하며, 구체적으로, 상기 양이온성 작용기는 키토산, 폴리아크릴아미드 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드 중에서 선택된 1종 이상이고, 상기 음이온성 작용기는 카복시메틸셀룰로스, 히알루론산 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하며, 서로 다른 정전기적 작용기를 가지는 생체 고분자와 결합할 수 있도록 하는데 효과적인 역할을 한다.
상기 생체 고분자와 화학 작용기는 1: 400 내지 600의 몰 비로 혼합되는 것이 바람직하고, 상기 제1액과 제2액의 생체 고분자 농도는 1 내지 30wt%인 것이 바람직한데, 상기 조성에 대한 구체적인 설명은 앞서 상술한 바와 동일하므로 생략하기로 한다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
제조예 1
전체 용액의 총 중량에 대하여, 소장점막하 조직 파우더 1wt%, 펩신 0.1wt% 및 아세트산 3wt%을 투입하고 48시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 전체 용액의 pH가 7.4가 되도록 1N의 수산화 나트륨 용액을 투입하여 소장점막하조직 용액을 제조하였다.
제조예 2 내지 4
히알루론산, 카복시메틸셀룰로스 파우더, 또는 알지네이트를 3차 증류수에 투입하고 상온에서 12시간 동안 교반하여 각각 히알루론산 용액, 카복시메틸셀룰로스 용액 및 알지네이트 용액을 제조하였다. (단, 각 성분의 함량은 하기 표 1에 나타내었다.)
구성성분(wt%) 제조예2 제조예3 제조예4
히알루론산 1 - -
카복시메틸셀룰로스 - 8 -
알지네이트 - - 1
3차 증류수 99 92 99
실시예 1 내지 7
1. 제1액의 제조
상기 제조예 1의 용액에 100mM의 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid 97.6㎎ 및 2.5M의 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2yl)-4-methylmorpholinium chloride 3.5g을 투입한 후, 상기 용액과 제1 화학 작용기를 포함하는 물질을 몰 비가 1:500이 되도록 투입하고 72시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 72시간 동안 투석하여 영하 80℃의 온도로 냉각시키고 동결 건조하여 화학작용기가 도입된 제1액의 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
2. 제2액의 제조
상기 1과 동일하게 실시하되, 제1 화학 작용기 대신 제2 화학 작용기를 포함하는 물질을 투입하여 화학작용기가 도입된 제2액의 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
단, 상기 제1 및 제2 화학 작용기를 포함하는 물질의 구체적인 종류는 하기 표 2에 나타내었다.
구분 제1 화학 작용기를 포함하는 물질 제2 화학 작용기를 포함하는 물질
실시예1 methyltetrazine-PEG4-amine trans- cyclooctene-amine
실시예2 amino-PEG4-alkyne azide-PEG4-amine
실시예3 amino-PEG4-alkyne thiol-PEG-amine
실시예4 2-oxiranyl-ethylamine PEG diamine
실시예5 2-oxiranyl-ethylamine thiol-PEG-amine
실시예6 acrylamide PEG diamine
실시예7 acrylamide thiol-PEG-amine
실시예 8 내지 14
실시예 1 내지 7과 동일하게 실시하되, 제조예 1의 용액 대신에 제조예 2의 용액을 사용하였다.
실시예 15 내지 21
실시예 1 내지 7과 동일하게 실시하되, 제조예 1의 용액 대신에 제조예 3의 용액을 사용하였다.
실시예 22 내지 28
실시예 1 내지 7과 동일하게 실시하되, 제조예 1의 용액 대신에 제조예 4의 용액을 사용하였다.
실시예 29 내지 33
실시예 1과 동일하게 실시하되, 추가로 줄기세포 또는 체세포를 1×106cells/㎖의 농도로 제1액 및 제2액에 모두 포접하여 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.(단, 투입된 상기 줄기세포 또는 체세포의 구체적인 종류는 하기 표 3에 나타내었다.)
구분 실시예29 실시예30 실시예31 실시예32 실시예33
세포의 종류 골수유래줄기세포
(hBMSC)		 근육유래줄기세포
(hMDSC)		 치수줄기세포
(hDPSC)		 섬유아세포
(Fibroblast)		 평활근세포
(SMC)
실시예 34
실시예 1과 동일하게 실시하되, 추가로 FITC가 도입되어진 메소트렉세이트(Methotrexate)약물을 375㎍/㎖의 농도로 제1액 및 제2액에 모두 봉입하여 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
실시예 35
실시예 1과 동일하게 실시하되, 추가로 IR-780 iodide dye를 317㎍/㎖의 농도로 제1액 및 제2액에 모두 도입하여 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
실시예 36
1. 제1액의 제조
전체 용액의 총 중량에 대하여, 키토산 파우더 2.5wt%를 0.1N의 아세트산에 투입하여 상온에서 12시간 동안 교반하여 키토산 용액을 제조한 후, 4℃의 온도에서 48시간 동안 안정화시켜 정전기적 작용기가 도입된 제1액의 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
2. 제2액의 제조
전체 용액의 총 중량에 대하여, 카복시메틸셀룰로스 파우더 12wt%를 Phosphate buffer saline에 투입하고 교반한 후, 4℃의 온도에서 48시간 동안 안정화시켜 정전기적 작용기가 도입된 제2액의 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
실시예 37
1. 제1액의 제조
실시예 36과 동일하게 실시하였다.
2. 제2액의 제조
실시예 36과 동일하게 실시하되, 카복시메틸셀룰로스 파우더 대신에 히아루론산 파우더 3wt%를 투입하였다.
실시예 38
1. 제1액의 제조
실시예 36과 동일하게 실시하였다.
2. 제2액의 제조
전체 용액의 총 중량에 대하여, β-글리세로포스페이트 파우더 5wt%를 Phosphate buffer saline에 투입하고 교반한 후, 4℃의 온도에서 48시간 동안 안정화시켜 용액을 제조한 후, 상기 실시예 12와 동일하게 실시하여 제조된 카복시메틸셀룰로스 용액과 혼합하여 제2액을 제조하였다.
실시예 39
1. 제1액의 제조
폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 20wt%를 Phosphate buffer saline에 투입하고 교반한 후, 4℃의 온도에서 48시간 동안 안정화시켜 제1액을 제조하였다.
2. 제2액의 제조
실시예 36과 동일하게 실시하였다.
실시예 40 내지 43
실시예 36과 동일하게 실시하되, 추가로 PKH labeling한 세포를 1×106cells/㎖의 농도로 제1액 및 제2액에 모두 포접하여 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.(단, 투입된 상기 세포의 구체적인 종류는 하기 표 4에 나타내었다.)
구분 실시예40 실시예41 실시예42 실시예43
세포의 종류 골수유래줄기세포
(hBMSC) 		근육유래줄기세포
(hMDSC) 		비갑개 유래 중간엽 기질세포
(hTMSC) 		치수줄기세포
(hDPSC)
실시예 44
실시예 36과 동일하게 실시하되, 추가로 커큐민 약물을 1㎎/㎖의 농도로 제1액 및 제2액에 모두 투입하여 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
실시예 45
실시예 44와 동일하게 실시하되, 단일축 초음파 노즐법을 이용하여 커큐민 약물이 봉입된 PLGA 마이크로 파티클을 제조하여 투입하였다.
실시예 46 내지 47
실시예 36과 동일하게 실시하되, 추가로 NIR-783 dye 또는 Rhodamine dye 3mg을 투입한 후 24시간 동안 혼합하여 반응시키고 투석 막을 이용하여 2일 동안 미반응된 dye를 제거하였다.
시험예 1: 생체소재용 지지체의 제조
도 2에서 보는 바와 같이, 두 개의 실린더를 가지는 3D 프린터를 사용하여, 실린더 A에는 제1액의 바이오 잉크 조성물을 투입하고, 실린더 B에는 제2액의 바이오 잉크 조성물을 투입한 후 압출시켜 생체소재용 지지체를 제조하였다.
도 3은 실시예 1의 바이오 잉크 조성물을 투입하여 프린팅한 결과를 나타낸 사진으로, 고체 상태의 3D 생체소재의 지지체가 제조된 것을 육안으로도 확인할 수 있다.
시험예 2: 세포 생존율 평가
실시예 1, 8, 15 및 22의 조성물을 3D 프린터로 프린팅하여 제조된 지지체를 10일 동안 배양한 후, 세포의 생존 및 거동 상태를 형광현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 10일이 지난 후에도 세포가 잘 분포하여 생존해 있음을 확인할 수 있다.
시험예 3: 생체 적합성 평가
실시예 1의 조성물을 3D 프린터로 프린팅하여 제조된 생체소재의 지지체에 대한 생체 적합성을 평가하기 위하여, 상기 지지체를 누드마우스의 피하에 이식하여 수일이 지난 후에 상기 이식된 부위를 적출하여 H&E(Hematocylin and eosin) stain을 통하여 생체 적합성을 확인 하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7을 살펴보면, 지지체가 이식되었던 주변 조직들의 괴사나 세포 사멸 등의 현상이 관찰되지 않은 것으로 보아, 생체에 적합한 형태로 성장하였음을 확인할 수 있다. 또한, recipient의 세포나 조직들이 지지체 안으로 차들어오는 것을 볼 수 있으며, 이는 상기 지지체가 생체 적합성에 있어서 효과적인 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
시험예 4: 화학적 결합을 통한 조성물에 대한 약물 전달체로써의 적합성 평가
실시예 34의 조성물을 3D 프린터로 프린팅하여 제조된 지지체를 누드마우스의 피하에 이식하였으며, 24시간이 지난 후에 FOBI(fluorescence-labeled organism bioimaging)로 관찰하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 24시간이 지난 후에도 도입된 약물이 지지체가 잘 유지되는 것을 확인할 수 있다.
시험예 5: 생체 내 이미지 추적 가능성 평가
실시예 35, 46 및 47의 생체내 추적 가능한 염료가 투입된 조성물을 3D 프린터로 프린팅하여 제조된 지지체를 누드마우스의 생체 내에 이식한 후, 이미징 장비인 FOBI을 사용하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 9 및 18에 나타내었다.
도 9 및 18에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 35, 46 및 47의 조성물로 제조된 지지체가 이식된 직 후 뿐만 아니라 실시예 35의 경우에는 14일이 지난 후에도 이미지 추적이 가능한 것을 확인할 수 있다.
시험예 6: 격자 형태의 프린팅 가능성 평가
실시예 36 내지 39의 조성물을 도 11에서 보는 바와 같이 12well의 플레이트에 격자 형태로 프린팅 하였으며, 그 결과를 도 11의 (a) 내지 (d)에 나타내었다.
도 11의 (a) 내지 (d)의 윗줄을 살펴보면, 원하는 격자 형태로 프린팅이 잘 이루어지며, 아랫줄에 세포 배양액을 추가한 뒤에도 격자의 형태가 잘 유지됨을 확인할 수 있다. 이로써 각각의 조성물에 세포를 넣어 프린팅 하여 세포배양액을 추가하였을 때, 지지체가 흐트러짐이 없이 잘 유지 되는 것을 확인 할 수 있다.
시험예 7: 독성 평가
실시예 41의 조성물을 상기 시험예 6에서 실시한 바와 같이 격자 형태로 프린팅 한 후, 세포 배양이 실시된 시점으로부터 1, 3, 5일이 경과한 시점에서 WST-1 cell proliferation assay kit를 첨가하여 독성 평가를 실시하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
또한, 실시예 40 내지 43의 지지체에 대한 세포형태 및 거동을 관찰하여 그 결과를 도 13 내지 14에 나타내었다.
도 13 내지 14에 보는 바와 같이, 5일이 지난 후에도 세포가 지지체 내부에 잘 분포하여 생존해 있음을 확인할 수 있다.
시험예 8: 정전기적 결합을 통한 조성물에 대한 약물 전달체로써의 적합성 평가
실시예 44 및 45의 조성물로 제조된 지지체를 누드마우스의 피하에 이식하였으며, 경과시간에 따라 FOBI으로 관찰하여 그 결과를 도 16 및 17에 나타내었다.(단, 비교예로 A-253 세포를 누드마우스에 주입한 종양모델을 제조하였다.)
도 16의 (a)는 curcumin 약물이 투입된 누드마우스의 사진이며, (b)는 curcumin 약물이 봉입된 마이크로 파티클이 투입된 사진이며, (c)는 실시예 44의 curcumin 약물이 방출된 사진으로, 약물이 봉입된 실시예 44의 경우가 생체 내의 약물지속시간이 증가하여 생체 이용률이 높아지는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 17에서 보는 바와 같이, 실시예 45의 경우에는 약물의 효능이 향상되어 항암효과가 뛰어남을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 여러 구현예에 따른 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물은 생체에 적합한 조성으로, 액상의 형태에서 화학적 또는 정전기적 결합을 통하여 고체상의 3D 생체소재를 제공하는데 탁월한 효과를 나타낸다.
또한, 상기 바이오 잉크 조성물에 세포, 유착 방지용 물질, 염료 또는 약물 등을 첨가하여 생체 조직 또는 장기 재생 등의 다양한 분야에 적용될 수 있다.

Claims (17)

  1. (A) 제1액 및 (B) 제2액을 포함하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물로서;
    (ⅰ) 상기 (A) 제1액은 제1 화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하고, 상기 (B) 제2액은 제2 화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하거나; 또는 (ⅱ) 상기 (A) 제1액은 제1 정전기적 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하고, 상기 (B) 제2액은 제2 정전기적 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하며;
    상기 제1 화학 작용기와 상기 제2 화학 작용기는 서로 화학 반응을 일으켜 결합되고, 상기 제1 정전기적 작용기와 상기 제2 정전기적 작용기는 서로 정전기적 인력(electrostatic attraction)에 의해 물리적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 생체 고분자와 상기 제2 생체 고분자는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 소장점막하 조직, 히알루론산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트, 키토산, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택된 1종이거나, 또는 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 화학 작용기, 상기 제1 정전기적 작용기, 상기 제2 화학 작용기, 상기 제2 정전기적 작용기는 상기 생체 고분자의 골격의 곁가지와 말단에 형성되는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    (상기 제1 화학 작용기, 상기 제2 화학 작용기)는 (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 싸이올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 싸이올기), (아크로일기, 아민기), (아크로일기, 싸이올기) 및 (테트라진, 사이클로옥텐) 중에서 선택되는 1종 이상의 조합인 것을 특징으로 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 정전기적 작용기와 상기 제2 정전기적 작용기는 각각 양이온성 작용기와 음이온성 작용기이거나, 또는 각각 음이온성 작용기와 양이온성 작용기인 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 양이온성 작용기는 키토산, 폴리아크릴아미드 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드 중에서 선택된 1종 이상이고;
    상기 음이온성 작용기는 카복시메틸셀룰로스, 히알루론산 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1액 및 상기 제2액 중 하나 또는 모두는 세포, 유착 방지용 물질, 염료 및 약물 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세포는 인간유래 줄기세포, 근육유래 줄기세포, 치수 줄기세포, 비갑개유래 중간엽 기질세포, 섬유아세포 및 평활근 세포 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 3D 프린터용 2액형 카트리지.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물의 상기 제1액과 상기 제2액이 결합하여 형성된 것을 특징으로 하는 3D 생체 소재.
  11. 상기 제10항의 3D 생체 소재를 포함하는 조직공학적 지지체.
  12. 상기 제10항의 3D 생체 소재를 포함하는 약물 전달체.
  13. 상기 제10항의 3D 생체 소재를 포함하는 유착 방지제.
  14. a) 생체 고분자에 제1 화학 작용기 또는 제1 정전기적 작용기를 포함하는 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계; 및
    b) 생체 고분자에 제2 화학 작용기 또는 제2 정전기적 작용기를 포함하는 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계;를 포함하며,
    상기 생체 고분자는 소장점막하 조직, 히알루론산, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트, 키토산, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택된 1종이거나, 또는 이들 2종 이상의 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제1 화학 작용기를 포함하는 물질은 amino-PEG4-alkyne, alkyne-PEG5-acid, alkyne-PEG-amine, oxiranylamine, 2-oxiranyl-ethylamine, acrylamide, acrylic acid, acryloyl chloride, methyltetrazine-amine, methyltetrazine-PEG4-amine, methyltetrazine-propylamine, tetrazine-PEG5-NHS ester, methyltetrazine-PEG4-NHS ester, methyltetrazine-silfo-NHS ester, methyltetrazine-PEG4-acid, methyltetrazine-PEG12-NHS ester, methyltetrazine-NHS ester, methyltetrazine-acid 및 tetrazine-acid 중에서 선택된 1종 이상이며,
    상기 제2 화학 작용기를 포함하는 물질은 azide-PEG4-amine, 3-amino-1-propanethiol, 11-mercaptoundecanoic acid, Amino-methanethiol, thiol PEG amine, ethylene diamine, PEG diamine, (S)-3-amino-2-(hydroxymethyl)propionic acid, amino-acetic acid, trans- cyclooctene-amine, trans-cyclooctene-NHS ester, trans cyclooctene-PEG-NHS ester 및 trans cyclooctene-PEG4-acid) 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물의 제조방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 제1 정전기적 작용기와 상기 제2 정전기적 작용기는 각각 양이온성 작용기와 음이온성 작용기이거나, 또는 각각 음이온성 작용기와 양이온성 작용기인 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물의 제조방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 제1액 및 상기 제2액 중 하나 또는 모두는 세포, 유착 방지용 물질, 염료 및 약물 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 2액형 3D 프린터용 바이오 잉크 조성물의 제조방법.
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