KR20200044181A - 물리적 및 생물학적 특성이 개선된 소장점막하조직을 이용한 바이오 잉크 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 물리적 및 생물학적 특성 개선을 위해 세포 운반물질로 소장점막하조직(small intestine submucosa, SIS) 유도체를 특정 함량 이상으로 포함한 바이오 잉크 조성물에 관한 발명으로, 보다 상세하게는 세포적합성을 가지며 프린팅이 용이한 높은 점성 및 탄성, 우수한 구조 안정성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내는 소장점막하조직(small intestine submucosa, SIS)이 함유된 바이오 잉크 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 높은 점탄성, 강한 구조 안정성, 우수한 프린팅성, 생체적합성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내기 때문에 삼차원적 바이오 프린팅을 이용한 조직 유사기관의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

물리적 및 생물학적 특성이 개선된 소장점막하조직을 이용한 바이오 잉크 조성물{Composition of bio-ink having improved physical and biological properties}
본 발명은 물리적 및 생물학적 특성 개선을 위해 세포 운반물질로 소장점막하조직(small intestine submucosa, SIS) 유도체를 특정 함량 이상으로 포함한 바이오 잉크 조성물에 관한 발명으로, 보다 상세하게는 세포적합성을 가지며 프린팅이 용이한 높은 점성 및 탄성, 우수한 구조 안정성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내는 소장점막하조직(small intestine submucosa, SIS)이 함유된 바이오 잉크 조성물에 관한 것이다.
삼차원적인 세포 배양기술은 실험실 내(in vitro)에서 생체조직과 유사한 환경에서 세포 및 조직을 제조할 수 있는 기술로 발달하여 세포의 성장과 분화, 조직 및 기관의 형성과 관련된 여러 연구 분야에 적용되어지고 있다. 이러한 조직 유사기관은 실제 조직이나 장기를 대신하여 약물의 독성 및 약물 동력학 연구에서 유용하게 사용되어 질 수 있으며, 이에 따라 인간 검체 및 기타 포유동물에의 직접적인 실험 적용을 줄일 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 손상된 조직 및 장기를 대체 또는 치료하기 위한 목적인 조직공학(tissue engineering) 기법의 중요한 요소로 조직 및 장기의 공학적 설계에 기여하고 있다.
삼차원 바이오 프린팅 기술은 이러한 조직 유사기관 및 이식 가능한 구조체를 정밀하게 제조하기 위한 유용한 장치가 되었다. 이러한 기술은 실제 인간의 조직을 거의 그대로 모방한 미세 및 거대 조직 구조체를 생성하는 것을 가능하게 하고 있다. 하지만 바이오 프린팅시 살아있는 세포를 운반하는 생체재료, 즉, 바이오 잉크(bio-ink)는 그 활용도에 있어서 많은 한계점을 나타내고 있다. 바이오 프린팅에 적용되기 위해 요구되는 바이오 잉크의 특성으로는 우수한 생체적합성이 요구되고, 미세구경의 디스펜싱 노즐(dispensing nozzle)을 원활히 통과하여 원하는 패턴으로 프린팅이 될 수 있는 우수한 프린팅성을 가져야 하며, 프린팅 후 세포-특이적 신호를 제공하면서 기계적인 지지체 역할을 유지할 수 있는 구조 안정성을 갖아야 한다는 것 등이다. 비록, 삼차원 바이오 프린팅 분야에서 천연 유래 또는 합성 하이드로겔 바이오 잉크가 개발되어 현재 사용되고 있지만, 이러한 기존 하이드로겔을 바탕으로 한 바이오 잉크는 생체적합성, 프린팅 적합성, 기하학적 정밀성, 정밀도와 같은 물리적 및 생물학적 측면에서 상당한 한계점을 보이고 있다.
본 발명자는 선행연구를 통해 특정한 함량의 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 공개한 바 있다(한국공개특허 제10-2017-0012099). 이를 통해, 전술한 종래기술의 문제점 중 일부가 해결되는 성과를 얻을 수 있었지만 손상된 조직 및 장기를 대체 또는 치료하기 위한 목적인 조직공학에는 적합하지 않은 구조 안정성, 정교한 생체조직을 모사하기 위한 프린팅 정밀성 등에서 여전히 한계점이 있다는 것을 발견하고 이를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭하였다. 이에, 종래 바이오 잉크 조성물에서 세포 운반물질로 소장점막하조직(small intestine submucosa, SIS) 유도체를 특정 함량 이상으로 포함할 경우 놀라울 정도로 향상된 구조 안정성 및 프린팅 정밀성을 갖는 바이오 잉크를 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하는 바이오 잉크 조성물에 있어서, 상기 세포 운반물질은 소장점막하조직(small intestinal submucosa, SIS) 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계; (b) 목적하는 조직 유사기관을 삼차원 프린팅 하는 단계; 및 (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사기관 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 방법에 따라 제조된 조직 유사기관(organoid)을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하는 바이오 잉크 조성물에 있어서, 상기 세포 운반물질은 소장점막하조직(small intestinal submucosa, SIS) 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계; (b) 목적하는 조직 유사기관을 삼차원 프린팅 하는 단계; 및 (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사기관 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 방법에 따라 제조된 조직 유사기관(organoid)을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하는 바이오 잉크 조성물에 있어서, 상기 세포 운반물질은 소장점막하조직(small intestinal submucosa, SIS) 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 세포 운반물질은 바이오 프린팅된 구조체 내에서 세포가 생존하기에 적합한 환경을 제공할 수 있는 물질로서, 생체적합성을 나타내어야 함은 물론이며 바이오 프린팅된 이후에 구조체에 안정성을 부여할 수 있는 적절한 물리적 강성 또한 나타내어야 한다. 본 발명의 바이오 잉크 조성물에서는 상기 세포 운반물질로서 소장점막하조직 및/또는 이의 유도체를 포함하는 것을 발명의 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 세포 운반물질로 젤라틴만을 사용한 종래 바이오 잉크 조성물과 비교하여, 세포 운반물질로서 소장점막하조직을 포함하는 본 발명의 조성물의 경우 프린팅 후 구조 안정성이 현저히 우수하고, 보다 정밀한 프린팅성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 상기 소장점막하조직은 세포가 존재하지 않는 조직으로 면역반응이 거의 일어나지 않으며 90% 이상이 피부에 있는 콜라겐 Ⅰ, Ⅱ 형으로 구성되어 있고 그 외에는 소량의 콜라겐 Ⅴ, Ⅵ형 등이 존재한다. 또한 소장점막하조직은 세포외기질(ECM)로서 글리코스아미노글리칸 및 피브로넥틴, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 하이아루론산과 염기성 섬유아세포 성장인자-2 (base fibroblast growth factor - 2; FGF-2), 신경성장인자 (nerve growth factor; NGF), 변환성장인자-β (transforming growth factor-β; TGF-β), 상피세포 성장인자 (epidermal growth factor; EGF), 혈관 내피세포 성장인자 (vascular endothelial growth factor; VEGF) 및 인슐린 성장인자 (insulin-like growth factor-1; IGF-1) 등의 다양한 사이토카인을 다량 함유하고 있다. 이와 같이 소장점막하조직 내에는 ECM 및 사이토카인이 존재하기 때문에 세포의 점착이나 성장, 이동, 분화 등의 세포의 기능적인 면에 도움을 줌으로써 조직 재생 이외에도 많은 분야에 응용이 되고 있다.
본 발명에서 상기 소장점막하조직은 인간을 제외한 포유류로부터 얻어진 것이라면 제한없이 이용이 될 수 있으며, 바람직하게는 돼지 소장점막하조직을 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 소장점막하조직은 당업계에서 이용되고 있는 제조방법에 따라 제조된 것이라면 제한없이 이용될 수 있으며, 예를 들면 한국등록특허 제1288088호, 한국공개특허 제20060100430호, 한국등록특허 제1364591호 등을 참조하여 분말화한 것을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 소장점막하조직은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다:
(1) 소장점막하조직을 산성 용액 및 펩신과 혼합하여 소장점막하조직 용액을 제조하는 단계; (2) 상기 (1)에서 얻어진 용액을 염기성 용액을 이용하여 생체 적합성 pH로 조절하는 단계; 및 (3) 상기 (2)에서 얻어진 용액을 동결건조하여 분말화하는 단계.
상기 산성 용액은 pH 2.5 ~ 4.5로 조절할 수 있는 용액이면 가능하고, 바람직하게는 아세트산, 파라톨루엔설포닌산 및 말레인산 중에서 선택된 산을 1 ∼ 5 중량% 농도로 포함된 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 염기성 용액은 산성을 적정시켜주고, 조직공학용 지지체로써 사용되어 질 때 주변의 세포들의 염증반응을 줄이기 위하여 사용되며, 예를 들어 수산화나트륨(NaOH), 탄산나트륨(Na2CO3), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 탄산수소칼슘(Ca(HCO3)2), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화질산칼슘(Ca(OH)NO3), 수산화염화칼슘(Ca(OH)Cl), 수산화시안칼슘(Ca(OH)CN), 수산화칼륨(KOH), 수산화암모늄(NH4OH) 및 아세트산나트륨(CH3COONa) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 이러한 염기성 용액을 적정시켜 pH 5.5 ~ 7.8의 생체내 pH와 유사하게 조절한다.
한편, 상기 (1) 단계 이전에 (a) 인간을 제외한 포유류로부터 수득한 소장점막하조직에서 장간 막, 점막층 및 근육층을 제거하는 전처리 단계; 및 (b) 상기 전처리된 소장점막하조직을 동결건조 후 분쇄하여 분말화하는 단계를 포함하는 소장점막하조직 전처리 단계를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 소장점막하조직 유도체란 화학적 변형을 통하여 가교할 수 있도록 변형된 형태의 소장점막하조직을 의미하는 것으로서, 가교제 또는 광학개시제 등을 통하여 가교반응이 유도될 수 있는 유도체라면 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 메타크릴화 소장점막하조직(methacrylated SIS), 아크릴화 소장점막하조직(acrylated SIS) 또는 사이올화 소장점막하조직(thiolated SIS)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 메타크릴화 소장점막하조직(methacrylated SIS)일 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 세포 운반물질은 소장점막하조직 또는 이의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하지만, 바람직하게는 상기 세포 운반물질은 소장점막하조직 유도체를 30 내지 100 w/w%, 더 바람직하게는 50 내지 100 w/w%, 더 바람직하게는 70 내지 100 w/w%, 가장 바람직하게는 100 w/w%로 포함할 수 있다.
상기 세포 운반물질에 소장점막하조직 유도체가 30% 미만으로 포함이 되는 경우에는 바이오 잉크 조성물로 프린팅된 구조체의 구조 안정성이 낮아질 수 있다는 점에서 바람직하지 않다.
본 발명에서 상기 세포 운반물질에는 상기 소장점막하조직 및/또는 소장점막하조직 유도체 이외에 균일한 세포 현탁액의 제조 및 우수한 프린팅 경향성을 나타내는데 적합한 것을 선택할 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 아가(agar), 아가로스, 플루로닉(pluronic) 및 폴리비닐알콜로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 점성 증강제는 우수한 프린팅 경향성 및 바이오 잉크의 초기 강성(strength)을 유지하는데 적합한 것을 선택할 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 히알루론산 또는 덱스트란일 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 윤활제는 전단률(shear rate)을 최소화 할 수 있고, 분배 속도(dispensing speed)를 개선할 수 있는 물질 중에서 선택되는 것이 바람직하며, 이의 비제한적인 예시로는 글리세롤을 들 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 구조물질은 빠른 가교결합의 형성 및 기계적 강성을 유지할 수 있는 물질로부터 선택되는 것이 바람직하며, 이의 비제한적인 예시로는 피브리노겐, 화학적으로 가교할 수 있도록 변형된 히알루론산 (예, 메타아크릴레이티드 히알루론산, 사이올레이티드 히알루론산, 등), 화학적으로 가교할 수 있도록 변형된 젤라틴 (예, 젤라틴 메타아크릴레이티드, 사이올레이티드 젤라틴, 등), 콜라겐, 알기네이트, 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 합성펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜 기초의 하이드로겔로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 피브리노겐은 겔의 안정성 측면에서 구조물질로서 적합할 뿐만 아니라, 세포가 프린팅된 이후에 세포의 부착 및 분화에 적합한 미세환경을 조성한다는 점에서 바람직한 구조물질로 선택될 수 있다. 히알루론산과 글리세롤은 각각 삼차원적 바이오 프린팅 적용시 분배 균일성(dispensing uniformity) 및 노즐의 막힘 방지효과 측면에서 본 발명의 조성물에 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 세포 운반물질은 0.01-10 w/v% , 0.05- 10 w/v%, 0.5-10 w/v%, 1-10 w/v%, 1.5-10 w/v%, 2-10 w/v%, 0.1-8 w/v%, 0.5-8 w/v%, 1-8 w/v%, 2-8 w/v%, 0.1-6 w/v%, 0.5-6 w/v%, 1-6 w/v%, 2-6 w/v%, 0.1-5 w/v%, 0.5-5 w/v%, 1-5 w/v% 또는 2-5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 2-4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 점성 증강제는 0.01-1 w/v%, 0.05-1 w/v%, 0.1-1 w/v%, 0.2-1 w/v%, 0.01-0.8 w/v%, 0.05-0.8 w/v%, 0.1-0.8 w/v%, 0.2-0.8 w/v%, 0.01-0.5 w/v%, 0.05-0.5 w/v% 또는 0.1-0.5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.2-0.4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 윤활제는 0.1-30 w/v%, 1-30 w/v%, 5-30 w/v%, 10-30 w/v%, 0.1-20 w/v%, 1-20 w/v%, 5-20 w/v%, 10-20 w/v%, 0.1-15 w/v%, 1-15 w/v%, 5-15 w/v% 또는 10-15 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 10-13 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 구조물질은 0.1-10 w/v%, 0.5-10 w/v%, 1-10 w/v%, 0.1-8 w/v%, 0.5-8 w/v%, 1-8 w/v%, 0.1-5 w/v%, 0.5-5 w/v% 또는 1-5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1-3 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발명자들은 삼차원적 바이오 프린팅에 적용되기에 적합한 물리적 및 생물학적 특성을 나타내는 바이오 잉크 조성물을 개발하기 위해 다양한 조합의 구성을 갖는 조성물의 물리적 및 생물학적 특성을 테스트하여 본 결과, 상기 조합 및 상기 함량의 구성성분의 조합으로 이루어진 바이오 잉크 조성물이 높은 구조 안정성, 우수한 프린팅 성능 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내어 조직 유사기관의 제조를 위한 삼차원적 바이오 프린팅에 특히 적합하다는 것을 발견하였다.
한편, 본 발명의 상기 바이오 잉크 조성물은 세포 0.05-60×106/mL을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포는 바람직하게는, 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 상기 세포 및 바이오 프린팅된 조직 유사 구조체 내에 포함된 세포는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 및 조직 배양 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures;Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 일반적인 포유동물 세포 배양 기술, 세포주, 및 본 발명과 함께 사용될 수 있는 세포 배양 시스템이 또한 문헌[Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다.
세포는 또한 원하는 세포주를 따라 세포의 분화를 유도하는 세포 분화 물질과 배양될 수도 있다. 예를 들면, 줄기세포는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 됨으로써 일정 범위의 세포 유형을 생성한다. 다수 유형의 분화 배지가 적당하다. 상기 줄기 세포는 비제한적 예로서 골원성(osteogenic) 분화 배지, 연골원성(chondrogenic) 분화 배지, 지방생성(adipogenic) 분화 배지, 신경 분화 배지, 심근세포 분화 배지, 및 장세포 분화 배지(예, 장표피)를 포함하는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 될 수 있다.
추가적으로, 세포는 성장인자, 사이토카인 등과 함께 배양될 수 있다. "성장인자"는 세포에 의해 생성되고 그 자체 및/또는 여러 가지의 다른 인접한 또는 동떨어진 세포에게 영향을 줄 수 있는, 사이토카인을 포함하는 단백질, 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 복합체를 지칭한다. 통상, 성장인자는 발생적으로 또는 다수의 생화학적인 또는 환경적인 자극에 반응하여 특정 유형의 세포의 성장 및/또는 분화에 영향을 미친다. 일부의 성장인자는 호르몬이다. 예시적 성장인자는 인슐린, 인슐린 유사 성장인자(IGF), 신경 성장인자(NGF), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 케라티노사이트 성장인자(KGF), 기본 FGF(bFGF)를 포함하는 섬유아세포 성장인자(FGF), PDGF-AA 및 PDGF-AB를 포함하는 혈소판 유래 성장인자(PDGF), BMP-2 및 BMP-7등을 포함하는 뼈형성단백질(BMP), 간세포 성장인자(HGF), 형질전환 성장인자 알파(TGF-α), TGFβ1 및 TGFβ3을 포함하는 형질전환 성장인자 베타(TGF-β), 표피 성장인자(EGF), 과립구-대식세포 콜로니-자극인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니-자극인자(G-CSF), 인터류킨-6(IL-6), IL-8 등이 있다. 당업자는 본 발명에 기술된 조건화 배지에서의 임의의 배양물 및 모든 배양물 유래 성장 인자가 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 이해할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포는 삼차원적 바이오프린터로부터 바이오 잉크를 침착 또는 압출시킴으로써 바이오 프린팅될 수 있다. 본 발명의 바이오 잉크는 복수의 세포를 포함하는 액체, 반고체, 또는 고체 조성물의 형태일 수 있다. 바이오 잉크는 액체 또는 반고체 세포 용액, 세포 현탁액, 또는 세포 농축물을 포함한다. 상기 바이오 잉크 조성물은 1) 복수의 세포 또는 세포 응집체와 생체적합성 액체 또는 겔을 소정의 비율에서 혼합하여 바이오잉크를 제조하는 단계, 및 2) 바이오 잉크를 치밀화하여 원하는 세포 밀도 및 점도를 갖는 바이오 잉크를 제조하는 단계 등에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 바이오 잉크의 치밀화는 원심분리, 접선류 여과("TFF"), 또는 이의 조합에 의해 실현되며 바이오 잉크의 치밀화는 압출가능한 조성물을 제조하여 다세포 응집체 또는 다세포체를 형성한다. 상기 "압출가능한"이란 노즐(nozzle) 또는 오리피스(예, 하나 이상의 구멍 또는 튜브)를 (예를 들어, 압력 하에서) 통과시킴으로써 성형될 수 있는 것을 의미한다. 또한 바이오 잉크의 치밀화는 적당한 밀도로 세포를 성장시키는 것으로부터 유도된다. 바이오 잉크에 필요한 세포 밀도는 사용할 세포 및 제조할 조직 또는 장기에 따라 달라진다.
본 발명은 또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 조직유래 성분이 추가로 포함될 수 있다.
조직유래 성분은 연골, 신장, 심장, 간, 근육 등과 같은 동물의 특정조직이 탈세포화 되고 세포외기질을 주성분으로 하는 물질의 겔(gel)화 된 것을 의미하며, 이는 바이오 잉크 조성물의 조직특이성을 강화하기 위하여 포함될 수 있다.
바이오 잉크 조성물에 포함된 세포가 삼차원 프린팅된 조직 유사기관 내에서 정상적으로 성장, 분화하기 위해서는 신체 내 원 조직의 미세환경(microenvironment)과 유사한 자연적인 환경을 조성할 필요가 있다. 인위적으로 생성된 어떠한 조성물도 세포외기질(extracellular matrix)과 같은 자연적인 조직유래 성분이 갖고 있는 특성을 모두 재연하는 것이 사실상 불가능하며, 따라서 탈세포화된 조직유래 성분을 바이오 잉크 조성물에 추가함으로써, 세포가 정상적으로 성장하고 분화할 수 있는 미세환경을 조성해 줄 수 있다.
탈세포화된 조직유래 성분은 인체 내에서 세포와의 상호작용을 통해 조성된 각각의 조직 특화된 구성성분 및 위상을 갖고 있기 때문에, 세포의 성장 및 분화에 유리한 환경을 제공하여 줄 수 있다. 따라서, 본 발명의 바이오 잉크 조성물에 조직유래 성분을 추가함으로써, 세포가 정상적인 형태를 유지하며 그 기능을 원활히 보존할 수 있도록 할 수 있다.
본 발명에서의 상기 조직유래 성분을 얻을 수 있는 조직은 특별히 제한되지 않으며, 제조하고자 하는 조직 유사기관에 따라 선택하여 탈세포화한 후 겔(gel)화 하여 사용할 수 있다. 조직을 탈세포화 하는 방법 및 겔(gel)화 하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자가 용이하게 선택하여 실시할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 분화조절 물질이 추가로 포함될 수 있다.
분화조절 물질은 바이오 잉크 조성물에 포함된 줄기세포(배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 성체줄기세포를 포함하는)가 특정 세포로 분화되는 것을 유도하기 위해 포함될 수 있으며, 이에 대한 비제한적인 예시로는 바이오 프린팅된 줄기세포를 골세포로 분화 유도할 때 뼈형성단백질-2(BMP-2)나 연골세포로 분화할 때 TGF-beta3 와 같은 성장인자, 골세포로 분화할 때 덱사메타손이나 근육세포로 분화할 때 5-아자시티딘(5-azacytidine) 과 같은 화학물질을 예로 할 수 있다. 이 외에도 추가적으로 사이토카인, 펩타이드 및 저분자 화학물질 등이 포함될 수 있다. 이와 같은 예에서 보듯이 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 줄기세포를 특정한 조직세포로 분화할 수 있도록 유도할 수 있는 성장인자, 사이토카인, 펩타이드 및 저분자 화학물질 등을 함유하여 바이오프린팅 후에 제조된 줄기세포를 포함한 조직유사 구조체를 특정조직으로 분화가 되도록 유도할 수 있는 기능성 바이오 잉크로 활용될 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 바이오 잉크 조성물은 세포 배양 배지를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 목적하는 세포에 적합한 임의의 배지를 포함하는 개념이며, 세포 배양 배지의 비제한적인 예시로는 둘베코 인산 완충 식염수, 얼 균형화 염, 행크 균형화 염, 티로드 염, 알시버 용액, 게이 균형화 염 용액, 크랩-헨젤라이트 변성 완충제, 크랩-링거 중탄산 완충제, 퍽 식염수, 둘베코 변성 이글 배지, 둘베코 변성 이글 배지/영양소 F-12 Ham, 영양소 혼합물 F-10Ham(Ham's F-10), 배지 199, 이글 최소 필수 배지, RPMI-1640 배지, 에임즈 배지, BGJb 배지(Fitton-JacksonModification), 클릭 배지, CMRL-1066 배지, 피셔 배지, 글라스코우 최소 필수 배지(GMEM), 이스코브 변성 둘베코 배지(IMDM), L-15 배지(Leibovitz), 맥코이 5A 변성 배지, NCTC 배지, 스윔 S-77 배지, 웨이마우스 배지,윌리엄 배지 E, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 세포 배양 배지는 알부민, 셀레늄, 트랜스페린, 페투인, 슈가, 아미노산, 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항생물질, 지질, 지질 담체, 시클로덱스트린, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 바이오 잉크 조성물은 세포 접착을 촉진하는 물질 및/또는 산화방지제를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 세포사(예, 괴사, 세포사멸, 또는 자율흡수작용)를 억제하는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 세포사를 억제하는 물질의 비제한적 예로서, 소분자, 항체, 펩티드, 펩티바디, 항-TNF 물질, 인터류킨의 활성을 억제하는 물질, 인터페론의 활성을 억제하는 물질, GCSF(과립구 콜로니-자극 인자)의 활성을 억제하는 물질, 대식세포 염증성 단백질의 활성을 억제하는 물질, TGF-B(형질전환 성장 인자 B)의 활성을 억제하는 물질, MMP(매트릭스 메탈로프로티나제)의 활성을 억제하는 물질, 카스페이스의 활성을 억제하는 물질, MAPK/JNK 신호전달 캐스케이드의 활성을 억제하는 물질, Src 키나아제의 활성을 억제하는 물질, JAK(야누스 키나아제)의 활성을 억제하는 물질, 또는 이의 조합으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 구성성분의 가교결합을 촉진하기 위한 가교제 또는 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 가교제는 통상적인 하이드로겔 조성물에 사용되는 다가 금속이온을 포함하는 화합물일 수 있다. 다가 금속이온 화합물은 알루미늄 화합물, 칼슘 화합물 및 마그네슘 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 수산화알루미늄, 함수규산알루미늄, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화알루미늄, 메타규산알루미늄산마그네슘, 아세트산알루미늄 및 규산알루미늄산마그네슘으로 구성되는 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다
상기 광학개시제는 빛에 노출됨에 따라 신속한 가교결합을 유발하는 물질을 의미한다. 본 발명에서 상기 광학개시제의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 자외선(UV)의 조사에 의해 가교반응이 일어나는 광학개시제 또는 가시광선의 조사에 의해 가교반응이 일어나는 광학개시제가 사용이 될 수 있다. 적절한 광학개시제의 비제한적인 예시로는, 아세토페논, 벤조인 메틸 에티르, 디에톡시아세토페논, 벤조일 포스핀 옥사이드 및 1-히드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 에오신 등을 들 수 있다. 첨가되는 광학개시제의 양은 노출되는 빛의 파장 및 시간에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 삼차원 바이오 프린터에 충전하는 단계; (b) 목적하는 조직 유사기관을 삼차원 프린팅 하는 단계; 및 (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사기관 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 제공되는 바이오 잉크 조성물은 다양한 조직 유사기관의 제조에 용이하다. 바이오 프린팅 기술은 조직 유사기관을 제조하기 위한 유용한 도구로서 당업계에서 발전되고 있다. 한편, 바이오 프린팅에 사용되기 위한 종래의 바이오 잉크 조성물들은 액상 형태이기 때문에 충분한 물리적 강성을 갖기가 힘들거나, 또는 지나치게 물리적 강성이 강하여 프린팅 과정에서 세포의 생존이 충분히 보장되지 않는다는 문제점이 있었다. 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 삼차원적 바이오 프린팅에 적용하여 조직 유사기관을 제조함에 있어서, 충분한 물리적 강성은 유지하고 바이오 프린터에 의해 분사됨에 있어서 세포의 생존이 충분히 보장된다는 장점이 있어 조직 유사기관의 제조에 굉장히 적합한 물리적 및 생물학적 특성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 종래 젤라틴만을 세포 운반물질로 사용한 바이오 잉크 조성물과 비교하여 정교한 프린팅 성능을 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 바이오 잉크 조성물을 바이오 프린터에 적용하여 바이오 프린팅을 한 후 일주일간 배양하여 본 결과, 세포의 증식이 지속적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 노즐에 의해 압출, 분사되는 과정에서 세포의 사멸이 최소화 된다는 점 및 세포의 생존에 유리한 미세환경이 충분히 제공되고 있다는 점을 알 수 있었다.
본 발명에서의 바이오 잉크 조성물은 삼차원적인 구조체의 적층을 가능하게 한다. 충분한 양의 세포가 포함된 본 발명의 바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 적층됨으로써 조직 유사기관을 형성하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서의 "바이오 프린팅"이란 자동화된, 컴퓨터 보조의, 삼차원 시제품화 장치(예, 바이오프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 세포 침착(예, 세포 용액, 세포 함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 다세포체 등)을 이용하는 것을 의미한다.
본 발명에서의 바이오 프린팅 방법은 연속 및/또는 실질적으로 연속이다. 연속 바이오 프린팅 방법의 비제한적 예는 바이오 잉크의 저장소에 연결되는 분사 팁(dispense tip) (예, 주사기, 모세관 등)을 통해 바이오 프린터로부터 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 연속 바이오 프린팅 방법은 기능 단위의 반복 패턴에서 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 상기 반복 기능 단위는 예를 들어 원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형, 및 불규칙 기하구조를 포함하는 임의의 적당한 기하구조를 갖는다. 또한, 바이오 프린팅된 기능 단위의 반복 패턴은 층을 포함하고 복수의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린팅 될 수 있다.(예를 들면, 적층된다). 구체적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린팅 될 수 있다.
바이오 프린팅된 기능 단위는 격자무늬(tessellated) 패턴으로 반복될 수 있다. "격자무늬 패턴"은 중첩되지 않고 갭이 없는 평면을 충전하는 평면 도형이다. 연속 및/또는 격자무늬 바이오프린팅의 이점은 바이오 프린팅된 조직의 증가된 생산성을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적 잠재적 이점은 이전에 침착된 바이오 잉크의 요소와 바이오 프린터를 정렬할 필요를 없앨 수 있다는 것이다. 연속 바이오프린팅은 또한 경우에 따라 시린지 메커니즘을 사용하여 바이오 잉크의 대형 저장소로부터 보다 큰 조직을 인쇄하는 것을 용이하게 할 수 있다.
바이오 프린터로부터 적당한 및/또는 최적의 분사 거리는 재료 편평화 또는 분사 바늘에의 부착화를 생성하지 않는다. 바이오 프린터 분사 팁은 약, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ㎛ 이상 및 이 범위 내의 증분의 내경을 갖는다. 또한, 바이오 프린터의 바이오 잉크 저장소는 약 .5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 입방 센티미터 이상 및 이 범위 내의 증분의 용적을 갖는다. 펌프 속도는 시스템에서의 잔류 압력 상승이 낮을 경우 적당하고/하거나 최적일 수 있다. 양호한 펌프 속도는 저장소의 단면적과 분사 바늘 사이의 비율에 의존할 수 있고, 보다 높은 비율은 보다 낮은 펌프 속도를 필요로 한다.
다양한 종류의 조직 유사기관이 상기한 방법에 의해 생성될 수 있다. 바이오 잉크 조성물을 적층하는 패턴이나 적층 배열은 제조하고자 하는 조직 유사기관의 크기 및 직경 등에 의해 결정될 수 있다. 또한, 조직 유사기관을 제조하기 위해 사용되는 바이오 잉크에 포함되는 세포의 개수는 세포의 종류, 바이오 잉크 조성물에 포함된 세포 영양성분의 함량 등에 따라 조절될 수 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물에 포함되는 세포의 종류는 상기 방법에 따라 제조하고자 하는 조직 유사기관의 종류에 따라 다양하게 변경이 가능하다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자라면, 삼차원 바이오 프린팅을 통해 제조하고자 하는 조직 유사기관의 종류에 따라 적절한 세포를 선택하여 이에 적용할 수 있을 것이다.
바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 분사되어 적층된 이후에는 이를 광(자외선 또는 가시광선)에 노출시키거나 또는 가교 결합용액을 첨가함으로써 바이오 잉크 조성물의 가교결합을 촉진할 수 있다. 이러한 가교결합은 적층된 바이오 잉크 조성물이 보다 단단한 구조물로 완성될 수 있도록 해준다. 한편, 상기 광(자외선 또는 가시광선)은 적층된 바이오 잉크 조성물의 표면에 직접적으로 노출시킬 수 있으며, 예를 들어 광(자외선 또는 가시광선) 발생기로부터 발생된 300 nm 내지 800 nm 의 파장을 이용하여 적층된 바이오 잉크 조성물로부터 1~20 cm 거리에서 1초 내지는 1000초간 노출이 될 수 있고, 또는 20초 내지 500초, 또는 40초 내지 240초간 노출될 수 있다. 이러한 광(자외선 및 가시광선) 노출 거리 및 시간은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 기술자라면, 짧은 거리 및 강한 파장이라면 짧은 시간 동안의 노출로도 충분한 가교결합을 형성할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.
가교결합을 위한 바람직한 광(자외선 또는 가시광선)의 파장은 300 nm 내지 800 nm일 수 있으며, 바람직하게는 자외선의 경우 350 nm 내지 380 nm, 가시광선의 경우 400nm 내지 600nm, 보다 바람직하게는 자외선의 경우 355 nm 내지 375 nm, 가시광선의 경우 400 nm 내지 500 nm, 가장 바람직하게는 자외선의 경우 360 nm 내지 370 nm, 가시광선의 경우 400nm 내지 480nm일 수 있다.
한편 본 발명의 방법은 (d) 상기 조직 유사기관을 배양액에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양 및 배양 배지에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 제조된 체내 이식 가능한 조직 유사기관 또는 조직 구조체를 제공한다.
삼차원 바이오 프린팅 기술은 모양 및 크기 면에서 임상적으로 적용이 가능한 조직 또는 기관 구조물을 제작할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 조직-특이적인 세포 종류 및 삼차원적 구조물에 적용된 바이오 잉크의 조합을 통하여, 세포에 내재된 재생산 능력을 이용할 수 있고, 이를 통해 필요한 조직 또는 장기를 생산해 내는 것이 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물을 이용하여 바이오 프린팅된 조직 구조체들은, 포유류 조직 및 기관과 해부학적으로 및 기능학적으로 유사성을 지닌 구조체를 제공해준다.
본 발명의 조성물을 이용하면 조직 유사기관 또는 체내 이식 가능한 조직의 단일 구조체를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 여러 가지 세포를 동시에 프린팅하여 조직과 조직간의 연계를 재연할 수 있는, 기능성이 현저히 향상된 조직 구조체를 제조할 수도 있다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 높은 점탄성, 강한 구조 안정성, 우수한 프린팅성, 생체적합성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내기 때문에 삼차원적 바이오 프린팅을 이용한 조직 유사기관의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1(도 1a 및 도 1b)은 세포전달물질로 젤라틴, 돼지 소장점막하 조직 및 메타크릴화 돼지 소장점막하조직로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 이용하여 제조된 구조체의 제조 직후 및 7일 경과 후 크기를 비교한 도면이다.
도 2는 세포전달물질로 젤라틴(잉크조성물 1), 돼지 소장점막하조직(잉크조성물 7) 또는 메타크릴화 돼지 소장점막하조직(잉크조성물 9)을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 3차원 바이오 프린터를 이용하여 격자 구조로 프린팅한 후, 제조된 구조체의 크기 변화를 7일간 육안으로 관찰한 결과(도 2A) 및 구조체의 면적을 측정한 결과(도 2B)를 나타낸 도면이다.
도 3은 세포전달물질로 젤라틴(잉크조성물 1), 돼지 소장점막하조직(잉크조성물 7) 또는 메타크릴화 돼지 소장점막하조직(잉크조성물 9)을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 3차원 바이오 프린터를 이용하여 격자 구조로 프린팅한 후, 광 가교를 진행하기 전 레오미터로 점탄성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 세포전달물질로 젤라틴(잉크조성물 1) 또는 메타크릴화 돼지 소장점막하조직(잉크조성물 9)을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 3차원 바이오 프린터를 이용하여 격자 구조로 프린팅한 후, 프린팅된 결과물의 패턴의 균일성을 육안으로 관찰한 결과이다.
도 5는 메타크릴화 돼지 소장점막하조직(잉크조성물 9)을 포함하는 바이오 잉크 조성물에 가시광선영역의 광학개시제(에오신)를 첨가하여 3차원 바이오 프린터로 프린팅하고, 450nm의 가시광선을 조사하여 가교반응을 진행한 후 구조체의 형상을 육안으로 관찰한 결과이다.
도 6은 돼지 소장점막하조직(잉크조성물 7) 또는 메타크릴화 돼지 소장점막하조직(잉크조성물 9)을 포함하는 바이오 잉크 조성물에 C2C12 myoblast 세포주를 첨가한 후, 3차원 바이오 프린터를 이용하여 프린팅한 구조물 내 세포의 증식성을 형광현미경으로 관찰하고(도 5A), 이를 정량화하여 나타낸 결과(도 5B)이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험준비
1. 세포배양
본 발명에서는 바이오 잉크 조성물을 평가하기 위해 C2C12 근육세포주(ATCC)를 사용하였으며, 이를 10% FBS와 1% 페티실린/스트렙토마이신이 함유된 고포도당 DMEM 배양액으로 배양하였다.
2. 돼지 소장점막하조직(small intestinal submucosa, SIS) 분리 및 보관
사후 4시간 이내의 6개월령 미만의 돼지의 공장을 추출하여 지방조직을 우선 제거하고, 물로 깨끗이 공장 안과 밖을 세척한 다음, 공장을 대략 10cm 정도의 길이로 잘라 다시 식염수에 넣고 세척하였다. 물리적 힘을 가해서 공장의 바깥층에 있는 치밀층을 제거하고 다시 뒤집어서 점막 근육층을 제거하여 소장점막하조직 층만을 분리하였다. 이를 식염수로 세척하고 난 후 -80 ℃ 급저온 냉각기에 보관하였다.
3. 돼지 소장점막하조직 분말의 제조
상기 과정을 거쳐 -80 ℃에서 보관된 돼지 소장점막하조직을 시트형태로 동결건조 후, 동결분쇄기(6750, SPEX Inc., USA)를 이용하여 10~30 ㎛ 크기의 분말로 제조하였다.
4. 생체적합성 돼지 소장점막하조직 분말의 제조
상기 제조된 분말 형태의 돼지 소장점막하조직을 3%의 아세트산, 0.1%의 펩신 및 3차 증류수를 이용하여 상온에서 48시간 동안 교반시켜 주었다. 이후에 형성된 돼지소장점막하 용액의 pH를 5N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 7.4로 조절하였다. pH를 조절한 상기 용액을 4 ℃에서 24시간 동안 투석하고 난 후 동결건조를 진행하였고, 그 후 동결분쇄기를 이용해 분쇄시켜 최종 생체적합성 돼지 소장점막하조직 분말을 얻었다.
5. 소장점막하조직 유도체의 제조 (메타크릴화 소장점막하조직)
상기 제조된 분말형태의 생체적합성 돼지 소장점막하조직 분말을 카보네이트-바이카보네이트 용매에 희석시킨 후 메타크릴 무수물을 가하여 24시간 동안 교반시켜 주었다. 28 ℃에서 72시간 동안 투석하고 난 후 동결건조를 진행하였고, 그 후 동결분쇄기를 이용해 분쇄시켜 소장점막하조직 유도체 분말을 얻었다.
<실시예 1>
바이오 잉크 조성물의 제조
본 발명에서는 하기 구성성분들을 하기 표 1에 기재된 비율에 따라 혼합하고, 37 ℃에서 DMEM 배지에 하루 동안 교반하여 균질화 하였다. 완전히 혼합되어 용해된 바이오 잉크 조성물을 UV를 이용하여 멸균하였다:
(1) 세포운반물질: 세포가 균일하게 혼합된 형태로 프린팅이 수행될 수 있도록 충분한 점도를 가지며 온도에 민감한 돼지 소장점막하조직(SIS) 및/또는 메타크릴화(methacrylated) 돼지 소장점막하 조직(SIS-MA)을 이용하였으며, 대조군으로 젤라틴을 사용하였다.
(2) 점성증강제: 프린팅시 바이오 잉크의 점도를 강화하고 패턴의 균일성을 향상시킬 수 있도록 점성증강제로 히알루론산을 사용하였다.
(3) 윤활제: 노즐 막힘 현상을 줄이기 위한 윤활제로 글리세롤을 사용하였다.
(4) 구조물질: 프린팅 후 가교에 의해 구조 안정성을 제공하는 구조물질로서 메타크릴화 젤라틴(methacrylated gelatin)을 사용하였다.
(5) 광학개시제 : 프린팅 후 가교를 이루어지도록 제공하는 물질로서 1%(w/v) 메틸프로피오페논 또는 에오신을 사용하였다.
Figure pat00001
<실시예 2>
잉크조성물의 구조 안정성 평가
상기 실시예 1에서 제조한 잉크조성물의 구조 안정성을 평가하고자 24웰 플레이트에 각 웰당 상기 각각의 잉크조성물 1ml를 5ml 주사기를 이용하여 충전하고 365 nm의 자외선에 60초간 노출하여 가교반응을 진행하여 구조체를 제작하였다.
제작 직후 구조체의 상부에 무게 80g의 추를 올려놓고 형태가 정상적으로 유지 되는지 여부를 관찰하여 잉크 조성물의 무름성을 평가하였다.
또한, 구조체 제작 후 이를 세포 배양액에 담가서 37℃에서 7일간 인큐베이션 한 후 구조체의 지름 변화를 관찰하여 안정성을 평가하였다.
이에 대한 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다. 하기 표 2에서 지름 크기변화(%)는 구조체 제작 직후(Day 0)의 지름 대비, 7일 경과 후(Day 7) 구조체의 지름의 길이 비율로 나타내었다.
Figure pat00002
<7일 경과 후 지름 비율>
◎: 86~90%, ○: 81~85%, △: 76~80%, □: 71~75%, ▣: 70% 이하
<프린팅된 구조체 무름성>
◎: 형태 변화가 전혀 없음(매우 양호),
○: 형태 변화가 거의 없음(양호)
△: 형태 변화가 약간 있음(보통)
□: 형태 변화가 확연함(불량),
▣: 형태 변화가 매우 심함(매우 불량)
도 1과 표 2 에 나타낸 바와 같이, 세포운반물질로 젤라틴만이 포함된 잉크조성물 1의 경우 7일 경과 후 지름의 크기 변화가 큰 것으로 나타나 상대적으로 구조 안정성이 약한 것을 알 수 있었다. 한편, 세포운반물질로 젤라틴과 SIS를 병용한 잉크조성물 2 내지 4 및 SIS만을 사용한 잉크조성물 5의 경우 7일 경과 후 지름의 크기변화가 현저히 향상 되었으나, 구조체의 무름성이 지나치게 커서 약한 압력에도 형태변화가 매우 큰 것으로 확인되었다. 다른 한편, 세포운반물질로 SIS-MA가 15mg/mL 이상 포함된 잉크조성물 7 내지 9 및 11의 경우, 지름의 크기변화가 매우 적고, 프린팅된 구조체의 무름성 또한 보통 이상인 것으로 나타나 구조 안정성이 다른 조성물과 비교해 우수한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 세포운반물질로 SIS-MA만이 30mg/mL로 포함된 잉크조성물 9의 경우, 지름 크기변화와 무름평 평가에서 가장 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 바이오잉크의 구성성분인 세포운반물질로서 SIS-MA를 사용하는 것이 젤라틴을 사용하는 것보다 제조된 구조체의 안정성 측면에서 더 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실험을 통해 구조 안정성이 우수한 것으로 확인된 잉크조성물 7 및 9를 선별하여 이하 실험을 진행하였으며, 그 효과를 비교하기 위하여 세포운반물질로 젤라틴만이 사용된 잉크조성물 1을 대조군으로 이용하였다.
<실시예 3>
3차원 프린터로 프린팅된 구조물의 안정성 평가
상기 실시예 1에서 제조된 바이오잉크를 3차원 프린터를 이용하여 프린팅하였을 때, 제조된 구조물의 안정성을 평가해 보고자 하였다. 구체적으로, 상기 각 잉크조성물을 바이오 프린터에 충전한 후, 압출량 250% (50-80 kPa)의 압력으로 300 ㎛ 구경의 노즐을 통해 격자 모양의 구조체로 프린팅 하였다. 바이오 프린팅된 상기 구조체를 365nm의 자외선에 60초간 노출하여 가교반응을 진행하였다. 이를 세포 배양액에 담가서 37℃에서 28일간 인큐베이션 한 후 구조체의 크기 변화를 관찰하여 안정성을 평가하였다.
본 실험에 사용된 바이오 프린터는 3축으로 움직이며, 바이오 잉크를 충전하는 주사형 저장소, 압출형태로 사출이 가능한 디스펜싱 모듈 및 노즐로 구성되어 있다.
이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 잉크조성물 7로 제조한 격자 형태의 구조체(세포운반물질로 SIS와 SIS-MA를 1:1로 사용한 구조체)와 잉크조성물 9로 제조한 격자 형태의 구조체(세포운반물질로 SIS-MA를 사용한 구조체)의 경우에는, 모두 제조 직후의 구조체 대비 28일 경과 후에도 80% 이상의 크기를 유지하고 있어 구조안정성이 매우 우수하다는 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다. 반면에, 잉크조성물 7로 제조한 격자 형태의 구조체(세포운반물질로 젤라틴을 사용한 구조체)의 경우에는 제조 직후부터 크기가 급격하게 줄어들기 시작하여 제조 직후의 구조체 대비 28일 경과 후에는 크기가 60% 미만으로 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
바이오 잉크조성물에 의한 프린팅성 평가
본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물의 프린팅성을 평가하기 위해, 광 가교를 진행하기 전 잉크조성물 1, 잉크조성물 7 및 잉크조성물 9를 각 200uL씩 사용하여 온도제어 시스템이 장착되어 있는 레오미터(MCR 102, Anton Paar, Ostfildern, Germany)로 25℃에서 점탄성을 측정하였다.
이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 잉크조성물 1로 프린팅한 구조체에 비해 잉크조성물 7 및 9로 프린팅한 구조체의 탄성과 점성이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다. 이는 프린팅 진행시 SIS-MA를 세포운반물질로 사용한 경우 젤라틴을 세포운반물질로 사용한 경우에 비해 프린팅성이 더 우수하다는 것을 의미한다.
한편, 상기 실시예 3에서 사용한 3차원 바이오 프린터를 이용하여 하기 표 3에 기재된 프린팅 조건 하에서 각 바이오 잉크조성물을 프린팅하여 가로 10mm, 세로 10mm, 높이 2mm 및 채움밀도 20%의 사각 출력물을 제조한 후, 프린팅 패턴 및 토출량의 균일성을 확인해 보고자 하였다.
Figure pat00003
이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 잉크조성물 1을 사용하여 프린팅된 삼차원 구조체는 바이오잉크 토출의 불안정함으로 인해 패턴이 고르지 않아, 잉크조성물의 적층이 균일하게 이루어지지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 잉크조성물 9를 사용하여 프린팅된 삼차원 구조체는 개선된 바이오잉크 토출성과 그에 따른 적층성으로 형태가 양호한 출력물이 제조가 되는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5>
가사광선영역의 광학개시제를 사용한 바이오잉크의 프린팅성
본 발명에 따른 바이오잉크 조성물 9에 가시광선 영역의 광학개시제인 에오신을 혼합한 후 상기 실시예 3에서 사용한 3차원 바이오 프린터를 이용하여 하기 표 4에 기재된 프린팅 조건 하에서 바이오 잉크조성물 9를 프린팅하여 가로 10mm, 세로 10mm, 높이 2mm 및 채움밀도 20%의 사각 출력물을 제조하였다. 바이오 프린팅된 상기 구조체를 450 nm에 180초간 노출하여 가교반응을 진행하였다.
도 5에서 확인 할 수 있는 바와 같이 토출성과 적층성이 양호한 출력물이 제조되었다.
Figure pat00004
<실시예 6>
바이오 잉크조성물 내 세포 증식성 평가
본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물로 프린팅 된 구조체 내에서의 세포 증식성을 평가하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 잉크조성물에 3 × 106 cells/mL 의 C2C12세포를 혼합한 후 바이오 프린터에 충전하였다. 이후 70 kPa의 압력으로 300㎛ 구경의 노즐을 통과시켜 패턴을 형성하며 삼차원적 구조체를 프린팅하였다. Live/Dead assay kit(Life Technologies) 사용하여 세포가 포함된 상기 삼차원 구조체 내에서의 세포 증식 정도를 7일간 평가하였다.
구체적으로, 0.5 uL/ml Calcein-AM과 2 uL/mL Eth-D가 용해되어 있는 인산완충액(PBS, Life technologies)을 세포와 함께 프린트된 바이오 잉크 구조체에 노출시켰다. 2시간 뒤 형광현미경으로 관찰하여 녹색 형광(calcein)을 띄는 세포, 즉 살아있는 세포 수를 확인하였다(40 배율에서 사진 찍은 후 초점이 잘 맞는 부분을 동일 구로 잘라 구획 안에 있는 모든 세포를 카운팅함).
이에 대한 결과를 도 6 및 하기 표 5에 나타내었다.
Figure pat00005
도 6 및 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바이오 프린팅된 삼차원 구조체 내 대부분의 세포에서 녹색 형광이 관찰되었으며, 이는 살아있는 세포를 나타낸다. 이는 곧 SIS 또는 SIS-MA를 세포전달물질로 포함하는 본원발명의 바이오 잉크 조성물은 세포 증식에 적합한 환경을 제공할 뿐만 아니라, 바이오 프린터의 노즐을 통과하는 동안 세포가 정상적을 보존이 되어 프린팅된 구조체 내에서 세포가 잘 증식할 수 있다는 것을 보여준다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 높은 점탄성, 강한 구조 안정성, 우수한 프린팅성, 생체적합성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내기 때문에 삼차원적 바이오 프린팅을 이용한 조직 유사기관의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims (14)

  1. 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하는 바이오 잉크 조성물에 있어서, 상기 세포 운반물질은 소장점막하조직(small intestinal submucosa, SIS) 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소장점막하조직은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물:
    (1) 소장점막하조직을 산성 용액 및 펩신과 혼합하여 소장점막하조직 용액을 제조하는 단계;
    (2) 상기 (1)에서 얻어진 용액을 염기성 용액을 이용하여 생체 적합성 pH로 조절하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)에서 얻어진 용액을 동결건조하여 파우더로 제조하는 단계.
  3. 제1항에 있어서, 상기 소장점막하조직 유도체는 메타크릴화 소장점막하조직(methacrylated SIS), 아크릴화 소장점막하조직(acrylated SIS) 또는 사이올화 소장점막하조직(thiolated SIS)인 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반물질은 30 내지 100 w/w%의 소장점막하조직 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포 운반물질이 0.1-10 w/v%, 점성 증강제가 0.01-1 w/v%, 윤활제가 1-30 w/v% 및 구조물질이 0.1-10 w/v% 포함된 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 세포 0.05-60×106/mL이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 조직유래 성분이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 분화조절 물질이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 점성 증강제는 히알루론산 또는 덱스트란, 상기 윤활제는 글리세롤 및 상기 구조물질은 피브리노겐 또는 메타크릴화 젤라틴인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  12. (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계;
    (b) 목적하는 조직 유사기관을 삼차원 프린팅 하는 단계; 및
    (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사기관 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, (d) 상기 조직 유사기관을 배양액에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  14. 제12항의 방법에 따라 제조된 조직 유사기관(organoid).
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