WO2020111868A1 - 인체 유래 성분을 함유하고 조직 특이적 세포 분화 효과를 갖는 3d 프린팅 바이오 잉크 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

인체 유래 성분을 함유하고 조직 특이적 세포 분화 효과를 갖는 3d 프린팅 바이오 잉크 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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WO2020111868A1
WO2020111868A1 PCT/KR2019/016728 KR2019016728W WO2020111868A1 WO 2020111868 A1 WO2020111868 A1 WO 2020111868A1 KR 2019016728 W KR2019016728 W KR 2019016728W WO 2020111868 A1 WO2020111868 A1 WO 2020111868A1
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bio
ink composition
derived
tissue
cells
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PCT/KR2019/016728
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이솔
원주윤
김형구
이환철
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주식회사 엘앤씨바이오
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D11/00—Inks
    • C09D11/02—Printing inks
    • C09D11/10—Printing inks based on artificial resins
    • C09D11/101—Inks specially adapted for printing processes involving curing by wave energy or particle radiation, e.g. with UV-curing following the printing

Definitions

  • the present invention relates to a 3D (Three dimensional) printing bio-ink composition and a method for manufacturing the same, in detail, according to the tissue specificity of human tissue-derived components contained in the bio-ink composition, having a synergistic effect of cell differentiation into a specific tissue It relates to a bio ink composition and a method of manufacturing the same.
  • Tissue engineering is the creation of human tissues or organs based on biology, engineering, and materials engineering to replace lost or damaged tissue.
  • the number of patients whose human tissue is lost or damaged due to industrialization and aging is increasing, and thus the scope of the field of tissue engineering for supplementing lost or damaged tissue is expanding.
  • 3D bio printing is an area that has recently attracted attention.
  • 3D bio printing is to obtain images by scanning a target structure in three dimensions, and to make an image scanned through cells and bio ink into a three-dimensional structure.
  • Common 3D printing techniques include extrusion-based processes, inkjet-based processes, and laser-based processes. Among them, extrusion-based processes are mainly used as bio-printing to create a three-dimensional structure with cells. Since bioprinting is the key to including living cells, bioink, a material that is mixed with cells to form a three-dimensional structure, is the most important part of 3D bioprinting.
  • Bio inks should have both physicochemical properties that can maintain a fine 3D structure and biological safety levels that can be used with living cells. As a physicochemical property, it must have printabilitiy, in which bio-ink can be extruded from a 3D printer, and rheological characteristics that can maintain a 3D structure even after printing. Because of its biosafety properties, it is essential to have cell affinity because bio-ink has to serve as a scaffold for cell growth and differentiation. In addition, since the printout output by 3D bioprinting contains the materials constituting the bioink, and becomes a 3D printout of an implantable property in the body, all of the material elements constituting the bioink are to be implanted in the body.
  • the material elements constituting the bio-ink should show a tendency to decompose the output in the body to a level consistent with the regeneration tendency of the new tissue, while the new tissue is regenerated at the transplant site through the output after transplantation in the body.
  • Biocompatible materials that can make up bio inks include agarose, alginate, chitosan, collagen, decellularized extracellular matrix, and fibrin/fibrinogen. /fibrinogen, gelatin, graphene, hyaluronic acid, hydroxyapatite, polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), poly(DL) -Lactic-co-glycolic acid (poly-D, L-lactic-co-glycolic acid, PLGA) and pluronic F 127.
  • alginate is a divalent cation It has the characteristic of crosslinking and gelling through the chelation of cation, and this property satisfies the printability of bio ink and the mechanical properties after printing, but alginic acid alone has low cell affinity, It does not provide a suitable environment for cells to adhere and grow.
  • Micronized human tissue decellularizes allogeneic tissues such as skin, bones, ligaments, tendons, blood vessels, cartilage, heart valves, amniotic membranes, fascia, nerves and pericardium, which are donated after death, and then lyophilized and crushed. The process results in particles of tens to hundreds of micrometers in size. Since the micro-particulated human tissue is a human-derived material that has undergone only the decellularization process, the extracellular matrix (ECM) is the main component. The extracellular matrix component is collagen, which is more than 90% structural protein, and the remaining 10% is glycoprotein, fibronectin, laminin, and glycosaminoglycan (GAG).
  • ECM extracellular matrix
  • tissue-specific growth factors and some cytokines (Cytokine) are known to promote cell growth and tissue-specific differentiation of undifferentiated cells.
  • components such as laminin, fibronectin, and glycosaminoglycan in the microparticulated human tissue act as a surface binding protein, and extracellular matrix such as cytokines or growth factors secreted from cells. It is known to attach to the structure to help the growth and differentiation of cells. Therefore, when the bio ink containing the extracellular matrix is cultured together with the cells, the cytokines and growth factors necessary for cell growth and differentiation are more easily transferred, thereby making the structure more tissue-like. (Non-Patent Document 1).
  • the extracellular matrix extracted from different tissues has tissue specificity, which has characteristics of each tissue, so that the cells are alive and suitable for constructing each tissue by attaching cytokines or growth factors suitable for the tissue. Is formulated (non-patent document 2).
  • the micro-particulated human tissue is a micro-unit particle type, and when mixed with a bio-derived polymer and a hydrogel to hydrate, it is physically evenly mixed and has the advantage of controlling the mechanical strength of the bio-ink according to the content. . Since the extracellular matrix previously used for bio-ink is used in a state dissolved in pepsin and acetic acid or hydrochloric acid to produce a liquid hydrogel, there is a limit in increasing the mechanical properties of the extracellular matrix itself. Therefore, the bio-ink containing micro-particulated human tissue has higher mechanical properties than the extracellular matrix solution bio-ink, and the micro-particulated human tissue itself is a component that has the form of tissue and is a more suitable environment for cells to live. This can be created.
  • the extracellular matrix extracted from heterologous tissues such as cows, pigs, horses, etc. may be an animal-derived virus and cross-infection, whereas the human-derived extracellular matrix deviates from the safety problems of heterogeneous substances in the body. It can be used as the most suitable material for human body application. Therefore, the microparticulated human tissue has a very high cell affinity, and since it is an extracellular matrix derived from the human body, it has the advantage of being able to be transplanted into the body with little or no immune rejection, foreign body reaction, and inflammatory reaction.
  • An object of the present invention is to provide a 3D bio printing bio ink composition containing a component derived from human tissue.
  • an object of the present invention is to provide a bio ink composition capable of cell growth and tissue-specific differentiation in a 3D printed structure by applying various human tissue-derived components to a bio ink composition and a method for manufacturing the same.
  • the present invention provides a bio-ink composition for 3D printing that includes microparticulated human tissue-derived components and biocompatible polymers.
  • the present invention also provides a method of manufacturing a structure comprising extruding a bioink composition for 3D printing comprising a microparticulated human tissue-derived component and a biocompatible polymer.
  • the present invention provides a bio-ink composition containing micro-particulated human tissue.
  • the bio-ink composition according to the present invention has cell affinity and thus exhibits excellent effects in cell growth and differentiation, and can provide tissue-specific differentiation according to the origin of human tissue in the bio-ink.
  • the bio-ink composition can improve mechanical properties because it contains micro-particulated human-derived tissue components.
  • the bio ink composition according to the present invention By applying the bio ink composition according to the present invention to 3D bio printing, cells in the output can be differentiated according to the origin of the human tissue of the bio ink.
  • the output output by 3D bio printing contains micro-particulated human tissue components, and thus, the cell affinity is high and cells can survive for a long time, and human tissue is a cell growth factor and Since it contains differentiation factors, it can regulate the function and differentiation of cells.
  • bio-ink composition of the present invention can be printed in a form extruded through a 3D printer for bio-printing, and can be used as a structure for regenerating tissue while maintaining a 3D structure after printing.
  • the present invention is applicable to various fields by applying a bio-ink composition containing various human tissue-derived components as a biomaterial through 3D bio-printing with cells of each tissue.
  • Figure 1 is a cell-free allogeneic dermal powder (M-ADM) mixed with a biocompatible polymer and a state of cross-linking by printing through a 3D printer and M-ADM-based bio ink (left) filled in a syringe.
  • Woo a cell-free allogeneic dermal powder
  • B is a cross-linked structure of a cell-free allogeneic cartilage powder (M-AC) mixed with a biocompatible polymer and printed through an M-AC based bio ink (top left) filled with a syringe and an extrusion-based 3D printer ( Idol). The cross-linked structure after printing maintains the structure against external pressure (below).
  • M-ADM cell-free allogeneic dermal powder
  • Idol extrusion-based 3D printer
  • Figure 2 (A) is a result of confirming the viability of cells after 1, 7, 21, 28 days by culturing M-ADM-based bio ink containing human dermal fibroblasts under a fluorescence microscope at 100 magnification.
  • the graph is a result of quantifying the number of living cells by culture time.
  • Figure 2 (B) is a result of confirming the viability of cells after 1, 7, 21, 28 days by culturing M-AC-based bio ink containing human chondrocytes with a fluorescence microscope at 100 magnification.
  • the graph is a result of quantifying the number of living cells by culture time.
  • FIGS. 2A and 2B are indicated by arrows.
  • Cells not indicated by arrows indicate living cells.
  • 3(A) is a result of confirming whether the cells survive after 7, 14, 21, 28 days by culturing M-ADM-based bio ink containing adipose-derived stem cells under a fluorescence microscope at 100 magnification.
  • the graph is a result of quantifying the number of living cells expressed in green by culture time.
  • FIG. 3(B) shows the results of culturing M-AC-based bio-ink containing adipose-derived stem cells and confirming the survival of the cells with a fluorescence microscope at 100 magnification.
  • the graph is a result of quantifying the number of living cells expressed in green by culture time.
  • FIG. 4(A) is a photograph obtained by culturing M-ADM-based bio ink containing adipose-derived stem cells and staining tissue sections after 21 days with DAPI, Collagen type 1 and alpha-SMA antibodies.
  • (B) is a result of quantifying the amount of mRNA expression of FSP1 after 3 weeks and 5 weeks by qRT-PCR analysis by culturing M-AC based bio ink containing adipose derived stem cells.
  • FIG. 4 (C), (D) of Figure 4 is a photograph of human chondrocytes and adipose-derived stem cells cultured and stained tissue sections with DAPI, Aggrecan, CD44 antibody. (C) is a result of confirming the cartilage differentiation of adipose-derived stem cells by expressing each specific marker in human chondrocytes and adipose-derived stem cells and incubating for 4 weeks in M-AC-based bio ink in (D).
  • 4(E) is a result of quantifying mRNA expression levels of Collagen type II and SOX-9 after 1 week and 2 weeks by qRT-PCR analysis by culturing an M-AC based bio ink containing adipose-derived stem cells. .
  • the present invention relates to a bio-ink composition for 3D printing that includes microparticled human tissue-derived components and biocompatible polymers.
  • fibroblast viability in M-ADM based bio ink was analyzed to confirm the cell affinity of the bio ink composition of the present invention.
  • the bio-ink composition of the present invention was confirmed by confirming the differentiation of adipose-derived stem cells into fibroblasts in M-ADM-based bioinks and the differentiation of adipose-derived stem cells into chondrocytes in M-AC-based bioinks. The activity of the was confirmed.
  • the applicability of the bio ink composition to 3D bio printing was confirmed.
  • bio ink composition for 3D printing of the present invention will be described in more detail.
  • bio-ink composition (or bio-ink) according to the present invention includes microparticulated human tissue-derived components and biocompatible polymers.
  • a component derived from human tissue refers to a decellularized tissue-derived component, and provides conditions for creating a microenvironment similar to the original tissue. Since it is a structure formed through interaction with cells in the human body rather than artificially generated substances, it has a tissue-specific component and phase, and can provide an advantageous environment for cell growth and differentiation.
  • the micro-particulated human tissue-derived component means that the human tissue is subjected to a decellularization step and crushed to a size of 10 to 1000 ⁇ m.
  • the microparticulated human tissue-derived component may be used for the purpose of improving biocompatibility, cell adhesion, and physical properties of bioink.
  • the human tissue can be obtained from allogeneic tissue such as skin, bone, ligament, tendon, blood vessel, cartilage, heart valve, amniotic membrane, fascia, nerve, pericardium, etc. that are donated after death.
  • allogeneic tissue such as skin, bone, ligament, tendon, blood vessel, cartilage, heart valve, amniotic membrane, fascia, nerve, pericardium, etc. that are donated after death.
  • the components derived from human tissue are decellularized human tissues, Acellular Dermal Matrix (ADM), Acellular Cartilage (AC), Acellular Adipose (AA) , Acellular Bone (AB) and Acellular Bone Derived Mineral (ABDM).
  • ADM Acellular Dermal Matrix
  • AC Acellular Cartilage
  • AA Acellular Adipose
  • AB Acellular Bone Derived Mineral
  • the allogeneic cartilage may be vitreous cartilage, elastic cartilage, fibrous cartilage, or a mixture thereof.
  • the microparticle-derived human tissue-derived component derived from skin and cartilage can enhance the tissue specificity of the bio ink as an extracellular matrix.
  • the human tissue-derived component is microparticulated, and the average particle diameter of the microparticulated human tissue-derived component may be 10 to 1000 um, 10 to 700 um, or 10 to 500 um.
  • the bio-ink can implement the input form through the micro-unit 3D printing nozzle, and can give strength to maintain the structure of the structure.
  • the original structure of the tissue is preserved to provide an environment favorable for cell growth and differentiation.
  • the bio-ink composition may be expressed as an M-ADM-based bio ink when the micro-particulated human tissue-derived component includes an acellular dermal matrix (ADM), and an acellular allogeneic cartilage (Acellular) Cartilage, AC), it can be expressed as M-AC based bio ink.
  • ADM acellular dermal matrix
  • Acellular acellular allogeneic cartilage
  • the microparticulated human tissue-derived component (S1) decellularizing human tissue
  • the decellularized human tissue may be prepared through microparticleization.
  • the order of the steps (S1) and (S2) is not limited, and may be sequentially performed with (S1) and (S2), or (S1) may be performed after performing the steps (S2).
  • Step (S1) is a step of decellularizing human tissue, and the decellularization can be performed by a general method in the art.
  • a defatting process may be performed using a polar solution such as alcohol and/or hexane and a non-polar solution
  • the decellularization process may be performed using a basic solution such as sodium hydroxide (NaOH).
  • the hair removal process may be performed using an alkaline solution such as Na 2 S. The process may be appropriately selected and performed according to the human tissue used.
  • a bleaching process and/or a neutralization process may be additionally performed.
  • the decellularized human tissue may be freeze-dried to remove moisture.
  • Step (S2) is a step of microparticleizing the decellularized human tissue.
  • the microparticulation may be performed by physically pulverizing human tissue or chemically granulating the tissue.
  • the type of the physical process is not particularly limited, for example, pulverized using a pulverizer, particularly a micro pulverizer, or pulverized by rotating the ball, or pulverized by rotating a ball or rod at cryogenic temperature to be finely granulated.
  • a pulverizer particularly a micro pulverizer
  • the type of the chemical process is not particularly limited, for example, it can be microparticles by performing a process of decellularization from tissues through an organic/inorganic solvent, a basic alkaline solvent, or the like.
  • the microparticulated human tissue derived component may include a differentiation factor.
  • Differentiation factor refers to a substance that can regulate cell growth and function.
  • the differentiation factor may act as a growth factor, and in particular, when applied to stem cells, it can induce differentiation into other cells.
  • the differentiation factor is transforming growth factor (beta), TGF- ⁇ , fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor.
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the content of the micro-particulated human tissue-derived component may be 2 to 20 parts by weight relative to the total weight of the bio ink composition (100 parts by weight).
  • the micro-particulated human tissue-derived component may be present in the bio-ink composition at 5-10% (w/v).
  • the biocompatible polymer imparts biocompatibility to the structure to be produced.
  • the type of biocompatible polymer is not particularly limited, for example, agarose, alginate, chitosan, collagen, decellularized extracellular matrix, fibrin/fibrinogen, gelatin, graphene, hyaluronic acid, hydroxyapatite, polycaprolactone (PCL), polylactic acid acid, PLA), poly(DL-lactic-co-glycolic acid (PLGA) and pluronic F 127).
  • PCL polycaprolactone
  • PLA polylactic acid acid
  • PLA poly(DL-lactic-co-glycolic acid
  • pluronic F 127 pluronic F 127
  • alginic acid may be used as the biocompatible polymer.
  • the alginic acid may include calcium, sodium, potassium, ammonium, or magnesium alginic acid.
  • the alginic acid has excellent biodegradability, improves physical properties of bioink, and is easy to crosslink.
  • alginate (alginate) is cross-linked through the chelation of a divalent cation (divalent cation), so as to gel, it is possible to satisfy the printability as a bio ink (printability) and mechanical properties after printing through the gelation properties have.
  • the content of the biocompatible polymer may be 0.5 to 10 parts by weight based on the total weight of the bio ink composition (100 parts by weight). In the range of parts by weight, desired physical properties may be satisfied when the support is prepared.
  • the bio ink composition may further include one or more selected from the group consisting of cells and differentiation factors.
  • cells to be used for tissue regeneration may be used as cells, for example, stem cells, fibroblasts, chondrocytes, osteoblasts, epithelial cells (Epithelial cell), keratinocytes (Keratinocyte), endothelial cells (Endothelial cell) and one or more selected from the group consisting of neurons (Neuron) can be used.
  • stem cells for example, stem cells, fibroblasts, chondrocytes, osteoblasts, epithelial cells (Epithelial cell), keratinocytes (Keratinocyte), endothelial cells (Endothelial cell) and one or more selected from the group consisting of neurons (Neuron) can be used.
  • the differentiation factor may be included in the microparticle-derived human tissue-derived component itself, but may be additionally added to the ink composition to maximize the effect of the differentiation factor, that is, cell growth and function control.
  • the differentiation factor may use the above-described types, specifically, transformation growth factor (beta), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor ( Epidermal Growth Factor (EGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Insulin-like Growth Factor (IGF) and Bone Morphogenic Protein (BMP) One or more can be used.
  • transformation growth factor beta
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • IGF Insulin-like Growth Factor
  • BMP Bone Morphogenic Protein
  • the content of one or more selected from the group consisting of cells and differentiation factors may be 0.001 to 20 parts by weight based on the total weight of the ink composition (100 parts by weight).
  • the cells may be included in 10 to 20 parts by weight, differentiation factor may be included in 0.001 parts by weight or more.
  • the ink composition of the present invention may contain water.
  • the present invention provides a method of manufacturing the above-described bio ink composition.
  • the bio-ink composition according to the present invention may be prepared by mixing the aforementioned components, that is, microparticulated human tissue-derived components and biocompatible polymers. Since the microparticle-derived human tissue-derived component is in the form of a micro-unit particle, it can be physically and evenly mixed without a separate mixing process when hydrated to a bio-derived polymer. In addition, in the present invention, it is possible to control the mechanical strength of the bio-ink according to the content of components derived from micro-particulated human tissue.
  • the present invention provides a method for manufacturing a structure comprising extruding a bio-ink composition for 3D printing comprising a microparticulated human tissue-derived component and a biocompatible polymer.
  • the bio ink composition according to the present invention can be applied to 3D bio printing.
  • the 3D bioprinting means a process of scanning a target structure in three dimensions to obtain an image, and making a scanned image through bio ink into a three-dimensional structure. In the present invention, it can be applied to an extrusion-based process.
  • the extrudate of the bio ink composition for 3D printing may be expressed as a structure, output, or scaffold.
  • the bio-ink composition according to the present invention can serve as a support for cell growth and differentiation, has biocompatibility, and has biocompatibility. Therefore, it can be easily transplanted into the body, and it is possible to control the growth and differentiation of cells in an in vitro culture or in vivo transplantation environment.
  • the structure may be manufactured by extruding a bio ink composition using a 3D printer.
  • a structure may be manufactured by printing 3D drawing data according to a program pre-designed with a 3D computer.
  • the extrusion force, and the extrusion speed can be appropriately adjusted to produce a structure.
  • the step of crosslinking the extruded structure may be further included.
  • the crosslinking may be performed through a process generally used in the art.
  • the alginic acid when using alginate as a biocompatible polymer, the alginic acid is crosslinked and gelled through the chelation of a divalent cation, so crosslinking can be performed using this property.
  • the structure completed through bio printing can be used for biotissue regeneration.
  • the structure made of bio-ink has biocompatibility, and can be usefully used in biotissue regeneration, tissue engineering, and regenerative medicine because it can induce tissue regeneration by containing cells on a support and attaching to a surface.
  • Skin tissue (collected from a body donated for treatment of a non-profit patient from a tissue bank) was acellularized.
  • the skin tissue was defatted using alcohol (alcohol) and hexane (Hexane). Thereafter, epidermis and cells were removed using sodium hydroxide (NaOH), and hair attached to the tissue was removed using sodium sulfide (Na 2 S). Next, after passing through hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), neutralization and washing were performed using distilled water. The washed skin tissue was lyophilized to remove moisture, and the tissue was crushed using a micro grinder. During the pulverization, dermal tissue powder of 500 ⁇ m or less was produced by passing through a sieve having a diameter of 250 to 500 ⁇ m.
  • the prepared powder-form tissue was sterilized.
  • the hydrogel type bio ink composition was prepared by mixing the M-ADM powder prepared in (1) with an aqueous alginate solution.
  • Alginic acid 1-2% (w/v) aqueous solution was prepared.
  • the alginate aqueous solution was used after filtration through a 0.22 ⁇ m syringe filter.
  • M-ADM 5-10% (w/v) was hydrated in the aqueous alginate solution.
  • the two syringes were connected to a Luer adapter and uniformly hydrated to prepare the composition.
  • 1(A) is a state in which the M-ADM-based bio ink is filled in a syringe.
  • Cartilage tissue (collected from a body donated for treatment of a non-profit patient from a tissue bank) was crushed using a micro grinder. The grinding was passed through a sieve having a diameter of 250 to 500 um to obtain cartilage tissue powder of 500 um or less.
  • cartilage tissue powder was obtained and acellularized.
  • the cartilage tissue was defatted using alcohol (alcohol) and hexane (Hexane). Thereafter, cells were removed using sodium hydroxide (NaOH), and washed with alcohol (Ethanol) and distilled water. After freeze-drying to remove moisture, the powdered tissue was sterilized by electron beam.
  • a bio-gel composition in the form of a hydrogel was prepared by mixing the M-AC powder prepared in (1) with an aqueous alginate solution.
  • Alginic acid 1-2% (w/v) aqueous solution was prepared.
  • the alginate aqueous solution was used after filtration through a 0.22 ⁇ m syringe filter.
  • M-AC 5-10% (w/v) was hydrated in an alginate aqueous solution.
  • the two syringes were connected to a Luer adapter and uniformly hydrated to prepare the composition.
  • 1(B) is a state in which the M-AC-based bio ink is filled in a syringe.
  • the cell affinity of the M-ADM-based bio ink prepared in Example 1 was confirmed using human dermal fibroblasts.
  • the structure was treated with 1% calcium chloride solution for 5-10 minutes for crosslinking.
  • the cross-linked structure was washed with phosphate buffer (PBS), immersed in a cell culture medium, and cultured in a cell culture medium.
  • PBS phosphate buffer
  • the cells were cultured for 1 day, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, and 4 weeks, the cells were analyzed using a Live/dead cell viability assay kit (Life Technology, USA).
  • the medium in which 0.5 ⁇ l/ml Calcein-AM and 2 ul/ml Ethidium homodimer-1 was dissolved was immersed in the structure and reacted for 30 minutes. After the reaction, it was confirmed through a confocal microscope (LSM 700, Carl Zeiss, Germany). Specifically, focusing was performed at 10 ⁇ m intervals to a depth of about 200 ⁇ m to confirm cell survival inside the construct.
  • Example 2 the cell affinity of the M-AC based bio ink prepared in Example 2 was confirmed using human chondrocytes (Human Chondrocyte).
  • a 1% calcium chloride solution was treated on the structure for 7-10 minutes for crosslinking.
  • the cross-linked structure was washed with phosphate buffer (PBS), immersed in a cell culture medium, and cultured in a cell culture medium.
  • PBS phosphate buffer
  • FIG. 2(A) The results of cell affinity analysis of the M-ADM based bio ink are shown in FIG. 2(A).
  • the graph of Fig. (A) is a result of quantifying the results. After 4 weeks of culture, it can be seen that the number of cells increased more than 4 times after 1 day of culture.
  • the cell affinity of the M-ADM-based bio ink prepared in Example 1 was confirmed using Adipose tissue-derived stem cells.
  • the cell affinity of the M-AC based bio ink was confirmed using Adipose tissue-derived stem cells.
  • FIG. 3(A) The cell affinity analysis results of the M-ADM based bio ink are shown in FIG. 3(A).
  • the graph in FIG. 3(A) is a result of quantifying living cells expressed in green in the photograph. Through this, it can be confirmed that the cell proliferation increases with time.
  • the graph in FIG. 3(B) is a result of quantifying living cells expressed in green in the photograph. Through this, it can be confirmed that the cell proliferation increases with time.
  • the evaluation was conducted through confirmation of the differentiation of adipose-derived stem cells into fibroblasts in the bioink composition.
  • fibroblasts differentiated was performed through tissue analysis using specific markers of fibroblasts. Structures in which M-ADM-based bio ink and adipose-derived stem cells were cultured together were collected. Frozen specimens were prepared using OCT Compound, and sections were prepared with a thickness of 4 to 20 ⁇ m through a frozen tissue cutter. The tissue sections on the slide glass were stained with antibodies of collagen type 1 and alpha-SMA, which are specific markers of fibroblasts, and then the expression of collagen type 1 and alpha-SMA was confirmed with a fluorescence microscope.
  • fibroblast marker FSP-1 Fibroblast specific protein-1
  • adipose-derived stem cells express collagen type 1 and alpha-SMA, which are fibroblast markers, in the support of the M-ADM-based bio ink.
  • adipose-derived stem cells differentiated into chondrocytes was performed through tissue analysis using specific markers of chondrocytes.
  • a structure in which M-AC-based bio ink and adipose-derived stem cells were cultured together was collected.
  • Frozen specimens were prepared using OCT Compound, and sections were prepared on slide glass with a thickness of 4 to 20 ⁇ m through a frozen tissue cutter. The tissue sections on the slide glass were stained with the antibody of Aggrecan, a specific marker of chondrocytes, and the antibody of CD44, a specific marker of adipose-derived stem cells, and then the expression of Aggrecan and CD44 was confirmed by a fluorescence microscope.
  • mRNA expression of collagen type II and SOX-9, chondrocyte markers was analyzed quantitatively through qRT-PCR to determine whether adipose-derived stem cells differentiated into chondrocytes.
  • FIG. 4(C) is a staining of human chondrocytes and adipose-derived stem cells, and shows the expressions of Aggrecan and CD44, respectively.
  • (D) was stained with adipose-derived stem cells in the M-AC based bio ink support to confirm the expression of each specific marker.
  • CD44 a marker of adipose-derived stem cells, was expressed in the early stage of culture in the M-AC-based bio-ink support, but it was confirmed that Aggrecan, a marker of chondrocytes, was expressed after culture.
  • the bio ink was put in a 10 ml syringe, and printing was performed at an extrusion speed of 4 mm/s through a 22G needle.
  • the structure was completed under a condition of porosity of 12% with a size of 10 mm x 10 mm x 2 mm (width x length x height).
  • Fig. 1(A) shows the result of printing with M-ADM based bio ink. It was confirmed that the structure was completed in a shape that did not collapse according to the planned shape, and that it was possible to maintain the shape when crosslinked with a calcium chloride solution for 5-10 minutes after printing. A structure having a strength that did not collapse when the structure was picked up with tweezers was confirmed.
  • Fig. 1 (B) shows the result of printing with M-AC based bio ink.
  • M-AC like M-ADM-based bio ink, was confirmed that the structure was completed in a shape that does not fall within the planned shape and does not collapse, and it is possible to maintain the shape. In particular, it was confirmed that it is a form that expands again after bending the structure in a folded shape and maintains the structure.
  • bio-inks containing micro-particulated human tissues can be printed in various structures and shapes through a 3D printer, and can be used as bio-inks for bio-printing and the influence of the environment provided by bio-inks It was verified that the stem cells differentiate according to the specificity of human tissue in the bio ink.
  • the bio-ink composition of the present invention can be printed in the form of being extruded through a 3D printer for bio-printing, maintain the 3D structure after printing, and can be used as a structure for tissue regeneration.

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Abstract

본 발명은 3D(Three dimensional, 3D) 프린팅용 바이오 잉크 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 바이오 잉크 조성물이 함유하는 인체 유래 성분의 조직 특이성에 따라, 특정 조직으로의 세포 분화 상승효과를 갖는 바이오 잉크 조성물 및 그 제조 방법을 제공할 수 있다.

Description

인체 유래 성분을 함유하고 조직 특이적 세포 분화 효과를 갖는 3D 프린팅 바이오 잉크 조성물 및 그 제조방법
본 발명은 3D(Three dimensional) 프린팅용 바이오 잉크 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 상세하게는 바이오 잉크 조성물에 함유된 인체 조직 유래 성분의 조직 특이성에 따라, 특정 조직으로의 세포 분화 상승효과를 가지는 바이오 잉크 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
조직 공학은 생물학, 공학, 재료공학을 기반으로 인체 조직 또는 기관을 만들어 손실 또는 손상된 조직을 대체하는 것이다. 산업화, 고령화로 인하여 인체 조직이 손실 또는 손상되는 환자 수가 증가하고 있으며, 이로 인해 손실 또는 손상된 조직을 보충하기 위한 조직공학 분야의 범위가 확대되고 있다. 그 중에서 최근 주목을 받고 있는 분야가 3D 바이오 프린팅이다.
3D 바이오 프린팅은 목표 구조물을 삼차원으로 스캐닝하여 이미지를 얻어, 세포와 바이오 잉크를 통해 스캐닝한 이미지를 삼차원 구조 형태로 만드는 것이다. 일반적인 3D 프린팅의 기술로는 압출기반 프로세스, 잉크젯기반 프로세스 및 레이저기반 프로세스가 있는데, 이중에 세포와 함께 삼차원 구조 형태를 만드는 바이오 프린팅으로 주로 압출기반 프로세스가 많이 사용되고 있다. 바이오 프린팅은 살아있는 세포를 포함하는 것이 핵심이므로, 세포와 함께 섞여서 삼차원 구조를 이루는 물질인 바이오 잉크는 3D 바이오 프린팅에서 가장 중요한 부분이다.
바이오 잉크는 미세 3D 구조를 유지할 수 있는 물리화학적 특성과 살아있는 세포와 함께 사용할 수 있는 수준의 생물학적 안전에 관한 특성을 모두 가지고 있어야 한다. 물리화학적 특성으로 바이오 잉크가 3D 프린터에서 압출될 수 있는 인쇄능(printabilitiy), 프린팅 후에도 3D 구조를 유지할 수 있는 유변학적 특성(rheological characteristics)을 가지고 있어야 한다. 생물학적 안전에 관한 특성으로 바이오 잉크가 세포의 생장 및 분화에 대한 지지체(scaffold) 역할을 수행해야 하기 때문에, 기본적으로 세포친화성을 지녀야 한다. 또한, 3D 바이오 프린팅으로 출력된 출력물은 바이오 잉크를 구성하는 물질들을 고스란히 함유하는 동시에 체내에 이식 가능한 성상의 3D 출력물이 되므로, 이러한 출력물이 체내에 이식되기 위해서는 바이오 잉크를 구성하는 물질 요소들 모두가 생체 적합한(biocompatible) 물질이어야 하며, 출력물의 체외 배양 또는 체내 이식 환경에서 세포의 생장과 분화를 조절할 수 있는 특성을 가져야 한다. 아울러, 바이오 잉크를 구성하는 물질 요소들은 체내 이식 후, 신생조직이 출력물을 통해 이식부위에서 재생되는 동안, 신생 조직의 재생 경향과 부합되는 수준으로 출력물의 체내 분해 경향을 보여야 한다.
바이오 잉크를 구성할 수 있는 생체적합성 물질로는 아가로즈(argarose), 알긴산(alginate), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 무세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix), 피브린/피브리노겐(fibrin/fibrinogen), 젤라틴(gelatin), 그래핀(graphene), 히알루론산(hyaluronic acid), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리(DL-락트-코-글라이콜산(poly-D, L-lactic-co-glycolic acid, PLGA) 및 플루로닉(pluronic F 127) 등이 있다. 이 중, 알긴산(alginate)은 2가 양이온(divalent cation)의 킬레이션(chelation)을 통해 가교되어 젤화하는 특징이 있고, 이 성질이 바이오 잉크의 인쇄능(printability)과 인쇄 후 기계적 물성을 충족시켜준다. 그러나 알긴산 단독으로는 세포친화도가 낮고, 세포가 부착하여 생장하기에 적합한 환경을 제공하지는 못한다.
미세입자화된(micronized) 인체 조직은 사망 후 기증되는 피부, 뼈, 인대, 건, 혈관, 연골, 심장판막, 양막, 근막, 신경, 심낭 등의 동종 조직을 탈세포화한 후, 동결건조 및 분쇄과정을 통해 수 십에서 수 백 마이크로미터 크기의 입자 상태로 만들어진다. 미세입자화된 인체 조직은 탈세포 공정만 거친 인체 유래 물질이기 때문에 세포외기질(Extracelluar matrix, ECM)이 주성분이다. 세포외기질 성분은 90% 이상이 구조 단백질인 콜라겐(Collagen)이며, 나머지 10%는 당단백질(Glycoprotein)인 파이브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin), 글리코스아미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG) 등으로 이루어져 있으며, 그 외에 조직 특이적 성장인자 (Growth factor) 및 일부 사이토카인 (Cytokine)들이 존재하여 세포의 성장 및 미분화세포의 조직 특이적 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 특히 미세입자화된 인체 조직에 있는 라미닌, 파이브로넥틴, 글리코스아미노글리칸과 같은 성분은 표면부착단백질(Surface binding protein)의 역할을 하여 세포로부터 분비되는 사이토카인 또는 성장인자 등을 세포외기질 구조 내에 부착시켜 세포의 성장과 분화에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 그렇기 때문에 세포외기질을 포함하는 바이오 잉크가 세포와 함께 배양되었을 때, 세포 성장과 분화에 필요한 사이토카인 및 성장인자의 전달이 더 용이하여 구조체가 더욱 조직과 유사한 형태로 변하게 할 수 있는 장점이 있다(비특허문헌 1). 더욱이, 서로 다른 조직에서 추출한 세포외기질은 각 조직의 특성을 갖고 있는 조직 특이성(Tissue specificity)이 있어 그 조직에 적합한 사이토카인 또는 성장인자를 부착시켜 세포가 살아서 각 조직을 구성하기에 알맞는 환경을 조성한다(비특허문헌 2).
또한, 미세입자화된 인체 조직은 마이크로 단위의 입자 형태로서 생체유래 고분자와 하이드로겔 형태로 혼합하여 수화 했을 때, 물리적으로 고르게 혼합되며, 함량에 따라 바이오 잉크의 기계적 강도를 조절할 수 있는 장점이 있다. 기존에 바이오 잉크에 활용했던 세포외기질은 액상의 하이드로겔로 제조하기 위해 펩신과 아세트산이나 염산에 용해시킨 상태로 사용하기 때문에 세포외기질 자체로 기계적 물성을 높이는 것에 한계가 있다. 따라서, 미세입자화된 인체 조직을 포함한 바이오 잉크는 기계적 물성이 세포외기질 용액 바이오 잉크보다 높으며, 미세입자화된 인체 조직 자체가 조직의 형태를 갖추고 있는 구성 요소로서 세포가 살아가기에 더 적합한 환경이 조성될 수 있다.
마지막으로, 소, 돼지, 말 등의 이종 조직에서 추출된 세포외기질은 동물 유래 바이러스 및 인수 교차 감염의 우려가 있는 반면에, 인체 유래 세포외기질은 이종 물질들의 체내 안전문제에서 벗어나 있기 때문에, 인체에 적용하기에 가장 적합한 재료로 사용될 수 있다. 따라서, 미세입자화된 인체 조직은 세포친화성이 매우 높으며, 인체 유래의 세포외기질이기 때문에 면역거부반응, 이물반응, 염증반응 등이 거의 없이 체내 이식이 가능하다는 장점을 갖는다.
[비특허문헌]
[1] D. Choudhury et al. Trend in Biotechnology. 2018
[2] R. Londono et al. Annals of Biomedical Engineering. 2015.
본 발명은 인체 조직 유래의 성분을 함유하는 3D 바이오 프린팅용 바이오 잉크 조성물을 제공을 제공하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명은 다양한 인체 조직 유래 성분을 바이오 잉크 조성물에 적용시켜 3D 프린팅된 구조물 내에서 세포 생장 및 조직 특이적 분화가 가능한 바이오 잉크 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함하는 3D 프린팅용 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함하는 3D 프린팅용 바이오 잉크 조성물을 압출하여 구조체를 제조하는 단계를 포함하는 구조체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 미세입자화된 인체 조직을 함유하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물은 세포친화성을 가져 세포 생장 및 분화에 있어서 우수한 효과를 나타내며, 바이오 잉크 내 인체 조직의 유래에 따라 조직 특이적 분화를 제공할 수 있다. 또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 미세입자화된 인체 유래 조직 성분을 포함하므로 기계적 물성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물을 3D 바이오 프린팅에 적용하여 출력되는 출력물 내 세포는 바이오 잉크의 인체 조직 기원을 따라 분화할 수 있다. 바이오 잉크 조성물이 살아있는 세포를 포함하는 경우, 3D 바이오 프린팅으로 출력된 출력물은 미세입자화된 인체 조직 성분을 함유하기 때문에 세포친화력이 높고 세포가 장기간 생존할 수 있으며, 또한 인체 조직이 세포 성장인자 및 분화 인자를 함유하고 있어 세포의 기능과 분화를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 바이오 프린팅을 위한 3D 프린터를 통해 압출되는 형태로 프린팅이 가능하고 출력 후 3D 구조를 유지하며 조직 재생을 위한 구조체로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 다양한 인체 조직 유래 성분이 포함된 바이오 잉크 조성물을 각 조직의 세포와 함께 3D 바이오 프린팅을 통하여 생체용 소재로 적용함으로써 다양한 분야에 적용가능하다.
도 1의 (A)는 무세포 동종 진피 분말(M-ADM)을 생체적합성 고분자와 함께 혼합하여 주사기에 충진한 M-ADM 기반 바이오 잉크(좌)와 3D 프린터를 통해 프린팅하여 가교한 구조체의 모습(우)이다. (B)는 무세포 동종 연골 분말(M-AC)을 생체적합성 고분자와 함께 혼합하여 주사기에 충진한 M-AC 기반 바이오 잉크(좌상)와 압출기반 3D 프린터를 통해 프린팅하여 가교한 구조체의 모습(우상)이다. 프린팅 후 가교된 구조체가 외부 압력에 대해 구조를 유지하는 모습(아래)이다.
도 2의 (A)는 사람진피 섬유아세포가 포함된 M-ADM 기반 바이오 잉크를 배양하여 1, 7, 21, 28일 후의 세포의 생존여부를 100 배율의 형광 현미경으로 확인한 결과이다. 그래프는 살아있는 세포 수를 배양 시기별로 정량한 결과이다.
도 2의 (B)는 사람 연골 세포가 포함된 M-AC 기반 바이오 잉크를 배양하여 1, 7, 21, 28일 후의 세포의 생존여부를 100 배율의 형광 현미경으로 확인한 결과이다. 그래프는 살아있는 세포 수를 배양 시기별로 정량한 결과이다.
상기 도 2의 (A) 및 (B)에서 죽은 세포는 화살표로 표시하였다. 화살표로 표시되지 않은 세포는 살아있는 세포를 나타낸다.
도 3의 (A)는 지방유래 줄기세포가 포함된 M-ADM 기반 바이오 잉크를 배양하여 7, 14, 21, 28일 후 세포의 생존여부를 100 배율의 형광 현미경으로 확인한 결과이다. 그래프는 초록색으로 표현되는 살아있는 세포 수를 배양 시기별로 정량한 결과이다.
도 3의 (B)는 지방유래 줄기세포가 포함된 M-AC 기반 바이오 잉크를 배양한 후 세포의 생존여부를 100 배율의 형광 현미경으로 확인한 결과이다. 그래프는 초록색으로 표현되는 살아있는 세포 수를 배양 시기별로 정량한 결과이다.
도 4의 (A)는 지방유래 줄기세포가 포함된 M-ADM 기반 바이오 잉크를 배양하여 21일 후의 조직 절편을 DAPI, Collagen type 1, alpha-SMA 항체로 염색한 사진이다. (B)는 지방유래 줄기세포가 포함된 M-AC 기반 바이오 잉크를 배양하여 3주, 5주 후의 FSP1의 mRNA 발현양을 qRT-PCR 분석으로 정량한 결과이다.
도 4의 (C), (D)는 사람 연골세포와 지방유래 줄기세포를 배양하여 조직 절편을 DAPI, Aggrecan, CD44 항체로 염색한 사진이다. (C)는 사람 연골 세포와 지방유래 줄기세포는 각각의 특정 표지자를 발현하고 (D)에서 M-AC 기반 바이오 잉크에서 4주 동안 배양하여 지방유래 줄기세포의 연골 분화를 확인한 결과이다.
도 4의 (E)는 지방유래 줄기세포가 포함된 M-AC 기반 바이오 잉크를 배양하여 1주, 2주 후의 Collagen type II와 SOX-9의 mRNA 발현양을 qRT-PCR 분석으로 정량한 결과이다.
본 발명은 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함하는 3D 프린팅용 바이오 잉크 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 M-ADM 기반 바이오 잉크 내에서의 섬유아세포 생존능, M-AC 기반 바이오 잉크 내에서의 인간연골세포 생존능, 및 M-ADM 기반 및 M-AC 기반 바이오 잉크 내에서의 지방유래 줄기세포 생존능을 분석하여 본 발명의 바이오 잉크 조성물의 세포친화성을 확인하였다. 또한, M-ADM 기반 바이오 잉크 내에서의 지방유래 줄기세포의 섬유아세포로의 분화 및 M-AC 기반 바이오 잉크 내에서의 지방유래 줄기세포의 연골세포로의 분화를 확인하여 본 발명의 바이오 잉크 조성물의 활성을 확인하였다. 또한, 상기 바이오 잉크 조성물의 3D 바이오 프린팅으로의 적용 가능성을 확인하였다.
이하, 본 발명의 3D 프린팅용 바이오 잉크 조성물을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물(또는 바이오 잉크라 한다.)은 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함한다.
본 발명에서 인체 조직 유래 성분은 탈세포화된 조직유래 성분을 의미하는 것으로서, 원래 조직과 유사한 미세환경을 조성할 수 있는 조건을 제공한다. 인위적으로 생성된 물질이 아니라 인체 내에서 세포와의 상호작용을 통해 형성된 구조이기 때문에, 조직 특화된 구성 성분 및 위상을 가지며, 세포의 성장과 분화에 유리한 환경을 제공할 수 있다.
본 발명에서 미세입자화된 인체 조직 유래 성분은 인체 조직을 탈세포화 단계를 거치고, 10~1000 μm의 크기로 분쇄된 것을 의미한다. 미세입자화된 인체 조직 유래 성분은 생체 적합성, 세포 부착성, 바이오 잉크의 물리적 특성 향상의 목적으로 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 인체 조직은 사망 후 기증되는 피부, 뼈, 인대, 건, 혈관, 연골, 심장판막, 양막, 근막, 신경, 심낭 등의 동종 조직으로부터 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 인체 조직 유래 성분은 탈세포화된 인체 조직으로서, 무세포 동종 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM), 무세포 동종 연골(Acellular Cartilage, AC), 무세포 동종 지방(Acellular Adipose, AA), 무세포 동종 뼈(Acellular Bone, AB) 및 무세포 동종 뼈 유래 무기질(Acellular Bone Derived Mineral, ABDM)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 이때, 동종 연골은 유리질 연골, 탄성 연골, 섬유질 연골, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 특히, 피부 및 연골 유래의 미세입자화된 인체 조직 유래 성분은 세포외기질이 주성분으로서 바이오 잉크의 조직 특이성을 강화시킬 수 있다.
일 구체예에서, 인체 조직 유래 성분은 미세입자화되며, 상기 미세입자화된 인체 조직 유래 성분의 평균 입경은 10 내지 1000 um, 10 내지 700 um 또는 10 내지 500 um일 수 있다. 상기 입경 범위에서 바이오 잉크는 마이크로 단위의 3D 프린팅 노즐을 통과하여 입력된 형태를 구현할 수 있으며, 구조체의 구조를 유지할 수 있는 강도를 부여할 수 있다. 또한, 세포외기질에 효소를 처리하여 하이드로겔 타입으로 제작한 바이오 잉크와 달리 조직의 원래 구조가 보존되어 세포의 성장과 분화에 유리한 환경을 제공할 수 있다.
일 구체예에서, 바이오 잉크 조성물이 미세입자화된 인체 조직 유래 성분으로 무세포 동종 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM)를 포함할 경우 M-ADM 기반 바이오 잉크라 표현할 수 있으며, 무세포 동종 연골(Acellular Cartilage, AC)을 포함할 경우 M-AC 기반 바이오 잉크라 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 미세입자화된 인체 조직 유래 성분은 (S1) 인체 조직을 탈세포화 하는 단계; 및
(S2) 상기 탈세포화된 인체 조직을 미세입자화하는 단계를 통해 제조할 수 있다.
상기 단계 (S1) 및 (S2)의 순서는 제한되지 않으며, (S1) 및 (S2)로 순차적으로 진행하거나, 단계 (S2)를 수항한 후 (S1)을 수행할 수 있다.
단계 (S1)은 인제 조직을 탈세포화하는 단계로, 상기 탈세포화는 당업계의 일반적인 방법에 의해 수행할 수 있다.
상기 단계에서는 예를 들어, 탈지방화 공정, 탈세포와 공정 및/또는 털 제거 공정을 수행할 수 있다. 탈지방화 공정은 알코올 및/또는 헥산 등의 극성 용액 및 비극성 용액를 사용하여 수행할 수 있고, 탈세포화 공정은 수산화나트륨(NaOH) 등의 염기성 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 털 제거 공정은 Na2S 등의 알칼리성 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 공정은 사용된 인체 조직에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다.
상기 탈세포화를 진행한 후 표백 공정 및/또는 중화 공정을 추가로 수행할 수 있다.
또한, 후술할 미세입자화를 용이하게 수행하기 위해 상기 탈세포화된 인체 조직을 동결건조하여 수분을 제거할 수 있다.
단계 (S2)는 탈세포화된 인체 조직을 미세입자화하는 단계이다.
상기 미세입자화는 인체 조직을 물리적으로 분쇄하거나 또는 화학적으로 입자화하여 수행할 수 있다.
물리적 공정의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 분쇄기, 특히 마이크로 분쇄기를 이용하여 분말화하거나, 볼을 회전시켜 분쇄하여 분말화하거나, 또는 극저온에서 볼 혹은 막대를 회전시켜 분쇄하여 미세입자화할 수 있다. 또한, 화학적 공정의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 유·무기 용매, 염기성 알카리성 용매 등을 통해 조직으로부터 탈세포화하는 공정을 수행하여 미세입자화할 수 있다.
일 구체예에서, 미세입자화된 인체 조직 유래 성분은 분화인자를 포함할 수 있다. 분화인자는 세포의 성장과 기능을 조절할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 분화인자는 성장인자로 작용할 수 있으며, 특히 줄기세포에 적용했을 경우에 다른 세포로의 분화를 유도할 수 있다.
예를 들어, 상기 분화인자는 전환 성장인자(Transforming Growth Factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 표피 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 혈관내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like Growth Factor, IGF) 및 골 형태발생 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 미세입자화된 인체 조직 유래 성분의 함량은 바이오 잉크 조성물 전체 중량(100 중량부) 대비 2 내지 20 중량부일 수 있다. 또한, 상기 미세입자화된 인체 조직 유래 성분은 바이오 잉크 조성물 내에서 5~10 %(w/v)로 존재할 수 있다.
본 발명에서 생체적합성 고분자는 제조되는 구조체에 생체 적합성을 부여한다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 아가로즈(argarose), 알긴산(alginate), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 무세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix), 피브린/피브리노겐(fibrin/fibrinogen), 젤라틴(gelatin), 그래핀(graphene), 히알루론산(hyaluronic acid), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리(DL-락트-코-글라이콜산(poly-D, L-lactic-co-glycolic acid, PLGA) 및 플루로닉(pluronic F 127)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 생체적합성 고분자로 알긴산을 사용할 수 있다. 상기 알긴산은 칼슘, 소듐, 포타슘, 암모늄, 또는 마그네슘 알긴산을 포함할 수 있다. 상기 알긴산은 생체 분해성이 우수하며, 바이오 잉크의 물리적 특성을 향상시키고, 가교가 용이하다는 특징을 가진다. 구체적으로, 알긴산(alginate)은 2가 양이온(divalent cation)의 킬레이션(chelation)을 통해 가교되어 겔화하므로, 상기 겔화 성질을 통해 바이오 잉크로서의 인쇄능(printability)과 인쇄 후 기계적 물성을 충족시킬 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자의 함량은 바이오 잉크 조성물 전체 중량(100 중량부) 대비 0.5 내지 10 중량부일 수 있다. 상기 중량부 범위에서 지지체 제조시 목적하는 물성을 총족시킬 수 있다.
본 발명에서 바이오 잉크 조성물은 세포 및 분화인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 세포로 조직 재생에 사용하고자 하는 세포를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 줄기세포(Stem cell), 섬유아세포(Fibroblast), 연골세포 (Chondrocyte), 조골세포(Osteoblast), 상피세포(Epithelial cell), 각질세포(Keratinocyte), 내피세포(Endothelial cell) 및 신경세포(Neuron)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 분화인자는 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 자체에 포함될 수 있으나, 추가로 잉크 조성물에 별도로 첨가함으로써, 상기 분화인자의 효과, 즉 세포의 성장과 기능 조절을 극대화할 수 있다.
예를 들어, 상기 분화인자는 전술한 종류를 사용할 수 있으며, 구체적으로, 전환 성장인자(Transforming Growth Factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 표피 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 혈관내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like Growth Factor, IGF) 및 골 형태발생 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 세포 및 분화인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 함량은 잉크 조성물 전체 중량(100 중량부) 대비 0.001 내지 20 중량부 일 수 있다. 상기 세포는 10 내지 20 중량부로 포함될 수 있으며, 분화인자는 0.001 중량부 이상으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 잉크 조성물을 물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 바이오 잉크 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물은 전술한 성분들, 즉, 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 혼합하여 제조할 수 있다. 미세입자화된 인체 조직 유래 성분은 마이크로 단위의 입자 형태이므로 생체유래 고분자에 수화 시 별도의 혼합 공정없이도 물리적으로 고르게 혼합될 수 있다. 아울러, 본 발명에서는 미세입자화된 인체 조직 유래 성분의 함량에 따라 바이오 잉크의 기계적 강도를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함하는 3D 프린팅용 바이오 잉크 조성물을 압출하여 구조체를 제조하는 단계를 포함하는 구조체의 제조 방법을 제공한다.
일 구체예예서, 본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물은 3D 바이오 프린팅에 적용될 수 있다.
상기 3D 바이오 프린팅은 목표 구조물을 삼차원으로 스캐닝하여 이미지를 얻고, 바이오 잉크를 통해 스캐닝한 이미지를 삼차원 구조 형태로 만드는 공정을 의미한다. 본 발명에서는 압출기반 프로세스에 적용될 수 있다.
본 발명에서 3D 프린팅용 바이오 잉크 조성물의 압출물을 구조체, 출력물, 또는 지지체(scaffold)라 표현할 수 있다. 본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물은 세포의 생장 및 분화에 대한 지지체 역할을 수행할 수 있고, 생체친화성을 가지며, 생체 적합성을 가진다. 따라서, 체내에 용이하게 이식될 수 있으며, 체외 배양 또는 체내 이식 환경에서 세포의 생장과 분화를 조절할 수 있다.
본 발명에서 구조체는 3D 프린터를 이용하여 바이오 잉크 조성물을 압출하여 제조할수 있다. 구체적으로, 3D 컴퓨터로 미리 디자인된 프로그램을 따라 3차원 도면 데이터를 프린트하여 구조체를 제조할 수 있다.
본 발명에서는 제조하고자 하는 목적에 따라, 압출력, 및 압출속도를 적절히 조절하여 구조체를 제조할 수 있다.
본 발명에서는 압출된 구조체를 가교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 가교는 당업계에서 일반적으로 사용하는 공정을 통해 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 생체적합성 고분자로 알긴산을 사용할 경우, 상기 알긴산은 2가 양이온(divalent cation)의 킬레이션(chelation)을 통해 가교되어 겔화하므로, 이 특성을 이용하여 가교를 수행할 수 있다.
본 발명에서는 3D 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크 조성물을 제공함으로써, 바이오 프린팅을 통해 완성된 구조체는 생체조직 재생을 위해 사용할 수 있다. 구체적으로, 바이오 잉크로 만들어진 구조체는 생체 친화성을 갖고, 지지체 내에 세포를 함유 및 표면에 부착하여 조직 재생을 유도할 수 있기에 생체조직 재생, 조직 공학, 재생 의학에 유용하게 사용될 수 있다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1. 미세입자화된 무세포 동종 진피(Micronized Acellular Dermal Matrix, M-ADM) 조직을 포함하는 바이오 잉크 제조
(1) M-ADM 분말 제조
피부 조직(조직은행으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 시신으로부터 채취)을 무세포화하였다.
먼저, 피부조직을 알코올(alcohol)과 헥산(Hexane)를 이용하여 탈지방화 과정을 수행하였다. 그 후, 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 표피와 세포를 제거하고, 황화나트륨(Na2S)을 이용하여 조직에 붙어있는 털을 제거하였다. 다음으로, 과산화수소(H2O2)을 거친 후 증류수를 이용하여 중화 및 세척을 진행하였다. 세척된 피부조직은 동결건조를 진행하여 수분을 제거하고, 마이크로 분쇄기를 이용하여 조직을 분쇄하였다. 상기 분쇄 시, 250~500 μm 구경의 체(sieve)를 통과시켜 500 μm 이하의 진피 조직 분말을 제작하였다.
상기 제작된 분말 형태의 조직을 멸균하였다.
(2) M-ADM 기반 바이오 잉크 제조
(1)에서 제작된 M-ADM 분말과 알긴산 수용액을 혼합하여 하이드로젤 형태의 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
알긴산 1~2% (w/v) 수용액을 준비하였다. 알긴산 수용액은 0.22 μm 시린지 필터로 여과한 후에 사용하였다.
알긴산 수용액에 M-ADM 5~10 %(w/v)을 수화시켰다. 두 개의 주사기를 루어 어댑터에 연결하여 균일하게 수화하여 조성물을 제조하였다.
도 1의 (A)는 M-ADM 기반 바이오 잉크를 주사기에 충진한 모습이다.
실시예 2. 미세입자화된 무세포 동종 연골(Micronized Acellular Cartilage, M-AC) 조직을 포함하는 바이오 잉크 제조
(1) M- AC 분말 제조
연골 조직(조직은행으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 시신으로부터 채취)을 마이크로 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다. 상기 분쇄는 250~500 um 구경의 체(sieve)를 통과시켜 500um 이하의 연골 조직 분말을 얻었다.
그 후, 연골 조직 분말을 을 얻은 후 무세포화하였다.
먼저, 연골 조직을 알코올(alcohol)과 헥산(Hexane)를 이용하여 탈지방화 과정을 수행하였다. 그 후, 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 세포를 제거하고, 알코올(Ethanol)과 증류수를 이용하여 세척하였다. 동결 건조를 진행하여 수분을 제거한 후, 분말 형태의 조직을 전자선으로 멸균하였다.
(2) M-AC 기반 바이오잉크 제조
(1)에서 제작된 M-AC 분말과 알긴산 수용액을 혼합하여 하이드로젤 형태의 바이오 잉크 조성물을 제조하였다.
알긴산 1~2% (w/v) 수용액을 준비하였다. 알긴산 수용액은 0.22 μm 시린지 필터로 여과한 후에 사용하였다.
알긴산 수용액에 M-AC 5~10 %(w/v)을 수화시켰다. 두 개의 주사기를 루어 어댑터에 연결하여 균일하게 수화하여 조성물을 제조하였다.
도 1(B)는 M-AC 기반 바이오 잉크를 주사기에 충진한 모습이다.
실험예 1. 바이오 잉크의 세포친화성 분석
(1) 바이오 잉크 내에서의 섬유아세포 또는 인간연골세포 생존능 분석
① 방법
실시예 1에서 제조된 M-ADM 기반 바이오 잉크의 세포 친화성을 인간진피섬유아세포(Human Dermal Fibroblast)를 사용하여 확인하였다.
구체적으로, 2×107 cells의 인간진피섬유아세포를 100 μl의 배지에 M-ADM 기반 바이오 잉크 1 ml를 혼합하였다. 혼합은 두개의 주사기를 루어 어댑터에 연결하여 균일하게 수화하였다. 상기 세포와 혼합한 바이오 잉크를 22G 주사 바늘로 압출하여 가로 10 mm, 세로 10 mm, 간격 2.5 mm의 격자무늬 형태의 구조물로 제작하였다.
격자무늬 형태의 구조물이 완성되면 가교를 위해 상기 구조물에 1% 염화칼슘 용액을 5~10분간 처리하였다. 가교된 구조물을 인산완충액(PBS)으로 세척한 뒤, 세포 배양 배지에 침지시키고 세포배양기에서 배양을 진행하였다.
세포 친화성 분석은 다음과 같이 진행하였다.
세포가 살아있는 구조물을 배양 1일, 1주, 2주, 3주, 4주 후에 Live/dead cell viability assay kit(Life Technology, USA)를 사용하여 분석을 진행하였다. 0.5 μl/ml Calcein-AM과 2 ul/ml Ethidium homodimer-1이 용해되어 있는 배지를 구조체에 침지하여 30분간 반응시켰다. 반응 후, 공초점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Germany)을 통해 확인한다. 구체적으로, 약 200 μm 깊이까지 10 μm 간격으로 초점을 맞추어 구조체 내부의 세포 생존을 확인하였다.
한편, 실시예 2에서 제조된 M-AC 기반 바이오 잉크의 세포 친화성을 인간연골세포(Human Chondrocyte)를 사용하여 확인하였다.
구체적으로, 2×107 cells의 인간 연골세포를 200 μl의 배지에 M-AC 기반 바이오 잉크 1.8 ml를 혼합하였다. 혼합은 두개의 주사기를 루어 어댑터에 연결하여 균일하게 수화하였다. 상기 세포와 혼합한 바이오 잉크를 22G 주사 바늘로 압출하여 가로 10 mm, 세로 10 mm, 간격 2.5 mm의 격자무늬 형태의 구조물로 제작하였다.
격자무늬 형태의 구조물이 완성되면 가교를 위해 상기 구조물에 1% 염화칼슘 용액을 7~10분간 처리하였다. 가교된 구조물을 인산완충액(PBS)으로 세척한 뒤, 세포 배양 배지에 침지시키고 세포배양기에서 배양을 진행하였다.
세포 친화성 분석은 상기 M-ADM의 분석 방법과 동일하게 진행하였다
② 결과
M-ADM 기반 바이오 잉크의 세포 친화성 분석 결과를 도 2(A)에 나타내었다.
도 2(A)의 사진을 통해, 시간이 지날수록 살아있는 세포가 많아지는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 세포가 바이오 잉크 내에 생존할 뿐만 아니라 증식이 가능함을 확인할 수 있다.
또한, 도 (A)의 그래프는 상기 결과를 정량화한 결과이다. 배양 4주 후는 배양 1일 후에 비해 세포수가 4배 이상 증가한 것을 확인할 수 있다.
한편, M-AC 기반 바이오 잉크의 세포 친화성 분석 결과를 도 2(B)에 나타내었다.
도 2(B)를 통해, M-ADM 기반 바이오 잉크에서와 마찬가지로, 시간이 지날수록 살아있는 세포가 많아지는 것을 확인할 수 있다. 또한, 세포가 바이오 잉크 내에 생존할 뿐만 아니라 증식되는 모습을 확인할 수 있다.
(2) 바이오 잉크 내에서의 지방유래 줄기세포 생존능
① 방법
실시예 1에서 제조한 M-ADM 기반 바이오 잉크의 세포 친화성을 지방유래 줄기세포(Adipose tissue-derived stem cell)를 사용하여 확인하였다.
구체적으로, 1×107 cells의 지방유래 줄기세포를 포함한 세포혼탁액 100ul에 M-ADM 기반 바이오 잉크 1 ml를 혼합하였다. 혼합은 두 개의 주사기를 루어 어댑터에 연결하여 균일하게 수화하였다. 세포와 혼합한 바이오 잉크를 22G 주사바늘로 압출하여 가로 10 mm, 세로 10 mm, 간격 2.5 mm의 격자무늬 형태의 구조물로 제작하였다.
격자무늬 형태의 구조물이 완성되면 가교를 위해 1% 염화칼슘 용액을 구조물에 5~10분간 처리하였다. 가교된 구조물을 PBS로 세척한 뒤, 세포 배양 배지에 침지시키고, 세포배양기에서 배양을 진행하였다.
세포 친화성 분석은 다음과 같이 진행하였다.
세포가 살아있는 구조물을 배양 1, 2, 3, 4주 후에 Live/dead cell viability assay kit (Life Technology, USA)로 염색하고 공초점 현미경 (LSM 700, Carl Zeiss, Germany)을 통해 확인하였다.
한편, M-AC 기반 바이오 잉크의 세포 친화성을 지방유래 줄기세포(Adipose tissue-derived stem cell)를 사용하여 확인하였다.
구체적으로, 2×107 cells의 지방유래 줄기세포를 포함한 세포혼탁액 200ul에 M-AC 기반 바이오 잉크 1.8 ml를 혼합하였다. 혼합은 두 개의 주사기를 루어 어댑터에 연결하여 균일하게 수화하였다. 세포와 혼합한 바이오 잉크를 22G 주사바늘로 압출하여 가로 10 mm, 세로 10 mm, 간격 2.5 mm의 격자무늬 형태의 구조물로 제작하였다.
격자무늬 형태의 구조물이 완성되면 가교를 위해 1% 염화칼슘 용액을 구조물에 7~10분간 처리하였다. 가교된 구조물을 PBS로 세척한 뒤, 세포 배양 배지에 침지시키고, 세포배양기에서 배양을 진행하였다.
세포 친화성 분석은 상기 M-ADM과 동일하게 진행하였다.
② 결과
M-ADM 기반 바이오 잉크의 세포 친화성 분석 결과를 도 3(A)에 나타내었다.
도 3(A)를 통해, 배양 시간이 지남에 따라 세포의 양이 바이오 잉크 구조체 내에서 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물 중의 M-ADM과 알긴산의 비율을 적절히 조절함으로써, 지방유래 줄기세포를 생존 및 증식하게 하는 세포적합성 및 세포친화성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
도 3(A)에서 그래프는 사진에서 초록색으로 표현되는 살아있는 세포를 정량한 결과이다. 이를 통해, 시간에 따라 세포 증식이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
M-AC 기반 바이오 잉크의 세포 친화성 분석 결과를 도 3(B)에 나타내었다.
도 3(B)를 통해, 배양 시간이 지남에 따라 세포의 양이 바이오 잉크 구조체 내에서 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물 중의 M-AC와 알긴산의 비율을 적절히 조절함으로써, 지방유래 줄기세포를 생존 및 증식하게 하는 세포적합성 및 세포친화성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
도 3(B)에서 그래프는 사진에서 초록색으로 표현되는 살아있는 세포를 정량한 결과이다. 이를 통해, 시간에 따라 세포 증식이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 바이오 잉크의 활성 확인
(1) 바이오 잉크 내에서의 지방유래 줄기세포의 섬유아세포로의 분화 확인
① 방법
전술한 실험예 1을 통해, 바이오 잉크 조성물의 구조물에서 지방유래 줄기세포가 생존하는 것을 확인하였다. 본 실험예에서는 본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물이 생존능력뿐만 아니라 세포의 기능을 조절할 수 있는지를 평가하였다.
상기 평가는 바이오 잉크 조성물 내에서 지방유래 줄기세포의 섬유아세포로의 분화 여부 확인을 통해 진행하였다.
섬유아세포로의 분화 여부는 섬유아세포의 특정 표지자를 이용한 조직분석을 통해 진행하였다. M-ADM 기반 바이오 잉크와 지방유래 줄기세포를 함께 배양한 구조물을 채취하였다. OCT Compound을 이용하여 동결 표본을 제작하고, 동결 조직 절단기를 통해 4~20 μm의 두께로 절편을 제작하였다. 슬라이드 글라스 위의 조직 절편을 섬유아세포의 특정 표지자인 Collagen type 1과 alpha-SMA의 항체로 염색한 뒤, 형광현미경으로 Collagen type 1과 alpha-SMA의 발현을 확인하였다.
또한, 지방유래 줄기세포가 섬유아세포로 분화하였는지의 여부를 섬유아세포의 표지자인 FSP-1(Fibroblast specific protein-1)의 mRNA 발현을 qRT-PCR을 통해 정량분석 하였다.
② 결과
평가 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4(A)를 통해 지방유래 줄기세포가 M-ADM 기반 바이오 잉크의 지지체 내에서 섬유아세포의 마커인 collagen type 1과 alpha-SMA를 발현하는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 4(B)를 통해, 지방유래 줄기세포가 M-ADM 기반 바이오 잉크와 함께 5주까지 배양되었을 때, FSP-1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이 때의 발현양은 섬유아세포가 발현하는 FSP-1의 양과 비슷하거나 우위의 수준임을 확인할 수 있다.
(2) 바이오 잉크 내에서의 지방유래 줄기세포의 연골세포로의 분화 확인
① 방법
M-AC 기반 바이오 잉크 내에서의 지방유래 줄기세포가 연골세포로의 분화 여부를 확인하였다.
구체적으로, 지방유래 줄기세포가 연골세포로 분화하였는지를 연골세포의 특정 표지자를 이용하여 조직분석을 통해 진행하였다. M-AC 기반 바이오 잉크와 지방유래 줄기세포를 함께 배양한 구조물을 채취하였다. OCT Compound을 이용하여 동결 표본을 제작하고 동결 조직 절단기를 통해 4~20 μm의 두께로 절편을 슬라이드 글라스에 제작하였다. 슬라이드 글라스 위의 조직 절편을 연골세포의 특정 표지자인 Aggrecan의 항체와 지방유래 줄기세포의 특정 표지자인 CD44의 항체로 염색한 뒤, 형광현미경으로 Aggrecan과 CD44의 발현을 확인하였다.
또한, 지방유래 줄기세포가 연골세포로 분화하였는지의 여부를 연골세포 표지자인 Collagen type II와 SOX-9의 mRNA 발현을 qRT-PCR을 통해 정량분석 하였다.
② 결과
평가 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4(C)는 사람 연골세포와 지방유래 줄기세포를 염색한 것으로 각각의 표지자인 Aggrecan과 CD44의 발현을 나타낸다. 또한, (D)는 M-AC 기반 바이오 잉크 지지체 내에서의 지방유래 줄기세포를 염색하여 각각의 특정 표지자의 발현을 확인하였다. 이를 통해, M-AC 기반 바이오 잉크 지지체 내에서 배양 초기에는 지방유래줄기세포의 표지자인 CD44가 발현되었지만, 배양 후 연골세포의 표지자인 Aggrecan가 발현되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 4(E)를 통해, 지방유래 줄기세포가 M-AC 기반 바이오 잉크와 함께 2주까지 배양되었을 때, Collagen type II와 SOX-9의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이 때의 발현양은 인간 연골세포가 발현하는 Collagen type II와 SOX-9의 양과 비슷하거나 우위의 수준임을 확인할 수 있다.
실험예 3. 3D 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크의 활용 여부
M-ADM 기반 바이오 잉크가 3D 프린터로 출력이 가능한지 확인하기 위해 3D 바이오 프린터를 이용하여 출력을 수행하였다.
바이오 잉크를 10 ml 주사기에 넣고, 22G의 주사바늘을 통해 4 mm/s의 압출속도로 프린팅을 수행하였다. 10 mm x 10 mm x 2mm (가로x세로x높이)의 크기로 12%의 공극률(porosity)의 조건으로 구조체를 완성하였다.
도 1(A)에 M-ADM 기반 바이오 잉크로 프린팅을 수행한 결과물을 나타내었다. 계획했던 모양에 맞게 무너지지 않은 형태로 구조체가 완성되었으며, 프린팅 후에 염화칼슘 용액으로 5~10분간 가교했을 때 모양 유지가 가능함을 확인할 수 있었다. 핀셋으로 구조체를 집어 들어도 형태가 무너지지 않은 강도의 구조체가 확인되었다.
한편, 도 1(B)에 M-AC 기반 바이오 잉크로 프린팅을 수행한 결과물을 나타내었다. M-AC 역시 M-ADM 기반 바이오 잉크와 마찬가지로 계획했던 모양에 벗어나지 않으며 무너지지 않은 형태로 구조체가 완성되었으며, 형태 유지가 가능함을 확인할 수 있었다. 특히, 접는 모양으로 구조체를 구부린 후에도 다시 펴지며 구조를 유지하는 형태임을 확인하였다. 상기의 결과로, 미세입자화된 인체 조직이 포함된 바이오 잉크가 3D 프린터를 통해 다양한 구조와 모양으로 프린팅 될 수 있으며, 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크로서 사용 가능함과 바이오 잉크가 제공하는 환경의 영향으로 줄기세포가 바이오 잉크 내 인체 조직 특이성에 따라 분화되는 것을 검증하였다.
본 발명의 바이오 잉크 조성물은 바이오 프린팅을 위한 3D 프린터를 통해 압출되는 형태로 프린팅이 가능하고 출력 후 3D 구조를 유지하며 조직 재생을 위한 구조체로 사용될 수 있다.

Claims (15)

  1. 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함하는 3D 프린팅용 바이오 잉크 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    인체 조직 유래 성분은 무세포 동종 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM), 무세포 동종 연골(Acellular Cartilage, AC), 무세포 동종 지방(Acellular Adipose, AA), 무세포 동종 뼈(Acellular Bone, AB) 및 무세포 동종 뼈 유래 무기질(Acellular Bone Derived Mineral, ABDM)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    미세입자화된 인체 조직 유래 성분의 입경은 10 내지 1000 um인 것인 바이오 잉크 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    미세입자화된 인체 조직 유래 성분은
    (S1) 인체 조직을 탈세포화 하는 단계; 및
    (S2) 상기 탈세포화된 인체 조직을 미세입자화하는 단계를 통해 제조되는 것인 바이오 잉크 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    미세입자화하는 단계는 인체 조직을 물리적으로 분쇄하거나 또는 화학적으로 입자화하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    미세입자화된 인체 조직 유래 성분은 분화인자를 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    분화인자는 전환 성장인자(Transforming Growth Factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 표피 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 혈관내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like Growth Factor, IGF) 및 골 형태발생 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    미세입자화된 인체 조직 유래 성분은 바이오 잉크 조성물 전체 중량 대비 2 내지 20 중량부로 포함되는 것인 바이오 잉크 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    생체적합성 고분자는 아가로즈(argarose), 알긴산(alginate), 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 무세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix), 피브린/피브리노겐(fibrin/fibrinogen), 젤라틴(gelatin), 그래핀(graphene), 히알루론산(hyaluronic acid), 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리(DL-락트-코-글라이콜산(poly-D, L-lactic-co-glycolic acid, PLGA) 및 플루로닉(pluronic F 127)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    생체적합성 고분자는 바이오 잉크 조성물 전체 중량 대비 0.5 내지 10 중량부로 포함되는 것인 바이오 잉크 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    세포 및 분화인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    세포는 줄기세포(Stem cell), 섬유아세포 (Fibroblast), 연골세포 (Chondrocyte), 조골세포(Osteoblast), 상피세포(Epithelial cell), 각질세포(Keratinocyte), 내피세포(Endothelial cell) 및 신경세포(Neuron)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하고,
    분화인자는 전환 성장인자(Transforming Growth Factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 표피 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 혈관내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like Growth Factor, IGF) 및 골 형태발생 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서,
    세포 및 분화인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 함량은 바이오 잉크 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 20 중량부인 것인 바이오 잉크 조성물.
  14. 미세입자화된 인체 조직 유래 성분 및 생체적합성 고분자를 포함하는 3D 프린팅용 바이오 잉크 조성물을 압출하여 구조체를 제조하는 단계를 포함하는 구조체의 제조 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    압출된 구조체를 가교하는 단계를 추가로 포함하는 구조체의 제조 방법.
PCT/KR2019/016728 2018-11-30 2019-11-29 인체 유래 성분을 함유하고 조직 특이적 세포 분화 효과를 갖는 3d 프린팅 바이오 잉크 조성물 및 그 제조방법 WO2020111868A1 (ko)

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