CN116064660A

CN116064660A - 绵羊诱导性多能干细胞及其制备方法

Info

Publication number: CN116064660A
Application number: CN202211006887.6A
Authority: CN
Inventors: 秦健; 杜荣; 赵迪鹏; 张昊; 刘澎涛
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2022-08-22
Filing date: 2022-08-22
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2042-08-22
Also published as: CN116064660B

Abstract

本发明公开了一种绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其是通过构建携带包括绵羊源转录因子OCT4、SOX2、KLF4、c‑MYC四因子串联、以及绵羊源转录因子NANOG和LIN28两因子串联的piggyBac转座子质粒，电穿孔转染至绵羊胎儿成纤维细胞中；挑选形态类似胚胎干细胞的克隆，再筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆进行传代培养、鉴定，得到绵羊诱导性多能干细胞。本发明首次使用绵羊自体转录因子制备绵羊诱导性多能干细胞，并优化了电穿孔条件，效率高、安全性强、分化潜能好，对探究绵羊体细胞重编程机制、干细胞定向分化机制、早期胚胎发育及细胞命运决定机制与制备克隆绵羊、特殊功能基因修饰绵羊和疾病模型等有着重大意义。

Description

绵羊诱导性多能干细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，更具体地，本发明涉及一种利用自体转录因子制备绵羊诱导性多能干细胞的方法及其制备得到的绵羊诱导性多能干细胞。

背景技术

2006年，Yamanaka等利用4个转录因子(OSKM)成功将小鼠体细胞重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。iPSCs具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)非常相似的特性，包括细胞形态、基因和蛋白表达模式、表观遗传修饰状态、增殖和分化能力、拟胚体和三层胚形成能力等方面，能够自我更新、无限增殖和多向分化。iPSCs克服了ESCs所涉及的获取来源、道德伦理和异体移植后免疫排斥等问题，在细胞治疗、药理和毒理学等领域展现出不可替代的优越性。

近年来，已相继构建出人和小鼠、猪、大鼠、羊、牛以及猕猴等动物的iPSCs细胞系，其中人和小鼠iPSCs的技术已相对成熟。绵羊作为一种主要的家畜，在生物医学和农业领域中都有着重要价值。虽然目前世界上已有几个实验室构建出了绵羊iPSCs，但都是应用了人和鼠等异源的干细胞转录因子进行诱导，重编程效率低、安全性低和阳性iPSCs克隆形成周期长仍是亟待解决的问题。

因此，克隆绵羊源自体转录因子并应用其将绵羊体细胞重编程为iPSCs，建立一种效率更高、安全性更强和分化潜能更好的诱导方法，不仅能为探究绵羊体细胞重编程机制和干细胞定向分化机制奠定基础，还能为特殊功能基因修饰绵羊的制备和疾病模型的构建提供优化方案。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其是利用绵羊源自体转录因子来制备绵羊诱导性多能干细胞，诱导效率更高、安全性更强、分化潜能更好。

实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：

一种绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)、构建携带转录因子的piggyBac转座子质粒；所述转录因子包括串联的绵羊源转录因子OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四因子、以及串联的绵羊源转录因子NANOG和LIN28两因子；

(2)、将步骤(1)构建得到的piggyBac转座子质粒，电穿孔转染至绵羊胎儿成纤维细胞中；

(3)、挑选形态类似胚胎干细胞的克隆，再筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆进行传代培养，得到绵羊诱导性多能干细胞。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述转录因子还包括串联的人源转录因子hRARG和hLRH1两因子、人源转录因子hTERT和猴肾病毒SV40 LT。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述电穿孔转染的程序为：电压180V～220V，电击1次～2次，持续时间18ms～22ms。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述电穿孔转染所使用的电转液为DMEM/F12，所述质粒piggyBac转座子质粒的浓度均为2.5μg/μL～3.5μg/μL。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，选择1～3代且细胞生长汇合度为70％～80％的绵羊胎儿成纤维细胞进行转染。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述绵羊源转录因子OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四因子是通过2A连接肽而实现串联的。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述绵羊源转录因子NANOG和LIN28两因子是通过2A连接肽而实现串联的。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述绵羊胎儿成纤维细胞的制备方法如下：采集妊娠30～45日龄的绵羊胎儿，快速剥取胎羊身体两侧的皮肤，并剁成0.1mm³～0.5mm³的组织碎块，离心后将沉淀均匀接种于明胶预处理的细胞培养皿，使用M10培养基培养细胞。

在其中一些实施例中，步骤(3)中所述符合胚胎干细胞特性的细胞克隆为同时表达OCT4、SOX2和NANOG基因的细胞克隆。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述传代培养包括步骤：将符合胚胎干细胞特性的细胞克隆按1:5～10比例传至已铺好的小鼠成纤维饲养层细胞上，使用M15培养基培养细胞。

在其中一些实施例中，所述小鼠成纤维饲养层细胞的制备方法包括如下步骤：使用M10培养基培养小鼠胚胎成纤维细胞，当细胞密度达到85～90％时，用0.008mg/mL～0.012mg/mL丝裂霉素C处理2.5～3个小时，弃去丝裂霉素C后，使用胰酶消化细胞，并接种于明胶预处理的细胞培养皿，使用M10培养基继续培养。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的绵羊诱导性多能干细胞。

在其中一些实施例中，所述绵羊诱导性多能干细胞中，OCT4、SOX2、NANOG、SALL4、ZFP42、TERF、PDRM1基因表达；表达干细胞多能性特异蛋白SOX2、OCT4、NANOG、SSEA4；以及拟胚体中三胚层特异基因和蛋白表达。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、在本发明中，以piggyBac转座子系统为载体，将包括6种绵羊源自体转录因子(串联的OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四因子，串联的NANOG、LIN28两因子)电穿孔转染至绵羊胎儿成纤维细胞，并优化了电穿孔的转染条件，使细胞存活率、转染效率、克隆数量及质量大大提升，最终重编程得到了绵羊诱导性多能干细胞，获得的绵羊iPSCs细胞形态清晰，生长状态稳定，碱性磷酸酶表达呈阳性，核型正常，实时荧光定量PCR和免疫细胞化学检测显示iPSCs能够表达干细胞多能性基因和特异蛋白，在体外能够分化形成拟胚体并表达三胚层特异基因和蛋白。经多次重复实验，该方法所建立的多株绵羊iPSCs系的生长特性和多能性鉴定均表现良好，体外传代目前已超过60代。

2、本发明使用绵羊自体转录因子(同源转录因子)制备绵羊诱导性多能干细胞，相比使用异体转录因子，诱导效率更高、安全性更强、分化潜能更好，对探究绵羊体细胞重编程机制、干细胞定向分化机制、早期胚胎发育及细胞命运决定机制与制备克隆绵羊、特殊功能基因修饰绵羊和疾病模型等有着重大意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中制备得到的绵羊胎儿成纤维细胞形态图(比例尺：200μm)。

图2为本发明实施例1中细胞克隆的形态图，其中，A为转染第6天，B为转染第10天(比例尺：200μm)。

图3为本发明实施例1中绵羊诱导性多能干细胞内源性核心多能性基因的mRNA表达水平。

图4为本发明实施例3中绵羊诱导性多能干细胞的碱性磷酸酶染色结果图(比例尺：200μm)。

图5为本发明实施例3中绵羊诱导性多能干细胞多能性基因SALL4、ZFP42、TERF、PDRM1的mRNA表达水平。

图6为本发明实施例3中绵羊诱导性多能干细胞的核型分析图。

图7为本发明实施例3中绵羊诱导性多能干细胞多能性特异蛋白SOX2、OCT4、NANOG、SSEA4的表达结果(比例尺：400μm)。

图8为本发明实施例3中绵羊诱导性多能干细胞形成的拟胚体图(比例尺：100μm)。

图9为本发明实施例3中绵羊诱导性多能干细胞分化后内胚层(SST)、中胚层(VIM、NANOS3、REN、MYF5)和外胚层(KRT8、NEUROD1、NES)特异基因mRNA的表达结果。

图10为本发明实施例3中绵羊诱导性多能干细胞分化后三胚层特异性蛋白的免疫荧光染色结果(比例尺：200μm)。

图11为本发明试验例1中电穿孔转染条件的优化前后对比结果(比例尺：200μm)。

图12为本发明试验例2中使用不同转录因子组合进行重编程后的绵羊干细胞克隆状态观察结果(比例尺：200μm)。

图13为本发明试验例2中使用不同转录因子组合进行重编程后的碱性磷酸酶染色结果(比例尺：200μm)。

图14为本发明试验例2中使用不同转录因子组合进行重编程后的内源性多能基因OCT4、SOX2和NANOG的mRNA表达量。

图15为本发明试验例2中使用各自独立(sOSKM(single))或串联的绵羊源四因子(sOSKM)进行重编程后的克隆样细胞数量比较。

图16为本发明试验例2中使用串联的绵羊源四因子(sOSKM)、绵羊源六因子(串联的sOSKM+串联的sNL)和十种转录因子(串联的sOSKM+串联的sNL+串联的hRL+hTERT+SV40LT)进行重编程后的克隆样细胞数量。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在本发明中，提供了一种诱导效率更高、安全性更高和分化潜能更好的绵羊iPSCs的诱导方法。发明人在研究中发现，使用绵羊源转录因子(串联的绵羊源转录因子OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四因子、以及串联的绵羊源转录因子NANOG和LIN28两因子)能够有效地将绵羊胎儿成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。并探索出合适的绵羊胎儿成纤维细胞电穿孔的转染条件，提升了细胞存活率和转染效率。

本发明首次使用6种绵羊源自体转录因子(串联的OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四因子，串联的NANOG、LIN28两因子)，并结合3种人源转录因子(RARG、LRH1、TERT)和猴肾病毒SV40LT，以piggyBac转座子系统为载体，通过合适的电穿孔转染方式将绵羊胎儿成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。本发明获得的绵羊iPSCs细胞形态清晰，生长状态稳定，碱性磷酸酶表达呈阳性，核型正常，实时荧光定量PCR和免疫细胞化学检测显示iPSCs能够表达干细胞多能性基因和特异蛋白，在体外能够分化形成拟胚体并表达三胚层特异基因和蛋白。经多次重复实验，该方法所建立的多株绵羊iPSCs系的生长特性和多能性鉴定均表现良好，体外传代目前已超过60代。本发明有助于确立绵羊iPSCs的诱导方案和最佳培养条件，对探究绵羊体细胞重编程机制、干细胞定向分化机制、早期胚胎发育及细胞命运决定机制与制备克隆绵羊、特殊功能基因修饰绵羊和疾病模型等有着重大意义。

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1绵羊诱导性多能干细胞的制备方法

本实施例制备得到了绵羊诱导性多能干细胞，具体包括以下步骤：

1、分离培养绵羊胎儿成纤维细胞

采集妊娠30～45日龄(胎羊体长约5～8cm)的绵羊子宫，使用75％酒精棉球消毒子宫表面，再用生理盐水冲洗后剥离出绵羊胎儿。使用含1％青链霉素双抗(PS双抗)的PBS冲洗胎儿至无血色，经75％酒精消毒后将其转至加入适量PBS溶液(含1％PS双抗)的解剖盘中。

快速剥取胎羊身体两侧的皮肤，依次用1％PS双抗的PBS、75％酒精和1％PS双抗的PBS清洗，并将胎儿皮肤剁成0.1～0.5mm³的组织碎块，离心去除漂浮的组织和上清液，将离心管底部的组织块沉淀均匀接种于0.1％明胶预处理的细胞培养皿，使用M10培养基(88％DMEM-Gulta，10％胎牛血清FBS，1％非必需氨基酸NEAA，1％PS，所有试剂均购自GIBCO公司)培养细胞，摇匀后放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

观察细胞生长密度，待细胞密度达到85～90％时，即得绵羊胎儿成纤维细胞，收集一部分细胞直接用于后续重编程，另一部分细胞进行传代、冻存，用于储备细胞资源(图1)。

2、绵羊干细胞转录因子及人TERT和猴肾病毒SV40 LT基因的扩增

(1)、在NCBI查询绵羊OCT4基因(XM_004018968.4)、SOX2基因(NM_001318074.1)、KLF4基因(NM_001164219.1)、c-MYC基因(NM_001009426)、LIN28基因(NM_001256479.1)和NANOG基因(XM_004006901.5)的序列，由上海生工生物公司合成串联的OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四因子(sOSKM)序列，串联的NANOG和LIN28两因子(sNL)序列，因子之间以2A连接肽相连。

人TERT和猴肾病毒SV40LT基因扩增的模板质粒pCI-neo-hTERT和pLVPT-tTR-KRAB-SV40LT购买于淼灵质粒平台。

根据以上因子的核苷酸序列，运用PrimerPremier 5设计引物，用于扩增相应序列，在引物两端加上酶切位点(表1)，其中F表示正向引物，R表示反向引物。

表1引物序列

注：引物5’加粗碱基为保护碱基，斜体下划线碱基为添加的酶切位点EcoRI(NLF端添加的酶切位点是SalI)和NOTI

(2)、建立以上因子的PCR扩增反应体系(表2)，设置PCR反应循环参数：94℃1min，(94℃30s，60℃30s，72℃1～3min)35Cycles，72℃2min，配制好反应液后进行混匀和短暂离心，然后进行PCR反应，得到4种PCR扩增产物。

表2 PCR扩增反应体系

(3)、PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测

以15000bp DNAMarker为参照，使用2％琼脂糖凝胶检测扩增片段，分别将5μLDNAMaker和步骤(2)的PCR扩增产物进行电泳检测。

(4)、琼脂糖凝胶回收

使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶DNA回收。具体操作为：将500μL平衡液BL加入吸附柱CA2中，12000rpm/min离心1min，倒掉废液；将PCR扩增产物点样于2％琼脂糖凝胶，150V电泳20min，在紫外分析仪下观察琼脂糖凝胶，切下目的DNA条带并称取重量，换算出胶块的体积；向胶块中加入等倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置充分溶解胶块，再加入1/2胶块体积的异丙醇；将混合液加入吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱CA2放回收集管；将600μL漂洗液PW加入吸附柱CA2中，12000rpm/min离心1min，倒掉废液，放回收集管；将吸附柱CA2室温放置3～5min；在吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm/min离心2min，将离心后的溶液重新加回吸附柱，放置2min后再次12000rpm/min离心2min，收集离心管中的DNA溶液。

3、基于piggyBac转座子系统构建转录因子及相关因子的表达载体

本实施例使用的piggyBac转座子骨架载体来源于发明人实验室。

(1)、piggyBac转座子骨架载体和PCR扩增产物双酶切及回收

piggyBac转座子骨架载体和PCR扩增产物双酶切体系如表3所示。

表3 piggyBac转座子骨架载体和PCR扩增产物的双酶切体系

按照表3的酶切体系配制酶切反应液，在水浴锅中37℃酶切反应15min。对piggyBac转座子骨架载体和PCR扩增产物(4种)进行双酶切及回收。

(2)、目的片段的连接

目的片段连接体系如表4所示。

表4目的片段连接体系

按照表4连接体系，将已双酶切的piggyBac转座子骨架载体分别与已双酶切的4种PCR扩增产物进行连接反应，16℃过夜连接。

(3)、质粒的转化

将1μL连接产物分别与30μLE.coli DH5α轻轻混匀，冰上静置30min，把含有混合液的EP管在水浴锅中42℃热激90s，再冰浴2min。在1.5mL EP管中加入300μL LB液体培养基(称量氯化钠3g、蛋白胨3g和酵母粉1.5g溶解于300mL蒸馏水，高压灭菌)，放置到振荡器上摇振荡培养1h，37℃，200rpm/min。

吸取约100μL菌液均匀涂布在含50μg/mL氨苄的LB固体培养基(称量氯化钠3g、蛋白胨3g、酵母粉1.5g和琼脂4.5g溶解于300mL蒸馏水)，高压灭菌，静置30min，放在37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。摇菌第二天用小枪头挑取单克隆到含有LB液体培养基的玻璃瓶，把玻璃瓶牢牢卡在振荡器上，37℃，200rpm/min，摇菌12h。

(4)、质粒的提取与测序鉴定

使用质粒提取试剂盒，将菌液12000rpm/min离心1min，弃去上清液，加入SolutionI，在涡旋仪上剧烈涡旋约1min，使沉淀悬浮混匀。在悬浮液中加入Solution II，前后颠倒4-6次使其混匀，再加入Solution III，轻轻颠倒至出现的絮状沉淀不再变多，离心10min。将收集管和HiBind DNA柱子组装好，将上清液吸到收集柱，常温离心。离心后把滤液弃掉并且将收集管和HiBind DNA柱子再次组装好，在收集管中加入HB Buffer再次离心，弃掉滤液，将Wash Buffer装入收集管，离心。将收集柱放入标记好的1.5mL离心管，加入20μL洗脱液后放置2min，离心收集质粒溶液，经华大生物技术有限公司测序验证，成功获得4个重组质粒PB-TRE-sOCT4-2A-sSOX2-2A-sc-MYC-2A-sKLF4(PB-TRE-sOSKM)、PB-TRE-sNANOG-2A-sLIN28(PB-TRE-sNL)、PB-TRE-hTERT、PB-TRE-SV40 LT。

4、电穿孔转染

选择1～3代且细胞生长汇合度为70～80％的绵羊胎儿成纤维细胞进行转染。弃去原细胞培养液，加入适量DPBS清洗，使用0.25％胰酶消化细胞，将细胞混合液收集至15mL离心管，1000rpm/min离心5min。离心结束后弃去上清，收集1×10⁶个细胞。

电转前混匀电转液(DMEM/F12，300μL)和步骤3构建的4种重组质粒(PB-TRE-sOSKM、PB-TRE-sNL、PB-TRE-hTERT、PB-TRE-SV40 LT)及发明人实验室前期构建保存的3种质粒(PB-TRE-hRL、PB-CAG-rTTA、PB-EF1a-transposase)(以上7种质粒，每种各3μg，浓度3μg/μL)。电转程序设定为：电压200V，电击2次,持续时间20ms。电转后室温静置5min，将细胞接种于0.1％明胶预处理且已铺好小鼠成纤维细胞饲养层的10cm细胞培养皿，摇匀后放置于37℃、5％CO₂培养箱，使用M15培养基(83％DMEM-Gulta，15％FBS，1％NEAA，1％PS，0.1mMβ-ME，10ng/mL LIF，10ng/mLbFGF，50μg/mL Vc，1μg/mL Dox，试剂购自GIBCO公司、Sigma公司、义翘神州公司)培养。

电转第3天对细胞进行换液，之后每隔1天进行换液。观察转染后第二天的成纤维细胞，细胞形态完整。电转后大约第6天，有圆状iPSCs样的细胞克隆出现(图2中的A)，继续培养。电转后大约第10天，细胞克隆形态发生改变，呈圆形，细胞核质比高，细胞核较大；细胞呈集落状生长，细胞界限清晰，多数形状像鸟巢或盘状(图2中的B)。

待明显克隆出现后，挑取形态好的单克隆进行扩增培养。在显微镜下用枪头轻推单克隆使其脱落，吸出转移至含有胰酶的96孔板孔中，放入培养箱消化5min，用移液器反复吹打克隆团块至单个细胞，再将细胞悬液吸入含有M15培养基的孔中终止消化。混匀后转移至12孔板，加入2mL M15培养基继续培养。

其中，该步骤中，小鼠成纤维饲养层细胞的制备方法如下：

从液氮罐中取出由Bradley等建立的小鼠胚胎成纤维细胞系SNL76/7(ATCC公司)，立即放入37℃水浴锅中融化，将冻存管中的细胞转移至15mL离心管，加入3～4mL M10培养基(88％DMEM-Gulta，10％胎牛血清FBS，1％非必需氨基酸NEAA，1％PS)，1000rpm/min离心5min。离心结束后弃去上清，加入2mL M10培养基重悬，吹打混匀后接种于0.1％明胶预处理的细胞培养皿，放置于37℃、5％CO₂培养箱，使用M10培养基培养细胞。当细胞密度生长到85～90％时，弃去原培养液，使用含有0.01mg/mL丝裂霉素C的MMC工作液(1mL DMEM-Gulta，20μL MMC，GIBCO公司)处理2.5～3个小时。弃去MMC工作液，使用0.25％胰酶消化细胞，收集细胞悬液至15mL离心管，1000rpm/min离心5min。离心结束后弃去上清，加入2mL M10培养基重悬，按照1.8×10⁶/mL细胞密度接种于0.1％明胶预处理的六孔板，摇匀后放置于37℃、5％CO₂培养箱，使用M10培养基继续培养细胞，即得小鼠成纤维细胞饲养层。

5、筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆

按照以下操作步骤提取RNA、反转录和qRT-PCR检测三种干细胞多能性基因(OCT4、SOX2和NANOG)的表达情况。

(1)、RNA的提取

使用碧云天RNAeasy^TM动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)抽提RNA。收集50-100万左右的细胞，弃去原培养液，加入300μL裂解液，轻轻吹打5-10次至固悬物溶解、溶液澄清，转移至洁净离心管。加入等体积结合液至裂解液中，轻轻颠倒混匀3-5次。将混合物转移至纯化柱，12000rpm/min离心30s，倒弃收集管内液体。加入600μL洗涤液I，12000rpm/min离心30s，倒弃收集管内液体。加入600μL洗涤液II，12000rpm/min离心30s，倒弃收集管内液体，再次加入600μL洗涤液II并离心，倒弃收集管内液体。14000rpm/min离心2min，去除残留的液体。将RNA纯化柱置于RNA洗脱管中，加入30-50μL洗脱液，室温放置2-3min，最高速离心30s，所得溶液即为纯化的RNA。

(2)、反转录

按照PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明书进行反转录。先去除总RNA中残存的DNA，反应体系见表5。

表5去除总基因组DNA的反应体系

所有操作均在冰上进行，加入所有体系后在微型振荡器上缓慢涡旋振荡混匀，瞬时离心，然后在PCR仪上42℃2min，反应结束后立即放置于冰上。然后进行反转录反应，反应体系见表6。所有操作也均在冰上进行，在PCR仪上37℃15min，85℃5s，反应结束后立即放置于冰上，产物保存至-20℃备用。

表6反转录反应体系

(3)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

根据NCBI上的绵羊OCT4、SOX2和NANOG基因序列，利用Primer Premier5.0软件和NCBI中的Primer-BLAST程序设计引物(表7)，送至北京华大基因公司进行合成。

表7引物序列

按照TB

Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR。按下列组份配制PCR反应液，反应液配制在冰上进行，反应体系见表8。采用两步法设置PCR反应程序：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)40Cycles，95℃10s。

表8 qRT-PCR反应体系

对于三种内源性核心多能性基因OCT4、SOX2和NANOG能够同时表达的细胞克隆，被初步确定为绵羊诱导性多能干细胞(iPSCs)。由图3结果可知，iPSCs与绵羊胎儿成纤维细胞相比，其内源性核心多能性基因均有高水平表达。

实施例2绵羊诱导性多能干细胞的传代

观察实施例1得到的绵羊诱导性多能干细胞(iPSCs)的细胞克隆形态，大约3-4天可进行传代，传代前一天准备好小鼠成纤维饲养层细胞。弃去原培养液，加入适量PBS清洗，使用0.25％胰酶消化细胞，观察到克隆全部脱落后，加入等量M15培养基终止消化。将混合液转移至15mL离心管，1000rpm/min离心5min。离心后弃去上清，加入适量M15培养基重悬，反复吹打至单细胞，将iPSCs接种于小鼠成纤维饲养层细胞上，摇匀后放置于37℃、5％CO₂培养箱，使用M15培养基培养细胞。

实施例3绵羊诱导性多能干细胞的多能性鉴定

取第5代的几个代表性绵羊诱导性多能干细胞，对其进行以下进一步的检测，以证实其具备干细胞特性。绵羊iPSCs的多能性鉴定主要包括碱性磷酸酶染色、qRT-PCR鉴定干细胞多能性基因表达、细胞免疫化学鉴定干细胞多能性特异蛋白表达、拟胚体形成能力和分化为三胚层特异基因及蛋白的潜能等。

1、碱性磷酸酶染色

弃去待检测iPSCs的培养基，使用DPBS清洗2-3次，4％多聚甲醛室温固定2-5min，再使用PBS清洗2次，加入预先混合调配好的AP染色工作液，常温避光染色30min。移去AP染色工作液后，加入一定量的PBS即可上镜观察。结果如图4所示，细胞被染成蓝紫色或蓝黑色，周围细胞不着色或着色较浅，表示绵羊iPSCs具有碱性磷酸酶活性，同时也说明这些克隆具有胚胎干细胞特性。

2、qRT-PCR检测干细胞多能性基因的表达

按照实施例1步骤5中的操作步骤提取RNA、反转录和qRT-PCR检测干细胞多能性基因的表达情况，基因引物如表9所示。SFF细胞作为阴性对照，GAPDH基因作为内参基因；每个样本均进行3次重复试验。

表9引物序列

qRT-PCR结果显示，绵羊iPSCs中不仅有核心干细胞多能性基因OCT4、SOX2、NANOG表达，还有其他干细胞多能性基因SALL4、ZFP42、TERF、PDRM1等表达(图5)。

3、核型分析

使用0.1μg/mL秋水仙素处理绵羊iPSCs 2.5h，加入适量PBS清洗，使用0.25％胰酶消化细胞。加入0.075mol/L KCL溶液重悬，37℃孵育25min，使用固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)固定10min，离心固定重复3次。收集细胞，滴片，Gimsa染色，空气干燥，封片。显微镜下观察，应用相关软件分析染色体配对。绵羊iPSCs细胞核型如图6所示，有27对染色体，具有正常绵羊核型。

4、细胞免疫化学检测干细胞多能性特异蛋白的表达

免疫染色所用抗体购自Cell Signaling Technology公司。

弃掉原培养基，加入PBS清洗3次，使用4％多聚甲醛(4％PFA)固定15min，PBS再次清洗3次，每次5min。用通透剂孵育样品20min，0.2％Triton X-100溶于PBS。使用PBS清洗细胞3次，每次5min。

滴加稀释后的封闭液均匀覆盖组织，37℃孵育30min。封闭时，在抗体稀释液中制备一抗。吸出封闭溶液，勿洗，然后加入稀释后的一抗，对照组加入PBS。4℃温度孵育过夜。将细胞培养皿从4℃转移至室温，静置20min，吸出一抗并回收，使用PBS在摇床中以40rpm/min清洗3次，每次5min。使用荧光抗体稀释液缓冲液稀释荧光素偶联的二抗，避光孵育1h。避光吸出二抗，PBS清洗3次，每次5min。加入少量DAPI，覆盖住样品，室温放置5min。吸出DAPI后PBS清洗3次，每次5min。使用荧光倒置显微镜观察免疫荧光染色结果。免疫荧光结果显示，绵羊iPSCs细胞表达干细胞多能性特异蛋白SOX2、OCT4、NANOG、SSEA4等(图7)。

5、拟胚体中三胚层特异性标记物鉴定

(1)、拟胚体的形成

取生长状态良好的绵羊iPSCs，弃去原培养液，使用PBS清洗，再使用0.25％胰酶消化细胞，期间可观察消化情况，当iPSCs漂起后加入等量拟胚体培养基(88％DMEM-Gulta，10％FBS，1％NEAA，1％PS，0.1mMβ-ME)终止消化。将混合液收集至15mL离心管，1000rpm/min离心5min。离心结束后弃去上清，加入2mL拟胚体培养基重悬。在10cm细胞培养皿盖下滴加20μL/滴(每滴约2×10⁵个细胞)细胞悬液，在皿底加入10mL无菌PBS，快速小心翻转皿盖，使液滴悬挂于皿盖上，放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。细胞悬滴培养2-3d后可见拟胚体形成(图8)。小心翻转皿盖，收集EB悬滴并转移至低吸附的细胞培养板中，继续悬浮培养3d。收集拟胚体，转移至0.1％明胶处理过的细胞培养皿，用于贴壁分化，分别从基因水平和蛋白水平检测三胚层的分化情况。

(2)、qRT-PCR检测三胚层特异性基因

按照实施例1步骤5的操作步骤提取RNA、反转录和qRT-PCR检测三胚层的分化情况，三胚层代表基因引物如表10所示。

表10引物序列

qRT-PCR检测结果显示，绵羊iPSCs中内胚层(SST)、中胚层(VIM、NANOS3、REN、MYF5)和外胚层(KRT8、NEUROD1、NES)特异基因都能够分别表达，表明绵羊iPSCs具有向三胚层分化的潜力(图9)。

(3)、细胞免疫化学检测三胚层特异性蛋白

选择三胚层特异性标记物，按照本实施例步骤4的操作步骤进行细胞免疫化学检测。

免疫荧光结果如图10所示，绵羊iPSCs通过形成拟胚体后贴壁分化发育，分别表达内胚层(AFP)、中胚层(SMA)和外胚层(TUBB3)三种特异蛋白，表明绵羊iPSCs具有向三胚层分化的潜力。

试验例1电穿孔的转染条件的优化

良好的细胞生长状态、较高的细胞存活率和转染效率是获得诱导性多能干细胞的前提，为进一步提升细胞存活率和转染效率，本试验例依次优化了电穿孔转染条件的6种参数，包括电穿孔缓冲液、电压、质粒浓度、质粒总量、电脉冲次数和持续时间。

优化前的电穿孔转染条件为：PBS作为电穿孔缓冲液，参数设置为250V，电击1次,持续时间10ms，质粒总量为10μg DNA(1μg/μL)。采用该电穿孔转染条件，成纤维细胞大量死亡且转染效率低，细胞转染效率和细胞存活率分别仅为24.8％和5.3％，红色荧光蛋白亮度低，细胞形态受到损伤，转染效果不佳(图11优化前)。

优化过程如下：

(1)、首先对电穿孔缓冲液进行了优化(其他条件同优化前)，分别测试细胞基础培养基DMEM/F12和DMEM的转染效果，发现这两种基础培养基的转染效果明显优于PBS，细胞转染效率和细胞存活率分别为53.4％、19.4％(DMEM/F12)和40.5％、9.4％(DMEM)，其中DMEM/F12效果最好。

(2)、在上一步(电穿孔缓冲液为DMEM/F12)基础上，对电压进行了优化，分别测试电压100V、150V、200V、250V和300V的转染效果，观察发现100V组几乎没有发光细胞、150V组发光细胞很少、300V组细胞几乎全部死亡，因此检测转染效果较好的200V和250V组，细胞转染效率和细胞存活率分别为41.4％、32.7％(200V)和53.6％、20.8％(250V)，综合考虑细胞转染效率和细胞存活率两项指标，200V转染效果最好。

(3)、在上一步(电穿孔缓冲液为DMEM/F12、电压200V)基础上，对质粒浓度进行了优化，分别测试质粒浓度1μg/μL和3μg/μL的转染效果，细胞转染效率和细胞存活率分别为41.3％、35.6％(1μg/μL)和62.6％、54.2％(3μg/μL)，其中3μg/μL转染效果最好。

(4)、在上一步(电穿孔缓冲液为DMEM/F12、电压200V、质粒浓度为3μg/μL)基础上，对质粒总量进行了优化，分别测试质粒总量10μg、20μg和30μg的转染效果，观察发现10μg的转染效果相对较差，因此检测转染效果较好的20μg和30μg组，其细胞转染效率和细胞存活率分别为68.9％、50.3％(20μg)和68.3％、45.4％(30μg)，其中20μg转染效果最好。

(5)、在上一步(电穿孔缓冲液为DMEM/F12、电压200V、质粒浓度为3μg/μL、质粒总量为20μg)基础上，对电脉冲次数进行了优化，分别测试电脉冲次数1次和2次的转染效果，细胞转染效率和细胞存活率分别为62.3％、48.2％(1次)和71.8％、42.4％(2次)，综合考虑细胞转染效率和细胞存活率两项指标，电脉冲2次转染效果最好。

(6)、在上一步(电穿孔缓冲液为DMEM/F12、电压200V、质粒浓度为3μg/μL、质粒总量为20μg，电脉冲次数为2次)基础上，对电脉冲持续时间进行了优化，分别测试电脉冲持续时间5ms,10ms,20ms和30ms的转染效果，观察发现5ms组发光细胞极少、30ms组细胞死亡较多，因此检测转染效果较好的10ms和20ms组，其细胞转染效率和细胞存活率分别为68.2％、46.0％(10ms)和78.0％、40.9％(20ms)，综合考虑细胞转染效率和细胞存活率两项指标，持续20ms时转染效果最好。

根据上述的优化过程，在使用DMEM/F12作为电穿孔缓冲液，参数设置为200V，电击2次,持续时间20ms，质粒总量为20μg DNA(3μg/μL)的条件下，可以保证一定的细胞存活率，而且转染效率大幅提高，红色荧光蛋白亮度高，细胞形态完整，为后续获得数量更多和质量更好的克隆奠定了基础，转染效果最佳(图11优化后)。因此，将该条件作为转染绵羊胎儿成纤维细胞的最优条件。

试验例2不同物种来源转录因子组合的重编程效率比较

本试验例应用不同物种来源和不同数量的转录因子组合，对绵羊胎儿成纤维细胞进行重编程(操作方法同实施例1)，并从细胞克隆的形态、内源性多能基因(OCT4、SOX2和NANOG)的表达和碱性磷酸酶染色等方面进行比较了重编程效率。

一、实验方法

转录因子组合1：使用绵羊源四个因子OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC(各自独立构建的载体(sOSKM(single))进行重编程。

转录因子组合2：分别使用串联的绵羊源、人源和猪源OSKM四因子的载体进行重编程。

转录因子组合3：使用串联的绵羊源四因子载体(sOSKM)的基础上，进一步加入串联的绵羊源重要多能性转录因子NANOG和LIN28两因子的载体(sNL)，即使用绵羊源六因子进行重编程。

转录因子组合4：使用sOSKM+sNL+hRL+hTERT+SV40 LT这十种转录因子组合的方式进行重编程。其中，hRL为串联的人源转录因子hRARG和hLRH1两因子，来源于PB-TRE-hRL质粒。

上述1～4转染进绵羊胎儿成纤维细胞后，按照实施例1和3的方法观察细胞克隆的形态、数量和碱性磷酸酶染色情况，检测内源性多能基因(OCT4、SOX2和NANOG)的表达。

二、实验结果

结果如图12～图16所示。

转录因子组合1：转染第7天出现克隆样细胞，克隆呈集落状生长，细胞呈圆形或椭圆形，细胞核质比高，细胞界限清晰，呈现出典型的小鼠胚胎干细胞的形态特点，这些克隆能够传代至20代左右，但是克隆表面出现了大量的细胞凋亡现象，随着继续传代，克隆的表面一直存在细胞凋亡现象(图12A)，碱性磷酸酶染色结果呈弱阳性(图13A)，内源性多能基因OCT4、SOX2和NANOG的mRNA表达量极低(图14)，说明采用非串联的四因子，重编程是不完全的。

转录因子组合2：应用串联的绵羊源四因子比非串联的四因子得到的克隆样细胞数量明显增加(图12B和图15)，但二者的碱性磷酸酶染色和内源性多能基因表达相似(图13B和图14)，说明了该重编程仍然是不完全的；虽然使用串联的人源和猪源四因子载体也能够得到一定数量的克隆样细胞，但是在挑取克隆传代至7代内，克隆几乎都会分化，无法继续维持培养和传代(图12C和图12D)。

转录因子组合3：使用绵羊源六因子(串联的sOSKM+串联的sNL)进行重编程，第4天开始出现克隆，克隆数有所增加(图16)，形态更接近于小鼠的胚胎干细胞，未出现细胞凋亡现象(图12E)，这些克隆目前已传代至40代左右。碱性磷酸酶染色结果为阳性(图13C)，内源性多能基因的mRNA表达量相比转录因子组合1和2明显提升(图14)，说明加入串联的绵羊源NANOG和LIN28两因子可以提高克隆数量和质量。

转录因子组合4：使用sOSKM+sNL+hRL+hTERT+SV40 LT这十种转录因子组合的方式进行转染，在重编程第4天就开始出现大量克隆，相比之前的转录因子组合，最终获得的克隆数量有了极大提高(图12F和图16)。这些克隆目前已传代至60代左右，碱性磷酸酶染色结果为强阳性(图13D)，内源性多能基因OCT4、SOX2和NANOG的mRNA表达量均处于较高水平，其中OCT4的表达量比转录因子组合3有所提高(图14)。

因此，综合不同物种来源各种因子组合转染后的细胞克隆形态、内源性多能基因表达和碱性磷酸酶染色，最终发现：采用sOSKM+sNL+hRL+hTERT+SV40LT十种转录因子组合的重编程效率最高。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述转录因子还包括串联的人源转录因子hRARG和hLRH1两因子、人源转录因子hTERT和猴肾病毒SV40 LT。

3.根据权利要求1或2所述的绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述电穿孔转染的程序为：电压180V～220V，电击1次～2次，持续时间18ms～22ms。

4.根据权利要求3所述的绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述电穿孔转染所使用的电转液为DMEM/F12，所述piggyBac转座子质粒的浓度均为2.5μg/μL～3.5μg/μL。

5.根据权利要求1所述的绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，选择1～3代且细胞生长汇合度为70％～80％的绵羊胎儿成纤维细胞进行转染。

6.根据权利要求1～5任一项所述的绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述绵羊源转录因子OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四因子是通过2A连接肽而实现串联的；和/或所述绵羊源转录因子NANOG和LIN28两因子是通过2A连接肽而实现串联的。

7.根据权利要求1～5任一项所述的绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述符合胚胎干细胞特性的细胞克隆为同时表达OCT4、SOX2和NANOG基因的细胞克隆。

8.根据权利要求1～5任一项所述的绵羊诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述传代培养包括步骤：将符合胚胎干细胞特性的细胞克隆按1:5～10比例传至已铺好的小鼠成纤维饲养层细胞上，使用M15培养基培养细胞；和/或所述小鼠成纤维饲养层细胞的制备方法包括如下步骤：使用M10培养基培养小鼠胚胎成纤维细胞，当细胞密度达到85～90％时，用0.008mg/mL～0.012mg/mL丝裂霉素C处理2.5～3个小时，弃去丝裂霉素C后，使用胰酶消化细胞，并接种于明胶预处理的细胞培养皿，使用M10培养基继续培养。

9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备的绵羊诱导性多能干细胞。

10.根据权利要求9所述的绵羊诱导性多能干细胞，其特征在于，所述绵羊诱导性多能干细胞中，OCT4、SOX2、NANOG、SALL4、ZFP42、TERF、PDRM1基因表达；表达干细胞多能性特异蛋白SOX2、OCT4、NANOG、SSEA4；以及拟胚体中三胚层特异基因和蛋白表达。