JP2022526302A - 間葉系幹細胞－ヒドロゲルを含有する注射用組成物、並びにその製造、凍結及び解凍方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、注射用間葉系幹細胞－ヒドロゲルを含有する組成物及びその製造方法に関し、具体的には、本発明の方法で製造した注射用間葉系幹細胞－ヒドロゲル組成物は、ヒドロゲルビーズのスキャフォールド内に幹細胞が付着しているため、注射後も幹細胞が消失しにくく、死滅しにくいので、幹細胞のパラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果が継続して発揮され、ヒドロゲルが分解されながら幹細胞が徐々に放出されるので、生着率が高まるという利点があり、また、タンパク質分解酵素で処理することなく注射剤形に製造することができるので、細胞膜が損傷せず、健康な細胞を用いることができ、さらに、凍結及び解凍後も間葉系幹細胞－ヒドロゲルビーズからの凍結保存液の除去が容易であるという利点がある。【選択図】図１Ａ
Description
本発明は、注射用間葉系幹細胞－ヒドロゲル組成物、並びにその製造、凍結及び解凍方法に関し、具体的には、幹細胞－ヒドロゲルを直径５ｍｍ以下の一定の形態に製造することにより、注射器への充填が容易な剤形に開発することができると共に、それを凍結保存することができ、必要に応じて直ちに解凍して用いることのできる方法に関する。
より具体的には、幹細胞を単独で体内に注射する場合、注射部位で幹細胞が消失しやすく、生着率が低いという問題があった。本発明の方法で製造した間葉系幹細胞－ヒドロゲル組成物は、ヒドロゲルビーズのスキャフォールド内に幹細胞が付着しているため、注射後も幹細胞が消失しにくく、死滅しにくいので、幹細胞のパラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果が継続して発揮され、ヒドロゲルが分解されながら幹細胞が徐々に放出されるので、生着率が高まるという利点がある。
また、本発明の方法で製造することにより、付着性の間葉系幹細胞をタンパク質分解酵素で処理することなく注射剤形に製造することができるので、細胞膜が損傷せず、健康な細胞を用いることができるという利点がある。さらに、解凍後も間葉系幹細胞－ヒドロゲルビーズからの凍結保存液の除去が容易であるという利点がある。
従来の第１世代幹細胞治療剤は、トリプシンやディスパーゼなどのタンパク質分解酵素で処理して得られた単離細胞であり、タンパク質分解酵素での処理中に細胞膜に露出しているあらゆるタンパク質を非選択的に分解するので、細胞間の結合や基底膜タンパク質などがほとんど維持されない。また、タンパク質分解酵素を不活性化させるためにＦＢＳなどの動物由来物質を添加するので、それを除去するために数回にわたって洗浄・遠心分離過程を行うが、通常１回の洗浄・遠心分離過程で約５～１０％の細胞損失が生じる。よって、タンパク質分解酵素を用いる細胞回収過程は、非常に非効率的な方法である。
また、単離した単一細胞を疾患部位に移植すると、拡散や吸収などによりターゲット部位から流出するので、細胞定着率が低くなる。それ以外にも、間葉系幹細胞は付着性が強い細胞であるので、単一細胞に分離すると６～２４時間以内に死滅し、生着率が非常に低いという欠点がある。
特許文献１は、生体適合性スキャフォールド内の成体間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から所定の形態及び規模の軟組織を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でｄｅ ｎｏｖｏ合成する方法及びその方法で製造した組成物について開示している。前記文献には、生体適合性スキャフォールドとしてヒドロゲル重合体、より具体的にはポリエチレングリコールジアクリレートを用いる方法が開示されている。しかしながら、前記組成物は軟組織の結合の再構築のためのものであり、ポリエチレングリコールジアクリレートがスキャフォールドとして用いられる場合に直径の変化がほとんどないことが求められることを示しているにすぎず、培養後に注射器に充填して直ちに投与を可能にする製造過程については開示も示唆もされていない。
特許文献２には、羊水由来幹細胞を含有する括約筋再生細胞治療剤が開示されており、前記細胞治療剤をヒドロゲル複合体、具体的にはアルジネート／ＰＦ－１２７／ヒアルロン酸に注入すると、その効果が増大することが開示されている。しかしながら、前記文献には、幹細胞とヒドロゲルを使用時に混合して注射するものであって、ヒドロゲル複合体に注入して製造された形態のものしか開示されておらず、ヒドロゲルビーズ内で幹細胞を培養することについては開示されていない。
特許文献３には、間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させる方法が開示されており、より具体的には、生分解性高分子であるフィブリン／ＨＡを含有する混合支持体に間葉系幹細胞を固定して培養する方法が開示されている。しかしながら、前記文献には、フィブリン／ＨＡを支持体として用いると、従来、細胞分化のために添加されていたＴＧＦ－ｂｅｔａを添加しなくても、軟骨細胞への間葉系幹細胞の分化が促進されることが開示されているにすぎない。
特許文献４には、軟骨細胞及び軟骨分化能を有する細胞を安定して大量生産する方法が開示されている。より具体的には、ｖ字状の底部を有する９６ウェルプレートに細胞を分注する過程、超高密度培養過程、ペレットを回収する過程を経て、支持体のない軟骨細胞治療剤を均一に大量製造して軟骨損傷部位に移植する方法が開示されている。しかしながら、これは支持体を用いることなく、軟骨細胞のみを用いて球状に製造するものであるので、幹細胞をヒドロゲルビーズ支持体において培養する本発明とは構成上の差異がある。
また、従来の方法においては、幹細胞治療剤を製造する過程で、タンパク質分解酵素で処理するので、細胞間の結合や基底膜タンパク質が損傷することがあり、細胞回収、洗浄、バイアル充填ステップ、及びバイアルから注射器に充填する各ステップにおいて細胞損失が生じることがあり、また酵素処理後に単一細胞のみを回収して注射するので、細胞培養中に合成されたコラーゲンなどの活性物質はほとんど除去されるという問題があった。
一方、これらを解決するために、特許文献５では、幹細胞を含むヒドロゲルマス（ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｍａｓｓ）を作製し、ヒドロゲルマスを注射器に充填する方法を開示しているが、ヒドロゲルマスは注射器に充填して注射する過程でヒドロゲルの形状が不規則になり、一定の剤形を維持できないという欠点があり、またヒドロゲルスキャフォールド内で細胞の成長が可能ではあるものの、注射器に充填できる程度の硬さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）を要するというヒドロゲルの濃度における制限があった。
特許文献６には、多孔性膜及びヒドロゲルを用いて幹細胞または一次培養細胞を培養する方法が開示されている。より具体的には、多孔性膜を細胞培養容器の内部に非接触で配置し、その上にヒドロゲルをコーティングすることにより、細胞を３次元で培養する方法が開示されている。しかしながら、前記文献においては、このシステムにより細胞の増殖及び生長が促進されることが明示されているにすぎず、細胞を含むヒドロゲルをビーズの形態に作製して培養することや、それを注射器に充填して投与することについては開示されていない。
上記問題を解決するために、最近では細胞または幹細胞を支持体に入れてビーズの形態に作製する方法に関する研究が行われている（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈら，２０１２；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら，２０１３；Ｈａｖｖａら，２０１６；Ｍｅｄｉら，２０１７）。ビーズの種類は、Ａｌｇｉｎａｔｅ ｂｅａｄが最も多く用いられている。
特許文献７には、軟骨形成細胞を含むヒドロゲルマトリックスを製造する方法及びビーズに作製する方法が開示されている。前記文献には、アルジネート溶液とキトサン溶液を作製し、その後軟骨形成細胞と混合してヒドロゲルマトリックスを作製し、ビーズに作製して培養する方法が開示されている。しかしながら、これは、幹細胞ではない、一般の軟骨細胞を用いた研究であり、針の直径を調節してビーズの平均サイズを調節するので、ビーズのサイズを一定にすることができず、軟骨細胞－ヒドロゲル複合体内の細胞の数を一定にすることができないという限界がある。
特許文献８には、間葉系幹細胞とヒドロゲル溶液を混合して培養する方法及び注射器に充填する方法が開示されている。しかしながら、これは、所望の数の細胞を注射器に充填することが困難であるという限界がある。それに対して、本発明は、一定数の細胞を１つのビーズに入れて培養する方法により、所望の細胞数で軟骨損傷部位に投与することができるという利点がある。
幹細胞または細胞をビーズの形態に作製して体内に注射できるようにすることも重要であるが、それを凍結して長時間保存することができ、いつでも、どこでも、必要な所で解凍して容易に使用できるようにすることも、治療剤の開発における重要な要因となる。よって、細胞損傷を減らし、細胞生存率を高めることのできる凍結及び解凍方法に関する研究が行われている（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅら，２０１７）。
特許文献９及び１０には、幹細胞の凍結保存用組成物に関する内容が開示されている。しかしながら、これは、２Ｄ培養した幹細胞の凍結／解凍時の細胞生存率を高める方法を開示したものであり、ヒドロゲル－ビーズ細胞混合物の凍結及び解凍方法を開示する本発明とは異なる。
従来の凍結保存して用いる幹細胞治療剤は、解凍後に凍結保存液を除去する方法に難があり、凍結保存液と共に注射する方法で用いられている。そうすると、凍結保存液の成分であるＤＭＳＯが体内で様々な副作用を引き起こすという問題がある。本発明によるヒドロゲル－ビーズ細胞混合物は、約０．１～５ｍｍのサイズを有するので、物理的に簡単な方法で凍結保存液を除去することができるという利点がある。
よって、本発明においては、幹細胞－ヒドロゲルを直径５ｍｍ以下の一定の形態に製造することにより、注射器への充填が容易な剤形を開発し、凍結及び解凍して治療剤として用いる当該注射用剤形は、目的に合わせてヒドロゲルの物性または物理的強度を様々に調整することができるので、様々な治療目的に利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、幹細胞－ヒドロゲルを直径５ｍｍ以下の一定の形態に製造することにより、注射器への充填が容易であり、物理的に簡単な方法で凍結保存液を除去することができ、長期の凍結保存が可能なｒｅａｄｙ－ｍａｄｅ製剤である注射用幹細胞－ヒドロゲルを含有する組成物及びその製造方法を提供するものである。
また、本発明は、薬学的に有効量の幹細胞－ヒドロゲルを含有する組成物を個体に投与するステップを含む、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防、治療または改善方法を提供するものである。
さらに、本発明は、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いる、幹細胞－ヒドロゲルを含有する組成物の用途を提供するものである。
本発明は、細胞及びヒドロゲルを含み、ビーズ（ｂｅａｄ）の形態である細胞－ヒドロゲル組成物を提供する。
また、本発明は、（ａ）細胞を培養するステップと、（ｂ）前記培養した細胞とヒドロゲル溶液を混合して細胞－ヒドロゲルビーズを形成するステップと、（ｃ）前記細胞－ヒドロゲルビーズを培養するステップとを含む、細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法を提供する。
さらに、本発明は、本発明の細胞－ヒドロゲルビーズを凍結及び解凍するステップをさらに含む、細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法を提供する。
さらに、本発明は、薬学的に有効量の細胞－ヒドロゲルビーズを個体に投与するステップを含む、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または改善方法を提供する。
さらに、本発明は、薬学的に有効量の細胞－ヒドロゲルビーズを個体に投与するステップを含む、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の治療方法を提供する。
さらに、本発明は、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いる、細胞－ヒドロゲルビーズの用途を提供する。
本発明の方法で製造した注射用間葉系幹細胞－ヒドロゲル組成物は、ヒドロゲルビーズのスキャフォールド内に幹細胞が付着しているため、注射後も幹細胞が消失しにくく、死滅しにくいので、幹細胞のパラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果が継続して発揮され、ヒドロゲルが分解されながら幹細胞が徐々に放出されるので、生着率が高まるという利点があり、また、タンパク質分解酵素で処理することなく注射剤形に製造することができるので、細胞膜が損傷せず、健康な細胞を用いることができ、さらに、凍結及び解凍後も間葉系幹細胞－ヒドロゲルビーズからの凍結保存液の除去が容易であるという利点がある。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、細胞及びヒドロゲルを含み、ビーズ（ｂｅａｄ）の形態である細胞－ヒドロゲル組成物を提供する。
また、本発明は、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いる、細胞及びヒドロゲルを含み、ビーズ（ｂｅａｄ）の形態である細胞－ヒドロゲル組成物の用途を提供する。
本発明の一態様において、前記細胞及びヒドロゲルは、直径が０．１～５ｍｍであることが好ましく、０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下であることがより好ましく、１ｍｍ以上４ｍｍ以下であることが最も好ましい。
本発明の一態様において、前記細胞は、幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択されるいずれかであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
本発明の一態様において、前記ヒドロゲルは、フィブリングルー、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、キトサン、セルロース、ペクチン、２－ヒドロキシエチルメタクリレート誘導体及びその共重合体、ポリエチレンオキシド並びにポリビニルアルコールからなる群から選択される１種または２種以上であることが好ましい。
本発明の一態様において、前記筋骨格系疾患は、関節の外傷、骨の疾患、筋肉の弱化、関節の神経損傷による筋炎、筋筋膜性疼痛症候群、腱炎、腱鞘炎、滑液包炎、結節腫、手根管症候群、ギヨン管症候群、手首の腱炎、手腕振動症候群、ばね指、ガングリオン、白蝋病、レイノー症候群、外側上顆炎、内側上顆炎、橈骨管症候群、尺骨管症候群、肘頭部滑液包炎、正中神経絞扼障害、肩インピンジメント症候群、癒着性肩関節包炎、変性性関節炎、頭部前方位姿勢、頸部神経根症、腰仙部挫傷、椎間板ヘルニア、脊椎分離症、脊椎すべり症、変形性腰椎症、変性疾患、尿失禁症、靭帯及び腱損傷からなる群から選択されるいずれかであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
本発明の一態様において、前記瘻孔性疾患は瘻孔性クローン病であるが、これに限定されるものではない。
本発明の一態様において、前記炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、ループス、凍瘡性狼瘡、結核性狼瘡、ループス腎炎、栄養障害型表皮水疱症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、腰痛症、線維筋痛症、筋膜疾患、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、反応性関節炎、骨関節炎、強皮症、骨粗鬆症、ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、真菌症、熱傷、外科または歯科手術による傷、糖尿病性足部潰瘍、１型糖尿病、２型糖尿病、潰瘍性皮膚疾患、副鼻腔炎、鼻炎、結膜炎、喘息、皮膚炎、炎症性膠原血管病、糸球体腎炎、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、敗血症性ショック、肺線維症、アテローム性動脈硬化、心筋炎、心内膜炎、心膜炎、嚢胞性線維症、橋本病、バセドウ病、ハンセン病、梅毒、ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、ボレリア症（Ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、神経ボレリア症、結核、サルコイドーシス（Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、黄斑変性、ぶどう膜炎、過敏性腸症候群、クローン病、シェーグレン症候群、慢性疲労症候群、慢性疲労免疫不全症候群、筋痛性脳脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、多発性硬化症からなる群から選択されるいずれかであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
本発明の組成物は、直径５ｍｍ以下の一定のビーズの形態を示すため、注射器への充填が容易であり、物理的に簡単な方法で凍結保存液の除去が可能であるので、体内で様々な副作用を引き起こす凍結保存液成分であるＤＭＳＯを投与前に容易に除去することができる。具体的には、前記物理的に簡単な方法の一例として、凍結保存液とビーズ混合液を注射器に入れ、注射器の前部に約１００ｕｌ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅのフィルタを装着して溶液を押すと、ビーズはフィルタを通過せず、凍結保存液のみ除去することができる。
また、注射器に充填して経皮注射、皮下注射、筋肉内注射、粘膜下注射、腹腔注射などにより投与することができる。
さらに、本発明におけるヒドロゲルの濃度は特に制限されず、様々な治療目的に応じて調節することができ、１．８～９０ｍｇ／ｍＬの濃度のフィブリノゲンを含むことが好ましい。
さらに、本発明は、（ａ）細胞を培養するステップと、（ｂ）前記培養した細胞とヒドロゲル溶液を混合して細胞ヒドロゲルビーズを形成するステップと、（ｃ）前記細胞ヒドロゲルビーズを培養するステップとを含む、細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法を提供する。
本発明の一態様において、ヒドロゲルとしては、フィブリングルー、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、キトサン、セルロース、ペクチン、２－ヒドロキシエチルメタクリレート誘導体及びその共重合体、ポリエチレンオキシド並びにポリビニルアルコールからなるヒドロゲル群から選択される１種または２種以上の複合体を用いることができ、より具体的にはフィブリングルーを用いることができる。
本発明の一態様において、前記フィブリングルーは、１．８～９０ｍｇ／ｍＬの濃度のフィブリノゲンを含んでもよい。
本発明の一態様において、前記細胞ヒドロゲルビーズは、０．１～５ｍｍであることが好ましく、０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下であることがより好ましく、１ｍｍ以上４ｍｍ以下であることが最も好ましい。
本発明の一態様において、ステップ（ｃ）の後に、細胞－ヒドロゲル組成物を注射器に充填するステップ（ｄ）をさらに含んでもよい。前記本発明の製造方法により製造した細胞－ヒドロゲル組成物は、１０～２５ゲージのニードルを用いて直ちに局所投与することができる。
なお、本発明の方法は、ステップ（ｃ）の細胞ヒドロゲルを培養した後に、凍結及び解凍するステップをさらに含んでもよく、凍結及び解凍後に凍結保存液を物理的に簡単な方法で除去することができる。
さらに、本発明の細胞－ヒドロゲル組成物を注射用に用いる場合、目的に合わせてヒドロゲルの物性または物理的強度を様々に調整して用いることができるので、特定のヒドロゲル濃度に限定されるものではない。
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を培養し、その後トロンビン溶液に添加し、次いでディスペンサを用いて培養容器にそれぞれ１～１０ｕＬの容量のフィブリノゲンと細胞－トロンビン溶液を点滴し、細胞を含むフィブリングルーヒドロゲルビーズ（以下、細胞－ヒドロゲルビーズ）を製造した（図１参照）。
また、本発明者らは、細胞－ヒドロゲルビーズ内の細胞数、生存率及び細胞の特性を観察した結果、本発明によりヒドロゲルビーズ内で培養した細胞は、代表的な間葉系幹細胞マーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５で陽性反応を示し、造血細胞マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５で陰性の免疫学的特性を維持することを確認した（表１、図２参照）。
さらに、本発明者らは、細胞－ヒドロゲルビーズ製造工程で細胞から分泌される活性因子がビーズ内にキャプチャされているか活性因子を観察した結果、間葉系幹細胞から分泌されるＨＧＦ及びコラーゲンｔｙｐｅ ２が有意にキャプチャされていることを確認した（図３参照）。
さらに、本発明者らは、細胞－ヒドロゲルビーズのパラクリン因子分泌効果を観察した結果、本発明の細胞－ヒドロゲルビーズは、インターロイキン１βにより誘発した炎症環境においてパラクリン因子を徐々に分泌し、有意な治療効果を発揮することを確認した（図４参照）。
よって、本発明の方法により製造した注射用間葉系幹細胞－ヒドロゲル組成物は、ヒドロゲルビーズのスキャフォールド内に幹細胞が付着しているため、注射後も幹細胞が消失しにくく、死滅しにくいので、幹細胞のパラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果が継続して発揮され、ヒドロゲルが分解されながら幹細胞が徐々に放出されるので、生着率が高まるという利点があり（図５参照）、また、タンパク質分解酵素で処理することなく注射剤形に製造することができるので、細胞膜が損傷せず、健康な細胞を用いることができ、さらに、凍結及び解凍後も間葉系幹細胞－ヒドロゲルビーズからの凍結保存液の除去が容易であるという利点がある。
さらに、本発明は、本発明の組成物を有効成分として含有する、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防及び治療用細胞治療剤を提供する。
本発明における「細胞治療剤」とは、ヒトから分離、培養及び特殊操作により作製した細胞及び組織であって、治療、診断及び予防の目的で用いられる医薬品を意味する。特に、細胞または組織の機能を復元させるために、生きた自己、同種または異種細胞を体外で増殖、選択したり、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させたりする一連の行為により、治療、診断及び予防の目的で用いられる医薬品を意味する。細胞治療剤は、細胞の分化の程度に応じて大きく体細胞治療剤、幹細胞治療剤に分類され、本発明は、より具体的には脂肪由来幹細胞治療剤に関する。
本発明における「個体」とは、本発明による細胞治療剤の投与により予防または治療できる疾患が既に発症したか、発症するリスクのある、ヒトを含むあらゆる動物を意味する。
前記組成物は、関節の外傷、骨の疾患、筋肉の弱化、関節の神経損傷による変性疾患、尿失禁症、変性性関節炎、靭帯及び腱損傷、糖尿病性足部潰瘍、下肢虚血性潰瘍、瘻孔性疾患などの様々な疾患に適用することができる。
さらに、本発明は、薬学的に有効量の細胞及びヒドロゲルを含み、ビーズ（ｂｅａｄ）の形態であり、前記細胞及びヒドロゲルは、直径が０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下である細胞－ヒドロゲル組成物を個体に投与するステップを含む、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または改善方法を提供する。
さらに、本発明は、薬学的に有効量の細胞及びヒドロゲルを含み、ビーズ（ｂｅａｄ）の形態であり、前記細胞及びヒドロゲルは、直径が０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下である細胞－ヒドロゲル組成物を個体に投与するステップを含む、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の治療方法を提供する。
前記細胞－ヒドロゲル、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患及び炎症性疾患については、前記細胞－ヒドロゲル組成物についての説明と同様であるので、その具体的な説明を省略する。
なお、本発明の方法で製造した注射用間葉系幹細胞－ヒドロゲル組成物は、ヒドロゲルビーズのスキャフォールド内に幹細胞が付着しているため、注射後も幹細胞が消失しにくく、死滅しにくいので、幹細胞のパラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果が継続して発揮され、ヒドロゲルが分解されながら幹細胞が徐々に放出されるので、生着率が高まるという利点があり、また、タンパク質分解酵素で処理することなく注射剤形に製造することができるので、細胞膜が損傷せず、健康な細胞を用いることができ、さらに、凍結及び解凍後も間葉系幹細胞－ヒドロゲルビーズからの凍結保存液の除去が容易であるという利点が確認された。よって、本発明の細胞－ヒドロゲル組成物は、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防、治療または改善に有用である。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
しかしながら、これらの実施例は本発明の理解を容易にするためのものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養方法
脂肪組織は、通常の脂肪吸引術で得ることができるが、これに限定されるものではない。
脂肪組織は、通常の脂肪吸引術で得ることができるが、これに限定されるものではない。
脂肪吸引により得られた脂肪組織から、次のように脂肪由来間葉系幹細胞を分離した。血液を除去するために、脂肪組織を同じ体積のＰＢＳで３～４回洗浄した。脂肪組織と同じ体積のコラゲナーゼ溶液を加え、３７℃の水浴で反応させた。これを遠心分離用チューブに移し、２０℃、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清である脂肪層を除去し、下層であるコラゲナーゼ溶液を揺れないように注意して分離した。細胞培養培地を入れて懸濁し、その後２０℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ここで、下に沈むのがストローマ血管画分であるので、上清を除去した。ストローマ血管画分を細胞培養培地に懸濁して培養容器に接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養した。培養液除去後にリン酸塩緩衝液で洗浄し、細胞培養培地、または細胞培養培地に塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）や表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）などの細胞成長因子を含む培地を用いて増殖した。脂肪由来間葉系幹細胞が培養容器の８０～９０％程度まで増殖したら、トリプシン処理により単一細胞に分離して取得した。
細胞－フィブリングルーヒドロゲルビーズの製造及び凍結
１）細胞－フィブリングルーヒドロゲルビーズの製造
実施例１で得られた脂肪由来間葉系幹細胞１～３×１０５個／ｍＬにトロンビン溶液を添加した。１．８～９０ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンを準備した。ディスペンサを用いて培養容器にそれぞれ１～１０ｕＬの容量のフィブリノゲンと細胞－トロンビン溶液を点滴し、細胞を含むフィブリングルーヒドロゲルビーズ（以下、細胞－ヒドロゲルビーズ）を製造した。
１）細胞－フィブリングルーヒドロゲルビーズの製造
実施例１で得られた脂肪由来間葉系幹細胞１～３×１０５個／ｍＬにトロンビン溶液を添加した。１．８～９０ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンを準備した。ディスペンサを用いて培養容器にそれぞれ１～１０ｕＬの容量のフィブリノゲンと細胞－トロンビン溶液を点滴し、細胞を含むフィブリングルーヒドロゲルビーズ（以下、細胞－ヒドロゲルビーズ）を製造した。
２）培養容器付着培養方法
細胞－ヒドロゲルビーズが培養容器上で完全に固まったら、そこに細胞培養培地を添加し、その後３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで４～８日間培養した。半球形の形態を示すことが確認された。
細胞－ヒドロゲルビーズが培養容器上で完全に固まったら、そこに細胞培養培地を添加し、その後３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで４～８日間培養した。半球形の形態を示すことが確認された。
３）浮遊培養方法
また、２）の培養容器付着培養方法に代えて浮遊培養方法を用いてもよい。細胞－ヒドロゲルビーズが完全に固まったら、培養容器の底からビーズを取り出し、培養容器に移した。細胞培養培地を添加してビーズを浮遊させ、その後３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで４～８日間培養した。なお、浮遊培養は、大容量の培養が容易であるという利点を有する。
また、２）の培養容器付着培養方法に代えて浮遊培養方法を用いてもよい。細胞－ヒドロゲルビーズが完全に固まったら、培養容器の底からビーズを取り出し、培養容器に移した。細胞培養培地を添加してビーズを浮遊させ、その後３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで４～８日間培養した。なお、浮遊培養は、大容量の培養が容易であるという利点を有する。
４）細胞－ヒドロゲルビーズの洗浄及び凍結
培養液を除去し、培養容器から細胞－ヒドロゲルビーズを回収した。回収したビーズは、１０％～２０％ＤＭＳＯを含むヒト血清アルブミンと１：１の比率で混合し、その後－８０℃で凍結保存した。
培養液を除去し、培養容器から細胞－ヒドロゲルビーズを回収した。回収したビーズは、１０％～２０％ＤＭＳＯを含むヒト血清アルブミンと１：１の比率で混合し、その後－８０℃で凍結保存した。
なお、凍結保存液とビーズ混合液を注射器に入れ、注射器の前部に約１００ｕｌ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅのフィルタを装着して溶液を押すと、ビーズはフィルタを通過せず、凍結保存液のみ物理的に簡単な方法で除去することができる。
図１Ａは培養した細胞－ヒドロゲルビーズを観察した写真である。ビーズの直径は３～５ｍｍであり、ビーズ内に細胞が良好に増殖し、フィブリングルーヒドロゲルと良好に融化したことが確認された。
図１Ｂは－８０℃で凍結保存した細胞－ヒドロゲルビーズを解凍し、その後注射器に充填し、１７ゲージのニードルを用いて噴射した顕微鏡写真である。凍結、解凍及びニードルでの注射後も、ビーズの形態及びサイズが全て一定に保たれることが確認された。
細胞－ヒドロゲルビーズ内の細胞数、生存率及び細胞の特性
実施例２で培養、洗浄、凍結、解凍した細胞－ヒドロゲルビーズを顕微鏡で観察した結果、ビーズ内に細胞が均質に分布することが確認された（図１）。次に、実施例２で培養、洗浄、凍結、解凍した細胞－ヒドロゲルビーズに酵素を添加してフィブリングルーを溶解し、その後細胞を取得した。トリパンブルーで染色して細胞数及び細胞生存率を分析した結果、１ビーズ当たり約１５，０００個の細胞が含まれており、細胞生存率は９５％以上であった。
実施例２で培養、洗浄、凍結、解凍した細胞－ヒドロゲルビーズを顕微鏡で観察した結果、ビーズ内に細胞が均質に分布することが確認された（図１）。次に、実施例２で培養、洗浄、凍結、解凍した細胞－ヒドロゲルビーズに酵素を添加してフィブリングルーを溶解し、その後細胞を取得した。トリパンブルーで染色して細胞数及び細胞生存率を分析した結果、１ビーズ当たり約１５，０００個の細胞が含まれており、細胞生存率は９５％以上であった。
前述したように取得した細胞をＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ３４、ＣＤ４５で染色してフローサイトメーターで分析した。その結果、図１に示すように、本発明によりヒドロゲルビーズ内で培養した細胞は、代表的な間葉系幹細胞マーカーであるＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５で陽性反応を示し、造血細胞マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５で陰性の免疫学的特性を維持することが確認された（表１及び図２）。
細胞－ヒドロゲルビーズ内の活性因子の含有
間葉系幹細胞は、培養中に様々な活性因子を分泌することが知られている。よって、細胞－ヒドロゲルビーズ製造工程で細胞から分泌される活性因子がビーズ内にキャプチャされているか活性因子を確認するために、実施例２で培養、洗浄、凍結、解凍した細胞－ヒドロゲルビーズに酵素を添加してフィブリングルーを溶解した溶出液を採取し、細胞－ヒドロゲルビーズ内の活性因子を分析した。
間葉系幹細胞は、培養中に様々な活性因子を分泌することが知られている。よって、細胞－ヒドロゲルビーズ製造工程で細胞から分泌される活性因子がビーズ内にキャプチャされているか活性因子を確認するために、実施例２で培養、洗浄、凍結、解凍した細胞－ヒドロゲルビーズに酵素を添加してフィブリングルーを溶解した溶出液を採取し、細胞－ヒドロゲルビーズ内の活性因子を分析した。
その結果、図３に示すように、間葉系幹細胞から分泌される代表的な活性因子である肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）は１ビーズ当たり約１０ｐｇ、主要な軟骨構成成分であるコラーゲンｔｙｐｅ ２は１ビーズ当たり約２ｐｇキャプチャされていることが確認された（図３）。
細胞－ヒドロゲルビーズのパラクリン因子分泌
間葉系幹細胞は、分泌作用（ｐａｒａｃｒｉｎｅ ａｃｔｉｏｎ）により抗炎症効能、抗細胞死効能、細胞増殖促進効能を有することが知られている。
間葉系幹細胞は、分泌作用（ｐａｒａｃｒｉｎｅ ａｃｔｉｏｎ）により抗炎症効能、抗細胞死効能、細胞増殖促進効能を有することが知られている。
よって、実施例２で培養、洗浄、凍結、解凍した細胞－ヒドロゲルビーズにＤＭＥＭを添加して７２時間培養して培養上清を採取し、その後残りの細胞－ヒドロゲルビーズに酵素を添加してフィブリングルーを溶解した溶出液を採取し、細胞－ヒドロゲルビーズから分泌される因子を分析した。
また、病変部位の微細環境（炎症環境）を作るためにインターロイキン１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｂｅｔａ；ＩＬ－１β）で処理し、その後同様に培養上清と溶出液を採取して分析した。
その結果、図４に示すように、間葉系幹細胞から分泌される代表的な炎症調節因子として知られるプロスタグランジンＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２；ＰＧＥ２）は、正常環境においては分泌されなかったが、炎症環境において分泌が促進されることが確認された（図４）。
また、間葉系幹細胞から分泌される代表的な成長因子のうち抗炎症、抗細胞死、細胞増殖促進、血管形成促進効果を発揮する肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）と血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）は、正常環境と炎症環境の両方において同様に分泌され、正常環境においては僅かしか分泌されない関節軟骨の主要な構成タンパク質であるコラーゲンＴｙｐｅ ２は、炎症環境において分泌量が急激に増加することが確認された（図４）。
よって、本発明の細胞－ヒドロゲルビーズは、病変環境において投与するとパラクリン因子を徐々に分泌するので、有意な治療効果を発揮することが確認された。
動物実験
実施例２で培養、洗浄、凍結、解凍した細胞－ヒドロゲルビーズ３０個をマウスの左側、右側の２カ所に皮下注射し、その後の体積変化を７日間測定した。
実施例２で培養、洗浄、凍結、解凍した細胞－ヒドロゲルビーズ３０個をマウスの左側、右側の２カ所に皮下注射し、その後の体積変化を７日間測定した。
その結果、図５に示すように、皮下注射後も幹細胞が消失しにくく、死滅しにくいので、幹細胞のパラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果が継続して発揮され、ヒドロゲルが分解されながら幹細胞が徐々に放出されることが確認された。
細胞－ヒドロゲルビーズの軟骨細胞死抑制能力
代表的な筋骨格系疾患である骨関節炎は、軟骨細胞死によりさらに悪化することが知られている。よって、実施例２で製造した細胞－ヒドロゲルビーズの軟骨細胞死抑制能を確認した。
代表的な筋骨格系疾患である骨関節炎は、軟骨細胞死によりさらに悪化することが知られている。よって、実施例２で製造した細胞－ヒドロゲルビーズの軟骨細胞死抑制能を確認した。
具体的には、ヒト軟骨細胞を４８ウェルプレート（４８－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に接種して付着させ、その後実施例２で製造した細胞－ヒドロゲルビーズまたは細胞を含まないヒドロゲルビーズを添加し、次いで２４時間共同培養した。その後、１００μＭ、２００μＭ及び４００μＭの濃度のｔ－ブチルヒドロペルオキシド（Ｔ－ｂｕｔｙｌ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ；ｔＢＯＯＨ）でそれぞれ１６時間処理し、ヒト軟骨細胞の酸化的死を誘導した。その後、水溶性テトラゾリウム塩（ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ；ＷＳＴ－１）を添加して約３時間培養し、次いで生きた細胞数を測定するために吸光度を測定した。
その結果、図６及び表２に示すように、細胞－ヒドロゲルビーズが酸化ストレスによる軟骨細胞死を抑制することが確認された（表２及び図６）。
細胞－ヒドロゲルビーズの抗炎症マクロファージ分化促進能力
ヒト単核球細胞をホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）で２４時間処理してマクロファージへの分化を誘導し、その後実施例２で製造した細胞－ヒドロゲルビーズを添加し、次いで４８時間追加培養した。その後、上清を回収して前炎症（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）の特性を有する活性化されたＭ１マクロファージから分泌されるＴＮＦ－α、及び抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）の特性を有する活性化されたＭ２マクロファージから分泌されるＩＬ－１０の量を酵素結合免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）で測定した。
ヒト単核球細胞をホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）で２４時間処理してマクロファージへの分化を誘導し、その後実施例２で製造した細胞－ヒドロゲルビーズを添加し、次いで４８時間追加培養した。その後、上清を回収して前炎症（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）の特性を有する活性化されたＭ１マクロファージから分泌されるＴＮＦ－α、及び抗炎症（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）の特性を有する活性化されたＭ２マクロファージから分泌されるＩＬ－１０の量を酵素結合免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）で測定した。
その結果、図７に示すように、ヒト単核球細胞にＰＭＡを添加した場合に分泌されるＴＮＦ－α量を１．００としたときに、それにさらに細胞－ヒドロゲルビーズを添加すると０．７３に減少するのに対して、ＰＭＡを添加した場合に分泌されるＩＬ－１０の量を１．００としたときに、それにさらに細胞－ヒドロゲルビーズを添加すると１．６１に増加することが確認されたので、細胞－ヒドロゲルビーズが塩症反応を抑制する効果があることが確認された（図７）。
本発明は、注射用間葉系幹細胞－ヒドロゲルを含有する組成物及びその製造方法に関し、具体的には、本発明の方法で製造した注射用間葉系幹細胞－ヒドロゲル組成物は、ヒドロゲルビーズのスキャフォールド内に幹細胞が付着しているため、注射後も幹細胞が消失しにくく、死滅しにくいので、幹細胞のパラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果が継続して発揮され、ヒドロゲルが分解されながら幹細胞が徐々に放出されるので、生着率が高まるという利点があり、また、タンパク質分解酵素で処理することなく注射剤形に製造することができるので、細胞膜が損傷せず、健康な細胞を用いることができ、さらに、凍結及び解凍後も間葉系幹細胞－ヒドロゲルビーズからの凍結保存液の除去が容易であるという利点があり、有用である。
Claims (19)
- 細胞及びヒドロゲルを含み、
ビーズ（ｂｅａｄ）の形態であり、
前記細胞及びヒドロゲルは、直径が０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下である
細胞－ヒドロゲル組成物。 - 細胞及びヒドロゲルは、直径が１ｍｍ以上４ｍｍ以下である、請求項１に記載の組成物。
- 細胞は、幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択されるいずれかである、請求項１に記載の組成物。
- ヒドロゲルは、フィブリングルー、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、キトサン、セルロース、ペクチン、２－ヒドロキシエチルメタクリレート誘導体及びその共重合体、ポリエチレンオキシド並びにポリビニルアルコールからなる群から選択される１種または２種以上の複合体である、請求項１に記載の組成物。
- 請求項１～４のいずれかに記載の組成物を有効成分として含む、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記筋骨格系疾患は、関節の外傷、骨の疾患、筋肉の弱化、関節の神経損傷による関節の外傷、骨の疾患、筋肉の弱化、関節の神経損傷による筋炎、筋筋膜性疼痛症候群、腱炎、腱鞘炎、滑液包炎、結節腫、手根管症候群、ギヨン管症候群、手首の腱炎、手腕振動症候群、ばね指、ガングリオン、白蝋病、レイノー症候群、外側上顆炎、内側上顆炎、橈骨管症候群、尺骨管症候群、肘頭部滑液包炎、正中神経絞扼障害、肩インピンジメント症候群、癒着性肩関節包炎、変性性関節炎、頭部前方位姿勢、頸部神経根症、腰仙部挫傷、椎間板ヘルニア、脊椎分離症、脊椎すべり症、変形性腰椎症、変性疾患、尿失禁症、靭帯及び腱損傷からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項５に記載の筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、ループス、凍瘡性狼瘡、結核性狼瘡、ループス腎炎、栄養障害型表皮水疱症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、腰痛症、線維筋痛症、筋膜疾患、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、反応性関節炎、骨関節炎、強皮症、骨粗鬆症、ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、真菌症、熱傷、外科または歯科手術による傷、糖尿病性足部潰瘍、１型糖尿病、２型糖尿病、潰瘍性皮膚疾患、副鼻腔炎、鼻炎、結膜炎、喘息、皮膚炎、炎症性膠原血管病、糸球体腎炎、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、敗血症性ショック、肺線維症、アテローム性動脈硬化、心筋炎、心内膜炎、心膜炎、嚢胞性線維症、橋本病、バセドウ病、ハンセン病、梅毒、ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、ボレリア症（Ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、神経ボレリア症、結核、サルコイドーシス（Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、黄斑変性、ぶどう膜炎、過敏性腸症候群、クローン病、シェーグレン症候群、慢性疲労症候群、慢性疲労免疫不全症候群、筋痛性脳脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、多発性硬化症からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、請求項５に記載の筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 請求項１～４のいずれかに記載の組成物を含む注射剤。
- 前記注射剤は、経皮注射、皮下注射、筋肉内注射、粘膜下注射及び腹腔注射からなる群から選択されるいずれかにより投与されることを特徴とする、請求項８に記載の注射剤。
- （ａ）細胞を培養するステップと、
（ｂ）前記培養した細胞とヒドロゲル溶液を混合して０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下の細胞ヒドロゲルビーズを形成するステップと、
（ｃ）前記細胞ヒドロゲルビーズを培養するステップとを含む、細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法。 - ヒドロゲルは、フィブリングルー、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、キトサン、セルロース、ペクチン、２－ヒドロキシエチルメタクリレート誘導体及びその共重合体、ポリエチレンオキシド並びにポリビニルアルコールからなる群から選択される１種または２種以上の複合体であることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法。
- ヒドロゲルはフィブリングルーであることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法。
- フィブリングルーは、１．８～９０ｍｇ／ｍＬの濃度のフィブリノゲンを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法。
- 細胞ヒドロゲルビーズは、１ｍｍ以上～４ｍｍ以下であることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法。
- ステップ（ｃ）の細胞ヒドロゲルビーズを培養した後に、凍結及び解凍するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法。
- ステップ（ｃ）の後に、細胞－ヒドロゲル組成物を注射器に充填するステップ（ｄ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の細胞－ヒドロゲル組成物の製造方法。
- 薬学的に有効量の
細胞及びヒドロゲルを含み、
ビーズ（ｂｅａｄ）の形態であり、
前記細胞及びヒドロゲルは、直径が０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下である細胞－ヒドロゲル組成物を個体に投与するステップを含む、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または改善方法。 - 薬学的に有効量の
細胞及びヒドロゲルを含み、
ビーズ（ｂｅａｄ）の形態であり、
前記細胞及びヒドロゲルは、直径が０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下である細胞－ヒドロゲル組成物を個体に投与するステップを含む、筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の治療方法。 - 筋骨格系疾患、瘻孔性疾患または炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物として用いる、
細胞及びヒドロゲルを含み、
ビーズ（ｂｅａｄ）の形態であり、
前記細胞及びヒドロゲルは、直径が０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下である細胞－ヒドロゲル組成物の用途。
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