JP4893915B2 - 移植材料 - Google Patents

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本発明は、移植材料に関する。
本発明の移植材料は、移植後においても細胞の機能を長期間保持することができる。
種々の細胞を培養増殖したのち、生体内へ移植する再生医療が行われつつある。多くの方法はフラスコ表面等2次元の平面上での細胞培養増殖を行い、その細胞を回収して細胞そのものの移植、あるいはその回収された細胞を、各種の多孔体のセラミック等の無機材料やポリ乳酸等の生体吸収性高分子に播種して、3次元培養組織を構築した後に生体内に移植している。
これらの方法により、各種の生体材料を用いて3次元培養組織の作製が可能ではあるが、セラミック等の無機材料は硬く、荷重部位である骨組織等の修復には優れているものの、他の組織・臓器修復には用いられにくい。また、ポリ乳酸等の生体吸収性高分子は、合成過程の改変により硬度、生体内での分解速度等のコントロールが可能であるが、細胞の接着部位に乏しく、有効な細胞の播種は困難である。
また、乳ガンの治療のための乳房切除術などの外科手術、事故などにより身体の一部が失われる場合があり、また、美容目的で身体の一部を修復、特に隆起させたい場合がある。
本発明は、恒久的な皮膚の隆起を行い、組織の再建もしくは修復を行うことを目的とする。
また、本発明は、移植用の再生組織を3次元的に構築することを目的とする。
本発明は、以下の移植材料に関する。
1. 骨芽細胞および軟骨細胞からなる群から選ばれる少なくとも1種の細胞とゲル材料
もしくは生体内でゲル化可能なゲル前駆体材料を含む、皮膚を隆起させる処置ための移植材料。
2. 前記ゲル材料もしくはゲル前駆体材料が天然または合成もしくは半合成のタンパク質、ペプチド、多糖類もしくはハイドロゲルである、項1に記載の移植材料。
3. 前記ゲル材料が種々の合成ペプチドからなる群から選ばれる少なくとも1種である
、項1又は2に記載の方法。
4. ゲル材料もしくはゲル前駆体材料の容量内に占める細胞の容量が、5−95%である項1〜3のいずれかに記載の方法。
5. 前記ゲルのゲル粘度が1〜1×106mPa・s(cP)である項1〜4のいずれかに記載の方
法。
6. 皮膚の隆起が、外科手術、疾患あるいは事故により失われた組織を再建するために行われる、項1〜5のいずれかに記載の移植材料。
7. 皮膚の隆起が、豊胸、隆鼻、あるいはしわもしくはたるみを修復するために行われる、項1〜5のいずれかに記載の移植材料。
8. ゲル材料内の間葉系幹細胞もしくはそれから分化可能な細胞を生体親和性材料内に
導入してなる、移植材料。
9. 前記生体親和性材料が、
(1) ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型アパタイト、
非晶質リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、フッ素化アパタイト、炭酸アパタイト、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、モネタイト、生体内でリン酸カルシウム類を吸着することができる無機化合物を包含するセラミックス系材料;
(2) キチン、キトサン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸
、アルギン酸、フィブロイン、デンプン、ペクチン、ペクチン酸、アガロース並びにこれらの部分分解物、酸化物、アルキレンオキシド付加物、カルボキシメチル化物及び架橋体を包含する天然高分子;及び
(3) ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、メ
タクリル酸エステル系ポリマー、シリコーン樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロラクトンなどの生体吸収性高分子の単独重合体又は共重合体を包含する合成高分子;
からなる群から選ばれる少なくとも1種である項8に記載の移植材料。
10. 上記生体親和性材料の形状が、塊状、不織布状、シート状、ビーズ状、ディスク状、多孔質状、またはスポンジ状の形状である項8または9に記載の移植材料。
11. 上記間葉系幹細胞が高分子ゲル内で種々組織に分化してなる項8〜10のいずれかに記載の移植材料。
12. 上記分化組織が骨、軟骨、神経、肝臓であることを特徴とする項8〜11のいずれかに記載の移植材料。
細胞をゲル材料の前駆体と混合し、必要に応じてこれをゲル化させることで細胞を保持し、分化誘導培養の手法により、生体外および生体内で三次元的な培養組織の作成を実現した。これらは、直接患部あるいは修復の必要な部位に移植することにより、種々組織再生・再建が可能である。移植の方法としては、切開後に培養組織を直接患部に埋入させて用いることができるが、切開等の操作を経ない、注射器やカテーテルを用いての注入という手段も用いることが出来る。
本発明において、骨芽細胞、軟骨細胞は、特に限定されないが、例えば各種の間葉系幹細胞から分化誘導したものを使用することができる。このような間葉系幹細胞からの分化誘導は、常法に従い行うことができる。
骨芽細胞および/または軟骨細胞を含む本発明の移植材料は、乳房再建術、あるいは豊胸、隆鼻、しわないしたるみをとることなど、皮膚表面を部分的に隆起させることにより処置できる場合の修復に好ましく利用できる。本発明の移植材料は、生体内で3次元ゲルを形成しており、そのなかで骨又は軟骨組織を産生している。この組織は一定の強度を持っているが、外から皮膚表面に触れた場合であっても違和感はなく、また皮膚の隆起した状態を永続的に維持することができる。本発明の移植材料により産生される骨又は軟骨組織は、皮膚の隆起を維持できれば、高い強度は必要ない。
該移植材料は、ゲル状である場合には、外科手術により皮下に埋め込むことができ、ゲル化していないが生体内に移植された時点で生体内の材料(例えば、血液や組織液などの体液)と反応してゲル化可能なゲル前駆体材料と骨芽細胞/軟骨細胞を含む場合には、注射により皮膚を隆起させたい部位の下に注入すればよい。注入する細胞の量としては、けがや手術の跡や、しわもしくはたるみを取るなどの比較的限定された場所でのわずかな皮膚隆起を行えばよい場合には、少量の細胞を生体内に入れればよく、乳房再建術や、豊胸術などの大きな隆起が必要とされる場合には、高密度の細胞を大量に使用することになる
。本発明の移植材料は、生体内でゲル化し、内部に軟骨細胞/骨芽細胞を保持できるため、軟骨/骨組織をゲル内で産生することができ、皮膚の隆起した状態を長く保つことができる。
例えば、美容状問題となる皺や皮膚のくぼみの直下にゲル内に封入した間葉系細胞を注入することにより、皺やくぼみがなくなる。この場合に用いる細胞数は該当部位あたり1
×106〜1×108個が例示される。さらに、乳房再建術や豊胸術等の場合には、大量の細胞
(1×108〜1×109個を用いることができ、さらに多くの細胞を使用することもできる。
本発明で使用するゲル材料もしくはゲル前駆体材料は、天然または合成もしくは半合成のタンパク質、ペプチド、多糖類、ハイドロゲルなどを用いることができる。
具体的なゲル材料もしくはゲル前駆体材料としては、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン等の多糖類、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、アルブミン等のタンパク質、ポリ−γ−グルタミン酸、ポリ−L−リジン、ポリアルギニンなどのポリアミノ酸、アルギニン/アラニン/アスパラギン酸の繰り返し構造を有する合成ペプチドならびにそれらの誘導体(例えば架橋剤もしくは熱などにより架橋したもの)などが挙げられる。
ゲル材料もしくはゲル前駆体材料の容量内に占める細胞の容量は、通常1〜95%、好ま
しくは5〜90%、より好ましくは30〜60%である。
ゲル材料に細胞を導入する方法、あるいは細胞を含むゲル材料を生体親和性材料に導入する方法としては、特に限定されないが、例えば大きさが1G(Gは重力加速度)より大き
く、200G以下である外力を加えるのが好ましい。外力としては、遠心力、加圧、減圧及び振動が挙げられる。
本発明の他の実施形態の移植材料は、間葉系幹細胞もしくはそれから分化可能な細胞はゲル材料内に存在し、該ゲル材料(細胞を内部に含む)は、さらに生体親和性材料内に導入された構成を有する。該移植材料は、間葉系幹細胞を前記ゲル材料もしくはゲル前駆体材料内において培養後、さらに生体親和性材料内に導入して必要に応じてゲル化ないし幹細胞を分化誘導して培養を継続することで製造することができる。このような移植材料は、生体親和性材料内で3次元的に培養して得ることができ、平面的な培養細胞と異なり、生体内で3次元的に機能する再生組織として機能することができる。細胞がゲル内部にあることで、細胞の3次元構造を維持しやすくなり、移植後の機能性を高めることができる。
前記生体親和性材料としては、以下の(1)〜(3)が例示できる:
(1) ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型アパタイト、非
晶質リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、フッ素化アパタイト、炭酸アパタイト、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、モネタイト、生体内でリン酸カルシウム類を吸着することができる無機化合物を包含するセラミックス系材料;
(2) キチン、キトサン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、
アルギン酸、フィブロイン、デンプン、ペクチン、ペクチン酸、アガロース並びにこれらの部分分解物、酸化物、アルキレンオキシド付加物、カルボキシメチル化物及び架橋体を包含する天然高分子;及び
(3) ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、メタ
クリル酸エステル系ポリマー、シリコーン樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロラクトンなどの生体吸収性高分子の単独重合体又は共重合体を包含する合成高分子。
好ましい生体親和性材料としては、ハイドロキシアパタイト,リン酸三)カルシウム,
炭酸カルシウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などが挙げられる。
1つの具体的な実施形態において、間葉系幹細胞はゲル内に封入して用い、必要に応じ
て分化誘導することができるが、1日から28日間分化誘導培養を行うことにより、間葉系幹細胞を軟骨細胞あるいは骨芽細胞に分化させた後にゲル内に封入することや、ゲル内に封入した間葉系幹細胞を1日から28日間分化誘導培養を行い、軟骨細胞あるいは骨芽細胞に分化させた上移植することも可能である。この場合、軟骨基質あるいは骨基質がゲル内で形成されるので、ある程度の硬度を保つことが出来、移植が容易となる。
本発明の移植材料は、例えば、骨・軟骨再生には細胞濃度を1×106〜1×108個/mlの比較的高濃度に調整し、直接骨欠損あるいは軟骨欠損等に移植する、または,生体親和性材料と組み合わせて移植する,すなわち細胞を封入したゲル材料又はその前駆体材料を各種の生体親和性材料に播種し、1〜24時間の短期間培養することによって足場材に高密度で付着せしめた後に、骨欠損あるいは軟骨欠損等に移植する。これにより、間葉系細胞が移植された部位で骨組織あるいは軟骨組織に分化する。さらに、軟骨基質や骨基質を十分に産生するため、培養期間を1〜3週間延長することも可能である。
虚血性の心筋の回復や拡張型心筋症の治療、もしくは慢性末梢性動脈閉塞性疾患(糖尿病性壊死、動脈硬化性閉塞症、バージャー病など)においてはゲル内に封入した間葉系細胞を患部に注入する。その場合用いられる細胞数は患部あたり1×107〜1×109個を使用することができる。
また、間葉系細胞は骨、軟骨細胞のみならず、各種の分化誘導因子の添加により、肝細胞、神経細胞など各種細胞への分化誘導が可能であり、これらの細胞を上記の方法を用いて種々組織・臓器の修復部に移植して、再生することも可能である。
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例1
本発明の実施例1として、ラット骨髄由来間葉系細胞/合成高分子ゲル複合体の作製方
法、合成高分子ゲル内での、ラット骨髄由来間葉系細胞の骨分化誘導実験の結果について記述する。

1.細胞培養
ラット骨髄由来間葉系細胞(以下MSCとする)は、雄Fisher344ラット大腿骨より採取した。採取したMSCを、MEM培地に15%ウシ胎児血清(以下FBSとする)、100U/mLペニシリン
G、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンBを加えたもの(以下基
本培地とする)で培養し増殖させた。培養皿の底面に接着し増殖したMSCをトリプシン処
理で回収し、10%スクロース液を用いて細胞濃度が1x106個/mLとなるように細胞懸濁液を
調整した。
上記の細胞懸濁液を、1%の合成高分子を含む液体と混合し、基本培地と接触させ、合
成高分子を含む液体をゲル化させ、MSCを内包するMSC/合成高分子ゲル複合体を作成した
。尚、高分子は合成ペプチドから形成されており、構成するアミノ酸の配列は以下の通りである。
Ac-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH2 (Ac:アミノ末端、R:アルギニン、A:アラニン、
D:アスパラギン酸、CONH2:カルボキシル末端)
翌々日より、MSCの骨分化誘導を開始した。骨分化誘導には、骨分化誘導培地(基本培
地に10nMデキサメサゾン、10mM βグリセロ燐酸、0.28mMアスコルビン酸を添加)を用
いた。コントロールには、骨分化誘導培地からデキサメサゾンを除いたものを用いた。培養は、37℃、5% CO2存在下で行い、培地交換は48時間おきに行った。

2.形態学的評価
MSCが骨分化誘導により骨芽細胞へと分化し、骨基質が産生されたことを確認するため
に、分化誘導後2週目、3週目、4週目に骨基質に親和性の高い蛍光試薬(カルセイン)を
用いて染色を行い、蛍光顕微鏡、および共焦点レーザー顕微鏡で観察した。骨分化誘導群は骨基質の沈着を示す蛍光領域が観察できたが、コントロール群では、明らかな蛍光領域を認めなかった。
共焦点レーザー顕微鏡により、骨分化誘導群で、蛍光領域がX-Y平面のみならず、Z軸方向にも拡散している像が捉えられた。また、時間経過とともに、蛍光領域は拡大していく傾向が見られた(図1〜3)。

3.生化学的評価(1)
MSCが骨分化誘導により骨芽細胞へと分化したことを確認するために、分化誘導後2週目、3週目、4週目にMSC/合成高分子ゲル複合体から細胞を回収し、アルカリフォスファターゼ活性を測定した。アルカリフォスファターゼ活性の測定は、細胞、PNPP存在下でのPNP
の産生量を定量することにより行った。
評価は30分間に生成されるPNP量を細胞量当たりに換算した。骨分化誘導群では、コン
トロール群と比較して有意に高いアルカリフォスファターゼ活性を示した。(図4)

4.生化学的評価(2)
上記の測定後、MSC/合成高分子ゲル複合体から骨基質(石灰化骨基質)を有機酸を用いて抽出し、ICP法によりカルシウム量を、EIA法によりオステオカルシン量を定量した。分化誘導群では、コントロール群と比較して有意に高いカルシウム値、オステオカルシン値が定量された(図5、6)。

以上のことから、MSCは合成高分子ゲル内で増殖し、骨分化誘導により骨芽細胞へと分化
し、三次元的に骨基質を産生することが示された。
実施例2
本発明の実施例2として、ラット骨髄由来間葉系細胞を封入した合成高分子ゲルを、多
孔体セラミックに播種した移植材料の同系ラットへの移植実験の結果について記述する。

1.細胞培養
ラット骨髄由来間葉系細胞(以下MSCとする)は、雄Fisher344ラット大腿骨より採取した。採取したMSCを、MEM培地に15%ウシ胎児血清(以下FBSとする)、100U/mLペニシリン
G、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンBを加えたもの(以下基
本培地とする)で培養し増殖させた。培養皿の底面に接着し増殖したMSCをトリプシン処
理で回収し、10%スクロース液を用いて細胞濃度が1x106個/mLとなるように細胞懸濁液を
調整した。
上記の細胞懸濁液を、1%の合成高分子を含む液体と混合した後、この混合液を多孔体
セラミックに播種し、直ちに基本培地と接触させ、合成高分子を含む液体をゲル化させ、MSCを内包するMSC/合成高分子ゲル/セラミック複合体を作成した。尚、高分子は合成ペプチドから形成されており、構成するアミノ酸の配列は以下の通りである。
Ac-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH2(Ac:アミノ末端、R:アルギニン、A:アラニン、D
:アスパラギン酸、CONH2:カルボキシル末端)
翌々日より、MSCの骨分化誘導を開始した。骨分化誘導には、骨分化誘導培地(基本培
地に10nMデキサメサゾン、10mM βグリセロ燐酸、0.28mMアスコルビン酸を添加)を用
いた。培養は、37℃、5%CO2存在下で2週間行い、培地交換は48時間おきに行った。

2.移植実験
雄Fisher344ラットの背部皮下に、上記1で作成したMSC/合成高分子ゲル/セラミック複
合体を移植した。コントロールとして、細胞を含有しない合成高分子液をセラミック上でゲル化させ、合成高分子ゲル/セラミック複合体を移植した。

3.組織学的評価
4週間後に、移植したMSC/合成高分子ゲル/セラミック複合体をラットから回収した。組織学的評価を行うために、回収したMSC/合成高分子ゲル/セラミック複合体をホルマリン
で固定し、脱灰処理後パラフィンに包埋、薄切し、ヘマトキシリンーエオジン染色を行い組織標本を作製した。
光学顕微鏡で組織標本を観察すると、骨分化誘導群でのみ、多孔体セラミックの孔の壁に沿って骨基質の沈着を認めた。また骨基質の沈着は、セラミック表面の孔のみならず、内部の孔にも認められた(図7-8)。

以上のことから、MSCを封入した合成高分子ゲル内を用いることにより、多孔体セラミッ
クに効率よくMSCが播種され、骨分化誘導により骨芽細胞へと分化し、生体内においても
三次元的に骨基質を産生することが示された。
実施例3
本発明の実施例3として、ラット骨髄由来間葉系細胞/高分子ゲル複合体の作製方法、
高分子ゲル内での、ラット骨髄由来間葉系細胞の骨分化誘導実験の結果について記述する。

1.細胞培養
ラット骨髄由来間葉系細胞(以下MSCとする)は、雄Fisher344ラット大腿骨より採取した。採取したMSCを、MEM培地に15%ウシ胎児血清(以下FBSとする)、100U/mLペニシリン
G、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンBを加えたもの(以下基
本培地とする)で培養し増殖させた。培養皿の底面に接着し増殖したMSCをトリプシン処
理で回収し、10%スクロース液を用いて細胞濃度が1x106個/mLとなるように細胞懸濁液を
調整した。
上記の細胞懸濁液を、1%の合成高分子を含む液体と混合し、基本培地と接触させ、合
成高分子を含む液体をゲル化させ、MSCを内包するMSC/合成高分子ゲル複合体を作成した
。尚、高分子は合成ペプチドから形成されており、構成するアミノ酸の配列は以下の通りである。
Ac-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH2(Ac:アミノ末端、R:アルギニン、A:アラニン、D:アスパラギン酸、CONH2:カルボキシル末端)
対照として、上記の細胞懸濁液を、1%の豚皮由来タイプIコラーゲン溶液に封入し、
中和、加温によりゲル化させ、MSCを内包するMSC/コラーゲンゲル複合体を作成した。
翌々日より、MSCの骨分化誘導を開始した。骨分化誘導には、骨分化誘導培地(基本培
地に10nMデキサメサゾン、10mM βグリセロ燐酸、0.28mMアスコルビン酸を添加)を用
いた。コントロールには、骨分化誘導培地からデキサメサゾンを除いたものを用いた。培養は、37℃、5% CO2存在下で行い、培地交換は48時間おきに行い、培養は4週間継続した


2.生化学的評価
分化誘導後2週目、3週目、4週目に、MSC/高分子ゲル複合体から骨基質(石灰化骨基質)
を有機酸を用いて抽出し、ICP法によりカルシウム量を定量した。分化誘導群では、MSC/
合成高分子ゲル複合体、MSC/コラーゲンゲル複合体の両者ともに、コントロール群と比較して有意に高いカルシウム値が定量された。また、分化誘導群でのMSC/合成高分子ゲル複合体、MSC/コラーゲンゲル複合体の両者間のカルシウム値は、同程度であった(図9)。

以上のことから、MSCは合成高分子ゲル、コラーゲンゲル内で同程度に増殖し、骨分化誘
導により同程度に骨芽細胞へと分化し、骨基質を産生することが示された
実施例4
本発明の実施例4として、骨分化誘導後のラット骨髄由来間葉系細胞を封入した合成高
分子ゲルの、同系ラットへの移植実験の結果について記述する。

1.細胞培養
ラット骨髄由来間葉系細胞(以下MSCとする)は、雄Fisher344ラット大腿骨より採取した。採取したMSCを、MEM培地に15%ウシ胎児血清(以下FBSとする)、100U/mLペニシリン
G、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンBを加えたもの(以下基
本培地とする)で培養し増殖させた。さらに7日間、骨分化誘導培地を用いてMSCを骨分
化させた後に細胞を回収し、10%スクロース液を用いて細胞濃度が1x106個/mLとなるよう
に細胞懸濁液を調整した。

2. 移植実験
雄Fisher344ラットの背部皮下に、上記の細胞懸濁液を1%の合成高分子を含む液体と混合した後、この混合液を注射器を用いて、同系ラットの背部皮下へ注入した。尚、高分子は合成ペプチドから形成されており、構成するアミノ酸の配列は以下の通りである。
Ac-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH2(Ac:アミノ末端、R:アルギニン、A:アラニン、D:アスパラギン酸、CONH2:カルボキシル末端)
コントロールとして、細胞を含有しない1%の合成高分子液を同系ラットの背部皮下へ注
入した。

3.形態学的評価
細胞を含有する合成高分子液も、細胞を含有しない合成高分子液も、注射器を用いて同系ラットの背部皮下に注入可能であり、合成高分子液は注入後数分でゲル化し、同程度の大きさの皮膚の隆起を生じた。
移植1週間後に、注入部を観察した。細胞を含有する合成高分子液を移植した方の皮膚の隆起は、注入時の大きさをほぼ保っていたが、細胞を含有しない合成高分子液を移植した方の皮膚の隆起は、注入時よりも小さくなっていた。(図10、11)

以上のことから、骨分化誘導後の細胞を用いることにより、長期間にわたり皮膚の隆起の形状を保持できることが示された。この保持効果は、間葉系細胞のゲル内における骨基質産生によるものと思われる。この点において、間葉系細胞は軟骨細胞へも分化することを我々は確認している。すなわち、間葉系細胞を軟骨細胞へ分化させて、軟骨基質産生による皮膚隆起効果も期待できる。すなわち、骨基質あるいは軟骨基質とゲルをもちいることにより、いわゆる皺の修復が期待できる。特に、ゲル状の状態であるので注入により皺を取ることが出来る。また、実施例3の結果も鑑みれば、コラーゲン等の動物由来高分子を用いても同様の結果が示されることが予想される。コラーゲンは皮膚への美容の効果が
あるとされているので、小量のコラーゲンゲルと間葉系細胞、特に間葉系細胞を骨あるいは軟骨分化させた細胞とコラーゲンゲルとの複合体が皺取りに用いることが可能となる。しかし、大量の高分子液を注入する状況下では、動物由来の抗原等の影響が未知であり、合成高分子による本法を用いることが好まれる。
実施例5
本発明の実施例5として、合成高分子液を用いてコーティングを行った培養皿上でのラ
ット骨髄由来間葉系細胞の肝細胞、および神経細胞への分化誘導実験の結果について記述する。

1.細胞培養
ラット骨髄由来間葉系細胞(以下MSCとする)は、雄Fisher344ラット大腿骨より採取した。採取したMSCを、MEM培地に15%ウシ胎児血清(以下FBSとする)、100U/mLペニシリン
G、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンBを加えたもの(以下基
本培地とする)で培養し増殖させた。培養皿の底面に接着し増殖したMSCをトリプシン処
理で回収し、10%スクロース液を用いて細胞濃度が1x106個/mLとなるように細胞懸濁液を
調整した。
1%の合成高分子を含む液体を培養皿上で以下の分化誘導培地に接触させてゲル化させ
、培養皿を合成高分子ゲルでコーティングした。尚、高分子は合成ペプチドから形成されており、構成するアミノ酸の配列は以下の通りである。
Ac-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH2(Ac:アミノ末端、R:アルギニン、A:アラニン、D:アスパラギン酸、CONH2:カルボキシル末端)
合成高分子ゲルでコーティングを施した培養皿に、上記の細胞懸濁液を播種し、翌々日より、MSCの肝細胞分化誘導、神経細胞分化誘導を開始した。肝細胞分化誘導には、肝細
胞分化誘導培地(DMEM培地に10nMデキサメサゾン、ITS、20ng/ml 肝細胞増殖因子、10%FBSを添加 )を用いた。ITSは、インスリン、トランスフェリン、セレニウムの混合物であ
る。コントロールには、肝細胞分化誘導培地から肝細胞増殖因子を除いたものを用いた。
神経細胞分化誘導には、まず神経細胞分化誘導培地(DMEM培地に10ng/ml上皮細胞増殖
因子、 10ng/ml 血小板由来増殖因子、1%FBSを添加)で培養し、数日後添加因子を50ng/ml 塩基性線維芽細胞増殖因子に変更した。培養は、37℃、5%CO2存在下で2週間行い、培地交換は48時間おきに行った。

2.分子生物学的、形態学的評価
肝細胞への分化は、培養した細胞を回収し、RNAを抽出しcDNAを合成後、ハウスキーピ
ング遺伝子のβアクチン、肝細胞特異的蛋白のアルブミンの遺伝子発現をPCR法により確
認した。
肝細胞分化誘導群、コントロール群の両群で、βアクチンはほぼ同程度に発現していたが、アルブミン遺伝子の発現は、分化誘導群で明らかに高くかった。
神経細胞への分化は、神経細胞分化マーカーである抗神経細胞特異的エノラーゼ(NSE
)抗体を用いた免疫染色法により、確認した。細胞体から軸索様の突起が伸長し、分化した神経細胞と同様の形態が観察された。

以上のことから、間葉系細胞は合成高分子ゲルを担体として、分化誘導により、肝細胞、神経細胞に分化することが示された。
図1は、骨分化誘導2週間後の蛍光顕微鏡写真である。Aは分化誘導群、Bはコントロール群を示す。緑色の部分が、カルセインにより染色された、骨基質の沈着部分である。 図2は、骨分化誘導2週間後の骨分化誘導群の共焦点レーザー顕微鏡写真である。AはX−Y平面像、BはZ軸方向への断層像である。緑色の部分が、カルセインにより染色された、骨基質の沈着部分である。 図3は、骨分化誘導4週間後の骨分化誘導群の共焦点レーザー顕微鏡写真である。AはX−Y平面像、BはZ軸方向への断層像である。緑色の部分が、カルセインにより染色された、骨基質の沈着部分である。 図4は、MSC/合成高分子ゲル複合体から回収した細胞の、アルカリフォスファターゼ活性を示したものである。Dex(+)は骨分化誘導群、Dex(-)はコントロール群を示す。値は6回の実験の平均±SD(標準偏差)である。アスタリスクは統計手法による有意差を示す。 図5は、MSC/合成高分子ゲル複合体から骨基質(石灰化骨基質)抽出し、定量したカルシウム量を示す。Dex(+)は骨分化誘導群、Dex(-)はコントロール群を示す。値は6回の実験の平均±SD(標準偏差)である。アスタリスクは統計手法による有意差を示す(p<0.01)。 図6は、MSC/合成高分子ゲル複合体から骨基質(石灰化骨基質)抽出し、定量したオステオカルシン量を示す。Dex(+)は骨分化誘導群、Dex(-)はコントロール群を示す。値は6回の実験の平均±SD(標準偏差)である。アスタリスクは統計手法による有意差を示す(p<0.01)。 図7は、骨分化誘導群から回収したMSC/合成高分子ゲル/セラミック複合体の組織標本像である。多孔体セラミックの孔内に、骨芽細胞が産生した骨基質(矢印)が沈着している。 図8は、コントロール群から回収した合成高分子ゲル/セラミック複合体の組織標本像である。多孔体セラミックの孔内には骨基質の沈着は見られず、線維状の組織の侵入(矢印)を認めるのみである。 図9は、MSC/高分子ゲル複合体から骨基質(石灰化骨基質)抽出し、定量したカルシウム量を示す。値は6回の実験の平均±SD(標準偏差)である。アスタリスクは統計手法による有意差を示し(p<0.01),N.Sは有意差がないことを示す。 図10は、合成高分子液および、細胞を含有する合成高分子液を、同系ラットの背部皮下に注入した直後の写真である。Aは細胞を含有する合成高分子液を注入した部位を示し、Bは合成高分子液のみを注入した部位である。 図11は、合成高分子液および、細胞を含有する合成高分子液を、同系ラットの背部皮下に注入した1週間後の写真である。Aは細胞を含有する合成高分子液を注入した部位を示し、Bは合成高分子液のみを注入した部位である。 図12は、PCR法により増幅した遺伝子の発現を、電気泳動により観察した写真である。上段は、βアクチン遺伝子、下段はアルブミン遺伝子を示し、左側のレーンがコントロール群、右側のレーンが肝細胞分化誘導群である。 図13は神経細胞分化誘導後の、免疫染色写真である。左側が弱拡大、右側が強拡大写真である。矢頭は神経細胞体,矢印は軸索様の神経突起の伸長を示す。

Claims (3)

  1. 骨芽細胞および軟骨細胞からなる群から選ばれる少なくとも1種の細胞とゲル材料を含み
    、前記ゲル材料がAc-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH2(Ac:アミノ末端のアセチル基、R:アルギニン、A:アラニン、D:アスパラギン酸) で表される合成ペプチドから形成された合成高分子ゲル複合体である、皮膚を隆起させる処置のための移植材料。
  2. 皮膚の隆起が、外科手術、疾患あるいは事故により失われた組織を再建するために行われる、請求項1に記載の移植材料。
  3. 皮膚の隆起が、豊胸、隆鼻、あるいはしわもしくはたるみを修復するために行われる、請求項1又は2に記載の移植材料。
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