JP6741408B2 - 細胞包埋ビーズ及びその製造方法 - Google Patents
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Description
(1)骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有することを特徴とする細胞包埋ビーズ。
(2)さらに、前記骨芽細胞により産生された骨基質及び骨塩を含有する(1)に記載の細胞包埋ビーズ。
(3)前記骨芽細胞に分化し得る細胞が間葉系幹細胞である(1)又は(2)に記載の細胞包埋ビーズ。
(4)前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である(1)〜(3)のいずれか一つに記載の細胞包埋ビーズ。
(5)前記細胞外マトリックス成分がI型コラーゲンである(4)に記載の細胞包埋ビーズ。
(6)前記骨芽細胞又は前記骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞密度が1×107cells/cm3以上である(1)〜(5)のいずれか一つに記載の細胞包埋ビーズ。
(7)骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する工程と、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる工程と、を備えることを特徴とする細胞包埋ビーズの製造方法。
(8)前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、撥水性表面を有する支持体に滴下し、前記液滴を作製する(7)に記載の細胞包埋ビーズの製造方法。
(9)前記凝集工程において、細胞分化誘導剤を添加する(7)又は(8)に記載の細胞包埋ビーズの製造方法。
一実施形態において、本発明は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する細胞包埋ビーズを提供する。
本明細書において、「骨塩」とは、骨を形成する成分のうち塩の成分を意味し、主にリン酸カルシウムの結晶であるハイドロキシアパタイトからなる。
骨芽細胞により産生された、上記の骨基質に、上記の骨塩が沈着することにより、骨が形成される。また、本実施形態の細胞包埋ビーズは、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞、生体適合性ハイドロゲル以外に、骨基質及び骨塩を含有することにより、より自家骨に近しい組成となり、高い骨再生効率を実現できる。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
一実施形態において、本発明は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する工程と、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる工程と、を備える細胞包埋ビーズの製造方法を提供する。
まず、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞1を、生体適合性ハイドロゲル2を含む溶液に懸濁し、目的に合わせた大きさの液滴を作製する。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
支持体の表面に、撥水処理又は撥水性を有する材質を重ね合せることにより、撥水性表面を有する支持体を得ることができる。
撥水処理としては、特別な限定はなく、例えばアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基又はアルケニルオキシ基等の低極性の官能基や、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されたアルキル基又はアルコキシ基等の疎水性の官能基を基板表面に導入する方法が挙げられる。また、撥水性を有する材質としては、特別な限定はなく、例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルフォン等の疎水性高分子;ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、フッ素化カーボン、ポリテトラフルオロエチレン等の塩素又はフッ素含有高分子等が挙げられる。
続いて、回収した細胞包埋硬化ゲル形成体を7日以上20日以下、好ましくは14日以上18日以下、25℃以上40℃未満(好ましくは、37℃)で浮遊培養する。
本実施形態の細胞包埋ビーズの投与量は、被検動物(ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト)の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
投与回数としては、1か月平均当たり、1回〜数回投与することが好ましい。
投与形態としては、例えば、皮下注射、鼻腔内的、または外科的に当業者に公知の方法が挙げられ、外科的方法が好ましい。
注射剤は、非水性の希釈剤(例えば、ポレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など)、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に懸濁して使用することができる。
本発明の医薬組成物は、治療的に有効量の細胞包埋ビーズ、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容されうる担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、着色剤、粘稠剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の1種以上を用いることにより、注射剤、液剤、懸濁剤又は乳剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、細胞包埋ビーズの生体内安定性を高める効果や、特定の骨組織、又は細胞へ、細胞包埋ビーズの移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができ、特定の骨組織、又は細胞へ、細胞包埋ビーズを効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。
また、本発明の一側面は、骨に関する疾患や事故等による骨折、骨の欠損等の骨の損傷部位の治療のための細胞包埋ビーズを提供する。
また、本発明の一側面は、骨に関する疾患や事故等による骨折、骨の欠損等の骨の損傷部位の治療のための細胞包埋ビーズの製造方法を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の細胞包埋ビーズを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、骨再生治療剤を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、骨再生治療剤を製造するための上記細胞包埋ビーズの使用を提供する。
また、本発明の一側面は、上記細胞包埋ビーズの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、骨に関する疾患や事故等による骨折、骨の欠損等の骨の損傷部位の治療方法を提供する。
また、適用可能な骨組織の疾患としては、骨の変性、壊死、損傷などを伴う任意の疾患であって、例えば変形性関節症、骨軟骨損傷、難治性骨折、骨壊死、軟骨損傷、半月損傷、靭帯損傷、腱損傷、軟骨変性、半月変性、椎間板変性、靭帯変性、腱変性、骨腫瘍、先天性骨系統疾患等が挙げられ、これらに限定されない。
(1)細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
培養ディッシュ上のヒト間葉系幹細胞(Mesenchymal Stem Cells:MSC)(LONZA製)をトリプシン処理して剥がし、15mLチューブに移した後、1,000rpm、180秒間遠心分離した。上澄みを吸い上げ、新たに培地を10mL加えてペレットを懸濁し、細胞数カウントを行ったところ、2×105cells/10mLであった。
オリゴデンドロサイト用培地(Oligodendrocyte Medium:OM)を2mL加え、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュの蓋の裏面から剥がした。培地ごと細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュに入れ、骨芽細胞分化培地(DMEM(Sigma社製)、デキサメタゾン(Sigma社製)、β−グリセロホスフェート(Sigma社製)、アスコルビン酸(WAKO社製))を添加し、14日間浮遊培養した。なお、2日おきに培地を交換した。
タイムラプス顕微鏡(BZ−X700 KEYENCE社製)を用いて、培養開始から18時間の細胞包埋ビーズの観察した結果を図2に示す。細胞包埋ビーズは、細胞の牽引力により、平均直径2mmから0.5mmまで凝集することが確かめられた。
(細胞包埋ビーズの凍結切片の作製)
細胞包埋ビーズをリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline:PBS)で洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定液を回収し、10%、20%、30%スクロース溶液にそれぞれ2時間ずつ浸し、液を置換した。続いて、細胞包埋ビーズを30%スクロース溶液ごと切片作製用容器に流し込み、スクロース溶液のみ回収した。続いて、凍結組織切片作製用包埋剤(Optimal Cutting Temperature Compound:O.C.T Compound)を静かに流し込み、細胞包埋ビーズを封入した。続いて、液体窒素の中に、切片作製用容器を入れ、細胞包埋ビーズを凍結させた。予め−22℃に冷却したミクロトームを用いて、細胞包埋ビーズを微小の厚さにカットした。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。
得られたスライドガラスにキシレンを1mL滴下し60分間静置した後、溶液を除去した。続いて、100%エタノールを1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。続いて、100%エタノールを1mL滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、90%エタノール溶液を1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。続いて、70%エタノール溶液を1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。続いて、マイヤー・ヘマトキシリン染色液を1mL滴下し3分間静置した後、溶液を除去した。続いて、流水に13分間浸し、洗い流した。続いて、エマシンYを1mL滴下し4分間静置した後、溶液を除去した。続いて、90%エタノール溶液を1mL滴下し30秒間静置した後、溶液を除去した。続いて、90%エタノール溶液を1mL滴下し1分間静置した後、溶液を除去した。続いて、100%エタノールを1mL滴下し1分間静置した後、溶液を除去した。続いて、100%エタノールを1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。続いて、100%エタノールを1mL滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、キシレンを1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。最後に、キシレンを1mL滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック(封入剤)を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図3に示す。
得られたスライドガラスにPBSを1mL滴下し、洗浄した。続いて、Alizarin red S(Sigma社製)をスライドガラスに1mL滴下し、5分間静置した。続いて、PBSで3回洗浄した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック(封入剤)を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図3に示す。
得られたスライドガラスにPBSを1mL滴下し5分静置した後、溶液を除去した(洗浄)。続いて、PBSを1mL滴下し、同じ操作をもう一度行い、洗浄した。続いて、1%BSA含有溶液を200μL滴下し、30分間静置し、ブロッキングを行った。続いて、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Dulbecco’s Phosphate−Buffered Saline:D−PBS)で100倍に希釈したウサギHif−1α抗体(Sigma社製)を一次抗体としてスライドガラスに1mL滴下し、4℃で一晩インキュベートした。続いて、0.1%Tween−20含有PBS(PBS−T)を1mL滴下し10分間静置した後、溶液を除去した(洗浄)。同じ操作を2回繰り返して、洗浄を行った。D−PBSで20μg/mLに希釈したAleza Fluor 488ヤギ抗ウサギIgG抗体(ライフテクノロジー社製)を二次抗体として、スライドガラスに200μL滴下し、アルミホイルで覆い、2時間常温でインキュベートした。続いて、PBS−Tを1mL滴下し10分間静置した後、溶液を除去した(洗浄)。同じ操作を2回繰り返し、洗浄を行った。続いて、PBSで100倍希釈したDAPI(4’,6−Diamidino−2−phenylindole)溶液をスライドガラスに200μL滴下し、9分間インキュベーションすることで、核染色を行った。続いて、PBSを1mL滴下し5分静置した後、溶液を除去した(洗浄)。続いて、PBSを1mL滴下し、同じ操作をもう一度行い、洗浄した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック(封入剤)を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図3に示す。
HE染色では、細胞質がピンク色に染色するが、ピンク色に染色していない部分が数か所存在した。染色されていない部分には、骨基質又は骨塩が産生していると推察できる。また、Alizarin red染色では、濃い赤色に染まっている部分にカルシウムが蓄積されていることが確認された。また、Hif−1α染色では、染色されている箇所が少ないため、低酸素状態に陥っていないことが確認された。
以上のことから、細胞包埋ビーズ内のMSCは骨基質又は骨塩を産生しており、骨芽細胞に分化していることが示唆された。
(1)細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
ヒト間葉系幹細胞の代わりにヒト骨芽細胞を使用した以外は、実施例1の(1)と同様の方法により、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。
骨芽細胞分化培地の代わりに骨芽細胞増殖培地(OSM(登録商標) Osteoblast Growth BulletKit(登録商標))(LONZA社製)を使用した以外は、実施例1の(2)と同様の方法により、14日間浮遊培養した。
Hif−1α染色にて一次抗体が3μg/mLとなるようにD−PBSで希釈し、200μL滴下したこと、またDAPI溶液での核染色後、PBSで3回洗浄したこと以外は、実施例1の(4)と同様の方法により、細胞包埋ビーズの凍結切片を作製し、HE染色、Alizarin red染色及びHif−1α染色を行った。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図4に示す。
ヒト間葉系幹細胞を用いて、実施例1と同様の方法により、2,000cells/2μL/個の細胞包埋ビーズを作製した。細胞非接着U底96ウェルプレート内に、骨芽細胞分化培地を添加し、14日間培養した。培養開始から3日後、7日後及び14日後の細胞包埋ビーズの模式図及び位相差蛍光顕微鏡像を図5(A)及び(B)に示す。図5から、細胞包埋ビーズが凝集していることが確かめられた。
ヒト間葉系幹細胞を用いて、2,000cells/個のスフェロイドを調製した。細胞非接着U底96ウェルプレート内に、骨芽細胞分化培地を添加し、14日間培養した。
(1)試薬の調製
(基質溶解液の調製)
0.2M炭酸ナトリウム溶液(WAKO社製)22mL、0.2M炭酸水素ナトリウム溶液(WAKO社製)28mL、水50mLを混合し、0.1M炭酸・重炭酸バッファー(pH9.8)を100mL調製した。続いて、塩化マグネシウム六水和物(WAKO社製)40.66mgを0.1M炭酸・重炭酸バッファー(pH9.8)に溶解し、基質溶解液を調製した。
p−ニトロフェノール(WAKO社製)0.0139gを、1mLの水に溶解し、100mM p−ニトロフェノール溶液を調製した。この溶液を遮光して、室温で保存し、実験ごとに2mMに希釈して使用した。
p−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物(WAKO社製)0.02gを8mLの水に溶解し、10mM p−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム溶液を調製した。
前灌流緩衝液(NaCl 8g、KCl 0.4g、NaH2PO4・2H2O 0.078g、Na2HPO4・12H2O 0.151g、HEPES 2.38g、Phenol Red 0.006g、EGTA 0.19g、NaHCO3 0.35g、Glucose 0.9gを 蒸留水900mLに添加し、溶けるまで撹拌したものに1N NaOH溶液を用いてpH7.2に調整した溶液)1mLに、コラゲナーゼ(WAKO社製)50mg、大豆由来トリプシンインヒビター(WAKO社製)10mgを溶解し、50mg/mLコラゲナーゼ溶液を調製した。
培養開始から3日後、7日後、14日後の実施例3の細胞包埋ビーズ及び比較例1のスフェロイドをそれぞれ培養液ごと吸い上げ、チューブに移した。1,000rpm、3分間遠心分離し、上澄みを除去した。続いて、0.1%トライトンX−100を含む50mM Tris−HCl溶液(pH7.6)を400μL加え、10分間静置した。続いて、37℃に温めた50mg/mLコラゲナーゼ溶液を100μL加えた。ビーズが溶け切ったら、−80℃で凍結し、室温で溶解するという操作を2セット繰り返した。続いて、ジルコニアビーズ入りのバイオマッシャーに、試料を移し、ボルテックスミキサーで3分間撹拌した。続いて、1,300rpmで5分間遠心分離した。
(2)の遠心分離で得られた上澄みを20μLずつ取って、96ウェルプレートに添加した。スタンダード列として、列の一番端のウェルに標準液を40μL加え、同じ列のその他のウェルに水を20μLずつ加え、端から順にピペッティングしながら20μLずつ移し替えてゆき、1倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍の希釈系列を作製した。続いて、全てのウェルに基質緩衝液を100μLずつ加えた。37℃で60分間インキュベートした。
プレートリーダーを用いて1分間撹拌した後、405nmにおける吸光度を測定した。結果を図6に示す。
培養開始から14日後において、比較例1では、培養開始から7日後と値がほとんど変わらないのに対し、実施例3では、ALP活性が向上していた。また全体を通して、実施例1のほうが、比較例1よりも、ALP活性が高かった。
以上から、細胞包埋ビーズの形態で培養したほうが、スフェロイド状で培養するよりも、骨芽細胞への分化誘導効率が高いことが示唆された。
(1)頭蓋骨欠損モデルマウスへの移植
頭蓋骨欠損モデルマウスに、欠損部を覆い隠すように実施例1で作製した細胞包埋ビーズを移植した。コントロールとして、何も移植しないマウスを用意した。また、比較例2として、β−リン酸三カルシウム(β−TCP)パウダーを移植したマウスを用意した。移植から1か月後に、μCTでの観察及びHE染色による組織学的評価を行った。
イソフルランを用いて、移植から1か月後のマウスに吸引麻酔を行った。マウス固定具を用いて、マウスの頭蓋骨の固定を行った。三次元計測X線CT装置(ヤマト科学(株)社製、TDM1000H−II(2K))を用いて、透過像及びCT像を撮影した。ImageJにより解析し、三次元画像を作製した。透過像及びCT像を図7に示す。
移植から1か月後のマウスの頭蓋骨を切り出した。続いて、20%ホルマリンに1日間浸漬し、組織を固定した。続いて、20%EDTA溶液に5日間浸漬し、脱灰(骨の石灰化部を溶かす処理)した。70%エタノール溶液で一晩浸漬し、90%エタノール溶液で30分間浸漬し、100%エタノールで1時間の浸漬を2回行い、エタノールへの置換を行った。続いて、エタノール:2−ブタノールの体積比が1:1の溶液に30分間浸漬し、100%2−ブタノールに1時間の浸漬を2回行い、ブタノールへの置換を行った。続いて、2−ブタノール:パラフィンの体積比が1:1の溶液に30分間浸漬し、100%パラフィンに1時間の浸漬を2回行い、さらに、一晩浸漬しパラフィンに置換した。ミクロトームを用いて、切片を作製した。乾燥機を用いて、乾燥した。
実施例1の(4)と同様の方法により、HE染色を行った。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図8に示す。図8のHE染色の画像において、黒三角の矢印は骨欠損部を示している。
以上のことから、本発明の細胞包埋ビーズは、組織学的な観点から骨再生に有用であることが示唆された。
Claims (6)
- 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、ゲル化する細胞外マトリックス成分である生体適合性ハイドロゲルとを含有し、
前記骨芽細胞又は前記骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞密度が1×107cells/cm3以上、6.4×10 7 cells/cm 3 以下である
ことを特徴とする細胞包埋ビーズ。 - さらに、前記骨芽細胞により産生された骨基質及び骨塩を含有する
請求項1に記載の細胞包埋ビーズ。 - 前記骨芽細胞に分化し得る細胞が間葉系幹細胞である
請求項1又は2に記載の細胞包埋ビーズ。 - 前記細胞外マトリックス成分がI型コラーゲンである
請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞包埋ビーズ。 - 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、ゲル化する細胞外マトリックス成分である生体適合性ハイドロゲルとを含有する溶液を、撥水性表面を有する支持体に滴下して、前記骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、前記生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する工程と、
前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる工程と、
を備え、
前記凝集工程において、細胞分化誘導剤を添加する
ことを特徴とする細胞包埋ビーズの製造方法。 - 骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、ゲル化する細胞外マトリックス成分である生体適合性ハイドロゲルとを含有する溶液を、撥水性表面を有する支持体に滴下して、前記骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、前記生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する工程と、
前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる工程と、
を備え、
前記凝集工程において、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させて、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞包埋ビーズを得る
ことを特徴とする細胞包埋ビーズの製造方法。
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