JP6100245B2 - ヒト臍帯組織由来細胞を使用する椎間板変性症の処置法 - Google Patents
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Description
臍帯由来細胞の単離
臍帯は、National Disease Research Interchange(NDRI,Philadelphia,PA)から得た。それらの組織は、正常分娩後に得られたものであった。細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。血液及び残渣を除去するために、臍帯を、抗真菌剤及び抗生物質(100単位/mLのペニシリン、100マイクログラム/mLのストレプトマイシン、0.25マイクログラム/mLのアンホテリシンB)の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;Invitrogen,Carlsbad,CA)中で洗浄した。次いで、それらの組織を、150cm2の組織培養プレート内で、50mLの培地(DMEM−低グルコース又はDMEM−高グルコース;Invitrogen)の存在下で、組織が微細なパルプ状に細断されるまで機械的に解離させた。細断した組織を、50mLのコニカルチューブに移した(チューブ1本当り組織約5グラム)。次いで、それぞれ上述の通りに抗真菌剤及び抗生物質を含有させた、DMEM−低グルコース培地若しくはDMEM−高グルコース培地中で、この組織を消化させた。一部の実験では、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素混合物を使用した(「C:D」;DMEM−低グルコース培地中、コラゲナーゼ(Sigma(St Louis,MO)、500単位/mL;及びディスパーゼ(Invitrogen)、50単位/mL))。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの混合物(「C:D:H」)を使用した(DMEM−低グルコース中、コラゲナーゼ、500単位/mL;ディスパーゼ、50単位/mL;及びヒアルロニダーゼ(Sigma)、5単位/mL)。これらの組織、培地、及び消化酵素を入れたコニカルチューブを、225rpmの軌道振盪器(Environ,Brooklyn,NY)内で、37℃で2時間インキュベートした。
ヒト分娩後に誘導される細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる評価
臍帯組織をフローサイトメトリーにより特性評価し、臍帯組織から得られた細胞の同一性についてプロファイルを用意した。
細胞の表現型の免疫組織化学的評価
ヒト臍帯組織を採取し、4%(w/v)パラホルムアルデヒドにより4℃で一晩浸漬固定した。免疫組織化学は、以下のエピトープに対する抗体を使用して実行した:ビメンチン(1:500;Sigma,St.Louis,MO)、デスミン(1:150、抗ウサギ;Sigma;又は1:300、抗マウス;Chemicon,Temecula,CA)、α−平滑筋アクチン(SMA;1:400;Sigma)、サイトケラチン18(CK18;1:400;Sigma)、ヴォン・ヴィレブランド因子(vWF;1:200;Sigma)、及びCD34(ヒトCD34クラスIII;1:100;DAKOCytomation,Carpinteria,CA)。更には、以下のマーカーを試験した:抗ヒトGROα−PE(1:100;Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、抗ヒトGCP−2(1:100;Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA)、抗ヒト酸化LDL受容体1(ox−LDL R1;1:100;Santa Cruz Biotech)、及び抗ヒトNOGO−A(1:100;Santa Cruz Biotech)。外科用メスを使用して、固定標本をトリミングし、エタノールを入れたドライアイス浴上で、OCT包理化合物(Tissue−Tek OCT;Sakura,Torrance,CA)内部に包埋した。次いで、凍結ブロックを、一般的クライオスタット(Leica Microsystems)を使用して切片(厚さ10μm)とし、染色のためにスライドガラス上に載置した。
オリゴヌクレオチドアレイ解析
Affymetrix GeneChip(登録商標)アレイを使用して、臍帯由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、及びヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この解析により、分娩後に誘導された細胞の特性評価が提供され、これらの細胞に関係する固有の分子マーカーが特定された。
(表7)において発現が増加していた遺伝子を示す。
臍帯由来細胞における細胞マーカー
上記に示した通り、分娩後に得られる細胞に対し遺伝子の「特徴(signature)」を確認した:酸化型LDL受容体1、インターロイキン8、レニン、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド3(CXCリガンド3)及び顆粒球走化性タンパク質2(GCP−2)。これらの「特徴的な」遺伝子は、分娩後に得られる細胞において比較的高レベルに発現していた。
分娩後に得られる細胞のインビトロでの免疫学的評価
存在する場合には、インビボ移植の際に分娩後由来細胞(PPDC)が誘導する免疫応答を予測する目的で、PPDC細胞を、それらの免疫学的特性に関してインビトロで評価した。HLA−DR、HLA−DP、HLA−DQ、CD80、CD86、及びB7−H2の存在に関して、PPDCを、フローサイトメトリーによってアッセイした。これらのタンパク質は、抗原提示細胞(APC)によって発現され、ナイーブCD4+ T細胞の直接刺激に必要とされる(Abbas & Lichtman、Cellular and Molecular Immunology,5th Ed.(Saunders,Philadelphia,2003;p.171))。これらの細胞株はまた、HLA−G(Abbas & Lichtman,2003年、上記参照),CD178(Coumans,et al.,Journal of Immunological Methods,1999;224:185〜196)、及びPD−L2(Abbas & Lichtman,2003年、上掲;Brown,et.al.,The Journal of Immunology,2003;170:1257〜1266)の発現に関しても、フローサイトメトリーによって分析された。胎盤組織内に存在する細胞による、これらのタンパク質の発現は、子宮内の胎盤組織の免疫特権状態を介在すると考えられる。胎盤由来細胞株及び臍帯由来細胞株が、インビボで免疫反応を誘導する程度を予測するために、それらの細胞株を、一方向混合リンパ球反応(MLR)で試験した。
臍帯由来細胞及び胎盤由来細胞による、栄養因子の分泌
臍帯由来細胞からの、選択された栄養因子の分泌を測定した。検出に使用される因子としては、(1)肝細胞増殖因子(HGF)(Rosen et al.,Ciba Found.Symp.,1997;212:215〜26)、単球走化性タンパク質1(MCP−1)(Salcedo et al.,Blood,(2000;96:34〜40)、インターロイキン−8(IL−8)(Li et al.,J.Immunol.,2003;170:3369〜76)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)(Hughes et al.,Ann.Thorac.Surg.,2004;77:812〜8)、マトリックスメタロプロテアーゼ1(TIMP1)、アンジオポエチン2(ANG2)、血小板由来増殖因子(PDGF−bb)、トロンボポエチン(TPO)、ヘパリン結合性上皮増殖因子(HB−EGF)、ストロマ細胞由来因子1α(SDF−1α)など、血管新生作用を有することが既知のもの;(2)脳由来神経栄養因子(BDNF)(Cheng et al.,Dev.Biol.,2003;258:319〜33)、インターロイキン−6(IL−6)、顆粒球走化性タンパク質−2(GCP−2)、トランスホーミング増殖因子β2(TGFβ2)など、神経栄養/神経保護活性を有することが既知のもの;並びに(3)マクロファージ炎症性タンパク質1α(MIP1a)、マクロファージ炎症性タンパク質1β(MIP1b)、単球走化性タンパク質−1(MCP−1)、ランテス(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)、I309、胸腺及び活性化制御ケモカイン(TARC)、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン(MDC)、IL−8など、ケモカイン活性を有することが既知のものが挙げられる。
増殖させたヒト臍帯由来細胞におけるIFN−γ誘導型のHLA−DR、DP、DQ発現をHMG−CoA還元酵素阻害剤により阻害
培養により増殖させたヒト臍帯由来細胞(022803 P4)を6穴組織培養プレートに播種し、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)低グルコース、15%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、βメルカプトエタノール(BME)で、およそ70%コンフルエントになるまで培養した。次に、10μMの各HMG−CoA還元酵素阻害剤(シンバスタチン酸(Alexis Biochemicals,Lausen,Switzerland)の10mM原液としてDMSOに配合)を添加した培地、又はDMSO溶媒0.1%(Sigma,St.Louis,MO)により細胞を処理し、並びに一晩インキュベートした。培地を吸引して除去し、500U/mL rhIFN−γ(BD Pharmingen,Franklin Lakes,NJ)及び10μMの各HMG−CoA還元酵素阻害剤を含有させた培地に取り替え、3日間インキュベートした。3日目に、トリプシンを用い細胞を回収した。
椎間板変性症のウサギモデルにおけるヒト臍帯由来細胞(hUTC)の有効性
試験を実施して、ヒト臍帯由来細胞(hUTC)が椎間板(IVD)変性症のウサギモデルにおいて有効であるか判定した。障害部位に細胞を注入し、円板の寸法をX線撮像により評価した。組織の解析には剖検を実施した。
インビトロでのヒト臍帯由来細胞による細胞外マトリックスタンパク質の発現
インビトロで、hUTCによる、3種の細胞外マトリックスタンパク質、すなわちアグリカン、I型コラーゲン及びII型コラーゲンの発現レベルを決定するために試験を実施した。細胞を、単独の場合、並びに栄養因子、TGF−β、GDF−5及びPDGF−BBにより刺激した場合について試験した。
臍由来細胞内でのテロメラーゼ発現
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延長するために役立つ、テロメア繰り返し体を合成するように機能する(Liu,K et al.、PNAS,1999年:96:5147〜5152)。テロメラーゼは、テロメラーゼRNAテンプレート(hTER)、及びテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)の、2つの成分からなる。テロメラーゼの調節は、hTERTではなく、hTERの転写によって決定される。したがって、hTERT mRNAのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、細胞のテロメラーゼ活性を判定する際に公認された方法である。
髄核へのヒト臍帯由来細胞の注入インビボでの椎間板変性症の進行の変更
本実施例では、ヒト臍帯由来細胞(hUTC)を髄核(NP)に直接注入することの有用性を、外科的にIVD変性を施したインビボモデルにより調査した。ヒドロゲル担体を用い、あるいは用いずにhUTCを注入した。本試験は、最初のMRIによる調査と、本変性モデルでの処置に対する生体力学的応答試験の間に行う。
以下により詳細に記載される通り、椎間板変性症について予め評価されているウサギ線維輪外科術(annulotomy)モデルに(Sobajima et al.Spine.2005;30(1):15〜24を参照されたい)、骨格が成熟しているニュージーランド種ウサギを30羽使用した(対照n=6、穿刺n=6、ヒドロゲル担体n=6、細胞+PBS緩衝液n=6、細胞+ヒドロゲル担体n=6)。椎体L2−3、L3−4及びL4−5を16G針で穿刺し、変性を誘導し、続いてヒドロゲル担体を用い又は用いずにヒト臍帯由来細胞により処理した。3Tニーコイルを使用し、0、3、6及び12週の時点で連続的な脊椎のMRIを得て、これまでに有効性が確認されている手法にしたがって、変性の痕跡について解析した。ウサギは12週の時点で屠殺し、円板L4−5を組織学的に解析した。短軸充填正規化配置試験(uniaxial load-normalized displacement testing)により、円板L3−4の粘弾性特性を解析した。これまでに有効性が確認されている二相指数モデル(two-phase exponential model)に従い、クリープ曲線を数学的にモデル化した。
本試験には、骨格が成熟している30羽のニュージーランドホワイト種ウサギを使用した(雌性、1歳齢、体重5kg)。ウサギを、非穿刺対照群(n=6)、穿刺群(n=6)、穿刺後担体のみを注入した群(n=6)、穿刺後細胞PBS溶液を注入した群(n=6)並びに穿刺後細胞を入れた担体を注入した群(n=6)とに割り付けた。
ヒト臍帯組織は、膣又は帝王切開による出産のいずれかを行いかつ同意の得られた提供者から得た。一人の提供者の臍帯からヒト臍帯由来細胞(hUTC)を単離し、増殖させた。簡潔に述べると、臍帯を手技により細切れにし、0.5U/mLコラゲナーゼ(Nordmark)、5.0U/mLディスパーゼ(Roche Diagnostics)及び2U/mLヒアルロニダーゼ(ISTA Pharmaceuticals)の混合物により、ほぼ完全に消化されるまで消化した。細胞懸濁液をシーブに通過させて未消化の組織を除去し、細胞を遠心分離し、増殖培地1(DMEM低グルコース(Cambrex/SAFC Biosciences)、15%(体積/体積)ウシ胎児血清(definedグレード、FBS;HyClone,Logan,UT)、0.001% βメルカプトエタノール(Sigma)、50U/mLペニシリン並びに50μg/mLストレプトマイシン(Lonza))を入れたブタゼラチンコートフラスコに5,000個/cm2で播種した。細胞を、標準的な組織培養条件下、すなわち、5%二酸化炭素の大気酸素下、37℃下で、Tフラスコで、集団倍加(PD)が5回行われるまで静置培養により増殖させ、保存した。次に(than)、増殖培地2(DMEM低グルコース、15%(vol/vol)ウシ胎児血清(definedグレードFBS;HyClone)、100U/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen))を入れたTフラスコで、静置培養により細胞を増殖させ累積約12回集団倍加させ、保管した。次に、増殖培地2を入れたスピナーフラスコ(Corning,NY)で、細胞を更にHILLEX(登録商標)IIマイクロキャリア(SoloHill Engineering)上で増殖させた。細胞を入れたスピナーフラスコを、60rpmに設定したスピナープレートに配置し、細胞を標準条件下、すなわち、二酸化炭素濃度5%の大気酸素の存在下、37℃にて、累積集団倍加数が約25〜30回に達するまで培養した。TrypLE(商標)(Invitrogen)を使用してマイクロキャリアから細胞を回収し、凍結保存し、低温貯蔵温度にて保存した。保存した細胞のアリコートを、安全性及び同一性を確実にするため、生存率、回収率、無菌性、内毒素、マイコプラズマ、核相、及び細胞表面マーカーの免疫表現型などについての特性評価試験を実施するために解凍した。細胞は、継代初期にウィルス性の病原菌についてPCR系の手法により試験し、HIV−1、HIV−2、CMV、HBV、HCV、HTLV及びEBVに特異的な核酸配列を検出した。使用時まで並びに送達直前の注入準備まで細胞を低温貯蔵温度で保存した。実験動物への注入直前に、細胞バイアルを37℃の水浴で解凍し、次にPBSで洗浄した。細胞懸濁液のアリコートを取り出し、トリパンブルーと混合し、血球計数器により計数した。送達にあたり、細胞濃度を適切な密度に調製した。担体溶液には、PBSか、あるいはEVICEL(登録商標)フィブリン糊(EVICEL(登録商標)フィブリンシーラント(ヒト),Omrix Pharmaceuticals,Ltd.)の成分から誘導されるインサイツ形成型ヒドロゲル担体を使用した。ヒドロゲルに細胞を充填するにあたり、細胞はヒトフィブリノゲン(6.8〜10.6mg/ml)のPBS溶液と混合した。この試薬をヒトトロンビン(0.4〜0.6U/Ml)PBS溶液と混合した。混合後すぐにゲル化が生じた。
滅菌手術条件下の獣医用手術室で、全身麻酔にかけたウサギの腰椎を、左前外側からアプローチをとり曝露させた。腸骨稜に対する位置をもとにL4−5円板を確認し、針の先端が椎間板の中央に来るよう、16ゲージの針を5mmの深さまで刺した。斜角部を頭部に向け、針を終板と平行に円板に刺し入れた。続いて直接観察し、触診して椎間板L3−4及びL2−3を確認し、上記の通りに穿刺した。外科手術後、ウサギを、移動を制限しない大型のプライベートケージに収容した。本手法によるウサギIVDに対する線維輪外科術(annulotomy)により、連続的にT2強調画像MRIにより説明することのできる、緩徐で、信頼のおける、再現可能な変性カスケードが誘導された(Masuda et al.Spine.2005;30(1):5〜14を参照されたい)。
処理群のウサギに対し、最初の穿刺手術から3週間後に再度外科手術を行った。右前外側からのアプローチをとり、脊椎を曝露させた(最初の穿刺手術とは反対側になる)。ハミルトン100マイクロリットルシリンジ(1710TPLT;製品番号81041)及びハミルトン30ゲージ鋭角針とプラスチック製ハブ(KF 730 NDL 6/パック,30G/2”;製品番号90130)を使用して、NPの中央に治療用の注射を行った。担体群については、15μLのヒドロゲルをシリンジに吸引し、次にゆっくりと(ゲル化する前に液体を注入しやすくするため4.5分未満で)各円板に注入した。細胞+緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水)群については、15μLの滅菌PBS中105個の細胞を各円板に注入した。担体群の細胞については、15μLのヒドロゲル担体中105個の細胞を注入した。注入はCアームによるガイダンス下で実施し、針が確実に円板の中央に位置するようにした。円板圧の急激な上昇並びにそれに伴う圧出を避けるため、工程にわたってすべての注入は意図的に緩徐にかつ一定速度で実施した。ウサギを縫合し、覚醒させ、穿刺術について記載した通りに世話した。
0時間(線維輪穿刺の前)、3週間(注入術の前)、6週間並びに12週間(屠殺前)の時点で矢状面のMRIを得た。3 Tesla Siemensの磁場システム並びに標準的なヒトニーコイルを使用してT1強調画像(TR=650ms、TE=14ms、スライス厚=0.6mm)及びT2強調画像(TR=3800ms、TE=114ms、スライス厚=0.6mm)を得た。ウサギを鎮静させ、背臥位でニーコイルに置いた。T1強調画像を使用して、脊椎中の何らかの骨異常について定性的な確認を行った。T2強調画像を使用して、円板の変性度を定量化した。熟練の医師により、椎体、脊髄並びに棘突起の幅をもとに、一連の正中矢状面のT2強調画像を確認した。目的とするNP領域を同定するにあたり、これまでに有効性の確認されている自動分割法(automated segmentation method)を採用した(Bechara et al.Am J Neuroradiology.2010;31(9):1640〜1644を参照されたい)。MRIインデックスは、対象とする領域内の各ピクセルにピクセル強度を乗じた画素面積の合計として算出した。第0週でのNP領域、及び対照値に対するMRIインデックスを、3つの対象とする円板に関し平均化し、時点に対してプロットした。スチューデントのt検定(p<0.05)により統計的有意性を算出した。
最初の穿刺手術から12週後(最後のMRIを得た後)にすべてのウサギを屠殺した。屠殺直後に脊椎をまとめて切り出した。組織学的解析のため椎間板L4−5を用意した。円板を固定し、DECALCIFIER I(登録商標)(Surgipath Medical Indus.,Inc.)により2週間脱灰させ、次に組織診断用の脱水包埋装置で脱水させ、パラフィンに包埋した。次に、厚さ5μmで円板の矢状面の切片を作製した。標準的な組織診断法を使用し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)(Sigma)により切片を染色し、Nikon E800顕微鏡により撮影した。
生体力学的解析のため、屠殺後、円板の機能単位(FSU,骨−円板−骨)として円板L3−4を切り出した。後に記載の溶液(posterior elements)によりサンプルを洗浄し、エポキシ樹脂に包埋し、Matlab(Matlab R2008a,The Mathworks,Inc.,Natick,MA)ファジー理論プログラムにより制御した軸方向試験装置(axial testing machine)のカスタム式固定具に取り付けた。生理食塩水に浸したガーゼによりすべての円板を包み、脱水を最小限に抑え、屠殺と同日に試験を実施した。標本を20サイクルの圧縮荷重(0〜1.0MPa,0.1mm/s)により前条件付けし、次に1100秒間、一定の圧力(1.0MPa)にかけた。日常的な活動によりヒトIVDが経験する圧力に相当するという点でこの荷重目標を選択した(ウサギの円板に合わせて大きさを小さくして調整した)(Wilke et al.Spine.1999;24(8):755〜762)。試験開始から200μ秒を初期傾斜相として定義し、試験の残りの期間をクリープ相して定義する。移行の試験では、クリープ曲線を2相指数モデルと適合させた。
ウサギ
いずれの群にも処置の結果としての副作用は観察されなかった。
円板L2−3、L3−4及びL4−5の正中矢状面のMRIのT1強調画像により、著しい変化、すなわち骨棘形成は存在していなかったことが示された。穿刺群の円板正中矢状面のMRIのT2強調画像は、非穿刺対照群のものと比較して変性していた(関心領域が暗く、かつ0〜12週で崩壊した)。全3種の処理群では、図1及び図2に示す通り、穿刺群と比較して、質的な変性が少なかった。穿刺(かつ非処理)円板は、NP面積の59%が減少し、かつ時点間のMRIインデックスが64%減少しており、最も変性を示した。全3種の処理群では、穿刺群と比較して総NP面積及びMRIインデックスのいずれもで変性の程度が低かった。処理群間では担体+細胞群が、最も面積及びMRIインデックスの減少の度合いが少なく、最も対照群に酷似していた(図3)。0週目及び3週目の時点では、対照群と3種の処理+穿刺群との間に、あるいは穿刺群と処理群との間に、MRIインデックス又は面積に関し統計的に優位な差は見られなかった。有効な変性モデルであることが見込まれた通り、6及び12週目の時点での、対照群及び穿刺群のMRIインデックスと面積には、統計的に優位な差が存在した。対照群及び担体処理群では、6及び12週の時点で、MRIインデックスに関し、並びに12週の時点で面積に関し統計的に優位な差が示された。対照及び緩衝液+細胞群では、12週目のMRIインデックスで統計的に有意な差が示された。対照群及び担体+細胞群では、6及び12週目のいずれの時点においても、MRIインデックス及び面積のいずれもで統計的に優位な差が示された。穿刺群並びに担体群は、MRIによる定量化において、時点間で統計的に優位な差を示さなかった。穿刺群及び緩衝液+細胞群では、6及び12週目のいずれの時点においても、MRIインデックス及び面積のいずれもで統計的に優位な差が示された。穿刺群及び担体+細胞群では、12週目にMRIインデックス及び面積に有意な差があった。
総荷重を正規化した置換を表す曲線(初期傾斜相及びそれに続くクリープ相)を図4に示す。群間に差が生じる傾向がある。具体的には、対照群により作成した曲線は、担体+細胞群のものと類似しており、穿刺群のものは緩衝液+細胞群のものと類似しており、担体群の曲線はこれらの群の間に存在する。群間のばらつきのほとんどは初期傾斜相から存在していた。これらの傾向にもかかわらず、曲線のクリープ層が2相指数モデルと適合させたときに、初期及び後期粘稠度及び弾性減衰係数には、統計的に優位な差はなかった(データ不掲載)。
円板L4−5の代表的な矢状面の切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)により染色し、倍率20倍及び100倍で観察した(図5、6及び7)。対照の円板は構造を維持していた。見込まれた通り、穿刺した円板では、NPにおいて、細胞充実性の低下及び線維症が観察され、変性が示唆された。穿刺した円板をヒドロゲル担体により処理した場合には、細胞充実性にはある程度の低下が見られたものの、頑強な細胞外マトリックスを維持した。細胞+緩衝液の場合、NP領域は比較的保存されていたものの、有意な線維症が観察された。細胞+担体により処理した場合、穿刺した円板と比較して細胞充実性及び構造は改善された。
本実施例には、椎間板変性症(IDD)の定量だけでなく、円板変性症を対象とした処置に対する応答を示すことも目的とした、新規MRI技術及びバイオメカニクスなどの広範かつ多様な計測結果が含まれる。本実施例で詳細に議論される通り、処置群は対照及び穿刺群のものとは異なる粘弾性特性を示した。
(1) 椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、ヒドロゲルと、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団とを含む医薬組成物を、前記疾患又は前記状態の処置に有効な量で椎間板に投与することを含み、前記臍帯組織は、血液をほぼ含まず、かつ前記均質な単離細胞集団は、培養時に自己再生能及び増殖能を示し、分化能を有し、かつCD117又はテロメラーゼを発現しない、方法。
(2) 前記単離細胞集団が、次の特性、
(a)レチクロン、ケモカイン受容体リガンド3及び/又は顆粒球走化性タンパク質を発現する、
(b)CD31、CD34及びHLA−DRを産生しない、
(c)ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、酸化型インターロイキン8及びレチクロン1の発現レベルが増加している、
(d)CD10、CD13、CD44、CD73及びCD90を発現する、のうちの1つ又は2つ以上を有する、実施態様1に記載の方法。
(3) 前記医薬組成物が、注入により投与される、実施態様1に記載の方法。
(4) 前記医薬組成物が、少なくとも1つのその他の細胞型及び/又は少なくとも1つの剤を更に含む、実施態様1に記載の方法。
(5) 前記少なくとも1つの剤が、栄養因子である、実施態様4に記載の方法。
(7) 前記少なくとも1つのその他の細胞型が、少なくとも1つの外来性遺伝子産物を発現するよう遺伝子操作される、実施態様4に記載の方法。
(8) 前記外来性遺伝子産物が、栄養因子である、実施態様4に記載の方法。
(9) 前記医薬組成物が、変性した椎間板に投与される、実施態様1に記載の方法。
(10) 前記医薬組成物が、前記椎間板の髄核又は線維輪に投与される、実施態様9に記載の方法。
(12) 前記均質な単離細胞集団が、線維輪細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、実施態様11に記載の方法。
(13) 前記均質な単離細胞集団が、髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、実施態様11に記載の方法。
(14) 椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、ヒドロゲルと、ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団とを、前記疾患又は前記状態の処置に有効な量で、椎間板に投与することを含み、前記臍帯組織は、血液をほぼ含まず、かつ前記均質な単離細胞集団は培養時に自己再生能及び増殖能を示し、分化能を有し、かつCD117又はテロメラーゼを発現しない、方法。
(15) 前記単離細胞集団が、次の特性、
(a)レチクロン、ケモカイン受容体リガンド3及び顆粒球走化性タンパク質を発現する、
(b)CD31、CD34及びHLA−DRを産生しない、
(c)ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン8及びレチクロン1の発現レベルが増加している、
(d)CD10、CD13、CD44、CD73及びCD90を発現する、のうちの1つ又は2つ以上を有する、実施態様14に記載の方法。
(17) 前記ヒドロゲルが、前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団と同時に、又はこれより前に、又は後に投与される、実施態様14に記載の方法。
(18) 前記均質な単離細胞集団が、埋め込み型装置内に投与される、実施態様14に記載の方法。
(19) 少なくとも1つのその他の細胞型を、前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団と同時に、又はこれより前に、又は後に投与することを更に含む、実施態様14に記載の方法。
(20) 前記少なくとも1つのその他の細胞型が、少なくとも1つの外来性遺伝子産物を発現するよう遺伝子操作される、実施態様19に記載の方法。
(22) 前記外来性遺伝子産物が、1つ又は2つ以上の細胞外マトリックスタンパク質の発現を調節する、実施態様21に記載の方法。
(23) 少なくとも1つの剤を投与することを更に含む、実施態様14に記載の方法。
(24) 前記少なくとも1つの剤が、栄養因子である、実施態様23に記載の方法。
(25) 前記栄養因子が、TGF−β、GDF−5、PDGF−BB、及びTIMP1からなる群から選択される、実施態様24に記載の方法。
(27) 前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、変性した椎間板に投与される、実施態様14に記載の方法。
(28) 前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、前記椎間板の髄核に投与される、実施態様27に記載の方法。
(29) 前記均質な単離細胞集団及び前記ヒドロゲルが、前記椎間板の線維輪に投与される、実施態様27に記載の方法。
(30) 前記ヒト臍帯組織から得られた均質な単離細胞集団を、インビトロで少なくとも部分的に分化するよう誘導することを更に含む、実施態様14に記載の方法。
(32) 前記均質な単離細胞集団が、髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、実施態様30に記載の方法。
(33) 椎間板変性症に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、前記疾患又は前記状態の処置に有効な量でヒドロゲルを投与することを含む、方法。
(34) 前記ヒドロゲルが、フィブリノゲン及びトロンビンを含む、実施態様33に記載の方法。
(35) 前記ヒドロゲルが、フィブリン糊を含む、実施態様33に記載の方法。
Claims (16)
- 椎間板変性症の患者の椎間板の細胞充実性及び構造を改善するための薬剤の製造における、臍帯組織由来細胞の均質な単離集団と、ヒドロゲルと、の使用であって、
前記細胞の均質な単離集団は、血液をほぼ含まないヒト臍帯組織から得られ、培養時に自己再生能及び増殖能を示し、分化能を有し、かつCD117又はテロメラーゼを発現せず、
前記ヒドロゲルが、(i)フィブリノゲン及びトロンビン、または、(ii)フィブリン糊を含む、使用。 - 前記臍帯組織由来細胞の均質な単離集団が、次の特性、
(a)レチクロン、ケモカイン受容体リガンド3及び/又は顆粒球走化性タンパク質を発現する、
(b)CD31、CD34及びHLA−DRを産生しない、
(c)ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、酸化型インターロイキン8及びレチクロン1の発現レベルが増加している、
(d)CD10、CD13、CD44、CD73及びCD90を発現する、のうちの1つ又は2つ以上を有する、請求項1に記載の使用。 - 前記臍帯組織由来細胞の均質な単離集団及び前記ヒドロゲルが、注入により投与されるように処方される、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記薬剤が、少なくとも1つのその他の細胞型及び/又は少なくとも1つの剤を更に含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 前記少なくとも1つの剤が、栄養因子である、請求項4に記載の使用。
- 前記栄養因子が、TGF−β、GDF−5、PDGF−BB、及びTIMP1からなる群から選択される、請求項5に記載の使用。
- 前記少なくとも1つのその他の細胞型が、少なくとも1つの外来性遺伝子産物を発現するよう遺伝子操作される、請求項4に記載の使用。
- 前記外来性遺伝子産物が、栄養因子である、請求項7に記載の使用。
- 前記外来性遺伝子産物が、1つ又は2つ以上の細胞外マトリックスタンパク質の発現を調節する、請求項8に記載の使用。
- 前記臍帯組織由来細胞の均質な単離集団及び前記ヒドロゲルが、変性した椎間板に投与されるように処方される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
- 前記臍帯組織由来細胞の均質な単離集団及び前記ヒドロゲルが、前記椎間板の髄核又は線維輪に投与されるように処方される、請求項10に記載の使用。
- 前記細胞の均質な単離集団が、埋め込み型装置内に投与される、請求項11に記載の使用。
- 前記使用が、前記臍帯組織由来細胞の均質な単離集団がインビトロで少なくとも部分的に分化するのを誘導することを更に含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
- 前記臍帯組織由来細胞の均質な単離集団が、線維輪細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、請求項13に記載の使用。
- 前記臍帯組織由来細胞の均質な単離集団が、髄核細胞の表現型を提示する細胞へと分化するよう誘導される、請求項13に記載の使用。
- 前記ヒドロゲルが、6.8〜10.6mg/mlのフィブリノゲンと0.4〜0.6U/Mlのトロンビンを含む、請求項1に記載の使用。
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