KR20210156009A

KR20210156009A - 바이오 잉크 제조를 위한 조직 분쇄기 및 이를 이용하여 제조된 바이오 잉크

Info

Publication number: KR20210156009A
Application number: KR1020200073641A
Authority: KR
Inventors: 강현욱; 정원우
Original assignee: 울산과학기술원
Priority date: 2020-06-17
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2021-12-24
Also published as: KR102422646B1

Abstract

본 발명은 바이오 잉크 제조를 위한 조직 분쇄기 및 이를 이용하여 제조된 바이오 잉크에 관한 것으로, 구체적으로 내부에 유체 경로를 포함하는 본체; 일단부는 상기 유체 경로에 연결되고, 상기 유체 경로의 양 말단에 위치하는 유체 유입구;및 소정의 간격으로 이격되어 상기 유체 경로 내부 원주면으로부터 중심을 향하여 돌출된 복수의 분쇄날을 포함하는 조직 분쇄기 및 상기 조직 분쇄기로 제조된 바이오 잉크에 관한 것이다.

Description

바이오 잉크 제조를 위한 조직 분쇄기 및 이를 이용하여 제조된 바이오 잉크{TISSUE HOMOGENIZER FOR THE PRODUCTION OF BIO-INK AND BIO-INK PREPARED USING THE SAME}

‘바이오 잉크’는 살아있는 세포 혹은 바이오 분자를 포함하며, 바이오 프린팅 기술에 응용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 통칭하는 용어이다. 따라서 바이오 잉크는 3차원 가공을 위한 물리적 성질과 세포가 목적된 기능을 수행하게 하기 위한 생물학적 환경을 제공하여 주어야 한다. 바이오 잉크는 우선 우수한 세포 친화성을 가져야 한다. 인공 조직 및 장기 재생의 경우는 프린팅 된 세포의 증식 및 분화에 유리한 생물학적 환경이 바이오 잉크로부터 주어져야 하는 것이다. 프린팅 공정이 길어질 때에는 카트리지 내에서 세포의 생존에 필요한 영양분과 산소의 공급이 적절히 이루어져야 한다. 또한 프린팅 과정에서 발생하는 물리적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있어야 한다. 그 외에도 바이오 잉크는 3차원 패터닝의 반복성, 생산성, 노즐의 막힘이 없어야 하는 등 프린팅 공정상에서 필요로 하는 물리적 성질을 가져야 한다. 이와 같이 살아 있는 세포를 이용하는 3D 바이오 프린팅 기술이 요구하는 잉크가 가져야 할 특성은 매우 다양하며 서로 복잡하게 얽혀 있다. 우수한 바이오잉크 기술의 개발은 우수한 바이오 프린팅 기술 개발의 핵심이라 할 수 있다.

세포를 포함한 3D 프린트된 생체 모방 구조체가 구조적 측면과 생물학적 측면에서 기능을 발휘하기 위해서 바이오잉크는 인쇄적성, 세포적합성, 생분해성, 젤화 특성/기계적 물성, 그리고 세포의 성장과 분화를 조절할 수 있는 특성을 가져야 한다. 즉 바이오 프린트된 구조물은 원하는 모양을 재생기간 동안 유지해야 하며 생체 내에서 재생 동안 적절한 속도로 분해되어야 한다.

다양한 생체재료들이 조직공학과 재생의약에서 사용되고 있지만 3D 바이오 프린팅에는 적합하지 않다. 현재 활용되고 있는 바이오잉크로는 다음과 같다. 스캐폴드에 기초한 바이오잉크로 수화젤(hydrogel), 마이크로 캐리어, 세포가 제거된 세포외 기질(extracellular matrix) 등이 있고, 스캐폴드(scaffold)가 없이 세포집합체를 바이오잉크로 사용하기도 한다. 수화젤은 대표적인 상품화된 바이오잉크로써 생체 적합성이 우수하고 인체의 조직과 유사한 구조를 갖고 있으며 세포 및 생리활성물질의 캡슐화가 용이하다. 콜라겐, 젤라틴, 알지네이트, 히알루론산과 PEGDA(poly(ethylene glycol) diacrylate), CollagenMA(collagen methacryloyl), GelMA(gelatin methacayloyl) 등이 대표적인 수화젤 바이오잉크 제품들이다.

최근 들어 바이오 잉크의 성능을 향상시키기 위한 연구가 활발히 진행되고 있지만, 아직은 생체 외에서의 프린팅 공정에 초점을 맞추는 경우가 많이 있다. 성인을 구성하는 세포는 약 60~100조에 이른다. 그리고 세포의 종류에 따라 필요로 하는 생물학적 환경이 크게 달라진다. 특히 간이나 심장과 같은 장기로 부터 얻어지는 세포는 생체 외 배양 자체도 쉽지 않다. 그리고 각 세포마다 선호하는 생물학적 환경이 크게 달라지기 때문에, 각 세포에 특화된 잉크의 개발은 보다 우수한 조직 및 장기 개발에서 중요한 포인트이다. 이러한 관점에서 최근 들어 연구되고 있는 탈세포 기반 바이오 잉크나 기존 생체 재료의 화학적 변형 등의 연구는 아주 주목할 만하다 할 수 있다.

한국등록특허제10-1954953호

본 발명자는 조직 ECM 환경을 제공하기 위하여 마이크로미터(㎛) 수준의 입자 크기를 가진 탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM) 분말을 개시한바 있으나(한국등록특허제10-1954953호), 이는 화학적 처리를 거쳐 ECM 주성분의 손상을 일으키고 세포를 활용할 수 없다는 단점이 있었다.

이에 본 발명자는 화학적 생물학적 처리를 하지 않고 세포 조직을 물리적으로 처리하여 자가 세포와 자가조직을 환자의 이식에 바로 활용할 수 있는 기술을 개발하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 내부에 유체 경로(12)를 포함하는 본체(11); 일단부는 상기 유체 경로(12)에 연결되고, 상기 유체 경로(12)의 양 말단에 위치하는 유체 유입구(14);및 소정의 간격으로 이격되어 상기 유체 경로 내부 원주면으로부터 중심을 향하여 돌출된 복수의 분쇄날(13)을 포함하는 조직 분쇄기를 제공한다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 조직 분쇄기의 단면도를 나타낸다.

상기 조직 분쇄기의 본체(11)는 내부에 유체 경로(12)를 포함하고, 상기 유체 경로(12)의 양 말단에는 분쇄하고자 하는 세포 조직이 유입되는 유체 유입구(14)를 포함할 수 있다.

상기 유체는 분쇄하고자 하는 세포 조직 또는 상기 세포 조직과 버퍼의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적으로 상기 버퍼에는 세포 배양시 오염을 막기 위한 항상제를 포함할 수 있다.

상기 유체 경로(12)는 분쇄하고자 하는 세포 조직이 통과하는 경로로 단면이 원형인 형상을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 유체 경로의 내부 직경은 1.4 ~ 4mm인 것이 바람직하다.

상기 조직 분쇄기는 각각의 유체 유입구(14)의 다른 단부에 연결되고, 유체 주입 장치와 결합하는 유체 주입 장치 결합부(15)를 더 포함할 수 있다. 즉 상기 유체 유입구(14)의 일단부는 상기 유체 주입 장치 결합부(15)에 연결되고, 다른 단부는 상기 유체 경로(12)에 연결된다.

상기 주입 장치 결합부(15)는 유체 주입 장치와 결합하여 유체 주입 장치에 포함되어 있는 세포 조직이 상기 조직 분쇄기 내부, 바람직하게는 유체 유입구(14)로 유입될 수 있도록 한다. 상기 유체 주입 장치 결합부(15)는 조직 분쇄기 양 말단에 위치하여 각각 한개씩, 모두 두 개의 유체 주입 장치를 결합할 수 있으며, 한쪽에 포함되어 있는 세포 조직을 가압하여 상기 조직 분쇄기를 통과하여 다른 한쪽의 유체 주입 장치로 이동시킬 수 있다. 상기 조직 분쇄기는 이러한 과정을 반복적으로 수행함으로써 세포 조직을 작게 분쇄할 수 있다.

상기 유체 주입 장치는 예를 들어 주사기일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유체 주입 장치 결합부(15)는 루어 락(Luer lock) 유형 및/또는 루어 슬립(Luer slip) 유형을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 루어 락(Luer lock) 유형을 포함한다. 유체 주입 장치가 루어 락(Luer lock) 유형의 주사기인 경우, 상기 조직 분쇄기는 상기 유체 주입 장치 결합부와 상기 주사기를 고정하기 위한 나사산(16)을 더 포함할 수 있다.

상기 조직 분쇄기는 일단부가 상기 유체 경로(12)에 연결되고, 상기 유체 경로(12)의 양 말단에 위치하는 유체 유입구(14)를 포함하고, 상기 유체 유입구(14)의 내부 직경은 외부에서 내부로 갈수록 감소하는 것이 바람직하다. 다시 말하면, 상기 결합부(15)에 연결된 유체 유입구의 내부 직경은 상기 유체 경로(12)에 연결된 유체 유입구의 내부 직경보다 크다.

따라서 상기 유체 유입구(14)의 내부 직경은 외부(유체 주입 장치 결합부와 연결된 부분)에서 내부(유체 경로와 연결된 부분)로 갈수록 점점 감소하며, 상기 유체 유입구(14)의 직경이 외부에서 내부로 갈수록 동일하게 제조되는 경우 유체 경로(12)와 유체 유입구(14)의 연결 부분에 턱(step)이 생겨 세포 조직이 원활하게 통과하지 못하고 턱에 걸려서 내부가 막히는 단점이 있다. 따라서 상기 유체 유입구(14)는 외부에서 내부로 갈수록 직경이 감소하여 유체 주입 장치, 구체적으로 유체 주입 장치 결합부(15)로부터 주입되는 세포 조직이 상기 유체 경로(12)로 원활하게 이동할 수 있도록 도와준다.

상기 조직 분쇄기는 소정의 간격으로 이격되어 상기 유체 경로(12)의 내부면으로부터 중심을 향하여 돌출된 복수의 분쇄날(13)을 더 포함할 수 있다.

상기 분쇄날(13)에 바람직한 실시예가 도 2에 도시되어 있다. 본 발명의 조직 분쇄기는 유체 경로(12)의 내부 원주면으로부터 내부 중심을 향하여 돌출되며, 쌍으로 배치되며, 대향하는 분쇄날(13)은 서로 연결되지 않고, 즉 맞닿지 않고 일정한 공간을 두고 이격되어 배치되는 것이 바람직하다(도 2A). 여기서 한 쌍의 대향하는 분쇄날(13) 사이의 간격은 1.5 ~ 2.5mm인 것이 바람직하고, 상기 분쇄날(13)의 간격이 1.5mm 미만인 경우 조직 분쇄 효과가 미비하고, 2.5mm를 초과하는 경우에는 세포 조직이 통과할 수 있는 공간이 감소하여 세포 조직이 원활하게 이동하지 못한다는 단점이 있다.

또한 상기 분쇄날(13)은 1 ~ 4 쌍(2 ~ 8개)으로 배치될 수 있고, 바람직하게는 1 ~ 2쌍으로 배치되는 것이 바람직하다. 4쌍을 초과하는 분쇄날(13)이 배치되는 경우에는 세포 조직이 통과할 수 있는 공간이 감소하여 세포 조직이 원활하게 이동하지 못한다는 단점이 있다.

상기 분쇄날(13)은 서로 맞닿지 않는 것이 바람직하고, 도 2B와 같이 분쇄날(13)이 십자(+), 일자(―)로 배치되는 경우에는 세포 조직이 원활하게 통과하지 못하여 세포 조직이 작게 분쇄되지 못하고, 분쇄날(13)에 걸려서 유체 경로(12)가 막히는 단점이 있다. 도 2C는 도 2B와 같이 분쇄날(13)이 십자(+), 일자(―)인 조직 분쇄기를 사용한 경우 세포 조직이 분쇄되지 못하고 뭉치는 결과를 보여주는 사진이다.

상기 분쇄날(13)의 두께는 100 ~ 300㎛인 것이 바람직하고, 분쇄날의 두께가 100㎛인 경우 조직 분쇄 효과가 미비하고, 300㎛을 초과하는 경우에는 세포 조직이 원활하게 통과하지 못하는 단점이 있다.

유체 경로(12)의 종축에 대한 상기 분쇄날(13)의 길이는 상기 유체 경로(12)의 길이와 동일하게 배치될 수 있고, 적어도 상기 유체 경로(12) 길이의 약 30%의 길이로 상기 유체 경로(12)의 중앙에 배치될 수 있다. 상기 분쇄날(13)의 길이가 상기 길이보다 짧은 경우에는 세포 조직 통과시 분쇄날(13)이 파손되는 단점이 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 조직 분쇄기에 의하여 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)이 분쇄된 조직 및 상기 조직 내의 살아있는 세포를 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다. 본 발명은 탈세포화 세포외 기질(decellularized extracellular matrix)과 달리 화학적 처리를 거치지 않고 조직을 물리적으로 처리하기 때문에, 세포와 조직이 손상되지 않고 조직 내의 세포는 살아있는 세포로 남아있어, 자가 세포와 자가 조식을 환자의 이식에 바로 활용할 수 있다는 장점이 있다.

세포외 기질(extracellular matrix, ECM)은 세포의 외부를 둘러싸고 있는 기질로서, 세포와 세포 사이를 차지하고 있으며, 주로 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 가지고 있다. 세포외 기질의 성분으로는 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 구조체(structural component), 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 및 테나신 등의 접착성 단백질, 황산콘드로이틴(chondroitin sulfate)이나 황산헤파란(heparan sulfate) 그리고 주단백질로부터 생성되는 프로테오글리칸, 및 다당류로만 이루어진 히알루론산 등으로 구분하고 있다.

상기 조직은 간 조직, 심장 조직, 연골 조직, 골 조직, 지방조직, 근육 조직, 피부 조직, 점막 상피 조직(mucosal epithelial tissue), 양막 조직, 또는 각막 조직 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 바이오 잉크 조성물은 생체적합성 고분자를 더 포함할 수 있다.

생체적합성 고분자는 고분자 사슬이 삼차원 구조를 이루는 친수성 망상구조 물질로, 신체의 일부가 손상되거나 기능을 잃었을 때 조직이나 장기를 대체하기 위한 조직재생용 지지체로 사용이 가능하며 생체 적합성을 부여한다.

생체적합성 고분자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 아가로즈(argarose), 알긴산(alginate), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 피브린/피브리노겐(fibrin/fibrinogen), 젤라틴(gelatin), 그래핀(graphene), 히알루론산(hyaluronic acid), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리(DL-락트-코-글라이콜산(poly-D, L-lactic-co-glycolic acid, PLGA) 및 플루로닉(pluronic F 127)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 생체적합성 고분자는 외부 온도에 따라서 그 성질이 바뀌는 고분자이며, 온도로 인해 물리적으로 하이드로젤을 형성하고, 온도 변화에 따라서 팽창-응축 현상을 보일 수 있다.

상기 생체적합성 고분자는 30 내지 40℃에서 졸(sol) 상태이며, 4 내지 25℃에서 젤(gel)화 될 수 있다. 상기 졸(sol)은 액체 내에 고체 입자가 분산되어 있는 것이며, 상기 젤(gel)은 졸을 가열 또는 냉각했을 때 고체 또는 반고체 상태의 일정한 형태를 갖춘 것을 의미한다.

바이오 잉크(bio-ink)는 살아있는 세포 혹은 바이오 분자를 포함하며, 바이오 프린팅 기술에 응용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 총칭한다. 바이오 잉크는 3차원 가공을 위한 물리적 성질과 세포가 목적된 기능을 수행하게 하기 위한 생물학적 환경을 제공하며, 우수한 세포 친화성을 가지는 소재이다.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에는 세포, 세포 배양액, 생리활성물질 및 첨가제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유될 수 있다.

상기 세포는 바이오 잉크 내에서 배양하고자 하는 세포, 조직, 또는 다른 세포로 분화시키고자 하는 세포, 또는 조직 재생에 사용하고자 하는 세포를 포함할 수 있다.

구체적으로 상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬 세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 줄기세포는 분화능을 갖는 세포를 의미할 수 있으며, 상기 분화능을 갖는 세포는 예를 들면, 아세포, 간세포, 섬유아세포, 근육아세포, 성체줄기세포, 중간엽줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포, 골수유래 중간엽줄기세포, 신경유래 중간엽줄기세포, 태반유래 중간엽줄기세포, 또는 제대혈줄기세포 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

상기 세포 배양액은, 이에 제한되지는 않으나, 목적하는 세포에 적합한 임의의 배지를 포함하는 것으로, 당업계에 세포주에 적합한 임의의 배지들이 공지되어 있고, 예를 들어, MEM 배지, RPMI1640 배지, DMEM 배지, IMDM 배지 등일 수 있다. 또한, 상기 세포 배양액에는 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항생 물질 등이 추가로 포함될 수 있다.

상기 생리활성물질은 세포의 성장과 기능을 조절하거나, 세포를 증식시키거나 세포외 기질 분비 또는 세포 분화를 촉진시키기 위한 물질로, 상기 생리활성물질은 전환 성장인자(transforming growth factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 골 형태발생 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 표피 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 태반 성장인자 (placental growth factor, PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor, GCSF), 아스코르베이트 2-포스페이트(ascorbate 2-phosphate), 3-이소부틸-1-메틸산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX), 인슐린(insulin), 글루코코르티코이드(Glucocorticoid), 덱사메타손(Dexamethasone) 및 아스코르브산(ascorbic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 첨가제는 피브리노겐(fibrinogen) 또는 글리세롤일 수 있다. 상기 '피브리노겐(fibrinogen)'은 글로불린에 속하는 단백질로, 세포의 부착 및 분화에 적합한 미세환경을 조성할 수 있으며, 상기 '글리세롤'은 C₃H₅(OH)₃의 분자식을 갖는 지방족 3가 알코올의 하나로서, 바이오 프린팅 적용시 막힘 방지효과 측면에서 본 발명의 조성물에 적합하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 세포 조직을 상기 조직 분쇄기에 반복하여 통과시키는 단계를 포함하는 바이오 잉크 제조방법을 제공한다.

구체적으로 상기 바이오 잉크 제조방법은 1) 유체 경로의 내부 직경이 2.5 ~ 3mm인 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조직 분쇄기에 세포 조직을 반복하여 통과시키는 단계; 및 2) 상기 유체 경로의 내부 직경이 1.4 ~ 2mm이고 분쇄날을 포함하지 않는 조직 분쇄기에 세포 조직을 반복하여 통과시키는 단계를 포함할 수 있다.

즉 본 발명의 바이오 잉크를 제조하는 방법은 내부 직경이 큰 유체 경로(12)를 포함하는 조직 분쇄기에서 내부 직경이 작은 유체 경로(12)를 포함하는 조직 분쇄기로 교체하면서 세포 조직을 분쇄한다.

구체적으로 본 발명의 조직 분쇄기를 이용하여 바이오 잉크를 제조하는 경우, 2가지 유형의 구조를 갖는 조직 분쇄기를 사용하는데, 1) 단계에서 사용되는 조직 분쇄기는 상기 유체 경로(12)의 내부 직경이 2.5 ~ 3mm인 유체 경로(12)를 포함하는 조직 분쇄기이고, 다음 단계인 2) 단계에서 사용되는 조직 분쇄기는 상기 유체 경로(12)의 내부 직경이 1) 단계에서 사용한 조직 분쇄기의 유체 경로(12)의 직경보다 작은, 예를 들어 1.4 ~ 2mm인 것이 바람직하다.

2) 단계에서 사용하는 조직 분쇄기는 분쇄날(13)을 포함하지 않는 것이 바람직하며, 이는 내부 직경이 매우 작기 때문에 분쇄날을 포함하는 경우 세포 조직이 통과할 수 있는 공간이 감소하여 세포 조직이 원활하게 이동하지 못한다는 단점이 있다.

본 발명의 바이오 잉크를 제조하는 방법은 상기 1) 단계 이전에 세포 조직을 유체 경로(12)의 내부 직경이 3.5 ~ 4mm이고, 분쇄날(13)을 포함하지 않는 조직 분쇄기에 세포 조직을 반복하여 통과시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 단계는 추출된 세포 조직의 점성이 높은 경우 분쇄날(13)을 포함하고 유체 경로(12)의 내부 직경이 2.5 ~ 3mm인 조직 분쇄기를 원활하게 통과하지 못하는 경우가 있다. 따라서 더 크고 분쇄날을 포함하지 않는 조직 분쇄기에 통과시키면서 세포 조직을 유연하기 한 후 더 좁은 유체 경로(12)의 조직 분쇄기를 사용하면 바이오 잉크를 수월하게 제조할 수 있게 된다.

또한 본 발명의 바이오 잉크를 제조하는 방법은 2) 단계 이후에 분쇄된 세포 조직을 필터로 걸러주는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이는 완전하게 조각나지 않은 세포 조직을 제거하기 위함이다. 상기 필터 체 크기(sieve size)는 500㎛ ~ 1mm, 바람직하게는 600 ~ 800㎛이다.

상기 필터의 체 크기가 1mm을 초과하는 경우에는 필터링된 세포 조직의 크기가 일반적으로 바이오 프린팅에 사용하는 노즐 크기보다 커서 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크로 적합하지 않다.

바이오프린팅에 주로 사용되는 노즐사이즈는 100, 150, 200, 250, 300 um 이거나 내경 1mm 사이즈 이내의 gauge needle 17G(내경 1.067mm), 18G(내경 0.838mm) 19G(내경 0.686), 20G(내경, 0.603), 21G (0.514) 등을 사용하기 때문에, 이보다 작은 범위의 체 크기를 갖는 필터로 큰 사이즈의 세포 조직을 걸러주어야 한다.

본 발명의 조직 분쇄기를 이용하는 경우 탈세포화(decellularization)기술의 응용과 다르게 화학적, 생물학적 처리를 하지 않고 조직을 물리적으로 처리하여 자가세포와 자가조직을 환자의 이식에 바로 활용이 가능하다. 또한 다양한 하이드로겔(Alginate, collagen, PluronicF-127 등)을 분쇄된 지방조직과 섞어서 원하는 농도로 만들어 사용할 수 있는 장점이 있다. 또한 하이드로겔에 적용시켜 주사 가능한 조직특이적인 하이드로젤(tissue specific injectable hydrogel)을 개발할 수 있으며, 바이오 프린팅 적용 및 구조체 제작, 2d 배양 플레이트 코팅(culture plate coating), 전기방사(electronspinning) 등에 활용할 수 있다.

도 1a는 본 발명의 실시예에 따른 조직 분쇄기의 전체적인 형태를 나타내는 도면이고, 도 1b는 본 발명의 실시예에 따른 조직 분쇄기의 단면도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 분쇄날의 형태를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 의하여 제조된 바이오 잉크 내 지방조직의 SEM 이미지를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에 의하여 인쇄성(printability)을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 바이오 잉크를 포함하는 일반 배양 배지에서 배양된 골수 유래 줄기세포의 지방 분화능을 확인한 oil red o 실험 결과이다.
도 6은 본 발명의 바이오 잉크를 포함하는 일반 배양 배지에서 배양된 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC)의 지방 분화능을 확인한 RT-PCR 실험 결과이다.
도 7은 골수 유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSC)의 신생 혈관능을 확인한 실험 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 - 지방조직 바이오잉크 제조

바이오 잉크를 제조하기 위하여 지방조직을 추출한 후 1% P/S(penycilin/streptomycin)가 첨가된 PBS와 1:1의 부피비로 혼합하고 주사기 내부에 주입하였다, 내부 직경이 2.5 ~ 3mm인 유체 경로(12)를 포함하고 내부에 4개의 분쇄날이 포함된 조직 분쇄기를 상기 주사기에 결합하고, 반대쪽에는 빈 주사기를 결합하였다. 그리고 두 주사기의 피스톤을 가압하여 지방조직을 30 ~ 40회 반복하여 조직 분쇄기를 통과시켰다.

이후 체 크기(sieve size)가 710㎛인 필터로 걸러주고, 걸러진 지방조직을 1% P/S(penycilin/streptomycin)가 첨가된 PBS로 세척하고 1300 rpm의 속도로 3분간 원심분리하였다. 이는 지방조직 내에 있는 지방(Lipid), 혈액 및 부산물을 제거하기 위한 것으로, 이들은 임상적용시 염증반응을 일으키는 문제가 될 수 있는 원인이 된다.

원심분리 이후, 상등액을 제거하고 침전물의 지방조직을 회수하였다.

MEM(Menimum Essential Medium)에 3㎎/㎖의 히알루론산(hyaluronic acid)을 첨가한 후, 37℃ 오븐(oven)에서 로테이터(rotator)를 이용하여 오버나이트(overnight) 동안 녹였다. 완전히 녹인 후, 37.5㎎/㎖의 젤라틴(geletin)과 10㎎/㎖의 피브리노겐(fibrinogen)을 첨가하고 오븐(oven)에서 상기와 같은 방식으로 37℃의 온도 조건하에서 로테이터를 이용하여 1시간 동안 녹여 젤라틴 기반 바이오 잉크(gelatin based bio-ink)를 제조하였다.

상기 젤라틴 기반 바이오 잉크에 젤라틴 기반 바이오 잉크 총 중량 대비 10, 20, 50 wt%의 지방조직을 혼합하고, 젤라틴 가교(gelatin crosslinking)를 위해서 10분간 4℃에 두고 fibrinogen crosslinking 을 위해서 10 U/ml 트롬빈(thrombin)을 처리하여 지방조직 바이오 잉크(adipose tissue bio-ink)를 제조하였다.

실험예 1 - 지방조직의 SEM(Scanning Electron Microscope) 이미지

상기 제조된 지방조직 바이오 잉크(adipose tissue bio-ink) 내의 지방조직 SEM(Scanning Electron Microscope) 이미지를 촬영하였다(도 3).

도 3을 참조하면, 지방조직의 함량이 증가할수록 바이오 잉크에 많은 지방 세포와 지방 ECM을 담지할 수 있었고, 해당 범위 내에서 지방조직을 혼합시킬 때 안정적인 배양이 가능하였다.

실험예 2 - 바이오 잉크(dECM based bio-ink)의 인쇄성(printability) 평가

상기 제조된 바이오 잉크(20%v/v 지방조직 포함)를 18℃ 온도 조건하에서 300㎛ 노즐(nozzle)을 이용하여 8×8㎜ 패턴(pattern)으로 바이오 잉크의 프린팅 테스트(printing test)를 진행하였다. 이때, 바이오잉크 토출양 (Extrusion rate)은 0.22 ul/sec이고, 바이오 잉크 이동 속도(printing speed)는 50 mm/min이고, 층간격 (layer thickness)은 150 um이었다.

한 개의 층(1 layer) 또는 다섯 개의 층(5 layer)으로 스태킹(stacking)한 후 이미지를 확인해 본 결과, 하기 도 4에 나타낸 바와 같이, 바이오 잉크의 인쇄성(printability)이 우수함을 확인하였다.

실험예 3 - 골수 유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSC)의 지방 분화능 확인

골수 유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSC)를 상기 제조된 바이오 잉크가 혼합된 배지에서 배양하여 Oil red O staining을 수행하였다.

골수 유래 중간엽 유래 줄기세포를 상기 제조된 지방조직 바이오 잉크(20%v/v 지방조직, hyaluronic acid 3mg/ml, fibrinogen 10mg/ml, gelatin 37.5mg/ml)에 혼합하였다. 젤라틴 가교(gelatin crosslinking)를 위해서 10분간 4℃에 두고 fibrinogen crosslinking 을 위해서 10 U/ml 트롬빈(thrombin)을 처리하고 일반 배양 배지에서 상기 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 배양하였다.

일반 배양 배지의 조성은 DMEM high glucose(Gibco;회사)+ 10% FBS(fetal bovine serum)+ 1% P/S(penycilin streptomycin)이다.

도 5를 참조하면, 10%, 20% 및 50%(v/v)의 지방조직이 첨가된 바이오 잉크를 첨가한 경우에 지방세포 분화(adipogenic differentiation)가 일어난 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 줄기세포는 분화배지에서만 분화를 하고 본 실험에 사용된 일반 배양 배지에서는 줄기세포는 분화하지 않는다. 그러나 일반 배양 배지에 본 발명의 바이오 잉크를 첨가한 경우 일반 배양 배지에서도 중간엽유래 줄기세포는 성공적으로 분화하였고 그 이유를 지방조직이 포함된 바이오잉크가 adipo inductive, adipo-conductive한 효과를 보인 것으로 확인된다.

즉 본 발명의 바이오 잉크는 농도가 높을수록 조직 특이적인 환경을 제공해서 줄기 세포의 분화를 유도할 수 있고, 분화 미디어의 도움 없이도 줄기 분화를 유도할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4 - 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC)의 지방분화능에 대한 유전자 조사

본 발명자는 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC)를 상기 일반 배양 배지에서 21일간 배양하고 상기 ADSC의 유전자 분석을 RT-PCR을 통하여 수행하였다(도 6). ADSC를 배양한 바이오잉크는 Trizol을 사용하여 RNA를 분리하고 cDNA 합성에 사용하였으며, 지방 분화와 관련된 유전자인 LPL, PPARr, c/EPBa에 대하여 GAPDH(세포유지유전자)대비 발현양을 측정하였다.

도 6을 참조하면, 0% AT 바이오 잉크(지방조직이 포함되지 않고 히알루론산(HA), 젤라틴, 피브리노겐만 포함된 바이오 잉크)에서는 분화마커(PPARr, c/EPBa)가 발현되지 않은 반면 지방조직이 10%v/v, 20%v/v 포함된 바이오잉크에서는 PPARr, c/EBPa 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5 - 골수 유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSC)의 신생 혈관능 확인

골수 유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSC)를 상기 제조된 바이오 잉크(20%v/v 지방조직 포함)가 혼합된 배지에서 배양하고, 인간 제대정맥 내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)를 이용하여 튜브 형성 실험을 수행하였다(도 7).

HUVEC이 포함된 바이오잉크는 지방조직이 없는 히알루론산 3mg/ml, 젤라틴 37.5mg/ml, 피브리노겐 5mg/ml으로 구성되었다. BM-MSC가 포함된 바이오잉크는 지방조직이 없거나 지방조직이 20%v/v이 포함된 바이오잉크를 사용하였다. 여기서 지방조직은 본 발명의 조직 분쇄기로 처리한 지방조직이다.

GFP-HUVEC(GFP로 라벨링된 HUVEC)를 상기 바이오 잉크와 혼한하여 H 형태로 프린팅하고 나머지 부분은 지방조직이 없거나 20%v/v 지방조직이 포함된 바이오잉크로 채우고 PCL이 외벽을 둘러싼 구조체를 제작하였다. 이후 혈관세포 배양배지 (Endothelial Cell Growth Medium, EGM-2)에서 배양하였다.

도 7을 참조하면, BM-MSC가 상기 지방조직이 포함되지 않은 바이오잉크에서 배양된 경우 혈관 형성이 미성숙하였지만 20%v/v 지방이 포함된 바이오잉크에서 배양된 경우 관 튜브가 형성되었다. 이는 지방조직이 포함된 바이오잉크에서 BM-MSC가 혈관 형성을 돕는 사이토카인(cytokine)이나 성장 인자(growth factor)과 같은 줄기세포 유래 혈관형성인자를 많이 분비하여 혈관이 고도 성숙화된 것으로 판단된다.

11: 본체
12: 유체 경로
13: 분쇄날
14: 유체 유입구
15: 유체 주입 장치 결합부
16: 나사산

Claims

내부에 유체 경로를 포함하는 본체;
일단부는 상기 유체 경로에 연결되고, 상기 유체 경로의 양 말단에 위치하는 유체 유입구;및
소정의 간격으로 이격되어 상기 유체 경로 내부 원주면으로부터 중심을 향하여 돌출된 복수의 분쇄날을 포함하는 조직 분쇄기.
제1항에 있어서,
상기 각각의 유체 유입구의 다른 단부에 연결되고, 유체 주입 장치와 결합하는 유체 주입 장치 결합부를 더 포함하는 조직 분쇄기.
제1항에 있어서,
상기 유체 경로의 내부 직경은 1.4 ~ 4mm인 조직 분쇄기.
제1항에 있어서,
상기 유체 유입구의 내부 직경은 외부에서 내부로 갈수록 감소하는 조직 분쇄기.
제1항에 있어서,
상기 분쇄날은 2 ~ 8개인 조직 분쇄기.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조직 분쇄기에 의하여 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)이 분쇄된 조직 및 살아있는 세포를 포함하는 바이오 잉크 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조직은 사람 또는 동물로부터 적출된 간 조직, 심장 조직, 연골 조직, 골 조직, 지방조직, 근육 조직, 피부 조직, 점막 상피 조직, 양막 조직, 또는 각막 조직인 바이오 잉크 조성물.
제6항에 있어서,
생체적합성 고분자를 더 포함하는 바이오 잉크 조성물.
제8항에 있어서,
상기 생체적합성 고분자는 아가로즈(argarose), 알긴산(alginate), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 피브린/피브리노겐(fibrin/fibrinogen), 젤라틴(gelatin), 그래핀(graphene), 히알루론산(hyaluronic acid), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리(DL-락트-코-글라이콜산(poly-D, L-lactic-co-glycolic acid, PLGA) 및 플루로닉(pluronic F 127)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
제6항에 있어서,
세포, 세포 배양액, 생리활성물질 및 첨가제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 바이오 잉크 조성물.
제9항에 있어서,
상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬 세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 바이오 잉크 조성물.
제9항에 있어서,
상기 생리활성물질은 전환 성장인자(transforming growth factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 골 형태발생 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 표피 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인슐린유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 태반 성장인자 (placental growth factor, PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor, GCSF), 아스코르베이트 2-포스페이트(ascorbate 2-phosphate), 3-이소부틸-1-메틸산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX), 인슐린(insulin), 글루코코르티코이드(Glucocorticoid), 덱사메타손(Dexamethasone) 및 아스코르브산(ascorbic acid)과 같은 세포 배양액 첨가물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 바이오 잉크 조성물.
제9항에 있어서,
상기 첨가제는 피브리노겐(fibrinogen) 및 글리세롤인 바이오 잉크 조성물
세포 조직을 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조직 분쇄기에 반복하여 통과시키는 단계를 포함하는 바이오 잉크 제조방법.
1) 유체 경로의 내부 직경이 2.5 ~ 3mm인 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조직 분쇄기에 세포 조직을 반복하여 통과시키는 단계;및
2) 상기 유체 경로의 내부 직경이 1.4 ~ 2mm이고 분쇄날을 포함하지 않는 조직 분쇄기에 세포 조직을 반복하여 통과시키는 단계를 포함하는 바이오 잉크 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 1) 단계 이전에 세포 조직을 유체 경로(12)의 내부 직경이 3.5 ~ 4mm이고, 분쇄날(13)을 포함하지 않는 조직 분쇄기에 세포 조직을 반복하여 통과시키는 단계를 더 포함하는 바이오 잉크 제조방법.
제15항에 있어서,
2)단계 이후에, 분쇄된 세포 조직을 필터링하는 단계를 더 포함하는 바이오 잉크 제조방법.