CN113195652A - 包含人源成分并具有组织特异性细胞分化效应的3d打印用生物墨水组合物及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及3D(Three dimensional)打印用生物墨水组合物及其制造方法。在本发明中,根据包含在生物墨水组合物的人源成分的组织特异性,可提供具有向特定组织的细胞分化协同效应的生物墨水组合物及其制造方法。
Description
技术领域
本发明涉及三维(3D,Three dimensional)打印用生物墨水组合物及其制造方法,更详细地,涉及根据包含在生物墨水组合物的人体组织源成分的组织特异性,具有向特定组织的细胞分化协同效应的生物墨水组合物及其制造方法。
背景技术
组织工程学是将生物学、工学、材料工程学作为基础,制造人体组织及器官来代替损失或者损伤的组织的学科。因工业化、高龄化,人体组织损失或者损伤的患者数在增加,由此用于补充损失或者损伤的组织的组织工程学领域的范围在扩大。其中,最近受到关注的领域是3D生物打印。
3D生物打印是将目标结构物以三维进行扫描并获得图像之后,通过细胞和生物墨水将扫描的图像制作成三维结构形态。通常的3D打印技术有挤出式过程、喷墨式过程以及激光式过程,其中作为与细胞一起制造三维结构形态的生物打印,主要使用挤出式过程。生物打印的核心为包括存活的细胞,因此作为与细胞一起混合形成三维结构物质的生物墨水是在3D生物打印中最为重要的部分。
生物墨水应同时具有可维持微细3D结构的物理化学特性和可与存活的细胞一起使用的水准的有关生物学安全的特性。作为物理化学特性,生物墨水应具有可从3D打印机挤出的打印适性(printabilitiy)、打印后也可维持3D结构的流变特性(rheologicalcharacteristics)。作为有关生物学安全的特性,生物墨水需要执行对于细胞的生长及分化的支撑体(scaffold)作用,因此,基本上应具有细胞亲和力。另外,由3D生物打印输出的输出物包含完整的构成生物墨水的物质的同时成为可植入到体内的属性的3D输出物,因此,为了将这些输出物植入到体内,构成生物墨水的所有的物质要素应为生物相容性(biocompatible)物质,并且具有在输出物的体外培养或者体内植入环境下,可调整细胞的生长和分化的特性。同时,构成生物墨水的物质要素植入到体内之后,新生组织通过输出物在植入部位再生的期间,应显示出与新生组织的再生倾向符合的水准的输出物的体内分解倾向。
作为可构成生物墨水的生物相容性物质,可具有琼脂糖(argarose)、藻酸盐(alginate)、壳聚糖(chitosan)、胶原蛋白(collagen)、脱细胞化的细胞外基质(decellularized extracellular matrix)、纤维蛋白/纤维蛋白原(fibrin/fibrinogen)、明胶(gelatin)、石墨烯(graphene)、透明质酸(hyaluronic acid)、羟基磷灰石(hydroxyapatite)、聚己内酯(polycaprolactone,PCL)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚-D,L-乳酸-共-乙醇酸(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid,PLGA)以及普朗尼克(pluronic F 127)等。其中,藻酸盐(alginate)具有通过2价阳离子(divalent cation)的螯合作用(chelation)交联凝胶化的特征,这性质满足生物墨水的印刷适性(printability)和印刷后的机械物性。但是,单独的藻酸盐的细胞亲和力低,并且不能提供适合于细胞粘贴并生长的环境。
微粒化(micronized)的人体组织是将死亡后捐献的皮肤、骨骼、韧带、肌腱、血管、软骨、心脏瓣膜、羊膜、筋膜、神经、心包等同种异体组织脱细胞化之后,通过冻结干燥及粉碎过程被制成从数十到数百微米大小的颗粒状态。微粒化的人体组织是仅经过脱细胞工艺的人源物质,因此,细胞外基质(Extracelluar matrix,ECM)为主成分。众所周知,细胞外基质成分的90%以上为作为结构蛋白的胶原蛋白(Collagen),其余10%由作为糖蛋白(Glycoprotein)的纤连蛋白(Fibronectin)、层粘连蛋白(Laminin)、糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)等形成,除此之外存在组织特异性生长因子(Growth factor)及部分细胞因子(Cytokine),促进细胞的生长及微分化细胞的组织特异性分化。尤其,众所周知地,如在微粒化的人体组织的层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖的成分起到表面结合蛋白(Surface binding protein)的作用,将从细胞分泌的细胞因子或者生长因子等粘贴在细胞外基质结构内,有助于细胞的生长与分化。因此,包括细胞外基质的生物墨水与细胞一起被培养时,更便于传递细胞生长与分化所需的细胞因子及生长因子,从而具有结构体可变化为与组织更类似的形态的优点(非专利文献1)。另外,在相互不同的组织提取的细胞外基质具有各组织的特性的组织特异性(Tissue specificity),因此,在其组织粘贴适当的细胞因子或者生长因子,来营造适合于细胞存活并构造各组织的环境(非专利文献2)。
另外,微粒化的人体组织作为微单位的颗粒形态,与生物源的高分子以水凝胶形态混合进行水合时,物理上均匀地混合,从而具有可根据含量调整生物墨水的机械强度的优点。为了制造成液体水凝胶,当前用于生物墨水的细胞外基质以溶解于胃蛋白酶和乙酸或者盐酸的状态使用,因此,以细胞外基质本身提高机械物性存在限制。因此,包括微粒化的人体组织的生物墨水的机械物性高于细胞外基质溶液生物墨水,微粒化的人体组织本身作为具有组织形态的构成要素,可营造更适合细胞存活的环境。
最后,从牛、猪、马等的异种组织提取的细胞外基质存在动物源病毒及人兽交叉感染的忧虑,与之相反,人源细胞外基质从异种物质的体内安全问题脱离,因此,可被使用为适用于人体的最佳材料。由此,微粒化的人体组织的细胞亲和性非常高,并且是人源的细胞外基质,因此,具有几乎没有免疫排斥反应、异物反应、炎症反应等,可植入到体内的优点。
[非专利文献]
[1]D.Choudhury et al.Trend in Biotechnology.2018
[2]R.Londono et al.Annals of Biomedical Engineering.2015
发明内容
(要解决的课题)
本发明的目的在于提供一种包含人体组织源成分的3D生物打印用生物墨水组合物。
具体地,本发明的目的在于提供一种将多种人体组织源成分适用于生物墨水组合物,从而在3D打印的结构物内可进行细胞生长及组织特异性分化的生物墨水组合物及其制造方法。
(解决课题的方法)
本发明提供一种3D打印用生物墨水组合物,其包括微粒化的人体组织源成分及生物相容性高分子。
本发明还提供一种结构体的制造方法,其包括挤出包括微粒化的人体组织源成分及生物相容性高分子的3D打印用生物墨水组合物来制造结构体的步骤。
(发明效果)
本发明提供包含微粒化的人体组织的生物墨水组合物。
根据本发明的生物墨水组合物,具有细胞亲和性,从而在细胞生长及分化上显示优异的效果,根据生物墨水内人体组织的源,可提供组织特异性分化。另外,所述生物墨水组合物包括微粒化的人源组织成分,因此可提高机械物性。
根据本发明,将生物墨水组合物适用于3D生物打印而输出的输出物内细胞,可根据生物墨水的人体组织源分化。生物墨水组合物包括存活的细胞时,由3D生物打印输出的输出物含有微粒化的人体组织成分,因此,细胞亲和力高且细胞可长时间存活,并且人体组织含有细胞生长因子及分化因子,从而可调整细胞的功能和分化。
另外,本发明的生物墨水组合物,可通过用于生物打印的3D打印机以被挤出的形态进行打印,并且输出后维持3D结构并可用于组织再生的结构体。
另外,在本发明中,将包含多种人体组织源成分的生物墨水组合物与各组织的细胞一起,通过3D生物打印适用为生物用材料,从而可适用在多种领域。
附图说明
图1的A是示出将同种异体脱细胞真皮基质粉末(M-ADM)与生物相容性高分子一起混合,并填充到注射器的基于M-ADM的生物墨水(左)和通过3D打印机进行打印并交联的结构体的状态(右)。B是示出将脱细胞软骨粉末(M-AC)与生物相容性高分子一起混合,并填充到注射器的基于M-AC的生物墨水(左相)和通过基于挤出的3D打印机进行打印并交联的结构体的状态(右相)。打印后,交联的结构体对于外部压力维持结构的状态(下)。
图2的A是示出培养包括人真皮成纤维细胞的基于M-ADM的生物墨水,并用100倍率的荧光显微镜确认1、7、21、28日后的细胞的存活与否的结果。图表是按培养时期定量存活细胞数量的结果。
图2的B是示出培养包括人软骨细胞的基于M-AC的生物墨水,并用100倍率的荧光显微镜确认1、7、21、28日后的细胞的存活与否的结果。图表是按培养时期定量存活细胞数量的结果。
在所述图2的A及B中,用箭头表示了死亡的细胞。未用箭头表示的细胞表示存活的细胞。
图3的A是示出培养包括脂肪源干细胞的基于M-ADM的生物墨水,并用100倍率的荧光显微镜确认7、14、21、28日后的细胞的存活与否的结果。图表是按培养时期定量由绿色表示的存活细胞数量的结果。
图3的B是示出培养包括脂肪源干细胞的基于M-AC的生物墨水,并用100倍率的荧光显微镜确认细胞的存活与否的结果。图表是按培养时期对绿色表示的存活细胞数量进行定量的结果。
图4的A是示出培养包括脂肪源干细胞的基于M-ADM的生物墨水,并用DAPI、I型胶原蛋白(Collagen type 1)、alpha-SMA抗体对21日后的组织切片进行染色的图。B是示出培养包括脂肪源干细胞的基于M-AC的生物墨水,并用qRT-PCR分析对3周、5周后的FSP1的mRNA表达量进行定量的结果。
图4的C、D是示出培养人软骨细胞和脂肪源干细胞,并用DAPI、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、CD44抗体染色组织切片的图。C示出人软骨细胞和脂肪源干细胞表达各个的特定标志物,D示出基于M-AC的生物墨水培养4周后确认脂肪源干细胞的软骨分化的结果。
图4的E是示出培养包括脂肪源干细胞的基于M-AC的生物墨水,并用qRT-PCR分析对1周、2周后的II型胶原蛋白(Collagen type II)与SOX-9的mRNA表达量进行定量的结果。
具体实施方式
本发明涉及包括微粒化的人体组织源成分及生物相容性高分子的3D打印用生物墨水组合物。
在本发明的实施例中,分析在基于M-ADM的生物墨水内的成纤维细胞存活能力、在基于M-AC的生物墨水内的人软骨细胞存活能力以及在基于M-ADM及基于M-AC的生物墨水内的脂肪源干细胞存活能力,从而确认了本发明的生物墨水组合物的细胞亲和性。另外,确认了在基于M-ADM的生物墨水内的脂肪源干细胞向成纤维细胞的分化及在基于M-AC的生物墨水内的脂肪源干细胞向软骨细胞的分化,从而确认了本发明的生物墨水组合物的活性。另外,确认了所述生物墨水组合物作为3D生物打印的适用可能性。
以下,更详细地说明本发明的3D打印用生物墨水组合物。
根据本发明的生物墨水组合物(或者称为生物墨水)包括微粒化的人体组织源成分及生物相容性高分子。
在本发明中,人体组织源成分意味着脱细胞化的组织源成分,提供能够营造与原组织类似的细微环境的条件。其不是人为生成的物质,而是在人体内通过与细胞的相互作用形成的结构,因此,具有组织特化的构成成分及相位,可提供有利于细胞的生长和分化的环境。
在本发明中,微粒化的人体组织源成分意味着经过了对人体组织进行脱细胞化的步骤,并粉碎至10-1000μm大小。微粒化的人体组织源成分可用作提高生物相容性、细胞黏附性、生物墨水的物理特性的目的。
在一具体示例中,人体组织可从死亡后捐献的皮肤、骨骼、韧带、肌腱、血管、软骨、心脏瓣膜、羊膜、筋膜、神经、心包等同种异体组织获得。
在一具体示例中,人体组织源成分作为脱细胞化的人体组织,可包括选自由脱细胞真皮基质(Acellular Dermal Matrix,ADM)、脱细胞软骨(Acellular Cartilage,AC)、脱细胞脂肪(Acellular Adipose,AA)、脱细胞骨(Acellular Bone,AB)以及脱细胞骨源性矿物质(Acellular Bone Derived Mineral,ABDM)组成的组中的一个以上。此时,同种异体软骨可以是玻璃体软骨、弹性软骨、纤维性软骨或者这些的混合物。尤其,皮肤及软骨源的微粒化的人体组织源成分的主成分为细胞外基质,可强化生物墨水的组织特异性。
在一具体示例中,人体组织源成分被微粒化,并且所述微粒化的人体组织源成分的平均粒径可以是10-1000um、10-700um或者10-500um。在所述粒径范围中,生物墨水可体现通过微单位的3D打印喷嘴被输入的形态,并且可赋予可维持结构体结构的强度。另外,在细胞外基质进行酶处理,从而与制成水凝胶形态的生物墨水不同,可保存组织的原来结构而提供有利于细胞的生长和分化的环境。
在一具体示例中,生物墨水组合物包括作为微粒化的人体组织源成分的脱细胞真皮基质(Acellular Dermal Matrix,ADM)时,可称为基于M-ADM的生物墨水,而包括脱细胞软骨(Acellular Cartilage,AC)时,可称为基于M-AC的生物墨水。
在一具体示例中,所述微粒化的人体组织源成分可通过将人体组织脱细胞化的步骤S1及将所述脱细胞化的人体组织微粒化的步骤S2制造。
所述步骤S1及S2的顺序不受限制,可按S1及S2依次进行,或者先执行步骤S2之后执行S1。
步骤S1作为脱细胞化人体组织的步骤,所述脱细胞化可由本领域的通常方法执行。
例如,在所述步骤可执行脱脂工艺、脱细胞化工艺和/或者脱毛工艺。脱脂工艺可使用醇和/或己烷等极性溶液及非极性溶液执行,脱细胞化工艺可使用氢氧化钠(NaOH)等碱性溶液执行。另外,脱毛工艺可使用Na2S等的碱性溶液执行。所述工艺可根据使用的人体组织适当地选择并执行。
进行所述脱细胞化之后,还可执行漂白工艺和/或中和工艺。
另外,为了便于执行后述的微粒化,可冻结干燥所述脱细胞化的人体组织来去除水分。
步骤S2是微粒化脱细胞的人体组织的步骤。
所述微粒化可将人体组织物理性粉碎或者化学性颗粒化来执行。
物理工艺的种类不受特别的限定,例如,可以利用粉碎机、尤其微粉碎机进行粉末化,或者旋转球进行粉碎的粉末化,或者在极低温下旋转球或者杆进行粉碎来微粒化。另外,化学工艺的种类不受特别的限定,例如,可通过有机/无机溶剂、碱性溶剂等,执行从组织脱细胞化的工艺并进行微粒化。
在一具体示例中,微粒化的人体组织源成分可包括分化因子。分化因子意味着可调整细胞的生长和功能的物质。所述分化因子可起到生长因子的作用,尤其适用于干细胞时,可诱导向其他细胞的分化。
例如,所述分化因子可以是选自由转化生长因子(Transforming Growth Factor-beta,TGF-β)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor,VEGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)以及骨形态发生蛋白(Bone Morphogenic Protein,BMP)组成的组中的一个以上。
在一具体示例中,微粒化的人体组织源成分的含量可以是相对于生物墨水组合物整个重量(100重量份)的2-20重量份。另外,所述微粒化的人体组织源成分可以按5-10%(w/v)存在于生物墨水组合物内。
在本发明中,生物相容性高分子向制得的结构体赋予生物相容性。
在一具体示例中,生物相容性高分子的种类不受特别的限定,例如,可使用选自由琼脂糖(argarose)、藻酸盐(alginate)、壳聚糖(chitosan)、胶原蛋白(collagen)、脱细胞化的细胞外基质(decellularized extracellular matrix)、纤维蛋白/纤维蛋白原(fibrin/fibrinogen)、明胶(gelatin)、石墨烯(graphene)、透明质酸(hyaluronic acid)、羟基磷灰石(hydroxyapatite)、聚己内酯(polycaprolactone,PCL)、聚乳酸(polylacticacid,PLA)、聚-D,L-乳酸-共-乙醇酸)(poly-D,L-lactic-co-glycolic acid,PLGA)以及普朗尼克(pluronic F 127)组成的组中的一个以上。
在一具体示例中,作为所述生物相容性高分子可使用藻酸盐。所述藻酸盐可包括钙、钠、钾、铵或者镁藻酸盐。所述藻酸盐具有优秀的生物分解性,并提高生物墨水的物理特性,并且具有便于交联的特征。具体地,藻酸盐(alginate)通过2价阳离子(divalentcation)的螯合作用(chelation)被交联凝胶化,因此通过所述凝胶化性质可满足作为生物墨水的印刷适性(printability)和印刷后的机械物性。
在一具体示例中,生物相容性高分子的含量可以是相对于生物墨水组合物整个重量(100重量份)的0.5-10重量份。在所述重量份范围可满足制造支撑体时所期望的物性。
在本发明中,生物墨水组合物还可包括选自由细胞及分化因子组成的组中的一个以上。
在一具体示例中,作为细胞可使用用于组织再生的细胞,例如,可使用选自由干细胞(Stem cell)、成纤维细胞(Fibroblast)、软骨细胞(Chondrocyte)、成骨细胞(Osteoblast)、上皮细胞(Epithelial cell)、角质细胞(Keratinocyte)、内皮细胞(Endothelial cell)和神经元(Neuron)组成的组中的一个以上。
另外,分化因子可包含于微粒化的人体组织源成分本身,也可以额外添加至墨水组合物,从而可极大化所述分化因子的效果,即细胞的生长及功能调整。
例如,所述分化因子可使用上述的种类,具体地,可使用选自由转化生长因子(Transforming Growth Factor-beta,TGF-β)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast GrowthFactor,FGF)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-likeGrowth Factor,IGF)以及骨形态发生蛋白(Bone Morphogenic Protein,BMP)组成的组中的一个以上。
在一具体示例中,选自细胞及分化因子组中的一个以上的含量可以是相对于墨水组合物整个重量(100重量份)的0.001-20重量份。所包含的所述细胞可以是10-20重量份,所包含的分化因子可以是0.001重量份。
另外,本发明的墨水组合物可包括水。
另外,本发明提供上述的生物墨水组合物的制造方法。
根据本发明的生物墨水组合物混合上述的成分,即微粒化的人体组织源成分及生物相容性高分子来制造。微粒化的人体组织源成分是微单位的颗粒形态,因此,在与生物源高分子进行水合时无需另外的混合工艺,也可物理地均匀混合。同时,在本发明中,根据微粒化的人体组织源成分的含量,可调整生物墨水的机械强度。
另外,本发明提供一种结构体的制造方法,其包括挤出包括微粒化的人体组织源成分及生物相容性高分子的3D打印用生物墨水组合物来制造结构体的步骤。
在一具体示例中,根据本发明的生物墨水组合物可适用于3D生物打印。
所述3D生物打印通过三维扫描目标结构物来获得图像,通过生物墨水将扫描的图像制作成三维结构形态的工艺。在本发明中可适用在基于挤出的过程。
在本发明中,可将3D打印用生物墨水组合物的挤出物表示为结构体、输出物或者支撑体(scaffold)。根据本发明的生物墨水组合物可执行对细胞的生长及分化的支撑体作用,具有生物亲和性,并且具有生物相容性。因此,可便于移植到体内,并且在体外培养或者体内移植环境可调节细胞的生长和分化。
在本发明中,可利用3D打印机挤出生物墨水组合物来制造结构体。具体地,根据由3D计算机预设计的程序打印三维图数据可制造结构体。
根据本发明所要制造的目的,可适当地调整挤出力以及挤出速度来制造结构体。
本发明还可包括使挤出的结构体交联的步骤。
所述交联可通过本领域通常使用的工艺来执行。
在一具体示例中,作为生物相容性高分子使用藻酸盐时,所述藻酸盐通过2价阳离子(divalent cation)的螯合作用(chelation)被交联凝胶化,因此利用此特性可执行交联。
在本发明提供用于3D生物打印的生物墨水组合物,通过生物打印完成的结构体可用于生物组织的再生。具体地,用生物墨水制造的结构体具有生物亲和性,可在支撑体内含有细胞及粘贴在表面而诱导组织再生,因此,可有用地使用在生物组织再生、组织工程学、再生医学。
本发明的实施方式
以下,通过实施例更具体地说明本发明。但是,本发明的范围不限定于以下实施例,本领域的技术人员应该理解在不脱离权利要求记载内容所得出的技术思想的范围内,可进行多种变形、修改或者应用。
实施例
实施例1:制造包括微粒化的脱细胞真皮基质(Micronized Acellular DermalMatrix,M-ADM)组织的生物墨水
(1)制造M-ADM粉末
脱细胞化皮肤组织(为了非盈利目的的患者治疗而从组织库捐献的尸体中收集)。
首先,利用醇(alcohol)和己烷(Hexane)对皮肤组织进行脱脂过程。其后,利用氢氧化钠(NaOH)去除表皮和细胞,利用硫化钠(Na2S)去除粘贴在组织的毛。然后,经过氧化氢(H2O2)后利用蒸馏水进行中和及清洗。被清洗的皮肤组织通过冻结干燥去除水分,并利用微粉碎机粉碎组织。在所述粉碎时,通过直径为250-500μm的筛子(sieve)制作500μm以下的真皮组织粉末。
对所述制作的粉末形态的组织进行灭菌。
(2)制造基于M-ADM的生物墨水
混合(1)制作的M-ADM粉末和藻酸盐水溶液,制造水凝胶形态的生物墨水组合物。
准备藻酸盐1-2%(w/v)水溶液。用0.22μm注射器式过滤器过滤之后使用藻酸盐水溶液。
在藻酸盐水溶液水合M-ADM 5-10%(w/v)。将两个注射器连接到鲁尔适配器(LuerAdapter)并均匀水合来制造组合物。
图1的A是将基于M-ADM的生物墨水填充到注射器的状态。
实施例2:制造包括微粒化的脱细胞软骨(Micronized Acellular Cartilage,M-AC)组织的生物墨水
(1)制造M-AC粉末
利用微粉碎机粉碎软骨组织(为了非盈利目的的患者治疗而从组织库捐献的尸体中收集)。所述粉碎中,通过直径为250-500um的筛子(sieve)获得500um以下的软骨组织粉末。
其后,获得软骨组织粉末后进行脱细胞化。
首先,利用醇(alcohol)和己烷(Hexane)对软骨组织进行脱脂过程。其后,利用氢氧化钠(NaOH)去除细胞,利用乙醇(Ethanol)和蒸馏水进行清洗。通过冻结干燥去除水分之后,利用电子束对粉末形态的组织进行灭菌。
(2)制造基于M-AC的生物墨水
混合在(1)制作的M-AC粉末和藻酸盐水溶液,制造水凝胶形态的生物墨水组合物。
准备藻酸盐1-2%(w/v)水溶液。用0.22μm注射器式过滤器过滤之后使用藻酸盐水溶液。
在藻酸盐水溶液水合M-AC 5-10%(w/v)。将两个注射器连接到鲁尔适配器(LuerAdapter)并均匀水合来制造组合物。
图1的B是将基于M-AC的生物墨水填充到注射器的状态。
实验例1:分析生物墨水的细胞亲和性
(1)分析在生物墨水内的成纤维细胞或者人软骨细胞存活能力
①方法
使用人真皮成纤维细胞(Human Dermal Fibroblast)确认了在实施例1制造的基于M-ADM的生物墨水的细胞亲和性。
具体地,将2×107细胞(cells)的人真皮成纤维细胞与1ml的基于M-ADM的生物墨水混合在100μl的培养基。混合时,通过将两个注射器连接在鲁尔适配器而均匀地水合。利用22G注射针挤出与所述细胞混合的生物墨水,并制造宽度10mm、长度10mm、间隔2.5mm的网格图案形态的结构物。
完成网格图案形态的结构物之后,利用1%氯化钙溶液处理所述结构物5-10分钟,以进行交联。将交联的结构物由磷酸盐缓冲液(PBS)清洗之后,沉浸在细胞培养基中,并在细胞培养基中进行培养。
以如下方式进行细胞亲和性分析。
将存活有细胞的结构物培养1日、1周、2周、3周、4周后,使用活/死细胞存活能力测定试剂盒(Live/dead cell viability assay kit(Life Technology,USA))进行分析。将溶解有0.5μl/ml钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和2ul/ml溴乙啡锭二聚体-1(Ethidiumhomodimer-1)的培养基沉浸在结构体并反应30分钟。反应之后,通过共聚焦显微镜(LSM700,Carl Zeiss,Germany)进行确认。具体地,以10μm间隔聚焦至约200μm深度,从而确认结构体内部的细胞存活。
另一方面,使用人软骨细胞(Human Chondrocyte)确认了在实施例2制造的基于M-AC的生物墨水的细胞亲和性。
具体地,将2×107细胞(cells)的人软骨细胞与1.8ml基于M-AC的生物墨水混合在200μl的培养基。混合时,通过将两个注射器连接在鲁尔适配器而均匀地水合。利用22G注射针挤出与所述细胞混合的生物墨水,并制造宽度10mm、长度10mm、间隔2.5mm的网格图案形态的结构物。
完成网格图案形态的结构物之后,利用1%氯化钙溶液处理所述结构物7-10分钟,以进行交联。将交联的结构物由磷酸盐缓冲液(PBS)清洗之后,沉浸在细胞培养基中,并在细胞培养基中进行培养。
与所述M-ADM的分析方法相同的方式进行细胞亲和性分析。
②结果
图2的A显示了基于M-ADM的生物墨水的细胞亲和性分析结果。
通过图2的A,可确认随着时间的流逝,存活细胞变多。通过此,可确认细胞不仅可在生物墨水内存活,而且还能够增殖。
另外,图2的A是定量化所述结果的结果。可以确认培养4周后,相比于培养1日后细胞数增加4倍以上。
一方面,图2的B示出了基于M-AC的生物墨水的细胞亲和性分析结果。
通过图2的B,与基于M-ADM的生物墨水相同,可确认随着时间的流逝,存活的细胞变多。另外,可确认细胞不仅在生物墨水内存活,而且还能够增殖。
(2)在生物墨水内的脂肪源干细胞存活能力
①方法
使用脂肪源干细胞(Adipose tissue-derived stem cell)确认了在实施例1制造的基于M-ADM的生物墨水的细胞亲和性。
具体地,在包括1×107细胞的脂肪源干细胞的细胞浑浊液100μl中混合1ml的基于M-ADM的生物墨水。混合时,通过将两个注射器连接在鲁尔适配器而均匀地水合。利用22G注射针挤出与细胞混合的生物墨水,并制造宽度10mm、长度10mm、间隔2.5mm的网格图案形态的结构物。
完成网格图案形态的结构物之后,利用1%氯化钙溶液处理5-10分钟所述结构物,以进行交联。将交联的结构物用PBS清洗之后,沉浸在细胞培养基中,并在细胞培养基中进行培养。
以如下方式进行细胞亲和性分析。
将存活有细胞的结构物培养1周、2周、3周、4周之后,用活/死细胞存活能力测定试剂盒(Live/dead cell viability assay kit(Life Technology,USA))进行染色,并通过共聚焦显微镜(LSM 700,Carl Zeiss,Germany)进行确认。
一方面,使用脂肪源干细胞(Adipose tissue-derived stem cell)确认了基于M-AC的生物墨水的细胞亲和性。
具体地,在包括2×107细胞的脂肪源干细胞的细胞浑浊液200μl中混合1.8ml的基于M-AC的生物墨水。混合时,通过将两个注射器连接在鲁尔适配器而均匀地水合。利用22G注射针挤出与细胞混合的生物墨水,并制造宽度10mm、长度10mm、间隔2.5mm的网格图案形态的结构物。
完成网格图案形态的结构物之后,利用1%氯化钙溶液处理所述结构物7-10分钟,以进行交联。用PBS清洗交联的结构物之后,沉浸在细胞培养基中,并在细胞培养基中进行培养。
与所述M-ADM相同方式进行细胞亲和性分析。
②结果
图3的A显示了基于M-ADM生物墨水的细胞亲和性分析结果。
通过图3的A,可确认随着时间的流逝,细胞的量在生物墨水结构体内增加。另外,确认了适当地调整生物墨水组合物中的M-ADM与藻酸盐的比率,可提高使脂肪源干细胞存活及增殖的细胞相容性及细胞亲和性。
图3的A表示出了对图中由绿色表示的存活细胞进行定量的结果。通过此,可确认随着时间增加,细胞增殖。
图3的B示出了基于M-AC的生物墨水的细胞亲和性分析结果。
通过图3的B,可确认随着培养时间的流逝,细胞的量在生物墨水结构体内增加。另外,确认了适当地调整生物墨水组合物中的M-AC与藻酸盐的比率,可提高使脂肪源干细胞存活及增殖的细胞相容性及细胞亲和性。
图3的B表示出了对图中由绿色表示的存活细胞进行定量的结果。通过此,可确认随着时间增加,细胞增殖。
实验例2:确认生物墨水的活性
(1)确认在生物墨水内的脂肪源干细胞向成纤维细胞的分化
①方法
通过上述的实验例1,确认了脂肪源干细胞在生物墨水组合物的结构物存活。在本实验例中评估了根据本发明的生物墨水组合物是否不仅可调整存活能力,而且还可调整细胞的功能。
通过确认在生物墨水组合物内脂肪源干细胞向成纤维细胞的分化与否来进行所述评估。
向成纤维细胞的分化与否是通过利用成纤维细胞的特定标志物的组织分析来进行的。收集将基于M-ADM的生物墨水和脂肪源干细胞一起培养的结构物。利用OCT化合物(OCT Compound)制作冻结标本,通过冻结组织切割器制作厚度为4-20μm的切片。利用作为成纤维细胞的特定标志物的I型胶原蛋白(Collagen type I)和alpha-SMA的抗体对载玻片上的组织切片进行染色之后,由荧光显微镜确认了I型胶原蛋白(Collagen type I)和alpha-SMA的表达。
另外,对于脂肪源干细胞是否分化为成纤维细胞,通过qRT-PCR定量分析了作为成纤维细胞的标志物的成纤维细胞特异蛋白1(Fibroblast specific protein-1,FSP-1)的mRNA表达。
②结果
在图4示出了评估结果。
通过图4的A可确认脂肪源干细胞在基于M-ADM的生物墨水的支撑体内表达作为成纤维细胞标志的I型胶原蛋白(collagen type 1)和alpha-SMA。
另外,通过图4的B可确认脂肪源干细胞与基于M-ADM的生物墨水一起被培养5周时,FSP-1的表达增加。并且可确认此时的表达量与成纤维细胞表达的FSP-1的量相似或者更高的水准。
(2)确认在生物墨水内脂肪源干细胞向软骨细胞的分化
①方法
确认了基于M-AC的生物墨水内的脂肪源干细胞是否分化为软骨细胞。
具体地,脂肪源干细胞是否分化为软骨细胞是利用软骨细胞的特定标志物并通过组织分析进行的。收集将基于M-AC的生物墨水和脂肪源干细胞一起培养的结构物。利用OCT化合物(OCT Compound)制作冻结标本并通过冻结组织切割器在载玻片上制作厚度为4-20μm的切片。利用作为软骨细胞的特定标志物的聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的抗体和作为脂肪源干细胞的特定标志物的CD44的抗体对载玻片上的组织切片染色之后,由荧光显微镜确认了聚集蛋白聚糖(Aggrecan)和CD44的表达。
另外,对于脂肪源干细胞是否分化为软骨细胞,通过qRT-PCR定量分析了软骨细胞标志物的II型胶原蛋白(Collagen type II)和SOX-9的mRNA表达。
②结果
在图4示出了评估结果。
图4的C是将人软骨细胞和脂肪源干细胞进行染色来显示各个标志物的聚集蛋白聚糖(Aggrecan)和CD44的表达。另外,D中,对基于M-AC的生物墨水支撑体内的脂肪源干细胞进行染色来确认了各个特定标志物的表达。通过此,可确认在基于M-AC的生物墨水支撑体内中,培养初期作为脂肪源干细胞的标志物的CD44表达,而培养后作为软骨细胞的标志物的聚集蛋白聚糖(Aggrecan)表达。
另外,通过图4的E可确认脂肪源干细胞与基于M-AC的生物墨水一起被培养两周时,II型胶原蛋白(Collagen type II)和SOX-9的表达增加。可确认此时的表达量与人软骨细胞表达的II型胶原蛋白(Collagen type II)和SOX-9的量相似或者更高的水准。
实验例3:用于3D生物打印的生物墨水的活用与否
为了确认用3D打印机能否输出基于M-ADM的生物墨水,利用3D生物打印机进行输出。
将生物墨水10ml放入注射器,通过22G的注射针以4mm/s的挤出速度进行打印。以12%孔隙度(porosity)的条件完成了大小为10mm×10mm×2mm(宽度×长度×高度)的结构体。
在图1的A示出了用基于M-ADM的生物墨水进行打印的结果物。按照计划好的模样,以不倒塌的形态完成了结构体,打印后利用氯化钙溶液交联5-10分钟时,可确认能够维持模样。可确认,即使用镊子拾起,结构体也具有形态不发生倒塌的强度。
一方面,在图1的B示出了用基于M-AC的生物墨水进行打印的结果物。对于M-AC而言,与基于M-ADM的生物墨水相同,按照不脱离计划好的模样,以不倒塌的形态完成了结构体,并且可确认能够维持模样。尤其,确认了以折叠的模样弯曲结构体之后,也可再次展开并且维持结构的形态。通过上述结果,验证了通过3D打印机能够以多种结构和模样打印包括微粒化的人体组织的生物墨水,能够作为用于生物打印的生物墨水来使用,且在生物墨水提供的环境的影响下,干细胞会根据生物墨水内人体组织特异性进行分化。
工业上可利用性
能够通过用于生物打印的3D打印机挤出的形态打印本发明的生物墨水组合物,并且输出生物墨水组合物后维持3D结构,可用作用于组织再生的结构体。
Claims (15)
1.一种3D打印用生物墨水组合物,其中,所述3D打印用生物墨水组合物包括微粒化的人体组织源成分及生物相容性高分子。
2.根据权利要求1所述的生物墨水组合物,其中,人体组织源成分包括选自由脱细胞真皮基质、脱细胞软骨、脱细胞脂肪、脱细胞骨以及脱细胞骨源性矿物质组成的组中的一个以上。
3.根据权利要求1所述的生物墨水组合物,其中,微粒化的人体组织源成分的颗粒直径为10-1000um。
4.根据权利要求1所述的生物墨水组合物,其中,微粒化的人体组织源成分通过以下步骤制造:
步骤S1,将人体组织脱细胞化;以及
步骤S2,将脱细胞化的所述人体组织微粒化。
5.根据权利要求4所述的生物墨水组合物,其中,微粒化的步骤中,将人体组织物理性粉碎或者化学性颗粒化。
6.根据权利要求1所述的生物墨水组合物,其中,微粒化的人体组织源成分包括分化因子。
7.根据权利要求6所述的生物墨水组合物,其中,分化因子包括选自由转化生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子以及骨形态发生蛋白组成的组中的一个以上。
8.根据权利要求1所述的生物墨水组合物,其中,相对于生物墨水组合物整个重量,包括2-20重量份的微粒化的人体组织源成分。
9.根据权利要求1所述的生物墨水组合物,其中,生物相容性高分子包括选自由琼脂糖、藻酸盐、壳聚糖、胶原蛋白、脱细胞化的细胞外基质、纤维蛋白纤维蛋白原、明胶、石墨烯、透明质酸、羟基磷灰石、聚己内酯、聚乳酸、聚-D,L-乳酸-共-乙醇酸以及普朗尼克组成的组中的一个以上。
10.根据权利要求1所述的生物墨水组合物,其中,相对于生物墨水组合物整体重量,包括0.5至10重量份生物相容性高分子。
11.根据权利要求1所述的生物墨水组合物,其中,所述3D打印用生物墨水组合物还包括选自由细胞及分化因子组成的组中的一个以上。
12.根据权利要求11所述的生物墨水组合物,其中,细胞包括选自由干细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞及神经细胞组成的组中的一个以上,
分化因子包括选自由转化生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子及骨形态发生蛋白组成的组中的一个以上。
13.根据权利要求11所述的生物墨水组合物,其中,相对于生物墨水组合物整个重量,选自由细胞及分化因子组成的组中的一个以上的含量为0.001-20重量份。
14.一种结构体的制造方法,其中,所述结构体的制造方法包括挤出3D打印用生物墨水组合物来制造结构体的步骤,所述3D打印用生物墨水组合物包括微粒化的人体组织源成分及生物相容性高分子。
15.根据权利要求14所述的结构体的制造方法,其中,所述结构体的制造方法还包括对挤出的结构体交联的步骤。
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CN115779151A (zh) * | 2022-11-29 | 2023-03-14 | 中国人民解放军总医院第一医学中心 | 生物墨水及其制备方法和应用 |
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Publication number | Publication date |
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KR20200066218A (ko) | 2020-06-09 |
KR102302770B1 (ko) | 2021-09-16 |
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