CN113966393A - 哺乳动物扩增潜能干细胞的培养基、组合物及其方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种用于建立哺乳动物扩增潜能干细胞(EPSC)系的培养基。提供了使用该培养基将包括多能细胞在内的细胞体外转化和维持为EPSC的方法。
Description
1.技术领域
提供了一种用于建立哺乳动物扩增潜能干细胞(EPSC)系的培养基。提供了使用该培养基将包括多能细胞在内的细胞体外转化并维持为EPSC的方法。
2.背景技术
哺乳动物胚胎发育从精子和卵子融合形成受精卵开始,该受精卵经历固定数量的分裂。直到8个细胞(8C)阶段,胚胎能够分化为胚胎固有组织和胚外组织中的所有谱系,并被认为是全能的(Ishiuchi,et al.,2013)。随后的细胞分裂产生了两个最早谱系:滋养外胚层上皮(TE)细胞(其限于滋养层细胞谱系,并且对胎盘的形成至关重要)和内细胞团(ICM)(其是多能的并产生胚胎本身的所有细胞类型),以及胚胎外内胚层和中胚层,以及胚胎干(ES)细胞(Gardner 1985,Rossant,et al.,2009,Yamanaka,et al.,2006)。
虽然ES细胞在返回囊胚环境时能够分化为胚胎的所有生殖细胞层,但是其通常无法形成滋养层细胞谱系。相反,衍生自滋养外胚层的滋养层干细胞能够在体外和体内有效地分化为滋养层细胞。然而,其无法分化成胚胎的所有生殖细胞层。
据报道,人类胚胎干细胞在某些条件下会在体外分化为滋养层细胞,然而关于这些体外分化的滋养层细胞是否是真正的滋养层细胞存在争议(参见Roberts R.M.,et al.,2014))。在体外培育时,人类胚胎干细胞显示出不同于典型胚胎干细胞的特有分子和生物学特性。术语“初始”(或“基态(ground state)”)以及“致敏(primed)”被用来描述观察到的差异。
近来,一些研究人员报告了在传统人类胚胎干细胞中诱导更“初始”多能状态的替代条件,例如,在抑制剂的混合物中培养(总结于Theunissen,et al.,2014)。然而,虽然通过这些方法产生的细胞展现出一些与初始细胞相当的特性,但也存在显著差异。
尽管有这些发现,仍不清楚是否有可能通过实验从重要的哺乳动物物种,尤其是在大型农场动物中产生和维持真正的多能干细胞。仍然需要改进的人类多能干细胞用于研究人类发育、生物学和再生医学。
3.发明内容
本文提供了用于建立扩增潜能干细胞(EPSC)系的培养基,该扩增潜能干细胞(EPSC)系类似于初始或基态胚胎干细胞,但是也能分化成胎盘滋养层细胞以及胚胎本身。
本公开的一个实施方案是包含基础培养基的猪干细胞培养基,该基础培养基包含SRC抑制剂、维生素C补充剂、LIF蛋白和活化素(ACTIVIN)蛋白。在某些实施方案中,基础培养基是DMEM/F-12。在某些实施方案中,基础培养基是DMEM。在某些实施方案中,SRC抑制剂是WH-4-023和XAV939。在某些实施方案中,培养基还包含N2补充剂,B27补充剂,谷氨酰胺青霉素-链霉素,NEAA,2-巯基乙醇,CHIR99021,以及FBS。
本公开的一个实施方案是包含基础培养基的猪干细胞培养基,该基础培养基包含SRC抑制剂、维生素C补充剂和LIF蛋白。在某些实施方案中,基础培养基是DMEM/F-12。在某些实施方案中,基础培养基是DMEM。在某些实施方案中,SRC抑制剂是A-419259和XAV939。在某些实施方案中,培养基还包含N2补充剂,B27补充剂,谷氨酰胺青霉素-链霉素,NEAA,2-巯基乙醇,以及CHIR99021。
本公开的一个实施方案是包含基础培养基的猪干细胞培养基,该基础培养基包含ITS-X200,维生素C补充剂,牛白蛋白组分V,微量元素B,微量元素C,还原型谷胱甘肽,确定的脂质,SRC抑制剂,内IWR-1(endo-IWR-1),SRK抑制剂,以及Chiron 99021。在某些实施方案中,基础培养基是DMEM/F-12。在某些实施方案中,基础培养基是DMEM。在某些实施方案中,SRC抑制剂是XAV939。在某些实施方案中,SRK抑制剂是A-419259。在某些实施方案中,培养基还包含神经基础培养基,青霉素-链霉素-谷氨酰胺,NEAA,丙酮酸钠,2-巯基乙醇,N2,B27,以及人类Lif蛋白。
本公开的一个实施方案是包含基础培养基的猪干细胞培养基,该基础培养基包含ITS-X200,维生素C补充剂,牛白蛋白组分V,微量元素B,微量元素C,还原型谷胱甘肽,SRC抑制剂,内IWR-1,Chiron 99021,人类Lif蛋白以及活化素A。在某些实施方案中,基础培养基是DMEM/F-12。在某些实施方案中,基础培养基是DMEM。在某些实施方案中,SRC抑制剂是WH-4-023以及XAV939。在某些实施方案中,培养基还包含神经基础培养基,青霉素-链霉素-谷氨酰胺,NEAA,丙酮酸钠,2-巯基乙醇,N2,以及B27。
本公开的一个实施方案是用于产生猪扩增潜能干细胞(EPSC)群的方法,其包括:(i)提供多能细胞群,和(ii)在本文公开的干细胞中培养该群。
4.附图说明
图1.猪EPSC的衍生和表征。a.左图:通过对德国长白猪PFF和中国TAIHU OCT4-Tdtomato敲入报告物(POT)PFF进行重编程,在pEPSC中的STO饲养细胞(feeder cells)上建立来自德国长白猪第5天体内衍生囊胚的猪(Sus Scrofa)EPSCEmb系,以及建立pEPSCiPS系的示意图。右图:建立的EPSC系的图像,以及POT-pEPSCiPS中的Td-tomato表达的荧光图像。在本研究中广泛测试了三个EPSCEmb系(雄性:K3和K5;雌性K1)以及三个pEPSCiPS系(#10,#11)。这些EPSC系在基因表达和分化方面表现相似。b.PFF、pEPSCiPS和pEPSCEmb中OCT4和NANOG启动子区域中CpG位点的亚硫酸氢盐序列分析。c.pEPSCEmb胚状体(EB,第7天)中的基因表达。在RT-qPCR中检查了胚胎体和胚胎外细胞谱系二者的基因。相对表达水平标准化为GAPDH来显示。数据为平均值±标准差(n=3)。*与pEPSCEmb相比,p<0.01。d.pEPSCEmb畸胎瘤切片(H&E染色)的组织组成:衍生自内胚层的腺上皮(i),衍生自中胚层的软骨(ii),衍生自外胚层的形成明确定义的神经管的未成熟神经组织(iii),以及使人联想到滋养层细胞的大的多核细胞(iv中的箭头)的示例。e.pEPSCEmb畸胎瘤切片中免疫染色显示为PL-1和KRT7阳性的细胞。f.第25-27天猪嵌合体孕体的示意图。圆圈标识出以下区域:在该区域中,在g中用于免疫荧光染色的冷冻切片选取为:i.中枢神经系统;ii.胎肝脏。g.检测嵌合体#16中大脑(H2BmCherry+SOX2+)和肝脏(H2BmCherry+AFP+)中的pEPSC后代。H2B-mCherry和SOX2位于核内,而AFP是细胞质蛋白。方框区以较高倍数显示。箭头指示代表性细胞,它们是是供体细胞后代(mCherry+)。DAPI对核进行染色。另外的嵌合体分析在扩展数据图5e-5f中显示。
图2.从pEPSCEmb体外生成PGC样细胞。a.通过在NANOS3-H2BmCherry报告物pEPSC中瞬时表达SOX17来诱导pPGCLC。通过FACS分析了胚状体(EB)中H2BmCherry+TNAP+细胞的存在。b.在pGCLC诱导之后的第三天EB中PGC基因的RT-qPCR分析。相对表达水平标准化为GAPDH来显示。数据为平均值±标准差(n=3)。*与未转染的EB相比,p<0.01。c.pPGCLC诱导后第3-4天的EB切片中PGC因子的免疫荧光分析。H2BmCherry+细胞共同表达NANOG、OCT4、BLIMP1、TFAP2C和SOX17。DAPI对核进行染色。实验至少进行三次。d.pPGCLC诱导的分选H2BmCherry+的RNA序列分析(热图)显示与PGC、多能或体细胞谱系(中胚层、内胚层和性腺体细胞)相关的基因表达。e.pEPSCEmb和pPGCLC之间的成对基因表达对比。突出显示了关键的上调(红色)和下调(蓝色)基因。f.条形图显示了pPGCLC和亲本pEPSCEmb中与DNA甲基化相关的基因表达。数据来自pPGCLC诱导的分选H2BmCherry+的RNA序列。每个样本有两个生物复制,条形图展示了两个复制的平均表达。
图3.人类EPSC的建立。a.建立的H1-EPSC或M1-EPSC(第25代)的图像。b.人类、猪和小鼠EPSC,人类致敏和初始ESC,PFF的大量RNA序列表达数据的主成分分析(PCA)。pEPSCPar:来自孤雌生殖胚胎的EPSC系;E14和AB2-EPSC为小鼠EPSC。c.H1-ESC和H1-EPSC之间的基因表达成对对比,显示了hEPSC(总共76个,红点)中的高表达基因(>8倍)和代表性组蛋白基因(蓝点)。d.热图,显示了所选组蛋白基因在H1-ESC、H1-EPSC、iPSC-EPSC和人类初始(5i)ESC以及人类植入前胚胎中的表达。人类致敏和初始ESC的RNA序列数据来自参考文献42,而胚胎细胞数据来自参考文献44。e.四个组蛋白1簇基因在三种条件下培养的七个人类ESC或iPSC系中的表达的RT-qPCR分析:FGF(致敏),5i(初始)和EPSCM(EPSC)。Hipsci iPSC系来自Wellcome Trust Sanger Institute(http://www.hipsci.org)的Hipsc项目:#1,HPSI1113i-bima_1;#2,HPSI1113i-qolg_3;#3,HPSI1113i-oaaz_2;#4,HPSI1113i-uofv_1。相对表达水平标准化为GAPDH来显示。数据为平均值±标准差(n=3)。*与FGF条件培养的细胞相比,p<0.01。#与5i条件培养的细胞相比,p<0.01。实验至少进行三次。f.小提琴图显示了多能基因在pEPSCEmb(上图)和人类H1-EPSC(下图)中的scRNA序列表达。g.pEPSCEmb(左图)和H1-EPSC(右图)的全局基因表达模式(通过scRNA序列)的PCA。h.人类H1-EPSC和人类植入前胚胎的scRNA序列的PCA和基因表达对比(参考文献46。详见方法)。i.pEPSCEmb和人类H1-EPSC中多能基因座的H3K27me3和H3K4me3标记的ChIP-序列分析。
图4.人类EPSC滋养层细胞的分化潜能。a.左图:在TGFβ抑制下hEPSC变为滋养层细胞的图表。详见方法。右图:CDX2-H2B-Venus报告物EPSC向滋养层细胞分化的流式细胞术分析。CDX2-H2B-Venus报告物EPSC也在常规的含FGF的hESC培养基或5i-初始培养基中培养,随后接受相同的分化条件并在流式细胞术中进行检查。在TGFβ抑制后4天收集细胞。b.通过RT-qPCR分析了在hEPSC分化期间滋养层细胞基因表达在几个时间点的动态变化。相对表达水平标准化为GAPDH来显示。数据为平均值±标准差(n=3)。*与H1-ESC细胞相比,p<0.01。#与H1-5i细胞相比,p<0.01。实验至少进行三次。c.来自用TGFβ抑制剂SB431542处理的H1-ESC、H1-EPSC或iPSC-EPSC的分化细胞的RNA-序列数据的tSNE分析。在分化期间的第0-12天对RNA进行取样。H1-EPSC和hiPSC-EPSC的分化轨迹不同于H1-ESC。d.由单个hEPSC(左)和第7代TSC(右)形成的原代TSC集落的对比图像。e.通过免疫染色检测的EPSC-TSC中滋养层细胞转录因子GATA3、TFAP2C和KRT7的表达。核用DAPI染色。用四个独立的EPSC-TSC系获得了类似的结果。f.通过免疫荧光检测到的SDC1在由EPSC-TSC分化的合体滋养层细胞中的表达。DAPI对核进行染色。g.对hESC、hEPSC、本研究中生成的hTSC以及按照EVT方案从hTSC分化的细胞中的HLA-G的流式细胞术检测(参考文献53)。代表绒毛外滋养层细胞并且表达HLA-G的绒毛膜癌细胞JEG-3和代表绒毛滋养层细胞并且因此不表达任何HLA分子的JAR(Apps R.,et al.Immunology 2009)分别作为阳性和阴性对照。h.免疫功能低下的小鼠中由注射的hTSC形成的病变中的SDC1或KRT7阳性细胞的免疫染色的共聚焦图像。DAPI对核进行染色。实验至少进行3次。
4.1扩展数据图
扩展数据图1.用于筛选培养条件的新的Dox依赖型猪iPSC系的建立。a.Yamanaka因子OCT4、MYC、SOX2和KLF4以及LIN28、NANOG、LRH1和RARG在野生型德国长白猪PFF中的强力霉素(Dox)诱导型表达。将cDNA克隆到piggyBac(PB)载体中,并用表达PB转座酶的质粒转染到PFF中,以将表达盒稳定整合到猪基因组中。pOMSK:猪源4Yamanaka因子OCT4、MYC、SOX2和KLF4;pN+hLIN:猪NANOG和人类LIN28;hRL:人类RARG和LRH1。在Dox诱导8-10天后,出现原代集落。这些集落在M15(15%胎牛血清)中在Dox存在下进行单细胞传代。b.LIN28、NANOG、RH1和RARG的共表达显著增加了重编程集落的数量。*p<0.01。数据为平均值±标准差(n=4):来自250,000PFF的8因子诱导集落与使用4Yamanaka因子的集落相比。c.将猪OCT4-tdTomato敲入报告物(POT)TAIHU PFF重编程为iPSC。在Dox诱导8天后出现原代集落,荧光显微镜下为tdTomato+。在Dox存在下挑取并扩增原代集落。图像上显示的是第3代明场和荧光细胞。d.iPSC系在RT-qPCR分析中表达了关键的多能基因。iPSC系#1和#2以及iPSC#3和#4分别来自野生型德国长白猪和TAIHU POT PFF。猪囊胚中的基因表达被用作对照。e.外源重编程因子在iPSC中在Dox存在下或在其去除后3天的表达的RT-qPCR分析。f.在Dox已被从培养基中去除后,iPSC细胞的分化。图像显示去除Dox 3天后的细胞。POT iPSC变为Td-tomato阴性。g.内源性多能基因在使用或不使用Dox培养的iPSC中的表达的RT-qPCR分析。h.在去除DOX 5-6天后,谱系基因在猪iPSC中的表达。通过RT-qPCR来测量基因表达。相对表达水平标准化为GAPDH来显示。数据为平均值±标准差(n=3)。实验至少进行3次。
扩展数据图2.鉴定猪EPSC的培养条件。a.在筛选中使用了德国长白猪品系的Dox依赖型iPSC克隆#1。选择了小分子抑制剂和细胞因子的各种组合。细胞存活、细胞形态以及内源性OCT4和NANOG的表达被用作读数。b-h.在补充有抑制剂和细胞因子组合的不同基础培养基中培养6天后存活细胞中内源性OCT4和NANOG的相对表达水平;b.不含Dox的M15培养基;c.不含Dox的N2B27基础培养基;d.不含Dox的20%KOSR培养基;e.不含Dox的Albu mMaxII基础培养基;f.含Dox的N2B27基础培养基;g.四种含Dox的独立基础培养基(M15:411-431;N2B27:432-453;KOSR:454-475;Albu mMax II:476-497);h.不含Dox的N2B27基础培养基。2i:GSK3i和MEKi;t2i:GSK3i、MEKi和PKCi(Takashima Y.,et al.,Cell,2014);4i:GSK3i、MEKi、JNKi和p38i(Irie N.,et al.,Cell,2015);5i:GSK3i、MEKi、ROCKi、BRAFi和SRCi(Theunissen T.W.,et al.,Cell Stem Cell,2014);mEPSCM:GSK3i、MEKi、JNKi、XAV939、SRCi和p38i(Yang J.,et al.,Nature,2017);抑制剂组合详见补充表1。相对表达水平标准化为GAPDH来显示。
扩展数据图3.通过对PFF进行重编程或从植入前胚胎建立猪EPSC。a.显示MEKi、PKCi和p38i在含Dox的M15中对猪iPSC的毒性的图像。b.在不存在Dox的情况下在pEPSCM中在猪iPSC中的内源性多能基因表达(#517最低条件,扩展数据图2h)。将基因表达与猪囊胚中的基因表达进行比较。数据为平均值±标准差(n=3)。c.在不含Dox的pEPSCM中野生型和OCT4-Tdtomato报告物iPSC的图像。将基因表达与猪囊胚中的基因表达进行比较。d.通过RT-PCR检测外源重编程因子的泄漏表达。约半数的iPSC系没有可检测的泄漏表达。e.对PFF进行重编程以在pEPSCM中建立EPSC系的示意图。f.检查了两个新建立的WT pEPSCiPS系(#10和#11)的内源多能基因和外源重编程因子的表达。数据为平均值±标准差(n=3)。g.补充有ROCK抑制剂的pEPSCM中猪早期囊胚的第10天长出物(outgrowth)。在第10-12天挑取长出物用于解离和重新铺板以建立稳定系。h.从猪体内衍生胚胎建立的pEPSCEmb(K3系)的代表性图像。实验至少进行3次。相对表达水平标准化为GAPDH来显示。
扩展数据图4.pEPSC的表征。a.pEPSCEmb(K3系)在25次传代后保留了正常的核型(10/10中期扩散检查是正常的)。在超过25次传代后,另外两个检查的系也具有正常的核型。b.pEPSCEmb和pEPSCiPS中多能因子以及标记物SSEA-1和SSEA-4的免疫染色检测。c-e.在用于先前报告的猪ESC的七种条件下(参考文献9-15)将pEPSC培养7天,并检查细胞形态和基因表达。c.OCT4表达的免疫荧光染色。d-e.每种条件下pEPSC中OCT4和NANOG的RT-qPCR检测。相对表达水平标准化为GAPDH显示。f.猪EPSCEmb和EPSCiPS中的活性Oct4远端增强子。小鼠Oct4远端和近端增强子构建体用于萤光素酶测定。数据为平均值±标准差(n=4)。g.pEPSCEmb中的基因组编辑。Crispr/Cas9系统促进了将H2B-mCherry表达盒敲入猪ROSA26基因座。在挑取出用于基因分型的20个集落中,有5个被正确靶向。重要的是,所靶向的pEPSC保留了正常的核型。h.pEPSCEmb集落的明场和荧光图像,其中H2B-mCherry正确靶向了ROSA26基因座。i.pEPSCEmb体外分化为三个体细胞胚层和滋养外胚层谱系(KRT7+)的细胞。j.对pEPSCEmb畸胎瘤切片中的表达SDC1的细胞进行免疫染色的共聚焦图像。DAPI对核进行染色。
扩展数据图5.pEPSC的体内分化潜能。a.pEPSC参与植入前胚胎发育。将表达H2B-mCherry的供体pEPSCiPS注射到第5天的宿主猪孤雌生殖胚胎中,该胚胎发育成囊胚。H2BmCherry+供体细胞在内细胞团和滋养外胚层(箭头所示)中均有发现。b.衍生自注入有H2BmCherry+pEPSCEmb的植入前胚胎的26天猪孕体的整装荧光和明场图像,显示在嵌合体#21中存在mCherry+细胞。c.嵌合体被处理用于两个一般目的:一半的嵌合体被固定用于免疫荧光分析,另一半用于FACS和DNA基因分型。为了准备用于FACS分析的细胞,从头(a)、躯干(b)和尾(c)以及从胎盘(d)中分离出每个胚胎的组织,并将其解离为单个细胞以检测供体H2BmCherry+细胞。解离的细胞还用于制备用于PCR分析的基因组DNA样本。d.使用上述基因组DNA样本对mCherry DNA进行PCR基因分型。通过流式细胞术分析,仅在mCherry+胚胎中检测到mCherry DNA。e.第25-27天猪嵌合体孕体的示意图。如下所示,圆圈标记了获取用于免疫染色和成像的组织切片的组织区。f.对第26-28天的mCherry+孕体或嵌合体胚胎和胎盘的冷冻切片进行免疫荧光分析,用于在不同组织中定位H2BmCherry+细胞。在分析中使用的抗体包括用于神经元的TUJ1(嵌合体#16);用于内胚层衍生物的SOX17和GATA4(嵌合体#21);用于中胚层衍生物的a-SMA(嵌合体#21);用于滋养层细胞的PL-1和KRT7(嵌合体#6的胎盘)。H2BmCherry、GATA4和SOX17在核中被发现,而TUJ、A-SMA、KRT7和PL-1不在核中。
扩展数据图6.pEPSC分化为pPGCLC。a.通过将H2B-mCherry盒靶向到NANOS3基因座,生成NANOS3-H2BmCherry报告物EPSCEmb。在所靶向的等位基因中,T2A-H2B-mCherry序列与猪NANOS3基因座的最后一个编码外显子同框,终止密码子TAA被删除。我们生成了特异性地靶向覆盖NANOS3终止密码子区域的gRNA质粒,并挑取了15个集落进行基因分型。四个被正确靶向。扩增后,那些所靶向的pEPSC保留了正常的核型。b.阐明了在pEPSCEmb中表达外源基因以实现pPGCLC规范和分化的策略的图标(详见方法)。c.在EB中在NANOS3-H2BmCherry报告物EPSCEmb向pPGCLC(H2BmCherry+)的分化中,单独或与SOX17联合表达NANOG、BLIMP1和TFAP2C。d.在以上(c)实验中NANOS3-H2BmCherry阳性细胞的定量。e.PGC基因的RT-qPCR分析。RNA样本是从pEPSC的第3天EB制备的,该pEPSC遵循b中的pPGCLC诱导方案单独或组合表达转基因。相对表达水平标准化为GAPDH显示。数据为平均值±标准差(n=3)。实验至少进行3次。
扩展数据图7.人类EPSC的建立和表征。a.pEPSCM或减少活化素A的pEPSCM中的H1、H9、M1和M10人类ESC集落的图像。通过免疫染色检测OCT4的表达。b.在hEPSCM中传代25次后,H1-EPSC和M1-EPSC的正常核型(10/10中期评分正常)。c.在hEPSCM中的原代iPSC集落(上图)和已建立的iPSC培养物(下图),该hEPSCM通过Dox诱导表达外源OCT4、MY、KLF4、SOX2、LRH1和RARG进行重编程以用于人类真皮成纤维细胞。d.多能基因(POU5F、SOX2、NANOG、REX1和SALL4)在H1-ESC、H1-初始ESC(5i)、H1-EPSC和iPSC-EPSC中的相对表达水平。*与H1-初始ESC(5i)、H1-EPSC和iPSC-EPSC相比,p<0.05。数据为平均值±标准差(n=3)。e.通过RT-qPCR检测外源重编程因子的潜在表达泄漏。在四个已建立的iPSC系中没有发现明显的泄漏。f.H1-ESC、H1-初始ESC(5i)、H1-EPSC和iPSC-EPSC的相对倍增时间。数据为平均值±标准差(n=3)。*与H1-5i ESC、H1-EPSC和iPSC-EPSC相比,p<0.05。g.谱系标记物(EOMES、GATA4、GATA6、T、SOX17和RUNX1)在H1-ESC、H1-初始ESC(5i)、H1-EPSC和iPSC-EPSC中的表达。致敏H1-ESC具有更高水平的这些谱系基因。数据为平均值±标准差(n=3)。*H1-ESC中的基因表达与H1-5i、H1-EPSC和iPSC-EPSC相比,p<0.01。h.H1-EPSC和iPSC-EPSC的多能因子和细胞表面标记物的免疫染色。i.H1-EPSC体外分化为三种体细胞谱系。j.免疫功能低下的小鼠hEPSC畸胎瘤的H&E染色显示软骨(中胚层.I)、腺上皮(内胚层.II)和成熟神经组织(神经胶质和神经元,外胚层.III)的存在。k.H1-EPSC的EB到PGCLC,对SOX17、BLIMP1和OCT4进行免疫染色。l.FACS分析CD38和TNAP在H1-EPSC的PGCLC上的表达。在至少两个独立的人类EPSC系上进行PGCLC的诱导,实验至少进行3次。相对表达水平标准化为GAPDH显示。
扩展数据图8.人类和猪EPSC转录组的RNA序列分析。a.人类致敏和初始ESC,人类扩展多能干(EPS)细胞(Yang Y.,et al.,Cell,2018),以及人类、猪和小鼠的EPSC的全局基因表达数据(批量RNA序列)的分层聚类。相关矩阵使用斯皮尔曼相关(Spearmancorrelation)和完全连锁进行聚类。pEPSCPar:来自猪孤雌生殖胚胎的EPSC系。E14和AB2-EPSC是小鼠EPSC,其RNA-序列数据来自我们之前的公开(Yang J.,et al.,Nature,2017)(参考文献1)。人类致敏ESC(WIBR1、iPS_NPC_4和iPS_NPC_13)和初始ESC(WIBR2、WIBR3_cl_12、WIBR3_cl_16、WIN1_1和WIN1_2)的数据来自Theunissen,et al.,Cell Stem Cell,2014和2016(参考文献29和42)。人类致敏H1 ES细胞(H1-rep1和H1-rep2)和扩展多能干(EPS)细胞(H1_EPS_rep、H1_EPS_rep2、ES1_EPS_rep1和ES1_EPS_rep2)的数据来自Yang Y.,etal.,Cell,2018(参考文献43)。b-c.猪(b)或人类(c)EPSC中多能和谱系基因的表达。d-e.猪(d)或人类(e)EPSC中滋养层细胞相关基因的表达。
扩展数据图9.猪和人类EPSC的表观遗传特性。a.猪和人类EPSC的全局DNA甲基化水平。分析中包括H1-5i人类初始ESC。数据为平均值±标准差(n=3)。*H1-5i人类初始ESC与H1-ESC和H1-EPSC相比,p<0.01。b-c.猪(b)和人类(c)EPSC中DNA甲基化或去甲基化编码酶的基因表达的RNA序列分析。d.人类H1-EPSC和人类植入前胚胎的scRNA序列数据的PCA(数据来自Dang Y.,et al.,Genome Biology,2016。详见方法)。e.小提琴图展示了人类EPSC(本研究)和人类植入前胚胎中指定阶段的指定组蛋白基因的表达水平(Dang Y.,etal.,Genome Biology,2016)。基因表达(TPM)通过salmon和log10(TPM+1)的值进行定量。在小提琴图的顶部,还绘制了单个细胞中的表达(由点表明),以显示所有单个细胞中表达的完整分布。f.在参与到DNA甲基化和去甲基化的编码酶基因和细胞谱系基因的基因座上进行组蛋白修饰(H3K4me3和H3K27me3)。
扩展数据图10.pEPSC和hEPSC培养条件中对单个组分的要求。a-b.通过RT-qPCR分析去除或添加单个抑制剂对pEPSCEmb(a)和H1-EPSC(b)中基因表达的影响。“-SRCi、-XAV939、-活化素、-Vc、-CHIR99”:从pEPSCM或hEPSCM中单独将其去除;“+TGFβi、+L-CHIR99、+H-CHIR99、+PD03”:添加TGFβ抑制剂SB431542、浓度较低的CHIR99021(0.2μM,在pEPSCM中使用的浓度)、浓度较高的CHIR99021(3.0μM)或三种浓度的MEK1/2抑制剂PD0325901。WH04/A419显示了在人类EPSC中用另一种SRC抑制剂WH-4-23替代A419259的影响。红色三角形表示没有形成集落。猪和人类EPSC培养基分别含有0.2μM和1.0μM的CHIR99021。培养基组分信息参见方法。c.将OCT4-H2B-Venus盒靶向H1-EPSC中的OCT4基因座。在所靶向的等位基因中,T2A-H2B-Venus序列与OCT4基因的最后一个编码外显子同框。所靶向的等位基因中的终止密码子TGA被删除。我们对19个集落进行基因分型,其中5个被正确靶向。d.通过Venus+细胞测量进行7天的从hEPSCM中去除SRC抑制剂WH-4-023或XAV939的影响。在指定条件下培养OCT4-H2B-Venus报告物EPSC,并通过荧光显微镜和流式细胞术分析Venus表达。e.猪和人类EPSC中AXIN1的Western印迹(Western blot)分析和SMAD2/3磷酸化的Western印迹(Western blot)分析。pEPSCEmb和H1-EPSC都具有水平高得多的AXIN1。pEPSCEmb、H1-EPSCs和H1-初始ESC(5i)具有较高水平的TGFβ信号传导,这通过与分化的(D)EPSCEmb或致敏H1-ESC中的pSMAD2/3相比更高的更高的pSMAD2/3来证明。f.猪和人类EPSC中典型Wnt信号活动的TOPflash分析。进行5天的从pEPSCM(pEPSCM-X)或hEPSCM(hEPSCM-X)中去除XAV939使TOPflash活性显著增加。*p<0.01。数据为平均值±标准差(n=4)。实验至少进行四次。g.显示在pEPSCM或pEPSCM中培养的pEPSCEmb的明场和免疫荧光图像,带有组分变化指示。对细胞进行OCT4和DAPI染色。h-i.在6孔板中通过去除培养基组分或添加小分子抑制剂,对STO饲养者(feeders)上由2,000个pEPSCEmb(h)或H1-EPSC(i)形成的AP+集落进行定量。通过对5次连续传代的集落进行评分,以确定去除XAV939、维生素C或CHIR99021或使用较低浓度CHIR99021(0.2μM,用于pEPSCM)、较高浓度CHIR99021(3.0μM)、JNK抑制剂、BRAF抑制剂或Mek1/2抑制剂(PD03)的影响。我们还定量了在没有ROCK抑制剂Y27632(-ROCKi)的情况下传代EPSC的影响。数据为平均值±标准差(n=4)。实验进行3次。j-k.当从pEPSCM和hEPSCM中去除XAV939或活化素A,或当TGFβ信号传导被SB431542抑制时,pEPSCEmb(j)或hEPSC(k)中谱系基因表达的RT-qPCR分析。还分析了3.0μM CHIR99021的影响。l.在hEPSCM中补充5.0ng/ml活化素A对由H1-EPSC形成的EB中谱系基因表达的影响。中内胚层谱系基因的表达显著增加。*与补充活化素A培养的人类EPSC比较,p<0.05。m-n.在含有或不含5.0ng/ml活化素A的hEPSCM中培养的NANOS3-Tdtomato报告物EPSC分化为PGCLC。添加活化素A显著增加了在FACS(Tdtomato+)中测量的PCGLC。PGCLC基因的RT-qPCR分析证实了PCGLC的增加。*与补充有活化素A的hEPSCM比较,p<0.05。RT-qPCR数据为平均值±标准差(n=3)。实验至少进行3次。相对表达水平标准化为GAPDH显示。
扩展数据图11.hEPSC滋养层细胞分化潜能的表征。a.CDX2-H2BVenus报告物EPSC系的生成。在所靶向的等位基因中,T2A-H2BVenus序列与人类CDX2基因的最后一个编码外显子同框。所靶向的等位基因中的终止密码子TGA被删除。随后在hEPSCM、含FGF的标准人类ECM培养基或人类基础ECS的5i条件下对报告物ESC进行培养,用于后续的分析。b.在通过4天BMP4处理诱导分化为滋养层细胞的细胞中,通过RT-qPCR测量滋养层细胞基因表达。实验至少进行3次。数据为平均值±标准差(n=3)。*与H1-ESC和H1-5i初始细胞相比,p<0.01。c.在SB431542+PD173074+BMP4诱导分化为滋养层细胞的hEPSC中,通过RT-qPCR测量的滋养层细胞基因表达。分析在几个时间点收集的细胞。qRT-PCR数据为平均值±标准差(n=3)。相对表达水平标准化为GAPDH显示。d.热图显示了从H1-ESC(绿色)、H1-EPSC(红色)或iPSC-EPSC(蓝色)分化而来的细胞中滋养层细胞基因的表达变化(RNA序列数据见补充表6)。在几个分化时间点收集细胞用于RNA序列分析。e.从H1-ESC、H1-EPSC和iPSC-EPSC分化的细胞中基因表达的皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)(RNA序列数据见补充表6),与PHTu和PHTd(分别为未分化和分化的人类原代滋养层细胞)的公开数据以及与人类体组织。这些分析的细节见方法。f.从经过六天SB431542处理的H1-EPSC、H1-ESC、H1-初始ESC(5i)和iPSC-EPSC分化而来的细胞中检测四种C19MC miRNA(hsa-miR-525-3p、-526b-3p、-517-5p和-517b-3p)。代表绒毛外滋养层细胞的绒毛膜癌细胞JEG-3和代表绒毛滋养层细胞的JAR用作对照。g.与上述相同的四种miRNA在BMP4(4天)处理的人类EPSC和人类ESC中的表达。数据为平均值±标准差(n=3)。*与H1-ESC相比,p<0.05。相对miRNA表达水平标准化为miR-103a显示。h.从H1-EPSC和其他细胞分化的细胞中ELF5基因座启动子区域的DNA去甲基化(SB431542处理6天)。来自H1-ESC、H1-初始ESC(5i)的细胞在ELF5启动子处没有显著的DNA去甲基化。i.衍生自TGFβ抑制(SB431542)诱导的H1-EPSC滋养层细胞分泌的激素。在SB431542处理之后经48小时间隔直到第16天,在从EPSC或ESC培养物分化的细胞的条件培养基中测量VEGF、PLGF、sFlt-1和sEng。j.从EPSC或ESC的滋养层细胞分泌的hCG。通过ELISA测量从第10天分化(SB431542处理)的EPSC和ESC分泌的hCG。数据为平均值±标准差(n=4)。*与H1-ESC相比,p<0.01。
扩展数据图12.来自人类EPSC的滋养层干细胞样细胞(hTSC)的衍生和表征。a.四个EPSC衍生的TSC系及其亲本hEPSC中多能和滋养层干细胞基因的RT-qPCR分析。数据为平均值±标准差(n=3)。*与TSC相比,p<0.01。b.衍生自EPSC的hTSC和从用TGFβ抑制剂SB431542处理的H1-EPSC分化的细胞的基因表达在几个时间点的PCA。hTSC似乎具有第四天的分化EPSC的丰富转录组学特性。c.从TSC分化的多核合体滋养层细胞的相衬和赫斯特(Hoechst)染色图像。d.从衍生自hESPC的TSC分化的合体滋养层细胞中CGB的免疫荧光检测。e.从hTSC形成合体滋养层细胞的效率。融合指数计算为合胞体中的核数/核总数。数据表示为平均值+标准差(n=4)。*与TSC相比,p<0.01。f.三个TSC系及其衍生合体滋养层细胞(ST)和绒毛外滋养层细胞(EVT)中滋养层细胞基因的RT-qPCR分析。相对表达水平标准化为GAPDH显示。g.在未分化的hESC、hEPSC、hTSC和从hTSC分化的hEVT中,通过单克隆抗体W6/32检测HLA I类。与hESC相比,hEPSC和hTSC表达的HLA I类分子水平显著降低。已知EVT表达HLA-C。绒毛膜癌细胞JEG-3和JAR分别是绒毛外滋养层细胞和绒毛滋养层细胞的代表。JEG-3表达HLA-G、HLA-C和HLA-E,而JAR细胞不表达任何HLA分子(Apps R.,et al.,Immunology,2009)。它们分别用作阳性和阴性对照。h.与图4g相关的HLA-G流式细胞术的同种型对照。i.对NOD-SCID小鼠皮下注射hTSC形成的病变进行H&E染色。j.在小鼠皮下注射hTSC(n=3)或媒介物对照(n=3)后7天,6只NOD-SCID小鼠的血清hCG水平。
扩展数据图13.来自猪EPSC的滋养层干细胞样细胞(pTSC)的衍生和表征。a.pEPSCEmb和人类H1-EPSC中与胎盘发育相关的编码因子的基因座处的H3K27me3和H3K4me3标记。b.在人类TSC条件下培养7天,从个体pEPSCEmb形成的原代TSC集落(上图)的图像,以及在第7代(下图)建立的pTSC的图像。虚线标记了推定的滋养层细胞区,这些区被挑取来建立稳定的pTSC系。c.四个pTSC系及其亲本pEPSCEmb中多能和滋养层细胞基因的RT-qPCR分析。数据为平均值±标准差(n=3)。*pEPSC与pTSC比较,p<0.01。相对表达水平标准化为GAPDH显示。d.通过免疫染色检测pEPSCEmb-TSC中滋养层细胞因子GATA3和KRT7的表达。核用DAPI染色。e.NOD-SCID小鼠中从pTSC形成的病变切片中表达SDC1和KRT7的细胞的免疫染色的共聚焦图像。f.pTSC皮下注射到免疫功能低下的的小鼠时形成的病变切片的H&E染色。g.对猪囊胚注射pTSC后1至2天的免疫染色共聚焦图像。给猪孤雌生殖桑椹胚和早期囊胚中注射表达H2B-mCherry的pTSC(两次注射中n=50个囊胚)。箭头指示TE中表达猪滋养外胚层转录因子CDX2和GATA3的H2B-mCherry+细胞。
扩展数据图14.人类EPSC中PARG的失活对滋养层细胞分化潜能的影响。a.CDX2-H2BVenus报告物hEPSC中PARG基因的外显子4中约350bp的CRISPR/Cas9介导的缺失。设计了两个gRNA(g1、g2)以靶向最大的编码外显子。转染筛选后,48个克隆中的6个克隆经PCR基因分型鉴定为双等位基因突变体,并通过测序确认。b.带有或不带有PARG缺失的CDX2报告物EPSC细胞用TGFβ抑制剂SB431542处理四天以进行滋养层细胞分化。通过流式细胞术分析细胞。c.Venus+细胞的百分比表示亲代细胞的滋养层细胞分化程度。PARP的失活导致Venus+细胞减少。数据为平均值±标准差(n=3)。*野生型和PARG-/-H1-EPSC比较,p<0.05。在使用两个独立的PARP缺陷的人类EPSC系的实验中获得了类似的结果。d.在SB431542处理6天后,来自对照(野生型)或PARG-缺陷CDX2-H2BVenus H1-EPSC分化的细胞中滋养层细胞基因表达的RT-qPCR分析。在PARG-缺陷细胞中发现显著较低的滋养层细胞基因表达。*p<0.05。数据为平均值±标准差(n=3)。相对表达水平标准化为GAPDH显示。实验至少进行3次。
4.2定义
除非另有定义,本发明所使用的所有技术和科学术语与本公开所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本发明描述的那些相似或等效的任何方法和材料,但是描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的,以下术语定义如下。
“iPSC”是衍生自于非多能、分化的祖先细胞的多能细胞。合适的祖先细胞包括体细胞,例如成体成纤维细胞和外周血细胞。这些祖先细胞通常通过将多能基因(或编码其的RNA)或其相应的蛋白质引入细胞中,或通过重新激活内源性多能基因进行重编程。在某些实施方案中,引入技术包括质粒或病毒转染或直接蛋白质递送。
“饲养细胞”或“饲养者”是用于描述一种类型的细胞与另一种类型的细胞共培养以提供第二种类型细胞可以生长的环境的术语。无饲养者的培养物含有少于约5%的饲养细胞。越来越优选含有少于1%、0.2%、0.05%或0.01%饲养细胞(以培养物中总细胞的百分比表示)的组合物。
“生长环境”是感兴趣的细胞将在其中进行体外增殖的环境。该环境的特征包括培养细胞的培养基和支撑结构(如固体表面上的培养基)(如果存在)。
“营养培养基”是用来培养细胞的含有促进增殖的营养物质的培养基,其包含:等渗盐水、缓冲液、氨基酸、血清或血清替代物以及其他外源添加的因子。
“条件培养基”通过以下方式制备:在培养基中培养第一细胞群,然后收获培养基。条件培养基连同细胞分泌到培养基中的任何物质可以在随后用于支持第二细胞群的生长。如果特定成分或因子被描述为已被添加到培养基中,则已通过有意操作将该因子混合到培养基中。
本公开中使用的术语“抗体”是指任何物种的多克隆和单克隆抗体。该术语的范围不仅涵盖完整的免疫球蛋白分子,还包括免疫球蛋白分子的片段和基因工程衍生物以及保留所需结合特异性的等效抗原结合分子。
术语“分离的”或“纯化的”是指基本上或本质上不含在其天然状态下通常伴随的组分的材料。纯度和均匀性通常使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析法来确定。
如本文所用的,术语“血清”是指在去除血细胞和纤维蛋白原/纤维蛋白后剩余的血液的液体部分。术语“无血清培养基”是指不含血清或从动物血清(尤其是来源于哺乳动物、鸟类、鱼类或甲壳类动物的血清)中提取的产物的培养基。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”。例如“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括另外的东西,例如X+Y。
除非另外由术语“准确地”、“精确地”或其他等效术语说明,否则所有表达成分数量、性质如分子量、反应条件等的数字在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰,因此固有地包含与实际陈述的数字相比多或少至多10%的变化。因此,这里的数值参数是近似值,取决于本公开寻求获得的期望性质。至少,每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管描述本公开的宽泛范围的数值范围和参数是近似值,但具体实施方案中的数值尽可能精确地被报告。然而,任何数值都固有地含有标准差,这些标准偏差必然从数值的测试测量中发现的误差产生。
5.具体实施方式
本文描述的是从多能细胞群中产生扩增潜能干细胞(EPSC)。EPSC具有“初始”或基态性质,并有分化为胚外细胞系(卵黄囊中的滋养层细胞和胚外内胚层)以及胚胎本身细胞的扩增潜能。EPSC可以从在扩增潜能干细胞培养基(EPSCM)中培养的不同多能细胞系产生。EPSC已成功分化为很多细胞类型,包括体细胞和滋养层细胞。EPSC可以用于研究发育机制以及EPSC或由其分化的细胞。这尤其有助于再生医学的研究和R&D,例如疾病建模、疗法筛选、毒性测试、遗传疾病研究和生殖生物学研究。
扩增潜能干细胞(EPSC)群可以通过在扩增潜能干细胞培养基中培养多能细胞群来产生。本文描述的是直接从植入前胚胎或通过对猪胎成纤维细胞进行重编程来衍生猪EPSC(pEPSC)系。多能细胞可以包括胚胎干细胞(ESC)和非胚胎干细胞(例如胎儿和成体干细胞),以及诱导多能干细胞(iPSC)。
5.1新的猪iPSC的生成
虽然猪iPSC是可得的,但使用这些细胞进行筛选会受到重编程后转基因重编程因子的泄漏表达或内源性多能基因低水平表达的影响[11-19]。为了克服这个挑战,生成新的猪iPSC来表达多能基因,如强力霉素(Dox)诱导型LIN28、NANOG、LRH1和RARG,与四种Yamanaka因子协同作用。
多能基因或蛋白质可以包含LIN家族成员、NANOG家族成员、LRH家族成员、RAR家族成员中的一、二、三、四、五或六种。
Lrh家族成员可以是LRH1。
Rar家族成员可以是Rar-g。
在一个实施方案中,多能基因或蛋白质可以包含Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(Yamanaka因子)。
用于生产iPSC的技术是本领域众所周知的(Yamanaka,et al.,Nature,2007;448:313-7;Yamanaka 6 2007Jun.7;1(1):39-49;Kim,et al.,Nature,2008Jul.31;454(7204):646-50;Takahashi,Cell,2007Nov.30;131(5):861-72.Park,et al.,Nature,2008Jan 10;451(7175):141-6;Kimet,et al.,Cell Stem Cell,2009Jun.5;4(6):472-6;Vallier L.,et al.,Stem Cells,2009.999(999A),Wang W.,et al.,PNAS,(2011)108;45;18283-8)。然而,本文提供的策略显著改善了将野生型德国长白猪胎成纤维细胞(PFF)和转基因PFF(其中tdTomato盒已插入猪OCT4(POU5F1)基因座(POT PFF)的3'-UTR中[20])重编程到推定的iPSC集落的效率(扩展数据图1a-c)。来自POT PFF的重编程的原代集落是OCT4-tdTomato+,表明OCT4基因座的重新激活(扩展数据图1c)。事实上,RT-qPCR显示,iPSC表达了高水平的内源性多能因子(扩展数据图1d),并且可以在STO饲养者上作为单细胞在含血清培养基(M15)加Dox中传代超过20代。
在去除Dox后,伴随着外源重编程因子和内源多能基因的快速下调以及胚胎和胚胎外细胞谱系基因的表达增加,iPSC在4-5天内分化(扩展数据图1e-h)。这些具有强大内源性多能基因表达的Dox依赖型猪iPSC为化学筛选提供了材料。
因此,可以通过引入多能基因或其相应的蛋白质,或通过重新激活内源性多能基因,使用本领域已知并且在本文讨论的技术,将非多能细胞(例如体细胞)重编程为诱导多能干细胞(iPSC),从而获得多能干细胞群。
iPSC可以从哺乳动物个体获得。哺乳动物包括犬科动物、猫科动物、啮齿动物、牛科动物、马科动物、猪科动物、绵羊科动物和灵长类动物。鸟类包括但不限于家禽、鸣禽和猛禽。在某些实施方案中,iPSC可以衍生自体细胞或从个体获得的其他祖先细胞。iPSC可以用于产生共享该个体基因型的EPSC群。在某些实施方案中,由个体体外产生的EPSC或由其分化的细胞可以用于研究与该个体相关的疾病状况的机制。
5.2培养基
用于多能细胞的合适培养基是本领域众所周知的,包括:补充有20%血清替代物、1%非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇和4ng/ml至10ng/ml FGF2的敲除Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(KO-DMEM);或者补充有4ng/ml FGF2的敲除(KS)培养基;或者补充有20%血清替代物、1%非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM(3-巯基乙醇和4ng/ml至10ng/ml人类FGF2的KO-DMEM;或者补充有20%敲除血清替代物(KSR)、6ng/ml FGF2(PeproTech)、1mM L-Gln、100μM非必需氨基酸、100μM 2-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的DMEM/F12。
在某些实施方案中,用于本方法的多能细胞群可以在化学限定性培养基(CDM)中培养,该化学限定性培养基包含化学限定性基础培养基,该化学限定性基础培养基包含GSK3(CHIR99021)、SRC(WH-4-023)和端锚聚合酶抑制剂(XAV939)(最后两个是对小鼠EPSC重要的抑制剂[1])(#517,猪EPSC培养基:pEPSCM)(扩展数据图2h),该CDM还补充有一种或多种附加组分,例如维生素C(Vc)、活化素A和LIF(扩展数据图2a、2h和补充表1)。在这些条件下,非Dox依赖型iPS(pEPSCiPS)在30次传代中维持未分化,以与猪囊胚相当的水平表达内源性多能因子,并且没有显示外源性重编程因子的泄漏表达(扩展数据图3b-d)。
为了将非Dox依赖型猪iPSC维持在未分化状态(扩展数据图2a;补充表1),在对20种小分子抑制剂和细胞因子的400多种组合保持推定的猪iPSC的能力进行筛选之后,排除了Mek1、p38和PKC抑制剂。报告了与之前使用小鼠模型的报告的区别;初始小鼠ESC培养基2i/LIF能够维持推定的猪iPSC[15,17,21],但在存在1.0μM Mek1抑制剂PD-0325901的情况下,无论是否存在Dox,猪iPSC都会迅速丢失(扩展数据图2b-h)。这表明猪多能干细胞和小鼠ESC在对Mek-ERK信号传导的要求方面存在差异。[26-28]p38和PKC的抑制无助于猪iPSC(扩展数据图2b-h和扩展数据图3a)。这些发现得出了小鼠或人类初始ESC条件[22-24]不能直接外推到猪多能干细胞的结论。因此,这三种Mek1/2、p38和PKC的抑制剂被排除在筛选之外。
用于细胞培养的合适技术是本领域众所周知的(参见,例如,Basic Cell CultureProtocols,C.Helgason,Humana Press Inc.U.S.(15Oct.2004)ISBN:1588295451;HumanCell Culture Protocols(Methods in Molecular Medicine S.)Humana Press Inc.,U.S.(9Dec.2004)ISBN:1588292223;Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique,R.Freshney,John Wiley&Sons Inc(2Aug.2005)ISBN:0471453293,Ho W Y etal J Immunol Methods.(2006)310:40-52,Handbook of Stem Cells(ed.R.Lanza)ISBN:0124366430)。‘Basic Cell Culture Protocols'by J.Pollard and J.M.Walker(1997),‘Mammalian Cell Culture:Essential Techniques’by A.Doyle and J.B.Griffiths(1997),‘Human Embryonic Stem Cells’by A.Chiu and M.Rao(2003),Stem Cells:FromBench to Bedside'by A.Bongso(2005),Peterson&Loring(2012)Human Stem CellManual:A Laboratory Guide Academic Press and‘Human Embryonic Stem CellProtocols’by K.Turksen(2006)。培养基及其成分可以从商业来源(例如Gibco、Roche、Sigma、Europa bioproducts、R&D Systems)获得。上述培养步骤可以采用标准哺乳动物细胞培养条件,例如37℃、5%二氧化碳。
使用的多能细胞群可以在本文所述的扩增潜能干细胞培养基(EPSCM)中培养以产生EPCS群。一旦转化,EPSC就可以在EPSC维持培养基(EPSCMM)中培养。维持培养基可以具有如本文所述的组成,例如,与用来转化细胞的EPSCM相比更少的抑制剂/调节剂。一旦转化,EPSC可以不需要与EPSC同样多的抑制剂/调节剂来在培养物中来维持它们。
合适的500ml猪EPSCM包含以下中的一种或多种:
0.3μM WH-4-023(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.5413),
2.5μM XAV939(Sigma,Cat.No.X3004)或2.0μM IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),
50μg/ml维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),
10ng/ml LIF(Stem Cell Institute,University of Cambridge.SCI),
20ng/ml活化素(SCI)。
任选地,EPSCM还可以含有LIF。EPSCM可以含有营养培养基。
合适的EPSCM或EPSCMM包含营养培养基和GSK3抑制剂。
合适的EPSCM或EPSCMM可以含有一种或多种以下成分:482.5ml DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020),2.5ml N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),5ml B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),5ml1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),5ml 1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016)、110μM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250)和0.2μM CHIR99021(GSK3i、TOCRIS,Cat.No.4423)、0.3%FBS(Gibco,Cat.No.10270)。
合适的500ml猪EPSCM包含一种或多种以下成分:
ITS-X 200×(thermos,51500056),添加2.5ml;
维生素C(Sigma,49752-100G),工作浓度64ug/ml;
牛白蛋白组分V(7.5%溶液)(Thermo,15260037),3ml;
微量元素B(Corning,MT99175CI)1000x
微量元素C(Corning,MT99176CI)1000x
还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G)10mg/ml,添加165ul
XAV939(Sigma X3004),工作浓度2.5μM;
内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),工作浓度1μM
WH-4-023(Tocris,Cat.No.5413),工作浓度0.16μM;
Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),工作浓度0.2μM;
人类Lif,工作浓度10ng/ml;以及
活化素A(STEM CELL TECHNOLOGY,Catalog#78001.1)20ng/ml。
合适的EPSCM或EPSCMM可以含有一种或多种以下成分:F12 DMEM(Gibco,21331-020),添加240ml;神经基础培养基(Life Technologies,21103-049)240ml;青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100X)(Gibco,10378016),添加5ml;NEAA 100×(Gibco,11140050),添加5ml;丙酮酸钠100×(gibco,11360070),添加5ml;14.3M 2-巯基乙醇(M6250 Aldrich,Sigma),添加3.8μl(工作浓度110μM);200×N2(Thermo 17502048),添加2.5ml;以及100×B27(Thermo 17504044),添加5ml。
合适的500ml人类EPSCM包含一种或多种以下成分:
0.1μM A-419259(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.3914),
2.5μM XAV939(Sigma,Cat.No.X3004)或2.5μM IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),
50μg/ml维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),
10ng/ml LIF(SCI)。
任选地,EPSCM还可以包含LIF。EPSCM可以包含营养培养基。
合适的EPSCM或EPSCMM包含营养培养基和GSK3抑制剂。
合适的EPSCM或EPSCMM可以包含一种或多种以下成分:482.5ml DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020),2.5ml N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),5ml B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),5ml1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),5ml 1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),110μM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250),和1.0μM CHIR99021(GSK3抑制剂,TOCRIS,Cat.No.4423)。
合适的500ml人类EPSCM可以含有一种或多种以下成分:
ITS-X 200×(thermos,51500056),添加2.5ml
维生素C(Sigma,49752-100G),工作浓度64μg/ml;
牛白蛋白组分V(7.5%溶液)(Thermo,15260037),3ml;
微量元素B(Corning,MT99175CI)1000×
微量元素C(Corning,MT99176CI)1000×
还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G)10mg/ml,添加165μl
确定的脂质(Invitrogen,11905031)500×
XAV939(Sigma X3004),工作浓度2.5μM;
内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),工作浓度2.5μM
A419259(Tocris Bioscience,3748),工作浓度0.1μM;
Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),工作浓度1.0μM.
合适的EPSCM或EPSCMM可以包含一种或多种以下成分:F12 DMEM(Gibco,21331-020),添加240ml;神经基础培养基(Life Technologies,21103-049)240ml;青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100X)(Gibco,10378016),添加5ml;NEAA 100×(Gibco,11140050),添加5ml;丙酮酸钠100×(gibco,11360070),添加5ml;14.3M 2-巯基乙醇(M6250 Aldrich,Sigma),添加3.8μl(工作浓度110μM);200×N2(Thermo 17502048),添加2.5ml;100×B27(Thermo17504044),添加5ml;以及人类Lif,工作浓度10ng/ml。
在一个实施方案中,猪EPSC培养基包含:
DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020),或敲除DMEM(Gibco Cat.No.10829-018),基础培养基,98%;
N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),范围从0.1%到1%,在0.25%到0.75%之间,在0.4%到0.6%之间;
B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),范围从0.1%到2%,在0.5%到1.5%之间,在0.8%到1.0%之间;
谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),基础补充剂,1%;
NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),基础补充剂,1%;
2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250),基础补充剂,110μM;
CHIR99021(GSK3i,TOCRIS,Cat.No.4423),范围从0.05μM到0.5μM,在0.1μM到0.5μM之间,在0.2μM到0.3μM之间;
WH-4-023(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.5413),范围从0.1μM到1.0μM,在0.2μM到0.8μM之间,在0.3μM到0.5μM之间;
XAV939(Sigma,Cat.No.X3004),范围从1μM到10μM,在2μM到5μM之间,甚至在2.5μM到4.5μM之间;或IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),范围从1μM到10μM,在2μM到5μM之间,在2.5μM到4.5μM之间;
维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),范围从10μg/ml到100μg/ml,在20μg/ml到80μg/ml之间,在50μg/ml到70μg/ml之间;
LIF(Stem Cell Institute,University of Cambridge.SCI),范围从1ng/ml到20ng/ml,在5ng/ml到15ng/ml之间,在8ng/ml到12ng/ml之间;
活化素(SCI),范围从10ng/ml到50ng/ml,在15ng/ml到30ng/ml之间,甚至在20ng/ml到25ng/ml之间;
FBS(Gibco,Cat.No.10270),范围从0.1%到0.5%,优选从0.2%到0.4%之间,从0.25%到0.35%之间,和
ITS-X(thermos,51500056),范围从0.1%到2%,优选从0.2%到0.8%之间,从0.4到0.6%之间。
在另一个实施方案中,人类EPSC培养基包含:
DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020),或敲除DMEM(Gibco,Cat.No.10829-018),基础培养基,98%;
N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),范围从0.1%到1%,在0.25%到0.75%之间,在0.4%到0.6%之间;
B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),范围从0.1%到2%,在0.5%到1.5%之间,在0.8%到1.0%之间;
谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),基础补充剂,1%;
NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),基础补充剂,1%;
2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250),基础补充剂,110μM;
CHIR99021(GSK3抑制剂,TOCRIS,Cat.No.4423),范围从0.2μM到2μM,在0.5μM到1.5μM之间,在0.8μM到1.2μM之间;
A-419259(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.3914),范围从0.05μM到0.5μM,从0.1μM到0.5μM之间,从0.15μM到0.3μM,XAV939(Sigma,Cat.No.X3004),范围从1μM到10μM,在2到5μM之间,在2.5μM到4.5μM之间,或IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),范围在1μM到10μM,在2μM到5μM之间,在2.5μM到4.5μM之间;
维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),范围从10μg/ml到100μg/ml,在20μg/ml到80μg/ml之间,在50μg/ml到70μg/ml之间;
LIF(SCI),范围从1ng/ml到20ng/ml,在5ng/ml到15ng/ml之间,在8ng/ml到12ng/ml之间;
在另一个实施方案中,人类EPSC培养基包含:
F12 DMEM(Gibco,21331-020),基础培养基,48%
神经基础培养基(Life Technologies,21103-049),基础培养基,48%
青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco,10378016),基础补充剂,1%
NEAA(Gibco,11140050),基础补充剂,1%
丙酮酸钠(gibco,11360070),基础补充剂,1%
2-巯基乙醇(Aldrich,Sigma),基础补充剂,110μM
N2(Thermo 17502048),范围从0.1%到1%,在0.25%到0.75%之间,在0.4%到0.6%之间
B27(Thermo 17504044),范围从0.1%到2%,在0.5%到1.5%之间,在0.8%到1.0%之间
ITS-X(thermos,51500056),范围从0.1%到1%,在0.25%到0.75%之间,在0.4%到0.6%之间
维生素C(Sigma,49752-100G),范围从10μg/ml到100μg/ml,从20μg/ml到100μg/ml之间,从50μg/ml到70μg/ml之间
牛白蛋白组分V(7.5%溶液)(Thermo,15260037),范围从0.1%到1%,在0.2%到0.8%之间,在0.4%到0.6%之间
微量元素B(Corning,MT99175CI),基础补充剂,0.1%
微量元素C(Corning,MT99176CI),基础补充剂,0.1%
还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G),范围从1μg/ml至20μg/ml,从1μg/ml到10μg/ml之间,从2μg/ml到5μg/ml之间
确定的脂质(Invitrogen,11905031),基础补充剂,0.2%
XAV939(Sigma X3004),范围从1μM到10μM,在2μM到5μM之间,在2.5μM到4.5μM之间
内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),范围从1μM到10μM,在2μM到5μM之间,在2.5μM到4.5μM之间
A419259(Tocris Bioscience,3748),范围从0.05μM到0.5μM,在0.1μM到0.5μM之间,在0.15μM到0.3μM之间
Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),范围从0.2μM到2μM,在0.5μM到1.5μM之间,在0.8μM到1.2μM之间
人类Lif(Stem Cell Institute,University of Cambridge.SCI),范围从1ng/ml到20ng/ml,在5ng/ml到15ng/ml之间,在8ng/ml到12ng/ml之间
在一个实施方案中,猪EPSC培养基包含:
F12 DMEM(Gibco,21331-020),基础培养基,48%
神经基础培养基(Life Technologies,21103-049),基础培养基,48%
青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco,10378016),基础补充剂,1%
NEAA(Gibco,11140050),基础补充剂,1%
丙酮酸钠(gibco,11360070),基础补充剂,1%
2-巯基乙醇(Aldrich,Sigma),基础补充剂,110μM
N2(Thermo 17502048),范围从0.1%到1%,在0.25%到0.75%之间,在0.4%到0.6%之间
B27(Thermo 17504044),范围从0.1%到2%,在0.5%到0.15%之间,在0.8%到1.0%之间
ITS-X(thermos,51500056),范围从0.1%到1%,在0.25%到0.75%之间,在0.4%到0.6%之间
维生素C(Sigma,49752-100G),范围从10μg/ml到100μg/ml,在20μg/ml到100μg/ml之间,在50μg/ml到70μg/ml之间
牛白蛋白组分V(7.5%溶液)(Thermo,15260037),范围从0.1%到1%,在0.2%到0.8%之间,在0.4%到0.6%之间
微量元素B(Corning,MT99175CI),基础补充剂,0.1%
微量元素C(Corning,MT99176CI),基础补充剂,0.1%
还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G),范围从1μg/ml到20μg/ml,在1μg/ml到10μg/ml之间,在2μg/ml到5μg/ml之间
XAV939(Sigma X3004),范围从1μM到10μM,在2μM到5μM之间,在2.5μM到4.5μM之间
内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),范围从1μM到10μM,在1μM到5μM之间,在1μM到2μM之间
WH-4-023(Tocris,Cat.No.5413),范围从0.1μM到1.0μM,在0.1μM到0.5μM之间,在0.1μM到0.2μM之间
Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),范围从0.05μM到0.5μM,在0.1μM到0.5μM之间,在0.2μM到0.3μM之间
人类Lif(Stem Cell Institute,University of Cambridge.SCI),范围从1ng/ml到20ng/ml,在5ng/ml到15ng/ml之间,在8ng/ml到12ng/ml之间
活化素A(STEM CELL TECHNOLOGY,Catalog#78001.1)。范围从10ng/ml到50ng/ml,在15ng/ml到30ng/ml之间,在20ng/ml到25ng/ml之间。
在一个实施方案中,500ml猪EPSC培养基包含:
482.5ml DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020),
2.5ml N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),
5ml B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),
5ml 1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),
5ml 1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),
110μM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250),
0.2μM CHIR99021(GSK3i,TOCRIS,Cat.No.4423),
0.3μM WH-4-023(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.5413),
2.5μM XAV939(Sigma,Cat.No.X3004)或2.0μM IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),
50μg/ml维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),
10ng/ml LIF(Stem Cell Institute,University of Cambridge.SCI),
20ng/ml活化素(SCI),
1ml ITS-X 200×(thermos,51500056),以及
0.3%FBS(Gibco,Cat.No.10270).
在另一个实施方案中,500ml人类EPSC培养基包含:
482.5ml DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020),
2.5ml N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),
5ml B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),
5ml 1×谷氨酰胺青霉素-林阿霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),
5ml 1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),
110μM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250),
1.0μM CHIR99021(GSK3抑制剂,TOCRIS,Cat.No.4423),
0.1μM A-419259(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.3914),
2.5μM XAV939(Sigma,Cat.No.X3004)或2.5μM IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),
50μg/ml维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),以及
10ng/ml LIF(SCI).
在另一个实施方案中,500ml人类EPSC培养基包含:
F12 DMEM(Gibco,21331-020),添加240ml,
神经基础培养基(Life Technologies,21103-049)240ml,
青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100X)(Gibco,10378016),添加5ml,
NEAA 100×(Gibco,11140050),添加5ml,
丙酮酸钠100×(gibco,11360070),添加5ml,
14.3M 2-巯基乙醇(M6250 Aldrich,Sigma),添加3.8μl(工作浓度110μM),
200×N2(Thermo 17502048),添加2.5ml,
100×B27(Thermo 17504044),添加5ml,
ITS-X 200×(thermos,51500056),添加2.5ml,
维生素C(Sigma,49752-100G),工作浓度64ug/ml,
牛白蛋白组分V(7.5%溶液)(Thermo,15260037),3ml,
微量元素B,(Corning,MT99175CI)1000x
微量元素C,(Corning,MT99176CI)1000x
还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G)10mg/ml,添加165ul,
确定的脂质,(Invitrogen,11905031)500x
XAV939(Sigma X3004),工作浓度2.5μM,
内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),工作浓度2.5μM,
A419259(Tocris Bioscience,3748),工作浓度0.1μM,
Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),工作浓度1.0μM,和
人类Lif,工作浓度10ng/ml。
在一个实施方案中,500ml猪EPSC培养基包含:
F12 DMEM(Gibco,21331-020),添加240ml,
神经基础培养基(Life Technologies,21103-049)240ml,
青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100X)(Gibco,10378016),添加5ml,
NEAA 100×(Gibco,11140050),添加5ml,
丙酮酸钠100×(gibco,11360070),添加5ml,
14.3M 2-巯基乙醇(M6250 Aldrich,Sigma),添加3.8μl(工作浓度110μM),
200×N2(Thermo 17502048),添加2.5ml,
100×B27(Thermo 17504044),添加5ml,
ITS-X 200×(thermos,51500056),添加2.5ml,
维生素C(Sigma,49752-100G),工作浓度64ug/ml,
牛白蛋白组分V(7.5%溶液)(Thermo,15260037),3ml,
微量元素B,(Corning,MT99175CI)1000x
微量元素C,(Corning,MT99176CI)1000x
还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G)10mg/ml,添加165ul,
XAV939(Sigma X3004),工作浓度2.5μM,
内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),工作浓度1μM,
WH-4-023(Tocris,Cat.No.5413),工作浓度0.16μM,
Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),工作浓度0.2μM,
人类Lif,工作浓度10ng/ml,和
活化素A(STEM CELL TECHNOLOGY,Catalog#78001.1)20ng/ml。合适的化学限定性基础培养基如上所述,并且包括Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)、Ham's F12、改进型Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM/F12)(Price,et al.,Focus(2003),25 3-6)、RPMI-1640(Moore,G.E.and Woods L.K.,(1976)Tissue Culture Association Manual.3,503-508)。优选的化学限定性基础培养基是DMEM/F12。
基础培养基可以补充有含血清或无血清培养基补充剂和/或附加组分。上文描述了合适的补充剂和附加组分并且可以包括L-谷氨酰胺或替代品,例如GlutaMAX-1TM、化学限定性脂质、白蛋白、1-硫代甘油、聚乙烯醇、胰岛素、维生素(如维生素C)、抗生素(如青霉素和/或链霉素)和转铁蛋白。
可以将每种抑制剂或调节剂添加到EPSCM中,其量的范围从0.1μM到150μM;在某些实施方案中,添加量为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM,4.5μM,5μM,5.5μM,6μM,6.5μM,7μM,7.5μM,8μM,8.5μM,9μM,9.5μM,10μM,11μM,12μM 13μM,15μMuM,16uM,17uM,18uM,19uM,20uM,25uM,30uM,35uM,40uM,45uM,50uM,60uM,70uM,80uM,90uM,100uM,110uM、120uM、130uM、140uM或150uM。
可以将每种抑制剂或调节剂添加到EPSCM中,其量的范围从0.05μM到0.1μM、0.1μM到1μM、1μM到2μM、2μM到3μM、3μM到4μM、4μM到5μM、5μM到6μM、6μM到7μM、7μM到8μM、8μM到9μM、9μM到10μM、10μM到15μM、15μM到20μM、20μM到30μM,30μM到40μM,40μM到50μM,50μM到60μM,60μM到70μM,70μM到80μM,80μM到90μM,90μM到100μM,100μM到110μM,110μMμM到120μM、120μM到130μM、130μM到140μM、140μM到150μM或150μM到160μM。
合适的抑制剂或调节剂包括天然和合成的小分子抑制剂或抗体。合适的Mek-ERK、JNK、p38、Src、GSK3和Wnt通路抑制剂是本领域已知的并且是可通过商业途径获得的。Mek-ERK通路是细胞中的蛋白质链,其将信号从细胞表面的受体传递到核中的DNA。该通路中的主要蛋白质是MEK和ERK。抑制这些蛋白质会破坏该通路中的信号传导。因此,抑制剂可以直接或间接抑制MEK或ERK,从而破坏该通路中的信号传导。例如,抑制剂可以是MEK抑制剂或ERK抑制剂。
合适的Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂包括来自www.scbt.com的JNK抑制剂VIII(目录编号sc-202673),RWJ 67657(目录编号sc-204251),抗生素LL Z1640-2(目录编号sc-202055),SX 011(sc-358841),贝马莫德(Bentamapimod)(sc-394312),AEG 3482(sc-202911),或来自www.invivogen.com的SP600125 JNK抑制剂。在一个实施方案中,JNK抑制剂为SP600125。
合适的p38抑制剂包括可从www.invivogen.com获得的sB203580(其抑制p38 MAPK的a和R同种型二者),可从www.scbt.com获得的p38 MAP激酶抑制剂IV(目录编号sc-204159)、LY2228820(目录编号sc-364525)、PH-797804(目录编号sc-364579)、p38 MAP激酶抑制剂(目录编号sc-204157)、SX 011(sc-358841)和2-(4-氯苯基)-4-(氟苯基)-5-吡啶-4-基-1,2-二氢吡唑-3-酮(sc-220665)。在一个实施方案中,p38抑制剂为sB203580。
Src家族激酶(SFK)是非受体酪氨酸激酶家族,其包括九个高度相关的成员。抑制多个src家族成员的广谱Src激酶家族抑制剂是可获得的并且是本领域已知的。合适的Src激酶家族抑制剂包括A-419259,它是广谱的Src家族激酶抑制剂(可从Sigma-Aldrich获得)。其他合适的SRK抑制剂包括也可从Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com)获得的PP1、PP2和CGP77675,以及可从Tochris Bioscience(www.tochris.com)获得的A419259三盐酸盐或KB SRC 4。在一个实施方案中,Src激酶家族抑制剂是WH-4-023或A-419259。
合适的GSK3抑制剂包括CHIR99021,一种可从Tocris Bioscience(cat 4423)获得的选择性强效GSK3抑制剂,或也可从Tocris Bioscience(www.tochris.com)获得的BIO(cat 3194),A 1070722(cat 4431),3F8(cat 4083),AR-A 014468(cat 39),L803-mts(cat2256)和SB 216763(cat 1616)。其他合适的GSK抑制剂包括GSK-3抑制剂IX(可从SantaCruz Biotechnology sc-202634获得)。在一个实施方案中,GSK-3抑制剂是CHIR99021。
此外,Wnt抑制剂可以添加到本公开的组合物中。Wnt抑制剂是Wnt/13-连环蛋白(catenin)信号通路的拮抗剂。
Wnt/13-连环蛋白信号通路是导致β-连环蛋白在细胞质中积累并最终易位到核中的Wnt通路。在没有wnt信号传导的情况下,β-连环蛋白被破坏复合物降解,该破坏复合物包括蛋白质Axin、腺瘤性息肉病(APC)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、糖原合酶激酶3(GSK3)和酪蛋白激酶In(CK1α)。
wnt抑制剂可以是端锚聚合酶抑制剂。端锚聚合酶抑制抑制axin泛素化并稳定axin蛋白(Huang et al 2009),从而抑制wnt信号传导。
合适的端锚聚合酶抑制剂是XAV939(www.sigmaaldrich.com)。另外已公布的端锚聚合酶抑制剂包括WIKI4、TC-E 5001和JW 55,均可从Tocris(www.tocris.com)通过商业途径获得。
可以将有效量的抑制剂加入到本公开的组合物中。有效量是足以抑制通路中或靶向蛋白质的信号传导的量。
扩增潜能干细胞培养基(EPSOM)可以是化学限定性培养基(CDM)。
化学限定性培养基(CDM)是用于培养细胞的营养液,其只含有特定组分,在某些实施方案中为已知化学结构的组分。因此,CDM没有未确定的组分或包括未确定组分的构成部分,例如饲养细胞、培养基细胞、血清、人工基底膜(matrigel)、血清白蛋白和复杂细胞外间质。合适的化学限定性基础培养基,例如改进型Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)或DMEM/F12(Price et al Focus(2003)25 3-6)、Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)和RPMI-1640(Moore,GE and Woods LK,(1976)Tissue Culture Association Manual.3,503-508;参见表1),基因敲除血清替代物(KSR)是本领域已知的并且可从商业来源获得(例如Sigma-Aldrich MI USA;Life Technologies USA)。
在一个实施方案中,基础培养基是DMEM/F12。该基础培养基可以包含或可以补充有AlbuMAX II,AlbuMAX II是通过商业途径获得的BSA或敲出血清替代物(KSR)。基础培养基可以还补充有以下中的任一或全部:N2、B27、L-谷氨酰胺,抗生素(在某些实施方案中,青霉素和链霉素);非必需氨基酸;维生素(在某些实施方案中,维生素C)以及基础培养基eagle(bME),上述所有都可通过商业途径获得(例如来自Sigma-Aldrich)。其他合适的补充剂在本领域已知并在本文中描述。
在某些实施方案中,以下添加剂可以存在于如下所述的组合物中。
谷氨酰胺,青霉素和链霉素可作为青霉素-谷氨酰胺-链霉素混合物(Cat.No.11140-050)通过商业途径获得,例如来自Thermo Fisher Scientific。
EPSCM的示例包括DMEM/F12基础培养基;补充有AlbuMAX II或敲出血清替代物以及本文所述的抑制剂和调节剂。EPSCM还可以包含以下中的任何:人类胰岛素;N2;B27;谷氨酰胺-青霉素-链霉素;非必需氨基酸;维生素C和基础培养基eagle(bME),以及LIF。
在某些实施方案中,EPSC群通过以下方式产生:在EPSCM中将多能干细胞群培养一个或多个(例如两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多)重复“传代”来产生EPSC的后代群。传代还被称为继代培养(sub-culturling),从先前培养物中把细胞转移到新鲜生长培养基。培养物中的细胞遵循滞后期、对数期和静止期的特征生长模式。这些时期的时间可以随使用的细胞(例如哺乳动物细胞对非哺乳动物细胞)而变化。确定细胞生长阶段的方法是本领域众所周知的。通常细胞在对数期传代。在某些实施方案中,多能干细胞可以在EPSCM中传代(即,继代培养)一到十次,三到十次,三到五次,以产生EPSC群。在一个实施方案中,群被传代至少三次来产生EPSC群。
如本文所述的EPSCM可以配制成用于销售的试剂盒。
试剂盒中的一种或多种培养基可以在去离子蒸馏水中配制。一种或多种培养基通常在使用之前进行灭菌以防止污染,例如通过紫外线、加热、照射或过滤。一种或多种培养基可以被冷冻(例如在-20℃或-80℃)用于储存或运输。一种或多种培养基可以含有一种或多种抗生素以防止污染。
一种或多种培养基可以是1x制剂或更浓缩的制剂,例如2x到250x浓缩的培养基制剂。在1x制剂中,培养基中的每种成分处于旨在用于细胞培养的浓度,例如上文阐述的浓度。在浓缩制剂中,一种或多种成分以高于旨在用于细胞培养的浓度的浓度存在。浓缩培养基是本领域众所周知的,例如盐沉淀或选择性过滤。浓缩的培养基可以用水(在某些实施方案中,去离子蒸馏水)或任何合适的溶液,例如盐水溶液、水性缓冲液或培养基稀释来使用。
试剂盒中的一种或多种培养基可以被包含在防止污染的密封容器中。对于培养基的运输或储存,密封容器可以是优选的。容器可以是任何合适的容器,例如烧瓶、盘子、瓶子、广口瓶、小瓶或袋子。
试剂盒还可以包括使用说明,例如用于使用EPSCM来获得EPSC。
5.3PFF重编程
本文提供的是通过直接培养pEPSCM中的原代集落进行的重复PFF重编程实验(扩展数据图3e),该实验从16个原代集落产生了11个稳定的pEPSCiPS系(70%效率)。所有系均表达高水平的内源性多能基因,并且其中的6个没有八个外源重编程因子的任何一个的可检测的表达(扩展数据图3f)。该pEPSCM条件随后被用于直接从猪植入前胚胎衍生干细胞系。从76个早期囊胚(5.0dpc)建立了总共26个系(pEPSCEmb,14个雄性和12个雌性),并从252个孤雌生殖囊胚中建立了12个细胞系(pEPSCpar)(图1a,表1和扩展数据图3g)。与pEPSCiPS相似,pEPSCEmb具有高核/细胞质比例,并形成具有光滑集落边缘的紧凑集落(图1a,扩展数据图3h)。pEPSCEmb每3-4天以1:10的比率作为单细胞传代,并且可以在STO饲养者上维持>40次传代而不会明显分化。在低细胞密度(6孔板中每孔2,000个细胞)下,亚克隆效率约为10%,但在常规传代中始终使用高细胞密度。pEPSCEmb在25次传代后核型正常(扩展数据图4a)。
pEPSCEmb和pEPSCiPS以与囊胚相当的水平表达多能基因(扩展数据图3f),其通过免疫染色验证(扩展数据图4b)。当pEPSC在先前报道的七种猪ESC培养基之一中培养时,多能基因表达显著降低或丢失[9-15](扩展数据图4c-e)。pEPSC在OCT4和NANOG启动子区域显示出广泛的DNA去甲基化(图1b),并具有OCT4远端增强子活性(扩展数据图4f)。EPSC适合Crispr/Cas9介导的H2B-mCherry表达盒插入ROSA26基因座(扩展数据图4g和4h)。在体外,pEPSC分化为表达代表三个胚层基因的组织:SOX7、AFP、T、DES、CRABP2、SMA、β-微管蛋白和PAX6,以及独特的滋养层细胞基因HAND1、GATA3、PGF、KRT7、ELF4、KRT8、ITGB4、TEAD3、TEAD4、SDC1和PLET1(图1c,扩展数据图4i)。在免疫缺陷小鼠中,pEPSCEmb与三个胚层的衍生物形成成熟的畸胎瘤,甚至包括胎盘催乳素-1(PL1)、KRT7和SDC1阳性滋养层细胞样细胞(图1d-1e和扩展图4j)。这些结果表明pEPSCEmb和pEPSCiPS与mEPSC[1]一样,可以对胚胎细胞谱系和胚胎外滋养层细胞谱系都具有扩展的发育潜能。测试了pEPSC对嵌合体中囊胚细胞谱系的贡献。在将pEPSC加入植入前胚胎中并培养48小时后,pEPSC(由EF1a-H2B-mCherry标记)已定植于囊胚的滋养外胚层和内细胞团(扩展数据图5a)。在将嵌合体胚胎转移到同步受体母猪后,在妊娠第26-28天从3窝共收获了45个受孕体(补充表2,扩展数据图5b)。来自嵌合体胚胎和胚外组织的解离细胞的流式细胞术显示在7个受孕体中存在mCherry+细胞(扩展数据图5c,补充表3和表4):在2个嵌合体中在胎盘和胚胎组织二者中均有mCherry+细胞(#8和#16);在3个嵌合体(#4、#21和#34)中仅在胚胎组织中;并且在2个嵌合体(#3和#6)中仅在胎盘中。基因组DNAPCR检测仅在这七个mCherry+嵌合体中检测到mCherry DNA,而在任何其他受孕体中均未检测到(扩展数据图5d,补充表3和4)。尽管供体mCherry+细胞的总体贡献较低,但在通过以下组织谱系标记物鉴定的多个宿主胚胎组织和器官中发现了它们:SOX2、TUJ1、GATA4、SOX17、AFP、α-SMA、PL-1和KRT7(图1f-g和扩展数据图5e-f)。
5.4PGC测试
测试pEPSC以查看它们是否有在体外产生类似于小鼠和人类多能干细胞的PGC样细胞(PGCLC)的潜力[25-27]。在早期原始条纹(PS)阶段的猪胚胎(E11.5–E12)中,在新生原始条纹的后端可以检测到第一簇猪PGC,其是SOX17+细胞,这些细胞随后共表达OCT4、NANOG、BLIMP1和TFAP2C[26]。NANOS3是进化保守的PGC特异性因子[28,29],人类NANOS3报告细胞已被用于研究PGCLC从多能干细胞的衍生[26,27]。为了便于鉴定推定的猪PGCLC,将H2BmCherry报告物盒靶向pEPSCEmb(K3系,雄性)中NANOS3基因座的3'UTR(扩展数据图6a)。在瞬时表达SOX17转基因达12小时后,允许携带NANOS3报告物的pEPSCEmb形成胚状体(EB)(扩展数据图6b),该胚状体在3-4天内包含共表达NANOS3(mCherry+)和组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP,PGC标记物)的细胞簇(图2a)。
推定的猪PGCLC的衍生是BMP2/4依赖性的,因为从EB培养物中去除BMP2或通过抑制剂LDN-193189抑制BMP2/4信号传导消除了mCherry+/TNAP+细胞簇的形成(图2a)。在pEPSC中单独或组合地表达NANOG、BLIMP1或TFAP2C转基因对NANOS3+细胞的优势没有影响(扩展数据图6c),这与报道的人类PGCLC的衍生不同[26]。然而,SOX17与BLIMP1而不是NANOG或TFAP2C的共表达,似乎增加了NANOS3+细胞的数量(扩展数据图6c和6c)。
EB中的mCherry+(NANOS3+)推定PGCLC表达了PGC特异性基因NANOS3、BLIMP1、TFAP2C、CD38、DND1、KIT和OCT4[33],这些基因在RT-qPCR中检测到,并通过单细胞分辨率的免疫荧光证实(图2b-c,和扩展数据图6e)。mCherry+/NANOS3+细胞的特定RNA-序列分析揭示了早期PGC基因(OCT4、NANOG、LIN28A、TFAP2C、CD38、DND1、NANOS3、ITGB3、SOX15和KIT)的表达,并降低了SOX2表达(图2d-e,补充表5)[27]。在源自人类ESC的PGCLC衍生过程中,细胞经历全局DNA去甲基化,其伴随着TET的上调和DNMT3A/B的下调[27]。类似地,相对于亲本pEPSCEmb,DNMT3B在猪mCherry+/NANOS3+细胞中下调,而TET1/2则上调(图2e-f,补充表5)。
5.5人类ES细胞的体外培养
人类ESC已广泛用于研究人类体外胚胎发育,并在再生医学方面具有巨大潜力。[36-37]发现抑制SRC和端锚聚合酶足以将小鼠ESC转化为mEPSC[1]并且这两种抑制剂是产生pEPSC所必需的,这增加了类似的体外培养条件也可以适用于其他哺乳动物物种的可能性。为了探索这种可能性,在pEPSCM中培养了四种已建立的人类ES细胞(hESC)系(H1、H9、Man1或M1,以及Man10或M10细胞)[30-32],并将它们传代多达3次。细胞显示出不同的形态和OCT4的异质表达(扩展数据图7a)。从pEPSCM中去除活化素A(20ng/ml)导致H1(<1.0%)和M1(5.0%)ESC培养物形成的细胞集落显著减少,而H9或M10中没有形成的细胞集落(扩展数据图7a),这与人类ESC固有的线间异质性是一致的[33,34]。随着培养条件的进一步完善(例如,在hEPSCM中用另一种SRC抑制剂A419259替换WH-4-023,参见方法),从单细胞亚克隆H1(H1-EPSC)和M1细胞(M1-EPSC)中建立了形态均一且稳定的细胞系(图3a)。在STO饲养者上的hEPSCM中生长的H1和M1细胞的核型分析揭示了遗传稳定性(在从亲本hESC转化后的第25代,扩展数据图7b)。
当从真皮成纤维细胞重编程的人类原代iPSC集落直接在hEPSCM中培养时,大约70%的挑取集落可以建立为稳定的iPSC系(iPSC-EPSC)(扩展数据图7c)。这些iPSC表达多能标记物,外源重编程因子没有明显泄漏(扩展数据图7d-e)。H1-EPSC增殖比在标准含FGF培养基(H1-ESC,致敏)或在5i/L/A条件下(H1-初始ESC)培养的H1 ESC更强劲,并且在ROCKi的瞬时存在下以约10%的单细胞亚克隆效率耐受单细胞传代。在5.0ng/ml活化素A存在时或通过以更高密度分裂细胞时,传代的细胞存活得到显著提高。人类EPSC以高于H1-ESC的水平和最低的谱系标记物(EOMES、GATA4、GATA6、T、SOX17和RUNX1)水平表达多能基因(OCT4、SOX2、NANOG、REX1和SALL4)(扩展数据图7d)(扩展数据图7g)。通过免疫染色证实了核心多能因子和表面标记物在人类EPSC中的表达(扩展数据图7h)。H1EPSC在体外和体内分化为三个胚层的衍生物(扩展数据图7i-j)。此外,使用针对生殖细胞感受态hESC或iPSC开发的体外条件,H1-EPSC成功分化为PGCLC[26,27](扩展数据图7k-1)。
这些结果表明,使用类似的一组小分子抑制剂可以衍生和维持人类和猪EPSC。全局基因表达谱显示pEPSC和hEPSC聚集在一起,并且与PFF或其他人类多能干细胞不同[1,42,43](图3b,扩展数据图8a和补充表6-7)。猪和人类EPSC均表达高水平的关键多能基因,低水平的体细胞谱系基因PAX6、T、GATA4和SOX7,或胎盘相关基因,如PGF、TFAP2C、EGFR、SDC1和ITGA5(扩展数据图8b-e)。与pEPSC和hEPSC的高水平全局DNA甲基化一致(扩展数据图9a),DNA甲基转移酶基因DNMT1和DNMT3A和DNMT3B高表达,而TET1、TET2和TET3以较低水平表达(扩展数据图9b-c)。与H1-ESC相比,在H1-EPSC中高度表达的76个基因(>8倍增加)中,17个基因编码组蛋白变异中的15个属于组蛋白簇1(图3c和补充表8)。有趣的是,这些组蛋白基因在5i和致敏人类ESC中以低水平表达,但在人类8细胞和桑椹期胚胎中高度表达(图3d)。与在常规人类ESC培养基(FGF)或5i(初始)培养基中培养的相同细胞相比,在更多hEPSC谱系中进一步证实了这些组蛋白基因的显著更高的表达(图3e)。
hEPSC和人类8细胞和桑椹胚期胚胎中高组蛋白基因表达的生物学意义仍有待进一步研究。猪和人类EPSC的单细胞RNA-序列(scRNA序列)显示核心多能因子的均匀表达:OCT4、SOX2、NANOG和SALL4(图3f),以及基本同质的细胞培养物(图3g)。在单细胞水平上,小鼠EPSC具有丰富的4细胞至8细胞卵裂球的转录组学特征[1]。hEPSC的scRNA序列分析表明,与人类植入前胚胎的其他阶段(图3h和扩展数据图8f)相比,hEPSC在转录上更类似于人类8细胞到桑椹胚阶段的胚胎[44,45],并且与RT-qPCR、批量RNA序列和scRNA序列中的组蛋白基因表达符合(图3d和扩展数据图9e)。有趣的是,转录组分析还揭示了EPSC中KLF2等初始多能因子的低表达(图3f和扩展数据图8b-c),这些因子在人类早期植入前胚胎中不表达。[46]尽管KLF2、TET1、TET2和TET3在pEPSC和hEPSC中均弱表达(扩展数据图8b和扩展数据图9b、9c),但它们的启动子区域的特征在于活跃的H3K4m3组蛋白标记(扩展数据图9f)。与多能基因相反,细胞谱系基因座(例如CDX2、GATA2、GATA4、SOX7和PDX1)在猪和人类EPSC中分别具有高H3K27me3和低H3K4me3标记(扩展数据图9f)。
5.6信号通路
hEPSC和pEPSC共享类似的信号传导要求,正如从培养基中去除单个组分后的影响所揭示的那样。去除SRC抑制剂WH-4-023或A419259降低了两种EPSC中多能因子的表达(扩展数据图10a-d)。值得注意的是,在人类EPSC中,使用SRC抑制剂WH-4-023代替A419259导致多能基因表达降低(扩展数据图10b)。与mEPSC类似,[1]XAV939增强了AXIN1蛋白含量(扩展数据图10e),并降低了两种EPSC中的典型WNT活性(扩展数据图10f)。XAV939的撤回导致这些EPSC的崩溃和分化(扩展数据图10a-b、10d和10g-k)。SMAD2/3在EPSC中被磷酸化(扩展数据图10e)。从pEPSCM中去除活化素A或添加TGFβ抑制剂SB431542导致pEPSC中大量细胞丢失和多能因子下调(扩展数据图10a、10g、10h和10j),而在人类EPSC中,TGFβ抑制剂SB431542诱导快速细胞分化,并且优先表达滋养层细胞谱系转录因子基因CDX2、ELF5和GATA2(扩展数据图10b、10i和10k)。在相对低浓度的外源活化素A(5.0ng/ml)下,hEPSC表现出更强的胚胎中内胚层谱系分化倾向(扩展数据图10l),并产生更多的NANOS3-tdTomato+PGCLC(扩展数据图10m-n)。从pEPSCM中去除CHIR99021和维生素C不会影响多能基因表达,但会减少单细胞的集落数量(扩展数据图10a和10h),而高浓度的CHIR99021(3.0μM)诱导猪和人类EPSC的分化(扩展数据图10a、10h和10j),类似于人类或大鼠初始细胞中的数据。[30,47]JNK和BRAF抑制可能会提高培养效率,但不是必需的(扩展数据图10h-i)。在hEPSC中,对CHIR99021和Vc的要求与pEPSC相似(扩展数据图10a-b和10h-I)。小鼠初始ESC的衍生需要1.0μM Mek1/2抑制剂PD0325901[26],但这种浓度的PD0325901对pEPSC培养条件筛选中的猪细胞有害(扩展数据图2b-2f)。与这一观察结果一致,即使是0.1μM PD0325901也会降低pEPSC存活,这是通过连续传代中的集落形成来测量的(扩展数据10h)。方法中包括了猪和人类EPSC培养条件的全部细节。
5.7分化
通过CDX2-Venus报告物(插入CDX2基因座的3'UTR中的T2A-Venus)的表达追踪hEPSC向滋养层细胞的分化(扩展数据图11a)。SB431542抑制TGFβ导致约70%的CDX2报告细胞为CDX2-Venus+(图4a),而如果报告细胞在FGF中或在5i初始ESC条件下培养,则基本上没有检测到CDX2-Venus+细胞。滋养层细胞相关基因如CDX2、GATA3、ELF5、KRT7、TFAP2C、PGF、HAND1和CGA的表达在分化H1-EPSC和iPSC-EPSC中迅速增加,但在H1-ESC或H1-5i初始细胞中则没有(图4b)。添加BMP4可促进人类ESC向推定的滋养层细胞分化,[48]在H1-EPSC和iPSC-EPSC中诱导的滋养层细胞基因的表达水平远高于在H1-ESC或H1-5i初始ESC中的表达(扩展数据图11b)。据报道,抑制FGF和TGFβ信号传导同时并行激活BMP4可有效诱导FGF培养的(致敏)人类ESC中的滋养层细胞分化。[49-50]在这些条件下,H1-EPSC中滋养层细胞基因,尤其是晚期滋养层细胞基因GCM1、CGA和CGB的表达仍远高于H1-ESC中基因的表达,而初始5i hESC未显示滋养层细胞分化(扩展数据图11c)。全局基因表达分析表明,在TGFβ信号传导抑制下,H1-EPSC和iPSC-EPSC遵循与H1-ESC不同的分化轨迹(图4c),并且是在从EPSC而不是从H1-ESC分化的细胞中,重要的滋养层细胞发育或功能基因高度表达,包括:(1)分化第2-4天的BMP4;(2)人类内源性逆转录病毒编码的、促进细胞滋养层细胞融合为合体滋养层细胞的包膜蛋白合胞素-1(ERVW-1)和合胞素-2(ERVFRD-1)的基因;(3)在滋养层细胞中表达并对正常胎盘发育至关重要的母源表达基因p57(由CDKN1C编码)[51-52];(4)调节免疫细胞活性的CD274(编码PD-L1或B7-H1);以及(5)在人类滋养层干细胞(hTSC)中很重要的EGFR53(扩展数据图11d和补充表6)。
为了通过TGFβ抑制进一步推断分化的hEPSC的身份,我们对从H1-EPSC、iPSC-EPSC或H1-ESC分化的细胞的转录组进行皮尔逊相关系数分析,外部参考数据包括原代人类滋养层细胞(PHTs)和人类胎盘组织,[50]分析再次揭示了从hEPSC和PHT分化的细胞与胎盘之间的相似性(扩展数据图11e)。通过TGFβ抑制从H1-EPSC分化的细胞表达人类滋养层细胞特异性miRNA(C19MC miRNA:hsa-miR-525-3p、hsa-miR-526b-3p、hsa-miR-517-5p和hsa-miR-517b-3p)[54](扩展数据图11f-g),在ELF5基因座显示DNA去甲基化[55,56](扩展数据图11h),并产生大量的胎盘激素(扩展数据图11i-j)。
当hEPSC(ESC-转化的-EPSC和iPSC-EPSC)在低细胞密度(2,000个细胞/3.5cm培养皿)的人类滋养层干细胞(hTSC)条件[53]中培养时,7-9天后形成具有TSC形态的集落(图4d)。在hTSC条件下挑取这些集落并扩增为稳定的细胞系,细胞系建立效率高达30%(图4d)。另一方面,hTSC系不是从人类H1或M1 ESC建立的,无论它们是在致敏还是初始ESC条件下培养的。hEPSC衍生的TSC样细胞(在本研究中称为hTSC)表达滋养层细胞转录调节因子:GATA2、GATA3和TFAP2C,但具有下调的多能基因(图4e和扩展数据图12a)。与人类EPSC分化为滋养层细胞期间的基因表达变化相比,源自hEPSC的hTSC在TGFβ抑制下具有第4-6天分化人类EPSC的丰富的转录组学特征(扩展数据图12b)。按照公布的方案,[53]hTSC分化为多核合体滋养层细胞(ST)和HLA-G+绒毛外滋养层细胞(EVT)(图4f-4g和扩展数据图12c-12h)。一旦注射到免疫功能低下的小鼠中,hTSC就会形成病变,该病变包含对滋养层细胞标记物SDC1和KRT7染色呈阳性的细胞(图4h和扩展数据图12i)。此外,在注射hTSC形成病变的小鼠血液中检测到高水平的hCG(人类绒毛膜促性腺激素),但在注射媒介物对照的小鼠中未检测到(扩展数据图12j)。尽管猪和人类EPSC均未表达高水平的胎盘发育相关基因,如PGF、TFAP2C、EGFR、SDC1和ITGA5(扩展数据图8d-e),但两种细胞在这些位点均具有高H3K4me3(扩展数据图13a),清楚地支持EPSC的滋养层细胞效力。与人类和猪EPSC之间的分子相似性一致,在人类TSC条件下,稳定的TSC样系也可以从猪EPSCEmb(此处称为pTSC。扩展数据图13b)中衍生。pTSC表达滋养层细胞基因,形成病变,该病变包含对免疫功能低下小鼠中的SDC1和KRT7染色为阳性的细胞(扩展数据图13c-13f)。当引入猪植入前胚胎时,pTSC的后代定位于滋养外胚层并表达GATA3(扩展数据图13g)。因此,这些结果提供了令人类信服的证据,表明人类和猪EPSC具有扩展的分化潜力,包括滋养层细胞谱系。
衍生和维持小鼠、猪和人类EPSC的关键机制之一是使用如XAV939等小分子抑制剂阻断PARP家族成员TNKS1/2的聚(ADP-核糖基)化活性。[57,58]在人类细胞中,蛋白质中的聚(ADP-核糖)被聚(ADP-核糖)糖水解酶(PARG)和ADP-核糖基水解酶3(ARH3)去除。[59]小鼠中Parp1/2和TNKS1/2的遗传失活导致滋养层细胞表型,[60]而使Parg失活导致功能性滋养外胚层和TSC的丢失。[61]测试PARG是否与衍生滋养层细胞的hEPSC发育潜力有任何相关性。在hEPSC中,PARG缺陷似乎不会引起EPSC培养物的显著变化,但会对滋养层细胞分化产生不利影响(扩展数据图14a-d),这可以表明EPSC和滋养层细胞从小鼠到人类发育的进化保守机制。
本文描述的本主题将通过以下非限制性实施例更具体地说明,应当理解,在不背离本公开内容的范围和精神的情况下可以在如在下文中要求保护的内容中做出改变和变化。还应理解,关于本公开为何起作用的各种理论不旨在限制。
6.实施例
6.1使用人类ESC工作的伦理考虑
使用人类ESC和人类细胞的实验得到了英国剑桥威康信托桑格研究所的HMDMC(HMDMC of the Wellcome Trust Sanger Institute,Cambridge UK)的批准。使用猪胚胎的实验得到了德国下萨克森州奥尔登堡拉维斯消费者保护和食品安全办公室(Niedersaechsisches Landesamt fuer Verbraucherschutz undLebensmittelsicherheit,LAVES,Oldenburg Germany)的批准。小鼠畸胎瘤实验是根据英国内政部法规和1986年动物(科学程序)法案(许可证号80/2552)进行的,并得到了威康基因组校园的动物福利和伦理审查机构(Animal Welfare and Ethical Review Body ofthe Wellcome Genome Campus)和香港大学教学和研究中活体动物使用委员会(CULATR,HKU)的批准。在本研究末尾,根据陈述的英国内政部规定,通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
6.2培养猪和人类EPSC
将猪和人类EPSC培养物常规维持在STO饲养者上。在传代前3-4天制备STO饲养者板,方法是将丝裂霉素C灭活的STO细胞以约1.1×104细胞/cm2的密度解冻并铺在0.1%糊化的板上。将猪/人类EPSC细胞维持在STO饲养者层上,每3-5天通过短暂的PBS洗涤进行酶促传代,然后用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Cat.No.25500-054)处理3-5分钟。将细胞解离并在M10培养基中离心(300g x 5分钟)。M10:敲除DMEM(Gibco,Cat.No.10829-018)、10%FBS(Gibco,Cat.No.10270)、1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140050)和1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016)。去除上清液后,将猪/人类EPSC重新悬浮并接种在添加了5μM ROCK抑制剂Y-27632(Tocris,Cat.No.1254)的pEPSCM/hEPSCM中。分别在pEPSCM和hEPSCM中加入5%FBS(Gibco,Cat.No.10270)和10%基因敲除血清替代物(KSR)(Gibco,Cat.No.10828028)以提高细胞存活率。12-24小时后,将培养基切换为仅pEPSCM/hEPSCM。pEPSCM和hEPSCM都是基于N2B27的培养基。N2B27基础培养基(500ml)通过包含以下组分制备:482.5ml DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020),2.5ml N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048)、5ml B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044)、5ml 1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050)和5ml 1×NEAA(ThermoFisher Scientific,Cat.No.10378-016),0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250)。pEPSCM(500ml)是通过将以下小分子和细胞因子添加到500ml N2B27基础培养基中生成的:0.2μM CHIR99021(GSK3i,TOCRIS,Cat.No.4423),1μM WH-4-023(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.5413)、2.5μM XAV939(Sigma,Cat.No.X3004)或2.5μM IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532)、50μg/ml维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G)、10ng/ml LIF(Stem CellInstitute,University of Cambridge.SCI)和20ng/ml活化素(SCI)。hEPSCM(500ml)是通过将以下组分添加到500ml N2B27基础培养基中产生的:1.0μM CHIR99021(GSK3抑制剂,TOCRIS,Cat.No.4423),0.5μM A-419259(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.3914)、2.5μM XAV939(Sigma,Cat.No.X3004)、50μg/ml维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G)、10ng/ml LIF(SCI)。尽管两者都靶向SRC家族激酶(SFK),但WH-4-023和A419259分别是猪和人类EPSC的优选。猪和人类EPSC都需要CHIR99021来改善增殖。用于小鼠ES细胞培养的高浓度CHIR9902(例如3.0μM)诱导猪和人类EPSC分化。CHIR99021用于猪和人类EPSC培养物的浓度分别为0.2μM和1.0μM。人类EPSC培养条件不含0.3%FBS。包含0.25μM SB 590885(BRAF抑制剂,R&D,Cat.No.2650)和2.0μM SP600125(JNK抑制剂,TOCRIS,Cat.No.1496)以改善猪和人类EPSC培养物,但它们不是常规维持猪和人类EPSC所必需的。除非另有说明,本文所有细胞培养均在37℃和5%CO2条件下进行。
6.3将PFF(猪胎成纤维细胞)重编程为iPSC
德国长白种[1]和中国TAIHU OCT4-TD-tomato[2]猪胎成纤维细胞(PFF)铺板在糊化的15厘米组织培养板上并在M20培养基中培养。它们被0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液(Gibco,Cat.No.25500-054)进行胰蛋白酶消化,并在80%合流时被收获来用于电穿孔。M20敲除DMEM(Gibco,Cat.No.10829-018)、20%FBS(Gibco,Cat.No.10270)、1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050)和1×NEAA(Thermo FisherScientific,Cat.No.10378-016)。使用Amaxa Nucleofector机器(Lonza)根据制造商的方案(NHDFKit,Cat.No.VPD-1001,program U-20)进行转染。piggyBac转座用于实现重编程因子的稳定整合。重编程因子的表达受tetO2四环素/强力霉素诱导启动子的转录控制。150万个PFF和6.0μg DNA(2.0μg PB-TRE-pOSCK、猪OCT4、SOX2、cMYC和KLF4;1.0μg PB-TRE-pNhL、1.0μg PB-TRE-hRL:人类RARG和LRH1、1.0μg EF1a-转座酶和1.0μg PB-EF1a-rTTA)用于每个电穿孔反应。PB-TRE-pOSCK:通过2A序列连接的猪OCT4、SOX2、cMYC和KLF4的cDNA表达为来自tetO2启动子的单个转录本[3]。PB-TRE-pNhL含有猪NANOG和人类LIN28的cDNA,也与2A序列相连[3]。PB-TRE-RL具有2A连接的人类RARG和LRH1 cDNA[4]。EF1a启动子被用来驱动PB转座酶表达。表达反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)以在添加Dox后诱导重编程因子的表达。转染后,将20万个PFF接种在M15中丝裂霉素灭活的STO饲养者上,并在10厘米培养皿中补充LIF(10ng/ml,SCI)和维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G)。M15:敲除DMEM(Gibco,Cat.No.10829-018),15%FBS(Gibco,Cat.No.10270),1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),1×NEAA(ThermoFisher Scientific,Cat.No.10378-016)和0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250)。添加强力霉素(Dox)(1.0μg/mL,Sigma,Cat.No.D9891)诱导重编程因子表达。隔一天更换一次培养基。对于转基因依赖的iPSC生成,第12天在补充有Dox、50μg/ml维生素C和10ng/mlbFGF(SCI)的M15中采集集落,并维持在相同的培养基中。为了在pEPSCM中直接建立非转基因依赖的iPSC系,在第9天去除Dox并立即将培养基切换到pEPSCM。在第14-15天,在补充有5μM ROCK抑制剂Y27632(Tocris,Cat.No.1254)的pEPSCM中采集不依赖Dox的iPSC集落。24小时后从培养基中取出Y26537,随后每天更新pEPSCM。
6.4猪EPSC培养条件的筛选
Dox依赖的猪iPSC在0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液(Gibco,Cat.No.25500-054)中解离,并以每孔1×104细胞的密度接种在24孔STO饲养板中。将细胞在添加了Dox(Sigma,Cat.No.D9891)、维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G)和10ng/ml bFGF(SCI)的M15中培养两天,然后将培养基切换到补充有指定小分子和细胞因子的培养基(补充表1)。M15和N2B27培养基:见上文。Albu mMax培养基:DMEM/F12(Gibco,Cat.No.21331-020)、20%Albu mMaxII(Gibco,Cat.No.11021-037)、25mg/ml人类胰岛素(Sigma,Cat.No.91077C)、2×B27补充剂、100ug/mL IGFII(R&D,Cat.No.292-G2-250)、1x谷氨酰胺青霉素-链霉素(ThermoFisher Scientific,Cat.No.11140-050)、1x NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016)和0.1mM 2巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250)。20%KSR培养基:DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020)、20%敲除血清替代物(KSR)(Gibco,Cat.No.10828-028)、1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050)、1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016)和0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250)。按照以下最终浓度添加小分子和细胞因子:CHIR99021(0.2或3μM,TOCRIS,Cat.No.4423)、PD0325901(0.1μM和1μM,TOCRIS,Cat.No.22854192);WH-4-023(4μM,TOCRIS,Cat.No.5413),PKC抑制剂Go6983(5μM.TOCRIS,Cat.No.2285);SB203580(p38抑制剂,10μM。TOCRIS,Cat.No.1202);SP600125(JNK抑制剂,4μM。TOCRIS,Cat.No.1496);维生素C(50μg/ml,Sigma,Cat.No.49752-100G)、SB590885(BRAF抑制剂,0.25μM,R&D,Cat.No.2650)、XAV939(2.5μM,Cat.No.X3004)、RO4929097(Notch信号传导抑制剂,10μM,Selleckchem,Cat.No.S1575)、LDN193189(BMP抑制剂,0.1μM,Sigma,Cat.No.SML0559)、Y27632(ROCKi,5μM,Tocris,Cat.No.1254)、维替泊芬(YAP抑制剂,10μM,Tocris,Cat.No.5305)。LIF(10ng/ml,SCI)、BMP4(10ng/ml,R&D,Cat.No.5020-BP)、SCF(50ng/ml,R&D,Cat.No.255-SC-010)、EGF(50ng/ml,R&D,Cat.No.236-EG-200)、TGFβ(10ng/ml,Cat.No.7754-BH-005)、bFGF(10ng/ml,SCI)、活化素(20ng/ml,SCI)。每天更新培养基,存活的细胞在第6天传代。在传代后的前24小时内,在培养基中添加5μM ROCKi Y27632(Tocris,Cat.No.1254)并在24小时后取出。生长4天后,收集存活的菌落用于RT-qPCR分析,以检查内源性猪OCT4和NANOG表达。
6.5母猪超数排卵
围青春期的德国长白小母猪(大约7-9个月大,体重90-120公斤)作为胚胎供体。通过喂养5ml/天/小母猪烯丙孕素(4mg/ml,MSD Animal Health,Germany)达13天来同步小母猪。然后在烯丙孕素喂养的最后一天注射1500IU PMSG(240I.E./ml,MSD Animal Health,Germany)[5]。76小时后通过肌内注射500IU的hCG(300I.E./ml,MSD Animal Health,Germany)诱导排卵。
6.6母猪授精和胚胎回收
使用体模经由戴手套的方法从德国长白公猪[1]收集精液,并立即在AndrohepPlus溶液(Minitube,Tiefenbach,Germany)中稀释。在施用hCG后,在40小时和48小时对母猪进行两次人工授精。第二次授精后五天,母猪被屠宰,子宫被切除并用Dulbecco氏PBS培养基(AppliChem,Cat.No.A0964)冲洗,添加1%新生小牛血清(NBCS,GibcoTM,Cat.No.16010159)。收集的桑椹胚直接用于注射实验或在PZM-3培养基中培养过夜至囊胚阶段并用于ICM分离(PZM-3培养基:108mM氯化钠(NaCl,Sigma-Aldrich,Cat.No.S5886)、10mM氯化钾(KCl,Sigma-Aldrich,P-5405)、0.35mM磷酸二氢钾(KH2PO4,SigmaAldrich,Cat.No.P5655)、0.40mM硫酸镁七水合物(MgSO4 x 7H2O,Sigma-Aldrich,Cat.No.M5921)、25.07mM碳酸氢钠(NaHCO3,Sigma-Aldrich,S4019)、2mM L(+)五水乳酸钙盐(C6H10CaO6×5H2O,Roth,Cat.No.4071)、0.2mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich,Cat.No.P2256)、1mM L-谷氨酰胺(AppliChem,Cat.No.A3704)、0.05mg/ml庆大霉素硫酸盐(Sigma-Aldrich,Cat.No.G3632)、0.55mg/ml亚牛磺酸(Sigma-Aldrich,Cat.No.H1384)、20μl/ml BME氨基酸溶液(Sigma-Aldrich,Cat.No.B6766)、10μl/ml MEM非必需氨基酸溶液(Sigma-Aldrich,Cat.No.M7145)和3mg/ml牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich,A7030))。
6.7卵母细胞采集、体外成熟(IVM)和孤雌生殖胚胎的产生
来自青春期前小母猪的猪卵巢在30℃下从当地屠宰场运输,并用含有0.06mg/ml青霉素G钾盐(AppliChem,Cat.No.A1837)的0.9%氯化钠(NaCl,Sigma-Aldrich,Cat.No.S5886)和0.131mg/ml的硫酸链霉素(AppliChem,Cat.No.A1852)洗涤3次。使用18号针头从直径为2-6毫米的卵泡中吸出卵母细胞,并在补充有0.33mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich,Cat.No.P2256)、5.56mM D(+)-葡萄糖一水合物(Roth,Cat.No.6887)、0.9mM氯化钙二水合物(AppliChem,Cat.No.A3587)、50mg/ml硫酸链霉素(AppliChem,Cat.No.A1852)、6mg/ml青霉素G钾盐(AppliChem,Cat.No.A1837)和1%新生小牛血清(NBCS,GibcoTM,Cat.No.16010159)的Dulbecco氏PBS培养基(AppliChem,Cat.No.A0964)中洗涤。具有多层致密卵丘的卵丘-卵母细胞复合物在1:1的DMEM高葡萄糖(Biowest,Cat.No.L0101-500)和补充有60μg/ml青霉素G钾盐(AppliChem,Cat.No.A1837)、50μg/ml硫酸链霉素(AppliChem,Cat.No.A1852)、2.5mM L-谷氨酰胺(AppliChem,Cat.No.A3704)、10%胎牛血清(FCS,Lot 42Q0154K,Cat.No.10270-106)、50ng/ml鼠表皮生长因子(EGF,SigmaAldrich,Cat.No.E4127)、10I.E./ml妊娠母马血清(PMSG,240I.E./ml,MSD Animal Health,Germany)、10I.E./ml人类绒毛膜促性腺激素(hCG,300I.E./ml,MSD Animal Health,Germany)、100ng/ml人类重组胰岛素样生长因子1(IGF1,R&D Systems,Cat.No.291-G1)、5ng/ml重组人类FGF-基础(bFGF,Peprotech,Cat.No.100-18B)的Ham氏F-12培养基(Merck,Cat.No.F0815)中,在38.5℃含5%CO2的加湿空气中40小时体外成熟。
6.8孤雌生殖胚胎发育激活
成熟后,通过在TL-Hepes 321+Ca2+培养基中与0.1%透明质酸酶(Sigma-Aldrich,Cat.No.H3506)孵育5分钟,使卵母细胞脱离卵丘细胞,其中TL-Hepes 321+Ca2+培养基由114mM氯化钠(NaCl,Sigma-Aldrich,Cat.No.S5886)、3.2mM氯化钾(KCl,Sigma-Aldrich,P-5405)、2mM二水氯化钙(CaCl2 x 2H2O;AppliChem,Cat.No.A3587)、0.4mM二氢钠(NaH2PO4 xH2O,Merck,Cat.No.106346)、0.5mM氯化镁六水合物(MgCl2 x 6H2O,Roth,Cat.No.HN03.2)、2mM碳酸氢钠(NaHCO3,Roth,Cat.No.HN01.2)、10mM HEPES(Roth,Cat.No.9105.3)、10mMDL-乳酸钠溶液(60%)(SigmaAldrich,Cat.No.L1375)、100U/L青霉素G钾盐(AppliChem,Cat.No.A1837)、50mg/L硫酸链霉素(AppliChem,Cat.No.A1852)、0.25mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich,Cat.No.P2256)、57mM蔗糖(Merck,Cat.No.107653)和0.4%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich,Cat.No.A9647)组成。在用TL-Hepes 321+Ca2+培养基洗涤后,在SOR激活培养基(182.2g/mol山梨糖醇(Sigma-Aldrich,Cat.No.S1876)、158.2g/mol醋酸钙水合物(Sigma-Aldrich,Cat.No.C4705)、214.5g/mol四水醋酸镁(Sigma-Aldrich,Cat.No.M5661)、0.1%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich,Cat.No.A9647))中将具有可见第一极体的卵母细胞暴露于24V单脉冲45μs。此后,卵母细胞在PZM-3培养基中的2mM 6二甲基氨基嘌呤(6-DMAP,Sigma-Aldrich,Cat.No.D2629)中孵育3小时。
6.9猪植入前胚胎的体外培养
激活后,将卵母细胞在PZM-3培养基中在39℃,5%CO2和5%O2中培养6天。为了分离ICM,将第6天的猪囊胚在含有DMEM高葡萄糖(Biowest,Cat.No.L0101-500)和2mM L-谷氨酰胺(AppliChem,Cat.No.A3704)、15%胎牛血清(FCS,Lot 42Q0154K,Cat.No.10270-106)、1%青霉素/链霉素溶液(Corning,Cat.No.PS-B)、1%MEM非必需氨基酸溶液(Corning,Cat.No.NEAA-B)、0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,Cat.No.M7522)补充有1000U/ml重组小鼠LIF蛋白(Millipore,Cat.No.ESG1107)的D15培养基中另外培养24小时。
6.10从猪孤雌生殖和体内收集的囊胚中分离ICM
第7天的猪孤雌生殖囊胚和第5天的体内衍生囊胚用于建立猪PSC系。囊胚在由114mM氯化钠(NaCl,Sigma-Aldrich,Cat.No.S5886)、3.2mM氯化钾(KCl,Sigma-Aldrich,Cat.No.P-5405)、2mM二水氯化钙(CaCl2 x 2H2O,AppliChem,Cat.No.A3587)、0.4mM磷酸二氢钠一水合物(NaH2PO4 x H2O,Merck,Cat.No.106346)、0.5mM六水氯化镁(MgCl2x 6H2O,Roth,Cat.No.HN03.2)、2mM碳酸氢钠(NaHCO3,Sigma-Aldrich,Cat.No.S4019)、10mM HEPES(Roth,Cat.No.9105.3)、10mM DL-乳酸钠溶液(60%)(Sigma-Aldrich,Cat.No.L1375)、100U/L Penicilin G钾盐BioChemica(AppliChem,Cat.No.A1837)、50mg/L硫酸链霉素BioChemica(AppliChem,Cat.No.A1852)、0.25mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich,Cat.No.P2256)、32mM蔗糖(Merck,Cat.No.107653)和0.4%牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich,Cat.No.A9647)组成的TLHepes 296+Ca2+培养基中洗涤两次。使用眼科剪刀(Bausch&Lomb GmbH,Germany)在100μl TL-Hepes 296+Ca2培养基滴中将ICM从滋养外胚层中分离。将分离的ICM在补充有10μM Y27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)的pEPSCM培养基中用丝裂霉素C处理的单层STO细胞培养7天,直到观察到初始长出物。随后,不含ROCKi的pEPSCM培养基用于进一步培养。培养基每天更换。接种后12-14天,使用细拉玻璃毛细管移液器从STO饲养细胞中机械去除ICM集落,并重新接种到新鲜饲养细胞上。每天评估集落的生长,大约三天后细胞开始形成明确的猪EPSCEmb集落。每3-4天使用0.05%胰蛋白酶-EDTA(GE Healthcare,Cat.No.L11-003)继代培养这些细胞。
6.11体外嵌合体测定
为了研究衍生细胞系的发育能力,将用mCherry表达标记的猪EPSCEmb和EPSCiPS注射到孤雌生殖囊胚中,并评估嵌合现象的发生率。用0.05%胰蛋白酶-EDTA(GEHealthcare,Cat.No.L11-003)将干细胞与饲养者分离,并重新悬浮在胎牛血清(FBS,Lot 42Q0154K,Cat.No.10270-106)中。离心后,将干细胞重新悬浮并在室温下储存在补充有1000U/ml重组小鼠LIF蛋白(Millipore,Cat.No.ESG1107)和10μMY27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)的D15培养基中。借助补充有10%FBS(Lot42Q0154K,Cat.No.10270-106)的I(1x)+Gluta mMAXTM-I还原型血清培养基(Cat.No.51985-026)中的压电显微操作器(Zeiss,Eppendorf),将含有6-8个细胞的小团块注射到第4天或第6天大的猪孤雌生殖胚胎中。注射后,将胚胎在补充有1000U/ml重组小鼠LIF蛋白(Millipore,Cat.No.ESG1107)和10μM Y27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)的D15培养基中在39℃下,5%CO2和5%O2中培养24小时(第6天囊胚)或48小时(第4天胚胎)。将在上述培养基中培养的第4天或第6天未注射的猪孤雌生殖胚胎用作胚胎发育。
6.12体内嵌合体测定的对照
上文描述了超数排卵、受精和胚胎收集的规程。在注射前,收集自八头小母猪的第5天猪桑椹胚在37℃下储存于恒温控制培养箱中的补充有10%FBS(Lot42Q0154K,Cat.No.10270-106)的I(1x)+Gluta mMAXTM-I减血清培养基(Cat.No.51985-026)中。mCherry+集落挑取后第2-8代的猪EPSC谱系用于胚胎注射。猪EPSC在pEPSCM培养基中的有丝分裂灭活的STO饲养者或MEF细胞上培养。注射前两天,将培养基切换为不含WH-4-023的pEPSCM培养基(SRCi,TOCRIS,Cat.No.5413)。注射前一天,用额外补充有肝素(5ng/ml,R&D,Cat.No.9041-08-1)和10ng/ml bFGF(SCI)的不含WH-4-023的pEPSCM培养基替换培养基。注射前四小时,用补充有5ng/ml肝素、10ng/ml bFGF(SCI-剑桥大学干细胞研究所)、10ng/ml LIF(SCI)、5μM Y27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)、20ng/ml人类重组活化素A(StemCell Technologies,Cat.No.78001)和10%胎牛血清(FCS,Lot 42Q0154K,Cat.No.10270-106)的不含WH-4-023的pEPSCM培养基替换培养基。为了注射,用0.05%胰蛋白酶-EDTA(GE Healthcare,Cat.No.L11-003)从培养皿分离EPSC,小心地重新悬浮并铺于500μl补充有50μg/ml维生素C(Sigma,Cat.No.49752)、0.1μMCHIR99021(GSK3i,TOCRIS,Cat.No.4423)、20ng/ml人类重组活化素A(StemCellTechnologies,Cat.No.78001)、10ng/ml bFGF(SCI)、10ng/ml Lif(SCI)、5ng/ml肝素和5μMY27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)的M15培养基液滴中。洗涤一次猪胚胎,然后铺于500μl补充有20ng/ml人类重组活化素A(StemCell Technologies,Cat.No.78001)、10ng/mlbFGF(SCI)、5μM Y27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)和10%FBS(Lot42Q0154K,Cat.No.10270-106)的Opti-I(1x)+Gluta mMAXTM-I减血清培养基(Cat.No.51985026)液滴中。在配备有显微注射系统(Transferman and CellTramVario micromanipulators,Eppendorf)的相衬倒置显微镜(Axiovert 35M,Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)下将注射液滴铺于注射板上,并用矿物油覆盖。在猪桑葚胚卵裂球之间注射含有约6-8个细胞的干细胞团块。此后,将胚胎在补充有50μg/ml维生素C(Sigma-Aldrich,Cat.No.49752)、0.1μM CHIR99021(GSK3i,TOCRIS,Cat.No.4423)、20ng/ml人类重组活化素A(StemCell Technologies,Cat.No.78001)、10ng/ml bFGF(SCI)、10ng/ml Lif(SCI),5ng/ml肝素和5μM Y27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)的M15培养基中洗涤两次,并孵育4小时直至胚胎移植或培养过夜,然后固定用于共聚焦显微镜分析。
6.13体外培养的猪囊胚中嵌合性的评价
猪嵌合囊胚在室温下在3.7%甲醛溶液(Honeywell Riedel-deCat.No.1635)中固定15分钟。此后,将胚胎与0.2μM SiR-DNA(Spirochrome,Switzerland)在37℃下孵育30min以使核可视化。使用共聚焦筛选显微镜(LSM 510,Zeiss)分析囊胚中猪干细胞的定位和增殖。将剩余的胚胎在4℃下保存于补充有0.5%FBS(Lot42Q0154K,Cat.No.10270-106)和1%青霉素/链霉素溶液(Corning,Cat.No.PS-B)的DPBS中,用于将来分析。
6.14冷冻切片和免疫荧光染色
从妊娠母猪身上解剖出第25-27天的猪胎并沿头尾轴切成两半。第一半胎在4℃下在4%多聚甲醛(Sigma,Cat.No.P6148)中固定过夜,随后转移到30%蔗糖溶液(Sigma,Cat.No.0389)中用于低温保存。第二半进行FACS和基因分型分析。将固定的半胎包埋在OCT化合物(CellPath,Cat.No.15212776)中并在干冰上冷冻。在Leica低温恒温器上切割切片(10μm厚)。切片用0.1%Triton-100(Sigma,Cat.No.T8787)透化30分钟,然后用5%驴血清(Sigma,Cat.No.D9663)和1%BSA(Sigma,Cat.No.A2153)封闭30分钟。进行mCherry和其他抗体的共免疫荧光以检查注射的表达mCherry的供体猪EPSC和宿主谱系标记的共定位。为了PGCLC EB冷冻切片的免疫荧光染色,将EB在4%PFA中固定约4小时或在4℃下过夜,并包埋在OCT化合物中用于冷冻切片。每个切片的厚度为10μm。切片首先用0.1%Triton透化,并用5%驴血清加1%BSA封闭,然后用一抗在室温下孵育1-2小时或在冷室中过夜。使用荧光缀合的二抗在室温下孵育载玻片1小时。抗体处理后,样品用10μg/ml DAPI(Thermo FisherScientific,Cat.No.62248)复染10分钟以标记核,并在荧光显微镜下观察。抗体列于补充表9中。
6.15用于PGCLC的解剖猪嵌合体组织和EB的流式细胞术
为了分析供体mCherry+猪EPSC在第25-27天嵌合体中的贡献,将半胎解剖成代表几个身体部位(头、躯干和尾)的小块。解剖的组织和胎盘用1.0mg/ml胶原酶IV(ThermoFisher Scientific,Cat.No.17104019)在振荡器上37℃下消化1-3小时。使用移液管吹打组织块并将它们解离成单个细胞。解离的细胞用35μm尼龙网(Corning,Cat.No.352235)过滤以去除组织团块。离心后,根据制造商手册(BD Cytofix,Cat.No.554655)使用固定培养基固定细胞,并在用流式细胞术分析前将洗涤后的细胞在4℃下保存于补充有0.1%NaN3(Sigma,Cat.No.199931)和5%FBS(Gibco,Cat.No.10270)的PBS中。所有样品均使用BD LSRFortessa血细胞计数器进行分析。使用561nm(610/20带通滤波器)和488nm(525/50带通滤波器)通道检测mCherry并排除自发荧光。PGC EB用0.25%胰蛋白酶/EDTA Gibco,Cat.No.25500-054)在37℃下消化15分钟,并用PerCP-Cy5.5缀合的抗TNAP抗体染色。使用561nm(610/20带通滤波器)和488nm(525/50带通滤波器)通道检测NANOS3-H2BmCherry+/TNAP+细胞。通过Flowjo软件分析FACS数据。这些实验中使用的抗体列于补充表9中。
6.16猪嵌合体胚胎的基因分型
使用DNA Releasy试剂盒(Anachem,Cat.No.LS02)从如上所述解剖的身体部位和为FACS制备的胎盘的解离细胞中提取猪胎的基因组DNA。采用H2BmCherry的基因组DNA PCR以检测供体细胞的存在。猪PRDM1基因座中一个区域的扩增充当基因组DNA质量和PCR对照。所有PCR引物列于补充表10中。
6.17猪EPSC向PGCLC的分化
为转录因子介导的猪PGCLC诱导实验,将基于piggyBac的PB-TRE-NANOG、PB-TRE-BLIMP1、PB-TRE-TFAP2C和PB-CAG-SOX17-GR表达构建体与PB-CAGG-rtTA-IRES-Puromycin和转座酶表达质粒共电穿孔到猪NANOS3-2A-H2BmCherry报告物EPSCsemb(系K3,雄性)。通过添加0.3μg/ml嘌呤霉素(Sigma,Cat.No.P8833)两天来选择携带pEPSCEmb的质粒。此后,用1.0μg/ml Dox(Sigma,Cat.No.D9891)诱导转基因NANOG、BLIMP1和TFAP2C指定周期。由于SOX17表达质粒具有潮霉素选择盒,使用150μg/ml潮霉素(Gibco,Cat.No.10687010)选择PB-CAG-SOX17-GR转染的细胞。SOX17蛋白与GR(人类糖皮质激素受体配体结合域)融合。该系统允许通过添加2μg/ml地塞米松(Dex)(Sigma,Cat.No.D2915)诱导SOX17的核易位。为了预诱导,通过0.1%2型胶原酶(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17101015)使pEPSCEmb从STO饲养层分离但不解离,并在胶化板上接种在补充有5μM ROCKi Y-27632(Tocris,Cat.No.1254)、20μg/ml ACTIVIN A(SCI)和1.0μg/ml Dox或1.0mg/ml Dex的M15培养基中。诱导和预分化12小时后,使用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Cat.No.25500-054)收集细胞并在100ml PGCLC培养基中以5,000-6,000个细胞/孔的密度铺到超低粘度U底96孔板(Corning,Cat.No.7007)。3-4天后,收集EB进行分析。PGCLC培养基由改良型RPMI 1640(GIBCO,Cat.No.12633-12)、1%B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044)、1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050)、1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016)、0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250)和以下细胞因子:500ng/ml BMP2(SCI)、10ng/ml人类LIF(SCI)、100ng/ml SCF(R&D,Cat.No.255-SC-010)、50ng/ml EGF(R&D,Cat.No.236-EG-200)和10μM ROCK抑制剂(Y-27632,Tocris,Cat.No.1254)组成。
对于人类PGCLC,用序列诱导方法测试了两个hEPSC谱系的PGC分化潜能[6]。首先在pre-ME培养基(补充有100ng/ml活化素A(SCI)、3μM CHIR99021和10μM ROCKi Y-27632的高级RPMI 1640培养基、1%B27补充剂、1×NEAA和1×谷氨酰胺青霉素-链霉素)中诱导人类前中胚层(pre-ME)12小时。使Pre-ME胰蛋白酶化为单个细胞并在100μl PGCLC培养基中以4,000-5,000个细胞/孔接种到Corning Costar超低粘附多孔96孔板(Corning,Cat.No.7007)中,用于猪PGCLC诱导。为了改善细胞聚集,在所有PGCLC诱导实验中,在基础培养基中添加了0.25%(v/v)聚乙烯醇(Sigma,Cat.No.341584)。
6.18猪和人类EPSC的畸胎瘤
将猪和人类EPSC在补充有30%基底膜(Corning,Cat.No.354230)和5μM Rock抑制剂Y-27632(Tocris,Cat.No.1254)的PBS中重新悬浮。将5×106猪或人类EPSC皮下注射到8周龄雄性NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1 Wjl/SzJ,杰克逊实验室)的两侧背侧上(每次注射100ul)。人类和猪EPSC在8和10周内形成可见的畸胎瘤。当畸胎瘤的大小达到1.2cm2时,将它们解剖,在10%磷酸盐缓冲的福尔马林中固定过夜,并在切片前包埋在石蜡中。
6.19猪和人类EPSC的EB形成分析
使猪和人类EPSC胰蛋白酶化并以4×106个细胞/孔的密度接种在凝胶化的6孔板中用于预分化。使用补充有20ng/ml活化素A(SCI)和5μM Rock抑制剂Y-27632的M15培养基培养重新铺板的细胞。第二天,使用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Cat.No.25500-054)分离细胞,并在200μl M10培养基中以5,000-6,000个细胞/孔的密度铺到超低粘度U底96孔板(Corning,Cat.No.7007)。生长7~8天后,收集EB进行分析。在培养基中加入0.25%(v/v)聚乙烯醇(Sigma,Cat.No.341584)以帮助细胞聚集。
6.20猪和人类EPSC的转染
需要在pEPSC转染之前预先准备没有SRC抑制剂WH-4-023的pEPSCM(pEPSCM-SRCi)。一旦pEPSC达到40-50%汇合,将培养基切换为pEPSCM-SRCi并将细胞再培养一天(第-2天)。第二天(第-1天),将5%FBS添加到pEPSCM-SRCi培养基中,并将细胞培养过夜。在转染日(第0天),用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Cat.No.25500-054)使猪EPSC胰蛋白酶化,并用M10培养基解离成单个细胞。离心后,将1~1.5x106细胞在含有5-6μg质粒DNA的100μl Opti-MEM(Gibco,Cat.No.31985062)中重新悬浮。使用Amaxa Nucleofector机器(Lonza)用程序A-023进行电穿孔。转染后,将一半的转染细胞接种在10cm皿中的抗药性STO饲养者上,并使用补充有5μM ROCKi Y-27632(Tocris,Cat.No.1254)和5%FBS的pEPSCM来培养转染细胞。Y-27632和FBS在第1天从培养基中去除。从第2天起将药物添加到pEPSCM培养基中以选择转染的集落。用于选择的药物浓度为:嘌呤霉素(0.3μ/ml,Sigma,Cat.No.P8833);G418(150μg/ml,Gibco,Cat.No.10131027);潮霉素(150μg/ml,Gibco,Cat.No.10687010)。选择3天后(第5天),将培养基更换为补充有药物的pEPSCM-SRCi用于连续选择。在第7-8天挑取存活的集落。在转染和选择过程中,培养基应每天更新。为了人类EPSC转染,在第二天使用0.05%胰蛋白酶-EDTA收集前,将10%KSR和5%FBS添加到hEPSCM中以培养hEPSC(70%-80%汇合)过夜。也使用M10培养基解离细胞和中和胰蛋白酶。一旦离心,使用300-400μl含有质粒DNA的PBS溶液以1000万个细胞/ml的密度重新悬浮细胞。取出300-400μl细胞/DNA混合物并添加到0.4cm的电穿孔比色皿中进行电穿孔(Gene PulserXcell System;Bio-Rad;320V,500μF,0.4-cm cuvettes)。将5×105转染细胞铺在10cm皿中的抗药性STO饲养者上,该皿含有补充有5μM ROCKi Y-27632(Tocris,Cat.No.1254)和10%KSR的hEPSCM。从第1天起从培养物中去除Y-27632和KSR,并从第2天起添加嘌呤霉素进行选择。在第7-8天左右挑取集落。遵循上述方法扩增选定的猪和人类EPSC集落。
6.21猪和人类EPSC细胞中Crispr/Cas9介导的基因组编辑
为了将EF1a-H2BmCherry-iRES-Puro盒靶向猪ROSA26基因座,构建了具有两侧为Rosa5’和3’同源臂的盒的靶向载体。5’和3’同源臂由IDT公司合成(650-bp 5’臂,Chr13:65756272-65756923;648-bp 3’臂,Chr13:65755620-65756267)。将序列5’CAATGCTAGTGCAGCCCTCATGG-3’设计为gRNA/CAS9的靶标。电穿孔后,使用嘌呤霉素(0.3μ/ml,Sigma,Cat.No.P8833)选择靶向的细胞。挑取的集落的基因分型分析揭示靶向效率约为25%-30%。为了调查pPGCLC从pEPSC的分化,将T2A-H2BmCherry表达盒直接敲入下游并与猪NANOS3的编码序列同框。同源臂也由IDT公司合成(699-bp 5’臂,chr2:65275456-65276148;699bp-3’臂,chr2:65274749-65275447)。通过gRNA/CAS9来靶向终止密码子前的20bp(5’-TCCACTTCTGCCTAAGAGGCTGG-3’)的序列以引入切割并介导同源重组。在用G418(150μg/ml,Gibco,Cat.No.10131027)选择后,从挑取的集落提取基因组DNA并进行基因分型PCR,揭示了靶向效率相当,为约25%–30%。对正确靶向的克隆进行核型分析以确认所用克隆的正常核型。采用相同的策略来制造人类OCT4-T2A-H2B-Venus和CDX2-T2A-H2B-Venus报告物EPSC谱系。对于人类OCT4基因座,同源臂是619-bp 5’臂(chr6:31164604-31165222)和636-bp 3’臂(chr6:31163965-31164600)。gRNA/CAS9靶向序列是5’TCTCCCATGCATTCAAACTGAGG-3’。CDX2同源臂是478-bp 5’臂(chr13:27963118-27963595)和557-bp 3’臂(chr13:27962558-27963114)。gRNA/CAS9靶向序列是5’-CCGTCACCCAGTGACCCACCGGG-3’。对于每次电穿孔,使用约5μg质粒DNA:1.5μg CAS9、1.5μggRNA和2μg供体载体。
6.22萤光素酶测定
为了TOPflash测定,用10μg TOPflash质粒转染2.0×106细胞。也转染了5μg pRL-TK(Renilla)载体用于标准化。将细胞以1:9分开至24孔板在具有或没有XAV939(WNTi,2.5μM,Cat.No.X3004)的pEPSCM和hEPSCM中48小时。收集细胞裂解物用于萤光素酶测定。为了确定猪EPSC中Oct4表达的调节模式,将10μg报告物构建体电穿孔到1.5×106pEPSC和5μgpRL-TK。48小时后进行分析。所有萤光素酶测定使用Dual-Glo萤光素酶测定系统(Promega,Cat.No.E2920)进行。
6.23定量实时PCR分析。
使用用于培养的细胞的RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Cat.No.74106)或用于分选的NANOS3-mCherry+细胞的RNeasy Micro试剂盒(Qiagen,Cat.No.74034)分离总RNA。随后对RNA进行定量并经gDNA WipeOut处理以去除基因组DNA。使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen,Cat.No.205311)制备互补DNA(cDNA)。RT-qPCR引物或TaqMan基因表达测定(LifeTechnologies)列于补充表10和11中。ABsolute Blue qPCR ROX Mix(ABgene,Cat.No.AB4138B)用于基于探针的qPCR分析以及SYBR Green ROX qPCR Mastermix(Qiagen,Cat.No.330523)用于基于引物的qPCR分析。所有qPCR反应均在ABI 7900HT序列检测系统(Life Technologies)上进行。有关用于qPCR分析的所有引物和探针的信息在补充表10和11中提供。使用ΔCt方法确定相对于GAPDH的基因表达。数据显示为平均值和标准差。
6.24DMR分析
根据制造商的建议,使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(Qiagen,Cat.No.59124)进行亚硫酸氢盐处理。使用之前描述的引物对来对人类ELF5和猪OCT4和NANOG启动子区域进行基因组DNA PCR[7-9]。将PCR产物克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega,Cat.No.A1360)并从两末端测序。用每个启动子的M13正向和M13反向引物对随机选择的克隆进行测序。该分析中使用的引物在补充表10中提供。
6.25培养细胞的免疫染色
为了用TFAP2C和GATA3对KRT7进行双重染色,分化的hEPSC在4%多聚甲醛(Sigma,Cat.No.P6148)溶液中固定,用3%山羊血清和1%BSA封闭,并在与小鼠抗KRT7抗体在4℃下孵育过夜。然后细胞经PBS溶液冲洗,与Alexa 488缀合的山羊抗小鼠IgG二抗(Abcam,Cat.No.AB150109)在室温下孵育1小时。用PBST(含0.3%Triton的PBS溶液)透化后,将细胞与兔抗TFAP2C和GATA3抗体在4℃下孵育过夜。第三天,细胞经PBST冲洗,与Alexa594缀合的山羊抗兔IgG(Invitrogen,Cat.No.A21207)在室温下孵育1小时,并用DAPI复染。为了分化的猪和人类EPSC中的Tuj1、α-SMA、AFP和KRT7免疫染色,将细胞固定并分别与小鼠抗TUJ1、α-SMA、AFP和KRT7抗体在4℃下孵育过夜。细胞经PBS溶液冲洗,并与Alexa 488缀合的山羊抗小鼠IgG(Abcam,Cat.No.AB150109)和594山羊抗小鼠IgG(Invitrogen,Cat.No.A21207)孵育。抗体处理后,样品经10μg/ml DAPI(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.62248)染色以标记核。对于猪和人类多能性标记物免疫染色,猪和人类EPSC在4%PFA/PBS溶液中固定,在含3%山羊血清(Sigma,Cat.No.G9023-10ML)和1%BSA(Sigma,Cat.No.A2153)的PBS溶液(用于细胞表面标记物)或者含3%山羊血清、1%BSA和0.1%Triton(Sigam,Cat.No.T8787)的PBS溶液(用于细胞内标记物)中封闭,与细胞表面抗体SSEA-1、SSEA-4、Tra-1–60、Tra-1–81或细胞内抗体OCT4、NANOG和SOX2在4℃下孵育过夜。冲洗细胞并与Alexa488或594缀合的山羊抗小鼠IgG、小鼠IgM、兔IgG孵育并用DAPI复染。这些实验中使用的抗体在补充表9中提供。
6.26Western印迹
全细胞提取物是由在裂解缓冲液中经指定处理的细胞制备的,该裂解缓冲液由50mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.15M NaCl、0.1%SDS、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠和完全微型无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science,Cat.No.11836170001)组成。当培养物达到70-80%汇合时,从同一批培养物中收集用于实验的细胞。包括了生物学重复以允许有意义的结论。10μg蛋白质用于电泳并转移到硝酸纤维素膜上。用5%牛奶封闭膜并用抗体处理。使用小鼠或兔抗AXIN1、SMAD2/3、p-SMAD2/3和ALPHA-TUBULIN的一抗。加入针对兔或小鼠IgG的辣根过氧化物酶缀合的二抗。抗体处理后,使用ECL Western印迹检测系统(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.32106)使印迹显影。这些实验中使用的抗体在补充表9中提供。
6.27人类ESC/iPSC向EPSC的转化
为了转化致敏的人类ESC系,将5×104个胰蛋白酶化的单个细胞接种在10cm的STO饲养板上,补充有5μM ROCK抑制剂Y-27632(Tocris,Cat.No.1254)的含bFGF的标准培养基中。标准人类ESC培养基:DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020)、20%敲除血清替换物(KSR)(Gibco,Cat.No.10828028)、1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo FisherScientific,Cat.No.11140-050)、1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),以及0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250)和10ng/ml bFGF(SCI)。一天后,将培养基切换为hEPSCM,然后每天更新。大多数细胞初始分化后,约5-6天出现圆顶形hEPSC集落,使用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Cat.No.25500-054)处理3-5分钟,该集落可以以5×104个细胞/10cm皿的密度在STO饲养层上大量扩增。5-6天后,可以遵循上述方法挑取和扩增稳定的圆顶形单集落。
6.28将人类成纤维细胞重编程为EPSC
用M20培养基来培养人类成年成纤维细胞GM00013。用0.25%胰蛋白酶/EDTA从约80%汇合的T75烧瓶中收集细胞,并用PBS溶液洗涤一次。根据制造商的方案(NHDF试剂盒,Cat.No.VPD-1001),使用Amaxa Nucleofector机器(Lonza)进行转染。5.0μg的DNA被预混合在100μl转染缓冲液中。DNA混合物由2.0μg PB-TRE-hOCKS、1.0μg PB-TRE-RL、1.0μg PB-EF1a-转染酶和1.0μg PB-EF1a-rtTA组成。其中,hOCKS是用人类OCT4、cMYC、KLF4和SOX2的cDNA通过2A肽连接而成。将1×106个洗净的人类成年成纤维细胞重新悬浮在100μl溶液/DNA混合物中,用U-20程序进行电穿孔。将0.2×106个转染的细胞接种在补充有维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G)的M15培养基中的STO饲养者层(10cm盘)上。在培养基中加入Dox(Sigma,Cat.No.D9891)使最终浓度为1.0μg/ml来诱导重编程因子表达。诱导12-14天后,去除Dox,将培养基切换到hEPSCM,以选择非Dox依赖型人类iPSC集落。存活的菌落在约第21天时被挑取到hEPSCM,并扩增为稳定的iEPSC谱系。
6.29人类EPSC向滋养层细胞谱系的分化
用0.25%胰蛋白酶/EDTA解离hEPSC,并以0.1×106个细胞/孔的密度接种在糊化的6孔板中。细胞在补充有5μM ROCK抑制剂Y-27632的20%KSR培养基中培养1天。20%KSR培养基:DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020)、20%敲出血清替代物(KSR)(Gibco,Cat.No.10828-028)、1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050)、1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016)和0.1mM2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250)。从第二天开始,将TGFβ抑制剂SB431542(10μM,Tocris,Cat.No.1514)、BMP4(50ng/ml,R&D,Cat.No.5020-BP)和FGF受体抑制剂PD173074(0.1μM,Tocris,Cat.No.3044)的不同组合加入20%KSR培养基中以开始滋养层细胞分化。在指定的时间点收集细胞进行分析。
6.30从EPSC衍生出稳定的TSC细胞系
将单一分离的hEPSC和pEPSCEmb以每孔2,000个细胞的密度铺在预涂有1mg/ml ColIV(Corning,Cat.No.354233)的6孔板上,如所述[10]加稍作修改,在hTSC培养基中培养。hTCS培养基:补充有0.1m M2-巯基乙醇的DMEM/F12(Gibco,Cat.No.21331-020)、0.2%FBS(Gibco,Cat.No.10270)、0.5%青霉素-链霉素、0.3%BSA(Gibco,Cat.No.15260037)、1%ITSX补充剂(Gibco,Cat.No.51500056)、50μg/ml Vc(Sigma,Cat.49752-100G)、50ng/mlEGF(R&D,Cat.No.236-EG-200)、2μM CHIR99021(GSK3i,TOCRIS,Cat.No.4423)、0.5μM A83-01(TOCRIS,Cat.No.2939)、1μM SB431542(Tocris,Cat.No.1514)、0.8μM VPA(STEMCELL,Cat.No.72292)和5μM Y27632(Tocris,Cat.No.1254)。培养约7-9天后,挑取有TSC样形态的集落,在TrypLE(Gibco,Cat.No.12605036)中解离,并在预涂有1mg/ml Col IV的板上重铺板。4-5个传代后,使用所述方法收集细胞进行合体滋养层细胞(ST)和绒毛外滋养层细胞(EVT)的分化试验[10]。
6.31猪TSC胚胎注射
两个转染了H2BmCherry(EF1a-H2BmCherry和CAGG-H2BmCherry)的猪TSC系(pK3-TSC-#1和pK3-TSC-#3)用于胚胎注射实验。用TrypLE(Gibco,Cat.No.12605036)短暂处理传代20次的细胞,从培养皿中轻轻拍出,并重新悬浮在人类TSC培养基中。离心后,将TSC重新悬浮在TL-Hepes 296无钙培养基中,其中无钙培养基由114mM氯化钠(NaCl,Sigma-Aldrich,Cat.No.S5886)、3.2mM氯化钾(KCl,Sigma-Aldrich,Cat.No.P-5405)、0.4mM磷酸二氢钠单水合物(NaH2PO4 x H2O,Merck,Cat.No.106346)、0.5mM六水氯化镁(MgCl2 x6H2O,Roth,Cat.No.HN03.2)、2mM碳酸氢钠(NaHCO3,Sigma-Aldrich,Cat.No.S4019)、10mMHEPES(Roth,Cat.No.9105.3)、10mM DL-乳酸钠溶液(60%)(Sigma-Aldrich,Cat.No.L1375)、100U/L青霉素G钾盐BioChemica(AppliChem,Cat.No.A1837)、50mg/L硫酸链霉素BioChemica(AppliChem,Cat.No.A1852)、0.25mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich,Cat.No.P2256)、32mM蔗糖(Merck,Cat.No.107653)、0.4%牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich,Cat.No.A9647)和10μM Y27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)。此后,借助补充有10%FBS(Lot 42Q0154K,Cat.No.10270-106)和10μM Y27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)的I(1x)+Gluta mMAXTM-I还原型血清培养基(Cat.No.51985-026)中的压电显微操作器(Zeiss,Eppendorf),将8-10个单个TSC注射到第6天大的猪孤雌生殖或IVF胚胎中。注射后,将胚胎洗涤两次,并在补充有1000U/ml重组小鼠LIF蛋白(Millipore,Cat.No.ESG1107)和10μM Y27632(ROCKi,Tocris,Cat.No.1254)的D15培养基中,在39℃,5%CO2和5%O2中培养1-2天。此后,用3.8%的多聚甲醛在室温下固定胚胎15分钟,并且将胚胎存储在4℃的补充有0.5%FBS(Lot 42Q0154K,Cat.No.10270-106)和1%青霉素/链霉素溶液(Corning,Cat.No.PS-B)的DPBS中。
6.32注入TSC的猪孤雌生殖胚胎的免疫荧光染色
固定的孤雌生殖囊胚在补充有0.5%FCS(Lot 42Q0154K,Cat.No.10270-106)的DPBS(Sigma,Cat.No.D5652-10X1L)中洗涤三次,在补充有0.5%X-100(Merck,Cat.No.108603)和0.5%FCS的DPBS中透化1小时。此后,用DPBS洗涤胚胎三次,并在室温下用阻断液(共染色GATA3/CDX2/mCherry:5%马血清(Sigma,Lot 14M175,Cat.No.H1270)和0.2%X-100在PBS中阻断1小时。阻断后,将胚胎与稀释在DPBS和0.5%FCS中的一抗在4℃下孵育过夜。第二天,将胚胎转移到补充有0.5%马血清的DPBS中进行多次洗涤,以获得GATA3/CDX2/mCherry。二抗(mCherry:驴抗兔IgG(H+L)Alexa FluorPlus 555,A32794,Invitrogen。GATA3/CDX2:驴抗羊IgG(H+L)Alexa Fluor Plus 488,A32814,Invitrogen)在补充有0.5%马血清的PBS中以1:1000稀释,在室温下孵育1小时,然后如上所述进行洗涤。为了使核可视化,将胚胎在SiR-Hoechst(Spirochrome,SiR-DNA试剂盒,Cat.No.SC007)中以1:500稀释度在DPBS中在37℃下孵育1小时,并立即使用共聚焦成像系统LSM510(Carl Zeiss MicroImaging GmbH,Germany)检查。
6.33猪和人类TSC病变测定
用TrypLE(Gibco,Cat.No.12605036)解离猪和人类TS细胞,并将其重新悬浮在补充有30%人工基底膜(Corning,Cat.No.354230)和10μM Rock抑制剂Y-27632(Tocris,Cat.No.1254)的PBS中。将5×106个猪或人类TSC皮下注射到8周龄雄性SCID小鼠的两侧背侧上(每次注射100ul)。人类和猪的TSC在7-10天内形成可见病变。剖开病变,在4%磷酸盐缓冲福尔马林中固定过夜,用OCT化合物(CellPath,Cat.No.15212776)和石蜡包埋进行切片。
6.34ELISA
人类VEGF、PlGF、sFlt-1、CGA和sEng的酶连接免疫吸附测定试剂盒来自R&DSystems,人类绒毛膜促性腺激素ELISA测定试剂盒来自ALPCO Diagnostics,并按照制造商的规范进行检测。
6.35EPSC和hTSC中全局基因表达的RNA-序列分析
用于制备RNA的细胞是在培养物达到70-80%汇合时从同一批培养物中收集的。包括了生物复制以得到有意义的结论。对于人类数据,使用GENCODE v27的蛋白编码转录本,并从参考文献中删除了PAR_Y区域的转录本;对于小鼠数据,使用GENCODE vM16的蛋白编码转录本;对于猪的数据,使用Ensembl build Sscrofa11.1。从GENCODE或Ensembl下载转录本fasta文件,并将ERCC序列加入每个构建(build)中。然后使用salmon(0.9.1版)并使用默认参数对转录本加ERCC fasta文件进行索引[11]。当使用GENCODE转录本参考时,"--gencode"标志在索引过程中被包括在内,以确保salmon正确处理转录本id。对于人类初始和致敏ESC RNA-序列[12],fastq文件从ENA下载(Study accession PRJNA326944);对于人类胚胎单细胞数据,fastq文件从ENA下载(Study accession PRJEB8994)[13,14]。对于小鼠EPSC数据,使用了以前的研究[15]中的fastq文件。使用有标志‘--useVBOpt--numBootstraps 100--posBias--seqBias--gcBias-l ISR-g gene_map.tsv’的salmon(0.9.1版)将所有的读数都直接针对相应物种的转录组进行定量,其中gene_map.tsv是以制表符为界的文件,将转录本的id与基因的id进行映射,以获得基因水平表达值。从表达矩阵中提取不同类型的人类细胞和早期胚胎中每个所选择的组蛋白基因的表达水平,并以GraphPad Prism 7.04(https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)生成的热图进行可视化。基因表达值被线性转化为颜色(如每个矩阵下面的颜色图例所表明),其中蓝色代表基因低表达,红色代表基因高表达,没有颜色相当于表达的最高水平的基因。对于单细胞RNA-序列,增加了一个额外的质量控制步骤,在下游分析之前,总读数少于10,000,或检测到的基因少于4,000(至少1个读数),或超过80%的读数映射到ERCC或超过60%的不可映射读数的细胞被删除。
6.36批量校正、主要组分分析(PCA)和跨物种比较
将每个样品的基因计数收集在一起,并进行log10转换。然后用NaiveDE软件包(https://github.com/Teichlab/NaiveDE/tree/master/NaiveDE)中的"regress_out"函数将批次效应(batche effect)(这里的批次(batches)指不同的研究)和测序深度(每个样品的总读数)回归出来。使用scikit-learn(Scikit-learn:Machine Learning in Python,Pedregosa et al.,JMLR 12,pp.2825-2830,2011.)对回归的矩阵进行主要组分分析。为了进行跨物种比较,只使用了一对一的直系同源基因。
6.37人类EPSC分化为滋养层细胞的RNA-序列分析
基因表达矩阵:参考指数是根据GENCODE数据库中的hg38创建的[16]。H1-ESC、H1-EPSC、hiPSC-EPSC、PHTu和PHTd的基因表达矩阵用Salmon[11]生成,参数如下:salmonquant--noversion-check-q-p 6--useVBOpt--numBootstraps 100--posBias--seqBias--gcBias。t-SNE(t分布的随机邻接嵌入)分析。R软件包'Rtsne'被用于基因表达矩阵的降维(最大TPM<=1的基因被过滤掉),相应的结果用自定义的R脚本进行可视化。皮尔逊相关:参考组织的RNA-序列数据从Chang et al.的论文[17]下载,参考细胞(uESCs,uPHTs,dESCs,dPHTs)的数据从Yabe et al.的论文[18]下载。由Chang et al.定义的组织特异性基因列表(n=2293)被选作皮尔逊相关系数分析。在所提供的数据(H1-ESC,H1-EPSC和hiPSC-EPSC)和外部参考文献之间进行配对计算。结果以热图形式进行可视化,红色为高相似度,蓝色为低相似度。分析了37个滋养层细胞标记物基因的表达动态。从表达矩阵中提取每个标记物基因的表达水平,并使用以下方法进行标准化。特定基因的TPM除以该基因在一行中的最高表达水平(每个细胞系有12个数据点,H1-ESC、H1-EPSC和hiPSC-EPSC共有36个值)。通过这种方法,每个TPM被转化为0和1之间的值。使用从蓝色(低表达基因)到红色(高表达基因)的色键把整体基因特征绘制成热图。用于制备RNA的细胞是在培养物达到70-80%汇合时从同一批培养物中收集的。包括了生物复制以得到有意义的结论。
6.38人类TSC RNA序列的PCA分析
“Factoextra”R软件包用于PCA分析,“limma”R软件包用于去除批量效应。从TPM表达矩阵中去除所有样本中TPM值低于1的基因。
6.39单细胞RNA序列文库的构建
单细胞mRNA-序列文库是按照SMART-seq2所述的方案生成的。简言之,将单个猪和人类EPSC分选到预先填充有裂解缓冲液和外部RNA掺入(Ambion)(1:500,000)的96孔板中。然后进行第一链合成和模板转换,然后进行25个循环的预扩增。使用自动机器人工作站(Zephyr)通过AMPure XP磁珠(Agencourt)纯化互补DNA。使用高敏DNA芯片用生物分析仪(Agilent)检查cDNA的质量。使用Nextera XT文库制备试剂盒(Illumina)构建和扩增多重(96-plex)文库。然后将文库合并且用AMPure XP磁珠纯化。然后,在提交到Wellcome TrustSanger Institute的DNA测序管道之前,通过生物分析仪(Agilent)对文库的质量进行评估。双端75bp读数通过HiSeq2000测序仪生成。猪和人类scRNA序列数据可以从以下地址下载:
ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/teichmann/xi/xuefei_epsc/single_
cell_expr_mat rix
来自scRNA序列的所有基因的表达小提琴图:猪EPSC:
ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/teichmann/xi/xuefei_epsc/porcine_
sc_vplot/ind ex.html
人类EPSC:
ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/teichmann/xi/xuefei_epsc/human_sc_
vplot/inde x.html
6.40EPSC中组蛋白修饰谱的ChIP-序列分析
猪和人类EPSC的H3K4me3、H3K27me3、H3K27ac和输入的ChIP文库是根据Lee et al[20]修改的ChIP方案制备的。简言之,大约2000万个细胞在室温下用1%的甲醛交联10分钟。然后用0.125M甘氨酸在室温下淬灭交联5分钟。细胞颗粒用PBS洗涤,用液氮快速冷冻并储存在-80℃直到进一步处理。用Bioruptor Pico(Diagenode)对染色质进行5-7个循环的剪切:30秒开启和关闭循环。免疫沉淀是用1μg预洗的抗体在4℃下与蛋白ADynaebeads(Invitrogen,Cat.No.10002D)预连接过夜来进行的。抗体:H3K4me3,H3K27me3,H3K27ac列于补充表9中。然后清洗珠子,用洗脱缓冲液在65℃下反转交联4小时。免疫沉淀的DNA用蛋白酶K消化和Qiagen minElute PCR纯化试剂盒(Qiagen,Cat.No.28004)进行纯化。用microplex文库构建试剂盒(Diagenode,Cat.No.C05010014)按照制造商的指导制备多重测序文库。DNA被扩增11个循环,并使用高敏DNA试剂盒在生物分析仪(Ailgent)上检查文库的质量。使用KAPA文库定量试剂盒(KK4824)通过qPCR检查文库浓度,并将不同文库的等摩尔数汇合起来,在HiSeq2500的两个通道上进行测序。使用默认设置的bowtie2(2.3.4版)[21]将50个碱基对的单端读数映射到UCSC参考基因组上(猪为build susScr11,人类为hg38)。对于人类的参考hg38,在绘图前除去了所有的替代位点(chr*_alt)。映射到线粒体基因组的读数被除去,映射到核基因组的读数由samtools[22]过滤,其中标记"-q 30"过滤映射质量相对较低(MAPQ小于30)的读数。对于来自人类初始和致敏ESC的ChIP-序列数据[12],原始读数从ENA下载(Study accession PRJNA255308)并以同样的方式处理。使用MACS2(2.1.1.20160309)[23]进行峰值调用。对于识别猪样本中点状标记(H3K4me3和H3K27ac)的富集区域,使用‘-t chip.bam-c input.bam-g 2.7e9-q 0.01-f BAM--nomodel-extsize200-B--SPMR’标记进行峰值调用。为了识别广义标记(H3K27me3)的富集区域,用‘-tchip.bam-c input.bam-g 2.7e9-q 0.01-f BAM-nomodel--extsize 200-B--SPMR--broad’标记进行峰值调用。对于人类数据,峰值调用以同样的方式进行,其中在峰值调用期间基因组大小“-g hs”发生变化。使用脚本bdg2bw(https://gist.github.com/jl32587/34370c995460f9d5ad65)将得到的bedGraph文件转换为bigWig文件。使用UCSC基因组浏览器[24]对bigWig文件进行可视化。为了比较初始和致敏基因周围的H3K4me3信号,从Theunissen et al的补充表中下载了人类初始和致敏的ESC之间差异表达的基因列表[12]。基因按log2倍数变化排序,然后选择前1000个初始或致敏基因。使用HOMER(v4.9)[25]在这2000个基因的转录起始位点周围直接定量人类EPSC的H3K4me3信号。对于猪数据,首先从ensembl基因组浏览器中提取这2000个基因的一对一直系同源物[26],然后以与人类相同的方式定量猪H3K4me3信号。当培养物达到70-80%汇合时,从同一批培养物中收集用于组蛋白修饰谱的细胞。包括了生物复制以得到有意义的结论。
6.41全基因组DNA甲基化分析
DNA甲基化水平通过全基因组亚硫酸氢盐测序来测量[27]。纯化DNA(QiagenBlood DNA Extraction试剂盒),使用covaris超声仪进行超声处理。使用NEBNext UltraDNA文库制备试剂盒(NEB E7370)使用甲基化接头(NEB或Illumina)处理每个样品约500ngDNA。在最终PCR扩增之前,使用EZ DNA甲基化Gold试剂盒(Zymo)进行亚硫酸氢盐转化。使用Illumina MiSeq平台对文库进行测序以生成100bp配对末端读数。使用TrimGalore(v0.4.1,www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/,Cutadapt version 1.8.1,parameters:--paired)修剪原始序列读数以去除质量差的调用和适配器并使用Bismark v0.18.2(Krueger and Andrews,2011)向人类或猪基因组对齐。使用SeqMonk(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/)使用500CpG运行窗口和每个窗口100CpG的最小覆盖率定量数据。当培养物达到70-80%汇合时,从同一批培养物中收集该分析中的细胞。
6.42统计分析
没有使用统计方法来预先确定样本大小。实验不是随机的。研究人员在实验和结果评估期间对分配并非不知情。使用Microsoft Excel或Prism 7.04(GraphPad)进行统计分析。使用双尾学生t检测计算P值。
6.43数据可用性
测序数据被保藏到ArrayExpress,登录号为E-MTAB-7252(ChIP-seq)、E-MTAB-7253(批量RNA-序列)和E-MTAB-7254(单细胞RNA-序列)。人类细胞测序原始数据(包括ChIP-序列和批量/单细胞RNA-序列)文件可经由ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/ teichmann/xi/xuefei_epsc/human_fastq/获得;猪细胞测序原始数据(包括ChIP-序列和批量/单细胞RNA-序列)文件可经由ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/teichmann/xi/ xuefei_epsc/pig_fastq/获得。所有其他相关数据可向相应作者索取。
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对具体实施方案的上述描述将充分揭示本公开的一般性质,使其他人类能够通过应用相关技术的知识(包括引用和在此通过引用并入的文件内容),在不进行不当的实验,不违背本公开的一般概念的情况下,为各种应用轻易地调整和/或修改此类具体实施方案。基于本文提出的教导和指导,此类修改和调整旨在处于所公开实施方案的等价物的含义和范围内。应当理解的是,这里的措辞或术语是为了描述目的而不是限制,因此本说明书的术语或措辞应由本领域技术人员根据本文提出的教导和指导,结合相关领域技术人员的知识来解释。
尽管上文已经描述了本公开的各种实施方案,但应该理解,它们是以举例的方式提出的,而不是限制。对相关领域技术人员来说,对于相关领域的技术人员来说显而易见的是,在不脱离本公开的精神和范围的情况下,可以在形式和细节上进行各种改变。因此,本公开不应受上述任何示例性实施方案中的限制,而应仅根据所附权利要求及其等价物来定义。
Claims (29)
1.用于猪细胞的细胞培养基,其包含基础培养基,
SRC抑制剂,
维生素C补充剂,
LIF蛋白,和
活化素蛋白。
2.根据权利要求1的培养基,其中所述基础培养基是DMEM/F-12或DMEM。
3.根据权利要求1的培养基,其中所述SRC抑制剂是WH-4-023、XAV939、IWR-1、端锚聚合酶抑制剂或其组合。
4.根据权利要求1所述的培养基,其中所述培养基进一步包含N2补充剂、B27补充剂、谷氨酰胺青霉素-链霉素、NEAA、2-巯基乙醇、CHIR99021、FBS或其组合。
5.产生猪扩增潜能干细胞(EPSC)群的方法,其包括:
(i)提供猪多能细胞群,
(ii)在根据权利要求1的干细胞培养基中培养所述群。
6.用于人类细胞的细胞培养基,其包含基础培养基,所述基础培养基包含:
SRC抑制剂;
维生素C补充剂;和
LIF蛋白。
7.根据权利要求6的培养基,其中所述基础培养基是DMEM/F-12或DMEM。
8.根据权利要求6的培养基,其中所述SRC抑制剂是A-419259、XAV939或其组合。
9.根据权利要求6的培养基,其中所述培养基进一步包含N2补充剂、B27补充剂、谷氨酰胺青霉素-链霉素、NEAA、2-巯基乙醇、CHIR99021或其组合。
10.产生人类扩增潜能干细胞(EPSC)群的方法,其包括:
(i)提供人类多能细胞群,
(ii)在根据权利要求6的干细胞培养基中培养所述群。
11.用于人类细胞的细胞培养基,其包含基础培养基,所述基础培养基包含:
ITS-X 200;
维生素C补充剂;
牛白蛋白组分V;
微量元素B;
微量元素C;
还原型谷胱甘肽;
确定的脂质;
SRC抑制剂;
内IWR-1
SRK抑制剂;和
Chiron 99021。
12.根据权利要求11的培养基,其中所述基础培养基是DMEM/F-12或DMEM。
13.根据权利要求11的培养基,其中所述SRC抑制剂是XAV939。
14.根据权利要求11的培养基,其中所述SRK抑制剂是A419259。
15.根据权利要求11的培养基,其中所述培养基进一步包含神经基础培养基、青霉素-链霉素-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、N2、B27、人类Lif蛋白或其组合。
16.产生人类扩增潜能干细胞(EPSC)群的方法,其包括:
(i)提供人类多能细胞群,
(ii)在根据权利要求11的干细胞培养基中培养所述群。
17.用于猪细胞的细胞培养基,其包含基础培养基,所述基础培养基包含:
ITS-X;
维生素C补充剂;
牛白蛋白组分V;
微量元素B;
微量元素C;
还原型谷胱甘肽;
SRC抑制剂;
内IWR-1;
Chiron 99021;
人类Lif蛋白;和
活化素A。
18.根据权利要求17的培养基,其中所述基础培养基是DMEM/F-12或DMEM。
19.根据权利要求17的培养基,其中所述SRC抑制剂是XAV939、WH-4-023或其组合。
20.根据权利要求17的培养基,其中所述培养基进一步包含神经基础培养基、青霉素-链霉素-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、N2、B27或其组合。
21.产生猪扩增潜能干细胞(EPSC)群的方法,其包括:
(i)提供猪多能细胞群,
(ii)在根据权利要求17的干细胞培养基中培养所述群。
22.猪EPSC培养基,其包含:
DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020)或敲除DMEM(Gibco,Cat.No.10829-018),基础培养基,98%。
N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),范围从0.1到1%,优选在0.25到0.75%之间,甚至优选在0.4-0.6%之间。
B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),范围从0.1到2%,优选在0.5到1.5%之间,甚至优选在0.8-1.0%之间。
谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),基础补充剂,1%。
NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),基础补充剂,1%
2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250),基础补充剂,110μM。
CHIR99021(GSK3i,TOCRIS,Cat.No.4423),范围从0.05到0.5μM,优选在0.1到0.5μM之间,甚至优选在0.2到0.3μM之间;
WH-4-023(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.5413),范围从0.1到1.0μM,优选在0.2到0.8μM之间,甚至优选在0.3到0.5μM之间;
XAV939(Sigma,Cat.No.X3004),范围从1到10μM,优选在2到5μM之间,甚至优选在2.5到4.5μM之间;或IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),范围从1到10μM,优选在2到5μM之间,甚至优选在2.5到4.5μM之间;
维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),范围从10到100μg/ml,优选在20到80μg/ml之间,甚至优选在50到70μg/ml之间。
LIF(Stem Cell Institute,University of Cambridge.SCI),范围从1到20ng/ml,优选在5到15ng/ml之间,甚至优选在8到12ng/ml之间。
活化素(SCI),范围从10到50ng/ml,优选在15到30ng/ml之间,甚至优选在20到25ng/ml之间。
FBS(Gibco,Cat.No.10270),范围从0.1到0.5%,优选在0.2到0.4%之间,甚至优选在0.25-0.35%之间,和
ITS-X(thermos,51500056),范围从0.1到2%,优选在0.2到0.8%之间,甚至优选在0.4-0.6%之间。
23.人类EPSC培养基,其包含:
DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020)或敲除DMEM(Gibco,Cat.No.10829-018),基础培养基,98%。
N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),范围从0.1到1%,优选在0.25到0.75%之间,甚至优选在0.4-0.6%之间。
B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),范围从0.1到2%,优选在0.5到1.5%之间,甚至优选在0.8-1.0%之间
谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),基础补充剂,1%
NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),基础补充剂,1%
2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250),基础添加剂,110μM
CHIR99021(GSK3抑制剂,TOCRIS,Cat.No.3914),范围从0.2到2μM,优选在0.5到1.5μM之间,甚至优选在0.8到1.2μM之间。
A-419259(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.3914),范围从0.05到0.5μM,优选在0.1到0.5μM之间,甚至优选在0.15到0.3μM之间
XAV939(Sigma,Cat.No.X3004),范围从1到10μM,优选在2到5μM之间,甚至优选在2.5到4.5μM之间或IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),范围从1到10μM,优选在2到5μM之间,甚至优选在2.5到4.5μM之间;
维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),范围从10到100μg/ml,优选在20到80μg/ml之间,甚至优选在50到70μg/ml之间。
LIF(SCI),范围从1到20ng/ml,优选在5到15ng/ml之间,甚至优选在8到12ng/ml之间
24.人类EPSC培养基,其包含:
DMEM/F-12(Gibco,21331-020),48%
神经基础培养基(Life Technologies,21103-049),基础培养基,48%
青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco,10378016),基础补充剂,1%
NEAA(Gibco,11140050),1%
丙酮酸钠(gibco,11360070),1%
2-巯基乙醇(M6250 Aldrich,Sigma),基础补充剂,110μM
N2(Thermo 17502048),范围从0.1到1%,优选在0.25到0.75%之间,甚至优选在0.4-0.6%之间
B27(Thermo 17504044),范围从0.1到2%,优选在0.5到1.5%之间,甚至优选在0.8-1.0%之间
ITS-X(thermos,51500056),范围从0.1到1%,优选在0.25到0.75%之间,甚至优选在0.4-0.6%之间
维生素C(Sigma,49752-100G),范围从10到100μg/ml,优选在20到100μg/ml之间,甚至优选在50到70μg/ml之间
牛白蛋白组分V(7.5%溶液)(Thermo,15260037),范围从0.1%到1%,优选在0.2%到0.8%之间,甚至优选在0.4-0.6%之间
微量元素B(Corning,MT99175CI)基础补充剂,0.1%
微量元素C(Corning,MT99176CI)基础补充剂,0.1%
还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G),范围从1到20μg/ml,优选在1到10μg/ml之间,甚至优选在2到5μg/ml之间
确定的脂质(Invitrogen,11905031)基础补充剂,0.2%
XAV939(Sigma X3004),范围从1到10μM,优选在2到5μM之间,甚至优选在2.5到4.5μM之间
内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),范围从1到10μM,优选在2到5μM之间,甚至优选在2.5到4.5μM之间
A419259(Tocris Bioscience,3748),范围从0.05到0.5μM,优选在0.1到0.5μM之间,甚至优选在0.15到0.3μM之间
Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),范围从0.2到2μM,优选在0.5到1.5μM之间,甚至优选在0.8到1.2μM之间,和
人类Lif(Stem CellInstitute,University of Cambridge.SCI),范围从1到20ng/ml,优选在5到15ng/ml之间,甚至优选在8到12ng/ml之间
25.猪EPSC培养基,其包含:
DMEM/F-12(Gibco,21331-020),48%
神经基础培养基(Life Technologies,21103-049),48%
青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco,10378016),1%
NEAA(Gibco,11140050),1%
丙酮酸钠(gibco,11360070),1%
2-巯基乙醇(M6250 Aldrich,Sigma),基础补充剂,110μM
N2(Thermo 17502048),范围从0.1到1%,优选在0.25到0.75%之间,甚至优选在0.4-0.6%之间
B27(Thermo 17504044),范围从0.1到2%,优选在0.5到1.5%之间,甚至优选在0.8-1.0%之间
ITS-X(thermos,51500056),范围从0.1到1%,优选在0.25到0.75%之间,甚至优选在0.4-0.6%之间
维生素C(Sigma,49752-100G),范围从10到100μg/ml,在20到100μg/ml之间,在50到70μg/ml之间
牛白蛋白组分V(Thermo,15260037),范围从0.1%到1%,在0.2到0.8%之间,在0.4-0.6%之间
微量元素B(Corning,MT99175CI)基础补充剂,0.1%
微量元素C(Corning,MT99176CI)基础补充剂,0.1%
还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G),范围从1到20μg/ml,优选在1到10μg/ml之间,甚至优选在2到5μg/ml之间
XAV939(Sigma X3004),范围从1到10μM,优选在2到5μM之间,甚至优选在2.5到4.5μM之间
内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),范围从1到10μM,优选在1到5μM之间,甚至优选在1到2μM之间
WH-4-023(Tocris,Cat.No.5413),范围从0.1到1.0μM,在0.1到0.5μM之间,在0.1到0.2μM之间
Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),范围从0.05到0.5μM,优选在0.1到0.5μM之间,甚至优选在0.2到0.3μM之间
人类Lif(Stem CellInstitute,University of Cambridge.SCI),范围从1到20ng/ml,优选在5到15ng/ml之间,甚至优选在8到12ng/ml之间,和
活化素A(STEM CELL TECHNOLOGY,Catalog#78001.1),范围从10到50ng/ml,在15到30ng/ml之间,在20到25ng/ml之间
26.500ml猪EPSC培养基,其包含:
482.5ml DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020),
2.5ml N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),
5ml B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),
5ml 1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),
5ml 1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),
110μM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250),
0.2μM CHIR99021(GSK3i,TOCRIS,Cat.No.4423),
0.3μM WH-4-023(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.5413),
2.5μM XAV939(Sigma,Cat.No.X3004)或2.0μM IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),
50μg/ml维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),
10ng/ml LIF(Stem Cell Institute,University of Cambridge.SCI),
20ng/ml活化素(SCI),
1ml ITS-X 200×(thermos,51500056),和
0.3%FBS(Gibco,Cat.No.10270)。
27.500ml人类EPSC培养基,其包含:
482.5ml DMEM/F-12(Gibco,Cat.No.21331-020),
2.5ml N2补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17502048),
5ml B27补充剂(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.17504044),
5ml 1×谷氨酰胺青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.11140-050),
5ml 1×NEAA(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.10378-016),
110μM 2-巯基乙醇(Sigma,Cat.No.M6250),
1.0μM CHIR99021(GSK3抑制剂,TOCRIS,Cat.No.4423),
0.1μM A-419259(SRC抑制剂,TOCRIS,Cat.No.3914),
2.5μM XAV939(Sigma,Cat.No.X3004)或2.5μM IWR-1(TOCRIS,Cat.No.3532),
50μg/ml维生素C(Sigma,Cat.No.49752-100G),和
10ng/ml LIF(SCI)。
28.500ml人类EPSC培养基,其包含:
240ml F-12DMEM(Gibco,21331-020),
240ml神经基础培养基(Life Technologies,21103-049),
5ml青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100X)(Gibco,10378016),
5ml NEAA 100×(Gibco,11140050),
5ml丙酮酸钠100×(gibco,11360070),
110μM 2-巯基乙醇(M6250 Aldrich,Sigma),
2.5ml 200×N2(Thermo 17502048),
5ml 100×B27(Thermo 17504044),
2.5ml ITS-X 200×(thermos,51500056),
64ug/ml维生素C(Sigma,49752-100G),
3ml牛白蛋白组分V(7.5%溶液)(Thermo,15260037),
微量元素B,(Corning,MT99175CI)1000×
微量元素C,(Corning,MT99176CI)1000×
165ul还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G)10mg/ml,
确定的脂质,(Invitrogen,11905031)500×
2.5μM XAV939(Sigma X3004),
2.5μM内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),
0.1μM A419259(Tocris Bioscience,3748),
1.0μM Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),和
10ng/ml人类Lif。
29.500ml猪EPSC培养基,其包含:
240ml F-12DMEM(Gibco,21331-020),
240ml神经基础培养基(Life Technologies,21103-049),
5ml青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100X)(Gibco,10378016),
5ml NEAA 100×(Gibco,11140050),
5ml丙酮酸钠100×(gibco,11360070),
110μM 2-巯基乙醇(M6250 Aldrich,Sigma),
2.5ml 200×N2(Thermo 17502048),
5ml 100×B27(Thermo 17504044),
2.5ml ITS-X 200×(thermos,51500056),
64ug/ml维生素C(Sigma,49752-100G),
3ml牛白蛋白组分V(7.5%溶液)(Thermo,15260037),
微量元素B,(Corning,MT99175CI)1000×
微量元素C,(Corning,MT99176CI)1000×
165ul还原型谷胱甘肽(sigma,G6013-5G)10mg/ml,
2.5μM XAV939(Sigma X3004),
1μM内IWR-1(Tocris,Cat.No.3532),
0.16μM WH-4-023(Tocris,Cat.No.5413),
0.2μM Chiron 99021(Tocris Bioscience,4423),
10ng/ml人类Lif,和
20ng/ml活化素A(STEM CELL TECHNOLOGY,Catalog#78001.1)。
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