KR20180086378A - 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 - Google Patents
인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 Download PDFInfo
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Abstract
알지네이트 하이드로겔 내의 인간 유래 중간엽 줄기세포 및 단핵구를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
Description
본원은 알지네이트 하이드로겔 내의 인간 유래 중간엽 줄기세포 및 단핵구를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
세포의 배양은 바이오 분야 연구에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체 질환을 연구하는 데에도 매우 광범위하게 이용되고 있다. 일반적인 진핵세포(eukaryotic cell)의 세포배양 방법이 개발 및 확립된지도 40 여년이 경과되었지만, 부착성 세포(adherent cell)의 성장을 지지하기 위해 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 방법은 폴리스티렌(polystyrene) 혹은 유리(glass)로 된 기질로 이루어진 2 차원 표면에서 세포를 배양하는 것이다. 그러나, 단층 세포배양 방법인 2 차원적 세포배양법에 의해 성장하는 세포는 세포외기질(extracellular matrix)에 부착되어 3 차원적 생체조직 환경에서 성장하는 세포와 많은 차이점을 나타낸다. 따라서, 2 차원적 및 3 차원적 세포배양은 전반적인 형태학적 차이를 나타내며, 또한 통상적인 2 차원적 세포배양을 통하여 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 많은 복잡한 생명 현상이 실제 생체 조직환경에서 일어나는 현상과 크게 다르기 때문에, 2 차원적 세포배양 방법은 3 차원 상에서 세포가 성장하는 생체의 생리적 환경을 정확히 반영할 수 없다는 문제점을 가지고 있다.
실제로, 비만, 당뇨, 동맥경화 등과 같은 대사성 질환(metabolic disease)의 치료제 개발 시에, 초기 시험관 내(in vitro) 실험에서는 우수한 약효를 보였던 약물들이 생체 내(in vivo) 동물 실험에서는 약효가 현저히 떨어지는 등 신약 개발에 많은 어려움이 따르고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는, 치료제 개발의 초기 단계에서부터 약물의 정확한 효능 및 독성을 예측할 수 있는 생체 내 모델과 유사한 시험관 내 모델이 필요하다.
외부 약물에 대한 생체 내 조직에서의 반응 및 기능 연구를 위해 조직 공학 또는 생명 공학 분야에서는 3 차원 스캐폴드(scaffold)를 이용한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 이러한 3 차원 인공 조직 스캐폴드에 의해 세포 분화 기전, 질병 치료제 개발, 및 조직 재생 등과 같은 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 10-2016-0021352호는 3 차원 세포배양 시스템 및 이를 이용한 약물 스크리닝 시스템을 개시하고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 3 차원 스캐폴드는 실제 조직이나 기관과 같이 세포와 세포간의 상호작용에 의해 구성되는 다양하고 복잡한 생체 내 구조를 모사할 수 없어 기술적인 한계가 존재하였다.
상기한 문제를 해결하고 대사성 질환 치료제 개발을 위한 신약 후보 물질을 빠르고 효율적으로 발굴하기 위해, 본원에서는 인간 유래 세포들이 생체 내와 같은 3 차원 환경에서 배양되면서 세포간 상호작용을 통해 생체 지방조직과 유사한 기능을 나타내게 하는 3 차원 세포배양 구조체 및 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법을 개발하고자 하였다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 알지네이트 하이드로겔; 및 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 포함된, 인간 유래의 중간엽 줄기세포 및 인간 유래의 단핵구를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체를 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, (a) 인간 유래의 중간엽 줄기세포, 인간 유래의 단핵구, 및 알지네이트 용액의 혼합물을 준비하고; (b) 상기 혼합물을 겔화하여 중간엽 줄기세포 및 단핵구를 포함하는 알지네이트 하이드로겔을 제조하고; 그리고 (c) 상기 하이드로겔 내에서 상기 중간엽 줄기세포 및 단핵구를 배양 및 분화시키는 것을 포함하는 3 차원 세포배양 방법을 제공할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 3 차원 세포배양 구조체를 지방세포 분화 배지 내에서 배양하여 상기 중간엽 줄기세포를 지방세포로 분화시키고; 분화된 지방세포에 약물 후보물질을 처리하고; 그리고
상기 지방세포의 유전자 발현, 단백질 발현 및 효소 활성 중 하나 이상을 분석하는 것을 포함하는 약물 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본원발명에 따라 인간 유래 중간엽 줄기세포와 단핵구 및/또는 단핵구로부터 분화된 마크로파지를 3 차원 세포배양 구조체 내에서 공동 배양하여 상기 중간엽 줄기세포를 지방 전구세포를 거쳐 지방세포로 분화시킴으로써, 하이드로겔 스캐폴드 내에서 세포간 상호작용에 의해 대사증후군 관련 생체 내 지방조직과 유사한 기능을 가지는 구조체를 형성하는 것이 가능하다. 이와 같이 하이드로겔 스캐폴드 내에서 형성된 지방조직 유사 구조체는 대사증후군 관련 생체 내 지방조직과 유사한 유전자 발현 및 단백질 활성을 나타나므로, 비만, 인슐린 저항성 및 제2형 당뇨병과 같은 지방조직과 관련된 대사성 질환 치료를 위한 연구 및 신약개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 비드 형태의 3 차원 세포배양 구조체의 사진 이미지이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 3 차원 세포배양 구조체 내의 중간엽 줄기세포의 생존률을 보여주는 형광현미경 이미지이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 3 차원 세포배양 구조체 내의 지방세포 분화를 보여주는 형광현미경 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 3 차원상 (도 4a) 또는 2 차원상 (도 4b)에서 배양 및 분화된 지방세포의 단백질 발현을 분석한 이미지, 및 3 차원 세포배양 구조체의 크기에 따른 지방세포의 단백질 발현을 분석한 이미지 (도 4c)이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 3 차원 및 2 차원 배양 시스템에 의해 배양된 지방세포 마커 단백질 발현을 비교한 개략도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 3 차원 세포배양 구조체 내의 중간엽 줄기세포의 생존률을 보여주는 형광현미경 이미지이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 3 차원 세포배양 구조체 내의 지방세포 분화를 보여주는 형광현미경 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 3 차원상 (도 4a) 또는 2 차원상 (도 4b)에서 배양 및 분화된 지방세포의 단백질 발현을 분석한 이미지, 및 3 차원 세포배양 구조체의 크기에 따른 지방세포의 단백질 발현을 분석한 이미지 (도 4c)이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 3 차원 및 2 차원 배양 시스템에 의해 배양된 지방세포 마커 단백질 발현을 비교한 개략도이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하, 본원의 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 알지네이트 하이드로겔; 및 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 포함된, 인간 유래의 중간엽 줄기세포 및 인간 유래의 단핵구를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체를 제공할 수 있다.
예를 들어, 상기 중간엽 줄기세포 및/또는 단핵구는 상기 3 차원 세포배양 구조체의 알지네이트 하이드로겔 내에서 증식 및/또는 분화될 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포가 지방 전구세포를 거쳐 지방세포로 분화되는 과정에서 상기 단핵구도 마크로파지로 분화(활성)이 유도되고, 단핵구 및/또는 분화(활성)된 마크로파지가 중간엽 줄기세포와 공동배양되는 일련의 과정에서 세포간 상호작용에 의해 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화가 유도 및/또는 촉진될 수 있다. 예를 들어, 상기 단핵구가 마크로파지로 분화함으로써, 중간엽 줄기세포가 지방 전구세포를 거쳐 지방세포로 분화되는 과정이 유도 및/또는 촉진 및/또는 활성화될 수 있다. 또한, 분화된 단핵구 또는 단핵구가 마크로파지로 분화함으로써, 중간엽 줄기세포가 지방 전구세포를 거쳐 지방세포로 분화되는 과정이 유도 및/또는 촉진 및/또는 활성화 될 수 있으며, 이에 따라 대사증후군 질환(대사성 질환)을 가지는 개체의 지방조직과 유사한 기능을 할 수 있다.
본원발명에서 알지네이트 하이드로겔 스캐폴드는 중간엽 줄기세포와 단핵구의 공동 배양시 세포들이 분화 및 증식하고 세포간 상호작용에 의해 일반적인 유사 지방조직 또는 대사증후군 질환 (대사성 질환)을 가지는 개체의 지방조직과 유사하게 기능하는 유사 지방조직이 형성되는 장소이다. 2 차원 평면 배지와 같이 일반적인 배지에서 세포를 배양하는 경우 세포 각각이 특정 부분에서만 세포간 상호작용을 하고, 증식 방향이 일방적이며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 세포간 상호작용을 할 수 있는 세포들이 한정적이다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 축적되어 불균형한 농도 구배를 이루게 된다. 따라서, 2 차원 상의 시험관 내에서 세포를 배양하는 경우에는 생체 내와 같은 세포간 상호작용이 유도될 수 없으며, 생체 내와 유사한 구조체를 형성하기도 어렵다.
반면, 본원발명에 따른 하이드로겔 스캐폴드의 경우 중간엽 줄기세포와 단핵구가 입체적인 구조의 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 상태로 중간엽 줄기세포가 지방 전구세포로, 그리고 지방 전구세포가 지방세포로 분화하기 때문에, 생체 내의 세포와 같이 주위 모든 방향으로 세포간 상호작용이 가능하고, 증식 방향이 일방적이지 않으며, 분화 및 증식을 통해 세포 수가 증가되는 경우에도 지속적으로 주위 세포들과 세포간 상호작용을 할 수 있다. 또한, 세포에서 분비되는 다양한 대사물질들이 특정 지역에 축적되는 것이 아니라 생체 내에서와 같이 주위 모든 방향으로 분비될 수 있어 불균일한 농도 구배를 방지할 수 있다. 이러한 특징에 의해, 중간엽 줄기세포 및 단핵구 또는 마크로파지로 활성화된 단핵구의 공동 배양시 생체 내와 같은 세포간 상호작용을 유도하여 일반적인 체내 지방 조직 또는 대사증후군 질환을 가지는 개체의 체내 지방 조직과 같이 기능하는 유사 지방조직을 형성할 수 있다.
본원발명에 따라 3 차원 세포배양 구조체 상에서 중간엽 줄기세포와 단핵구를 공동 배양함으로써, 2 차원 상에서 일반 배지에서 중간엽 줄기세포 및/또는 지방 전구세포 및/또는 지방세포를 배양한 경우와 비교하여 대사증후군 질환을 가지는 개체의 체내 지방 조직 생체 내 지방 조직과 더욱 유사한 유전자 발현 및 단백질 활성을 나타내는 유사 지방조직 형성이 가능하다.
본원발명의 3 차원 세포배양 구조체 내의 중간엽 줄기세포를 증식 및/또는 분화시키기 위해서는, 증식 및/또는 분화를 위한 배지를 하이드로겔 스캐폴드에 처리하여 하이드로겔 스캐폴드에 배지를 흡수시키고, 하이드로겔 스캐폴드에 흡수된 배지가 각 세포들에 작용하여야 한다. 이어서 배지 처리에 의해 하이드로겔 스캐폴드에 포함된 중간엽 줄기세포가 증식 및/또는 분화하게 되고, 분화되는 지방 전구세포 및 지방세포 등이 단핵구 또는 마크로파지로 분화된 단핵구 세포간 상호작용에 의하여 대사증후군 질환을 가지는 개체의 지방조직과 유사한 기능을 나타낼 수 있다.
본원발명의 세포배양 구조체 내의 단핵구의 농도는, 중간엽 줄기세포와의 공동 배양시 중간엽 줄기세포, 지방 전구세포 및 분화된 지방세포의 생존, 분화, 증식 및/또는 유사 지방조직 구조체 형성을 위해 조절될 수 있다. 단핵구가 너무 적거나 또는 아예 존재하지 않는 경우 중간엽 줄기세포가 대사증후군 질환을 가지는 개체의 지방조직과 유사한 지방조직 구조체로 분화되기가 어렵고, 단핵구가 지나치게 많으면 지방세포로의 분화율이 감소하고, 지방세포 특이적 유전자 발현이 감소하며, 단백질 활성이 감소함으로써 대사증후군 질환을 가지는 개체의 지방조직과 유사한 지방조직 구조체의 형성이 저하된다. 예를 들어, 단핵구의 함량은 3 차원 세포배양 구조체 내의 중간엽 줄기세포와 대비하여 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하 또는 약 10% 이하의 양으로 포함될 수 있으며, 약 2% 내지 약 10%의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 약 15% 또는 약 20% 이하의 양으로 포함될 수도 있다. 예를 들어, 상기 단핵구의 함량은 지방 전구세포에 비하여 약 1 내지 20%, 약 1 내지 10%, 약 1 내지 5% 또는 약 1 내지 2%일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 단핵구가 중간엽 줄기세포에 비하여 약 2% 이하, 약 3% 이하, 약 4% 이하, 약 5% 이하, 약 6% 이하, 약 7% 이하, 약 8% 이하, 약 9% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하 또는 약 20% 이하의 양으로 포함되는 경우, 특히 지방세포로의 분화가 원활하게 이루어지며 인슐린 저항성이 증가하는 등 실제의 대사증후군 질환을 가지는 개체의 지방조직과 유사한 기능을 나타낼 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포(adipose tissue derived mesenchymal stem cell, ADMSC)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 알지네이트 하이드로겔은 콜라겐, 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 콜라겐, 젤라틴 및 알지네이트의 함량은 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키고자 하는 목적에 맞게 통상의 기술자가 조절하여 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 하이드로겔은 크게 제한되지 않으나 조류(algae), 특히 갈조류로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 조류 유래의 하이드로겔을 사용하는 경우 알지네이트의 함량이 적합하지 않으면, 하이드로겔 스캐폴드내의 지방세포의 분화기간 및 이후의 실험 진행기간 동안 하이드로겔이 안정적으로 유지되지 못하고 용해될 수 있다. 특히, 알지네이트의 함량이 지나치게 높은 경우 세포의 성장 및 분화가 억제될 수 있다. 알지네이트는 수용성 고분자 전해질로 염화칼슘과 같은 다원자가 양이온 염을 사용하여 가교결합을 이룰 수 있고, 조류 유래의 하이드로겔의 경우 알지네이트의 함량이 하이드로겔 스캐폴드 생성을 위한 지방세포, 단핵구 및 하이드로겔 혼합물 대비 약 1 내지 10 %(w/v), 1 내지 8 %(w/v), 2 내지 6 %(w/v), 2 내지 3 %(w/v), 1 내지 3 %(w/v), 2 내지 3 %(w/v), 또는 약 2 %(w/v)가 사용될 수 있다. 바람직한 알지네이트 함량보다 낮을 경우 세포배양 구조체의 용해도가 증가하며, 높을 시에는 세포들의 증식 및 생존율이 감소하게 된다. 예를 들어, 갈조류로부터 유래된 알지네이트의 함량이 2 %(w/v) 미만 포함되는 경우 지방세포의 생존 및 증식은 매우 활발할 수 있으나, 하이드로겔 스캐폴드에서 지방세포 및 단핵구 공동 배양시 구조체의 형태가 오래 유지되지 않아 배양 및 연구의 적용에 어려움이 있을 수 있다. 따라서, 알지네이트 함량이 약 2 %(w/v)일 때 하이드로겔 스캐폴드의 형태가 유사 지방조직 형성 시까지 충분히 유지될 수 있으며 지방세포의 생존 및 증식도 일정하게 유지될 수 있다. 예를 들어, 본원의 세포 구조체에 포함되는 알지네이트 하이드로겔은 젤라틴 및 콜라겐이 더 포함될 수 있으며, 젤라틴과 콜라겐의 함량은 하이드로겔 전체 함량 대비 각각 약 0.1 내지 5 %(w/v), 약 0.2 내지 2 %(w/v), 또는 약 0.5 %(w/v) 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 3 차원 세포배양 구조체는 세포 배양 배지 및/또는 세포 분화 배지 내에 존재할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 3 차원 세포배양 구조체가 세포 배양 배지 및/또는 세포 분화 배지 내에 존재하는 경우, 상기 배지가 하이드로겔을 통하여 중간엽 줄기세포, 중간엽 줄기세포로부터 분화되는 지방 전구세포, 지방 전구세포로부터 분화되는 지방세포, 단핵구, 및/또는 단핵구로부터 분화되는 마크로파지에 작용할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 분화 배지는 지방 전구세포 분화 배지 및/또는 지방세포 분화 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 지방 전구세포 분화 배지 및/또는 지방세포 분화 배지는 본원발명이 속하는 기술 분야에서 중간엽 줄기세포를 지방 전구세포로 분화시키거나 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키기 위해 필요로 하는 것으로 여겨지는 배지의 구성 성분 및/또는 인자(factor)를 포함할 수 있으며, 포함되는 성분 또는 인자의 종류 및/또는 농도는 통상의 기술자가 용이하게 조절할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 중간엽 줄기세포는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 약 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 중간엽 줄기세포는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 약 1 x 106 세포/mL 포함될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 단핵구는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 약 1 x 103 세포/mL 내지 1 x 105 세포/mL 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 단핵구는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 약 1 x 104 세포/mL 포함될 수 있다.
구체적으로는, 본원발명에서 하이드로겔 스캐폴드가 제조될 때 혼합되는 중간엽 줄기세포의 수는 혼합물 또는 하이드로겔 스캐폴드의 디자인, 및 원하는 분화 또는 증식 속도 등에 따라 조절될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 하이드로겔과 혼합되는 세포 수가 많은 경우 배양 시간이 지날수록 증식률이 상승하게 되므로, 하이드로겔과 혼합되는 중간엽 줄기세포의 수는 1 x 105 세포/ml 이상인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않을 수 있다. 중간엽 줄기세포의 수가 1 x 105 세포/ml 미만일 경우에는 증식이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, (a) 인간 유래의 중간엽 줄기세포, 인간 유래의 단핵구, 및 알지네이트 용액의 혼합물을 준비하고; (b) 상기 혼합물을 겔화하여 중간엽 줄기세포 및 단핵구를 포함하는 알지네이트 하이드로겔을 제조하고; 그리고 (c) 상기 하이드로겔 내에서 상기 중간엽 줄기세포 및 단핵구를 배양 및 분화시키는 것을 포함하는 3 차원 세포배양 방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 3 차원 세포배양 방법은 상기 하이드로겔 내에서 상기 중간엽 줄기세포를 지방 전구세포로 분화시키는 것을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 3 차원 세포배양 방법은 상기 하이드로겔 내에서 상기 단핵구를 마크로파지로 분화시키는 것을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 3 차원 세포배양 방법은 상기 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키는 것을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 분화된 지방세포는 C/EBPα, PPARγ2, ACC, FAS, 페리리핀 (perilipin) 및 FABP로 구성되는 군에서 선택되는 마커를 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 분화된 지방세포는 상기 마커들 외에도 인간 유래 지방세포가 정상적으로 발현하는 것으로 알려진 다른 마커들을 발현할 수 있고, 인간 유래 지방세포가 정상적이라면 발현하지 않는 것으로 알려진 다른 마커들을 발현하지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 분화된 지방세포가 정상 지방조직 또는 대사증후군 질환을 가지는 개체의 지방조직과 유사하게 기능하는 유사 지방조직을 형성할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 유사 지방조직은 인체 내의 정상 지방조직 또는 대사증후군 질환을 가지는 개체의 지방조직과 유사한 형태 및/또는 기능 및/또는 유전자 발현 및/또는 단백질 발현을 보이는 것일 수 있으며, 따라서 외부 약물에 대한 반응 역시 생체 내와 유사할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 알지네이트 용액은 콜라겐, 젤라틴 및 알지네이트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 중간엽 줄기세포는 상기 혼합물 내에 약 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 중간엽 줄기세포는 상기 혼합물 내에 약 1 x 106 세포/mL 포함될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 단핵구는 상기 혼합물 내에 약 1 x 103 세포/mL 내지 1 x 105 세포/mL 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 단핵구는 상기 혼합물 내에 약 1 x 104 세포/mL 포함될 수 있다.
예를 들어, 본원발명에서 세포 및 알지네이트 용약을 겔화하여 알지네이트 하이드로겔 스캐폴드를 형성하는 것은, 디스펜서를 구비한 3 차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 3 차원 세포-프린팅 시스템(3 차원 cell-printing system)은 입체구조의 하이드로겔 스캐폴드를 생성하기 위해 사용되는 시스템이다. 상기 시스템은 3 차원 세포-프린팅을 위해 x-y-z 스테이지(stage), 디스펜서, 실린지 노즐(syringe nozzle), 압축 컨트롤러 및 컴퓨터 시스템을 구비할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 스캐폴드의 구조 및 구성은 혼합물에 포함된 성분 및 농도, 프로그램을 통한 디자인, 세포-플로팅 시 압력 및/또는 속도에 의해 적절하게 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 세포 공동 배양을 위한 하이드로겔 스캐폴드의 형태는, 예를 들어 비드(bead) 모양일 수 있으나, 이러한 모양에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 혼합물을 겔화하는 것은 상기 혼합물을 비드 형태로 적하(dropping)하는 것에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 혼합물을 겔화하는 것은 3 차원 세포-프린팅 시스템을 이용하여 수행되거나, 또는 실린지를 이용하여 액체 상태의 혼합물을 식염수 또는 버퍼와 같은 용매 내로 적하하는 것에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 용매는 염화칼슘 및/또는 염화마그네슘 수용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 3 차원 세포배양 구조체를 지방세포 분화 배지 내에서 배양하여 상기 중간엽 줄기세포를 지방세포로 분화시키고; 분화된 지방세포에 약물 후보물질을 처리하고; 그리고 상기 지방세포의 유전자 발현, 단백질 발현 및 효소 활성 중 하나 이상을 분석하는 것을 포함하는 약물 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 약물 스크리닝 방법은 상기 약물 후보물질을 처리하기 전후의 상기 지방세포의 유전자 발현, 단백질 발현 및 효소 활성 중 하나 이상을 상호 비교하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 유전자 발현 및/또는 단백질 발현 및/또는 효소 활성의 비교는, 본원발명이 속하는 기술 분야에서 널리 알려진 유전자 발현 분석 방법 및/또는 단백질 발현 분석 방법 및/또는 효소 활성 분석 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 약물 스크리닝 방법은 대사성 질환 (대사증후군 질환)의 예방 또는 치료용 약물 탐색을 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 다르면, 상기 대사성 질환이 비만, 인슐린 저항성 또는 제2형 당뇨병일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[
실시예
]
세포 배양
지방 조직 유래 중간엽 줄기세포(ADMSCs, adipose tissue derived mesenchymal stem cell, human mesenchymal stem cell from adipose tissue)를 CEFO Bio Inc. (Seoul, Korea)로부터 구매하였으며, U937 단핵구(monocytes) (ATCC #CRL-1593.2)를 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 구매하였다. ADMSC 및 U937는 ADMSC 보충 배지 (CEFO Bio Inc., Seoul, Korea) 10% 및, 100 ㎍/ml의 페니실린과 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 (Invitrogen, CA, USA)의 혼합물 1%를 함유하는 ADMSC 성장 배지 (CEFO Bio Inc., Seoul, Korea) 내에서 유지되었다. 이어서, 세포들은 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내의 T75 세포 배양 플라스크 내에서 성장 및 유지되었다. DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline, Invitrogen, CA, USA)로 세척된 후에, 플레이트에 부착된 ADMSC는 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내에서, 1 ml의 0.5% 트립신-EDTA (Gibco, CA, USA)에서 인큐베이션되었고, 이후 ADMSC는 5 ml의 DPBS와 함께 스크랩(scrap) 되었다. U937는 배지 내에서 부유 성장 특성을 가지므로 트립신 처리 없이 회수가능하였다. 세포 현탁물은 2 분 동안 1,500 rpm에서 원심분리되었고, 세포 펠렛은 하이드로겔과 균질하게 혼합되었다.
세포-적하(cell-drop) 시스템
3 차원 디스펜싱(dispensing) 구조를 조립하기 위해 3 차원 세포-적하 시스템이 사용되었다. 상기 시스템은 x-y-z 스테이지, 디스펜서, 시린지 노즐, 압축 컨트롤러, 및 컴퓨터 시스템으로 구성되어 있다. 상기 디스펜서는 하이드로겔을 보유하는 리저버 탱크(reservoir tank)이다. 상기 컴퓨터 시스템은 디스펜서 내의 세포-하이드로겔 혼합물의 공기압을 조절한다. 세포-적하 시스템의 공기압은 50 kPa로 조절되었다. 일정한 공기압이 디스펜서에 적용되었다. 세포-적하 시스템을 이용하여 구성된 하이드로겔은 알지네이트 (2%), 젤라틴 (0.5%), 및 콜라겐 (0.5%)을 함유한다. 갈조류로부터 유래한 중간 점도의 소듐 알지네이트, 염화칼슘, 젤라틴 및 콜라겐 타입 1은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. 세포 적하를 위한 0.5 mm 및 1 mm 노즐을 가지는 디스펜서 내에 콜라겐, 젤라틴 및 세포와 혼합된 알지네이트를 위치시켰다. 적하된 스캐폴드를 이용하여, 지방전구세포 또는 단핵구 공동 배양 및 이후의 분화를 이용한 지방 조직 모델을 최적화하기 위한 연구를 수행하였다. 적하된 알지네이트 구조는 구형의 모양을 가졌다. 이러한 비드 모양의 스캐폴드 제작 장비 및 관련 소프트웨어는 Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT)에서 사용되었다.
알지네이트
하이드로겔을
이용한
3 차원
비드
모양
스캐폴드
제작
비드 모양 하이드로겔 스캐폴드는, 알지네이트, 젤라틴 및 콜라겐을 함유하는 세포-적하 시스템을 이용하여 제조되었다. 갈조류로부터 유래한 중간 점도의 소듐 알지네이트, 염화칼슘, 젤라틴 및 콜라겐 타입 1은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. 콜라겐, 젤라틴 및 세포와 혼합된 알지네이트는, 세포-혼합물 프린팅을 위해 1 mm 노즐을 가지는 디스펜서 내에 위치되었다. 프린트된 비드 모양 스캐폴드를 이용하여, 지방 전구세포로 분화된 ADMSC 또는 마크로파지로 활성화된 U937 단핵구의 공동 배양 및 이후의 분화를 이용한 지방 조직 모델을 최적화시키기 위한 연구를 수행하였다. 제조된 비드 모양 알지네이트 스캐폴드 구조의 크기는 디스펜서의 노즐 크기에 의해 조절될 수 있다 (도 1). 도 1은 다양한 3 차원 비드 모양 알지네이트 하이드로겔의 대표적인 형태를 보여주는 사진 이미지이다. 3 차원 세포-적하 시스템에 의한 3 차원 비드 모양 스캐폴드는 거의 구형으로 제작되었다. 콜라겐, 젤라틴 및 세포와 혼합된 알지네이트는 디스펜서 내에 위치되고, 이어서 세포-혼합물은 0.5 mm (그룹 2) 및 1 mm (그룹 1)의 디스펜서 노즐을 통해 적하되었다.
세포의 공동 배양 및 분화
ADMSC (1×106 세포/ml) 및 U937 (1×104 세포/ml)의 시딩(seeding) 밀도는 일회용 혈구계산기-기반 세포계수기 (SKC Co. Ltd., Seoul, Korea) 및 도립현미경 (inverted microscope, Eclipse TE2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 조절하였다. 세포-하이드로겔 혼합물은 세포-적하 시스템을 이용하여 비드 모양 스캐폴드로 제작되었다. 제작된 하이드로겔 내의 세포는 형광 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)을 이용한 세포 생존 분석(live/dead cell assay)에 의하여 관찰되었다. 제작된 비드 모양 스캐폴드 또는 2 차원 배양된 ADMSC는, 분화 배지에 의해 지방전구세포 및 지방세포로 분화되었다. 2 차원 배양 실험군의 경우 3 차원 배양과 동일한 배지를 사용하여, 0.5 x 105 세포/mL의 지방전구세포를 6-웰 세포배양 플레이트 상에 배양하여 실험에 사용하였다. 지방전구세포로의 분화를 위해, 50 ㎍/ml 인슐린, 500μM 이소부틸메틸잔틴 (IBMX), 1μM 덱사메타손 (DEX) 및 50μM 인도메타신 (INDO)을 함유하는 분화 배지에서 4 일 동안 배양되었으며, 지방세포로의 분화를 위해서는, 50 ㎍/ml 인슐린, 500 μM IBMX, 1 μM DEX 및 50 μM INDO를 함유하는 분화 배지에서 14 일 동안 배양되었다. 공동배양되는 단핵구의 마크로파지로의 분화 및 활성의 유지를 위해, 10 ng/ml PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 100 ng/ml LPS (lipopolysaccharide)를 지방세포 분화배지에 첨가하여 배양하였으며, 지방전구세포 분화기간에도 첨가하였다.
세포가 완전히 분화된 후, 배지는 10% FBS를 함유하는 무인슐린 배지로 교환되었다. 세포는 성장 배지에서 하루 동안 배양되었다.
세포
생존률
및 증식 분석
3 차원으로 제작된 비드 모양 스캐폴드 내에서의 세포 생존률은 세포 생존 분석(live/dead cell assay) 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 측정되었으며, 형광 현미경 (ECLIPSE TE2000-U; Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰되었다. 스캐폴드 세포들은 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, Gibco, CA, USA,)로 세척되었고, HBSS 내에서 칼세인(calcein) 및 EthD-1(ethidium homodimer-1)로 15 분 동안 염색되었다. 염색된 세포는 HBSS로 2 회 세척되었고, 녹색 (살아있는 세포에서 ex/em ~495 nm/~515 nm) 및 적색 (죽은 세포에서 ex/em ~495 nm/~635 nm) 형광의 여기가 형광 현미경에 의해 시각화되었다. 세포의 증식은 세포 계수 키트 (Cell Counting Kit-8, CCK-8) 분석 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정되었다. 24-웰 플레이트 내의 3 차원 제작된 비드 모양 스캐폴드는 100 μl의 CCK-8을 함유하는 1 ml의 배지 내에 위치되어 37℃에서 4 시간동안 인큐베이션되었으며, 이어서 마이크로-플레이트 분광광도계 (BIORAD, Inc., Korea)에 의해 450 nm에서의 흡광도가 측정되었다.
지방 입자(lipid droplet)의 형광 염색
3 차원 비드 모양 스캐폴드 내의 성숙한 지방세포의 지방 입자 염색이 보론-다이피로메텐 (Boron-dipyrromethene, BODIPY 493/503) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 수행되었다. 디메틸 설폭사이드(DMSO) 내의 BODIPY 493/503 스톡 용액 (2 mg/ml)이 준비되었으며, 염색을 위해 HBSS 내에 1/2,000 (1 μg/ml BODIPY)으로 희석되었다. 염색을 위한 전처리로서 고정을 하기 위하여, 스캐폴드는 HBSS로 세척되었고, 이어서 4% 파라포름알데히드 용액 내에서 4℃에서 30 분 동안 고정되었다. 3 회의 HBSS 세척으로 파라포름알데히드 용액을 제거하고, 스캐폴드는 희석된 BODIPY 1 ml에 의해 37℃에서 30 분 동안 염색되었다. 스캐폴드 내의 염색된 지방 입자는 HBSS에 의해 2 회 세척되었고 형광 현미경을 이용하여 시각화되었다.
웨스턴
블랏
분석
프로테아제 저해제 혼합물 (protease inhibitor cocktail, Roche life science, Seoul, Korea)을 함유하는 프로-프렙 (PRO-PREP) 단백질 추출 용액 (iNtRON Biotechnology Inc., Seoul, Korea)을 이용하여 스캐폴드로부터 수득한 세포 용출물을 처리하였다. 이어서 세포 용출물을 13,000 rpm에서 원심분리한 후, 각각의 샘플들로부터 얻은 20 μg의 단백질을 NuPage Bis-Tris Mini Gels (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 상에 로딩하고 PVDF 멤브레인 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)으로 트랜스퍼하였다. 블로킹된 멤브레인은 이어서 FABP4 (fatty acid binding protein 4), CCAAT-인핸서-결합 단백질 알파 (C/EBPα), 페리리핀, 지방산 합성 (fatty acid syntheses, FAS), 아세틸 코엔자임 A (acetyl Coenzyme A, ACC), β-액틴 (Cell Signaling, MA, USA) 및 PPARγ (Abcam, Cambridge, UK)의 항체와 함께 인큐베이션되었다. 면역반응성 밴드들은 Supersignal West Dura Extended Duration Substrate Kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)의 화학발광 (chemiluminescent) 시약에 의해 발색되었다. 단백질 밴드들은 바이오라드 (BIORAD, Inc. Korea)사의 화학발광장치에 의해 시각화 되었다.
글루코스
수용 분석 (glucose uptake assay)
2 차원 배양, 또는 U-937 및 제작된 3 차원 비드 모양 스캐폴드와 공동 배양된 ADMSC가 각각 96-웰 조직 배양 플레이트 및 24-웰 조직 배양 플레이트에서 지방 전구세포 및 지방세포로 분화되었으며, 2-디옥시-D-글루코스로부터 2-디옥시-D-글루코스-6-포스페이트의 전환률이 측정되었다. 조직 배양 플레이트 내의 ADMSC로부터 최대 4 일 동안 지방 전구세포가 유도되었고, 글루코스 수용 평가를 위해 조직 배양 플레이트 내의 ADMSC로부터 지방 생성(adipogenesis)이 최대 18 일 동안 유도되었다. 완전히 분화된 후에, 인슐린 의존-글루코스 수용이 제조자의 설명서에 따라 글루코스 수용 분석 키트 (Glucose Uptake Assay Kit, Abcam, UK)을 이용하여 비색 분석에 의해 정량적으로 측정되었다.
통계
결과 도표들은 평균 ± 평균 표준 오차 (S.E.M)로 표시되었다. 통계적 유의도는 GraphPad Prism 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 이용하여 분석되었다. 통계적 유의도는 스튜던트의 T 검정 또는 일원분산분석 (one-way analysis of variance, ANOVA)에 이은 Tukey의 다중비교분석 (Tukey's multiple-comparison test)에 의해 분석되었다.
결과
도 2는 3 차원 비드 모양 하이드로겔 내의 ADMSC의 형태를 나타낸 것이다. 세포의 형태는 세포 생존 분석 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용해 분석되었으며 형광 현미경을 이용해 관찰되었다. 살아있는 세포는 녹색 형광을 발현하며 죽은 세포는 적색 형광을 발현한다 (화살표). 제작된 ADMSC 비드 모양 스캐폴드는 세포 생존 분석에 의해 우수한 세포 생존률을 보여주었다 (도 2). 생존 세포들은 녹색 형광 이미지로 식별되었으며, 죽은 세포들은 적색 형광 이미지로 식별되었다. 사용된 하이드로겔 스캐폴드의 알지네이트 농도는 2%였으며, 이러한 2% 알지네이트 하이드로겔 스캐폴드 내의 세포는 18 일 내지 한 달 까지 둥근 모양을 유지하였다. 이전의 연구에서는, 다양한 알지네이트 농도 (2% 내지 4%)에서의 증식이 연구된 바 있다. 그 결과, 2% 알지네이트 스캐폴드 내의 세포가 우수한 생존력을 나타낸 바 있다.
도 3은 3 차원 알지네이트 스캐폴드 내의 지방세포의 형광 이미지이다. 세포의 형태는 BODIPY 지방 염색 분석 키트를 이용해 분석되었으며 40 x 배율에서 시각화되었다. 알지네이트 하이드로겔 시스템이 ADMSC를 지방 전구세포 및 성숙한 지방세포로 분화시켰는지 확인하기 위해, ADMSC가 배양되었고 지방 전구세포로 분화되었다. 추가적으로, ADMSC로부터 분화된 지방 전구세포는 14 일의 분화 기간 동안 DEX, IBMX, INDO 및 인슐린과 같은 분화 배지 첨가제를 이용하여 유도되었다. 이러한 첨가제들이 처리된 3 차원 비드 모양 스캐폴드 내의 ADMSC는 총 18 일 동안 분화되었으며, 3 차원 비드 모양 알지네이트 하이드로겔 스캐폴드 내에서 우수한 세포 생존률을 가진다는 것이 관찰되었다. 18 일 후에, BODIPY 지방 염색 분석에 의해 성숙한 지방세포의 세포질 내에 내에 균등하게 분포된 지방 입자가 관찰되었다 (도 3).
도 4a 내지 4c는 ADMSC의 2 차원 배양 및 3 차원 비드 모양 알지네이트 스캐폴드 배양에서의 지방세포 마커의 시간-의존 발현을 보여주는 이미지이다. 웨스턴 블랏 분석에서, 2 차원 및 3 차원 비드 모양 알지네이트에서 최대 18 일 동안 지방 형성이 유도되었다. ADMSC는 6-웰 플레이트 및 세포-하이드로겔 혼합물 내에 각각 1×106 세포/ml로 시딩되었다. 도 5는 2 차원 및 3 차원 배양 시스템에서의 지방세포 마커 단백질 발현 시점을 비교 분석한 개략도이다.
그 결과, 지방세포 마커 발현이 3 차원 하이드로겔 스캐폴드 내에서의 배양 및 분화 기간 동안 크게 증가하였다. 3 차원 알지네이트 비드 내에서, C/EBPα 단백질은 3 일 후에 발현되었다. PPARγ2 단백질은 5 일 후에 발현되었다. ACC, FAS, 페리리핀 및 FABP는 7 일 후에 발현되었다 (도 4a). 2 차원 ADMSC 분화 기간에서, C/EBPα 단백질은 2~4일 후에 발현되었다. PPARγ2 단백질은 6 일 후에 발현되었다. ACC 및 FAS는 6 일 후에 발현되었다. 페리리핀 단백질은 7 일 후에 발현되었다. FABP4 단백질은 11 일 후에 발현되었다 (도 4b). 2 차원 ADMSC 분화와 비교하여, 3 차원 알지네이트 비트 내의 ADMSC의 지방형성 마커 발현은 상대적으로 빠른 것으로 관찰되었다 (도 4 및 5).
또한, 비드의 크기에 따른 단백질 마커 발현의 차이를 확인하기 위해 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 작은 크기 (4 mm) 및 큰 크기 (6 mm)의 3 차원 비드 모양 알지네이트 스캐폴드가 제작되었다. 본원의 목적은 3 차원 배양 시스템을 초고속 약물 스크리닝 시스템 (HTS drug screening system)에 적용하는 것이므로, 96 웰 플레이트에 삽입하기 위해서는 비드의 크기가 6 mm을 초과하면 안되었다. ADMSC는 세포-하이드로겔 혼합물에 1×106 세포/ml로 시딩되었다. 두 종류의 크기의 3 차원 비드 모양 알지네이트 내에서 0 일 내지 15 일 동안 지방 형성이 유도되었으며 웨스턴 블랏 분석되었다. 이에 따른 분석 결과가 도 4c에 나타나 있다. 그 결과. 비드의 크기 또는 부피에 관계 없이 두 종의 ADMSC 알지네이트 비드에서 지방세포로의 분화가 관찰되었다 (도 4c).
이어서, 3 차원 비드 모양 공동 배양 세포, 3 차원 공동 배양 비드 모양 스캐폴드 내에서의 지방세포 마커의 발현이 웨스턴 블랏 분석에 의해 연구되었다.
먼저, 3 차원 공동 배양 시스템 내의 지방세포의 지방 입자의 형광 이미지를 수득하기 위해, 3 차원 비드 모양 스캐폴드가 활성화된 U937 (1×104 세포/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 ADMSC 지방 전구세포 (1×106 세포/ml)를 이용해 제작되었다. 세포의 형태는 BODIPY 지방 염색 분석 키트를 이용해 분석되었으며 40 x 배율에서 시각화되었다.
또한, 3 차원 공동 배양 시스템에서의 지방세포 마커의 발현 분석하기 위해, 3 차원 비드 모양 스캐폴드가 활성화된 U937 (1×104 세포/ml)의 존재 또는 비존재 하에서 ADMSC 지방 전구세포 (1×106 세포/ml)를 이용해 제작되었다. 웨스턴 블랏 분석을 위해, 3 차원 비드 모양 알지네이트에서 최대 18 일까지 지방 형성이 유도되었다.
그 결과, 3 차원 ADMSC 지방 전구세포 스캐폴드에서보다 3 차원 지방세포 및 공동 배양 스캐폴드에서 지방산 합성-관련 마커인 FABP4, FAS 및 ACC 등의 발현이 높게 관찰되었다. 3 차원 ADMSC 알지네이트 비드 및 공동 배양된 비드에서는, 단핵구 없이 배양된 지방세포와 유사한 발현 패턴 및 지방 형광 이미지가 나타났다. GLUT4 및 Akt 인산화와 같은, 글루코스 대사-관련 마커 발현 및 인산화는 3 차원 지방 전구세포 스캐폴드에 비하여 3 차원 지방세포 스캐폴드에서 크게 증가되었다. 그러나, 3 차원 공동 배양 스캐폴드에서의 GLUT4 발현은 3 차원 지방세포 스캐폴드에서보다 감소되었다.
다음으로, 3 차원 비드 모양 알지네이트 스캐폴드에서 단독- 또는 공동 배양된 지방세포의 글루코스 수용 활성을 분석하기 위해, 3 차원 비드 모양 스캐폴드 내의 단독- 또는 공동 배양된 ADMSC 지방 전구세포에서 최대 18 일까지 지방 형성이 유도되었다.
글루코스 수용 분석 결과, 인슐린 처리된 3 차원 지방 전구세포 그룹은 글루코스 수용이 약간 향상되었으나 인슐린 비처리 지방 전구세포에 비해 유의적인 차이는 보이지 않았다. 3 차원 지방세포 그룹은 3 차원 지방 전구세포 스캐폴드에 비해 현저히 향상된 글루코스 수용 수준을 나타내었다. 인슐린 처리된 3 차원 지방세포 그룹은 인슐린 비처리 지방세포 그룹에 비하여 현저히 향상된 글루코스 수용 수준을 나타내었다. 3 차원 공동 배양 그룹은 3 차원 지방 전구세포 그룹과 비교하여 약간 향상된 글루코스 수용 수준을 나타내었다. 추가적으로, 인슐린 처리된 3 차원 공동 배양 그룹은 글루코스 수용 수준이 약간 향상되어 인슐린 비처리 지방세포 그룹 정도의 수준을 나타내었다. 인슐린 처리된 3 차원 공동 배양 그룹의 글루코스 수용 수준은, 비록 인슐린이 글루코스 수용 수준을 증가시키기는 했지만, 활성화된 U937 마크로파지에 의해 조절되었다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (22)
- 알지네이트 하이드로겔; 및
상기 알지네이트 하이드로겔 내에 포함된, 인간 유래의 중간엽 줄기세포 및 인간 유래의 단핵구(monocyte)
를 포함하는, 3 차원 세포배양 구조체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포(adipose tissue derived mesenchymal stem cell, ADMSC)인, 3 차원 세포배양 구조체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 알지네이트 하이드로겔은 콜라겐, 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 것인, 3 차원 세포배양 구조체.
- 제 1 항에 있어서,
세포 배양 배지 또는 세포 분화 배지 내의, 3 차원 세포배양 구조체.
- 제 4 항에 있어서,
상기 세포 분화 배지는 지방 전구세포 분화 배지 또는 지방세포 분화 배지인 것인, 3 차원 세포배양 구조체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL 포함되는 것인, 3 차원 세포배양 구조체.
- 제 1 항에 있어서,
상기 단핵구는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 1 x 103 세포/mL 내지 1 x 105 세포/mL 포함되는 것인, 3 차원 세포배양 구조체.
- (a) 인간 유래의 중간엽 줄기세포, 인간 유래의 단핵구, 및 알지네이트 용액의 혼합물을 준비하고;
(b) 상기 혼합물을 겔화하여 중간엽 줄기세포 및 단핵구를 포함하는 알지네이트 하이드로겔을 제조하고; 그리고
(c) 상기 하이드로겔 내에서 상기 중간엽 줄기세포 및 단핵구를 배양 및 분화시키는 것을 포함하는, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포인, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 하이드로겔 내에서 상기 중간엽 줄기세포를 지방 전구세포로 분화시키는 것을 더 포함하는, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 10 항에 있어서,
상기 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키는 것을 더 포함하는, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 11 항에 있어서,
상기 분화된 지방세포는 C/EBPα, PPARγ2, ACC, FAS, 페리리핀 및 FABP로 구성되는 군에서 선택되는 마커를 발현하는 것인, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 11 항에 있어서,
상기 분화된 지방세포가 유사 지방조직을 형성하는 것인, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 하이드로겔 내에서 상기 단핵구를 마크로파지로 분화시키는 것을 더 포함하는, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 알지네이트 용액은 콜라겐, 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 것인, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL 포함되는 것인, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 단핵구는 상기 알지네이트 하이드로겔 내에 1 x 103 세포/mL 내지 1 x 105 세포/mL 포함되는 것인, 3 차원 세포배양 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 혼합물을 겔화하는 것은 상기 혼합물을 비드 형태로 적하(dropping)하는 것에 의하여 수행되는 것인, 3 차원 세포배양 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 3 차원 세포배양 구조체를 지방세포 분화 배지 내에서 배양하여 상기 중간엽 줄기세포를 지방세포로 분화시키고;
분화된 지방세포에 약물 후보물질을 처리하고; 그리고
상기 지방세포의 유전자 발현, 단백질 발현 및 효소 활성 중 하나 이상을 분석하는 것을 포함하는,
약물 스크리닝 방법.
- 제 19 항에 있어서,
상기 약물 후보물질을 처리하기 전후의 상기 지방세포의 유전자 발현, 단백질 발현 및 효소 활성 중 하나 이상을 상호 비교하는 것을 포함하는, 약물 스크리닝 방법.
- 제 19 항에 있어서,
대사성 질환의 예방 또는 치료용 약물 탐색을 위한, 약물 스크리닝 방법.
- 제 21 항에 있어서,
상기 대사성 질환이 비만, 인슐린 저항성 또는 제2형 당뇨병인, 약물 스크리닝 방법.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| KR1020170010068A KR20180086378A (ko) | 2017-01-20 | 2017-01-20 | 인간 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 |
| PCT/KR2018/000875 WO2018135891A1 (ko) | 2017-01-20 | 2018-01-18 | 포유동물 유래 중간엽 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포를 포함하는 3 차원 세포배양 구조체, 이를 이용한 3 차원 세포배양 방법, 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 및 이의 용도 |
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| KR (1) | KR20180086378A (ko) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2020190094A1 (ko) * | 2019-03-21 | 2020-09-24 | (주)안트로젠 | 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 주사형 조성물 및 이의 제조, 동결 및 해동방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160021352A (ko) | 2014-08-14 | 2016-02-25 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 3차원 세포배양 시스템 및 이를 이용한 약물 스크리닝 시스템 |
-
2017
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|---|---|---|---|---|
| WO2020190094A1 (ko) * | 2019-03-21 | 2020-09-24 | (주)안트로젠 | 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 주사형 조성물 및 이의 제조, 동결 및 해동방법 |
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