CN112322587A - 一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系、构建方法、鉴定方法及应用 - Google Patents

一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系、构建方法、鉴定方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于多能干细胞领域，具体涉及一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系、构建方法、鉴定方法及应用。本专利利用基因编辑方式将Cas9基因整合到人源iPS细胞基因组中，从而构建可以进行基因编辑的人源iPS细胞系（iPS‑Cas9）。基于该iPS‑Cas9细胞系，后续可以构建任何类型的基因突变iPS细胞，进而诱导其分化为特定的靶细胞，建立疾病细胞模型，进行疾病发病机理和药物筛选研究等，具有巨大的临床应用价值。

Description

一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系、构建方法、鉴定 方法及应用
技术领域
本发明属于多能干细胞领域，具体涉及一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系、构建方法、鉴定方法及应用。
背景技术
2006年，Yamanaka等首次通过逆转录病毒将四种重编程因子（Oct4, Klf4, Sox2,和c-Myc）导入到小鼠皮肤成纤维细胞, 进而获得了类似于胚胎干细胞（ES）的全能干细胞,并命名为“可诱导多能性干细胞”（iPS）。紧接着，Takahashi等和Yu等又分别将人源成纤维细胞重编程为iPS细胞，使得iPS细胞用于临床的可能性又向前迈进了一步。iPS细胞既具备了ES细胞一样的多能性，理论上能被诱导分化为各种类型的细胞，同时彻底规避了ES细胞所面临的免疫排斥和伦理学问题，具备巨大的临床应用价值。iPS细胞主要用于细胞分化和移植，并可提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开放新的治疗方法，如何使iPS细胞具有更大的应用价值是目前需研究的方向。
发明内容
本发明的第一方面，提供一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系。CRISPR/Cas9技术是目前最具价值的基因编辑技术，它可以利用特定的sgRNA引导Cas9酶对靶基因进行切割，造成DNA双链断裂。从而利用基因同源重组或非同源重组，在特定的靶基因序列区进行基因编辑，引入突变，纠正突变或插入特定外源基因序列。本发明提供的iPS-Cas9细胞系，后续可以构建任何类型的基因突变iPS细胞，进而诱导其分化为特定的靶细胞，建立疾病细胞模型，进行疾病发病机理和药物筛选研究等，具有巨大的临床应用价值。
本发明的第二方面，提供如上述的述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，包括以下步骤：
（1）将能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列克隆至带有gRNA克隆位点和Cas9酶基因序列的载体上，得到克隆载体；
（2）将步骤（1）得到的克隆载体和带有药物筛选标记和Cas9酶的基因序列的载体共转入人源iPS细胞中；
（3）通过外加药物进行筛选，获取带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞；
步骤（2）中的药物筛选标记与步骤（3）中外加的药物相对应。
优选地，步骤（1）中，能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列为: 5'-CACCGGTCCCCTCCACCCCACAGTG-3' 和3'-CCAGGGGAGGTGGGGTGTCACCAAA-5'。
优选地，步骤（1）中，用BbsI酶切带有gRNA克隆位点和Cas9酶基因序列的载体，然后与带BbsI酶切位点的且能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列行T4 DNA 连接酶连接，连接产物纯化后即为克隆载体。
优选地，步骤（2）中，通过细胞电转仪将步骤（1）得到的克隆载体和带有药物筛选标记和Cas9酶的基因序列的载体共转入人源iPS细胞中。
优选地，所述步骤（2）中的药物筛选标记为嘌呤霉素药物筛选标记，步骤（3）中外加的药物为嘌呤霉素。
优选地，步骤（3）中，将步骤（2）得到的iPS细胞用带嘌呤霉素的培养基培养，筛选出将带有嘌呤霉素抗药性的iPS细胞即为带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞。
基于基因编辑方式，将靶向人源细胞19号染色体第一个内含子区AAVS1安全位点，带BbsI酶切位点gRNA序列克隆至带有gRNA克隆位点和Cas9酶基因序列的载体上，然后通过细胞电转仪将该克隆载体和带有药物筛选标记和Cas9酶的基因序列的载体共转入人源iPS细胞中。通过基因同源重组，将带有嘌呤霉素药物筛选标记和Cas9酶的基因整合入iPS细胞的安全位点区。然后通过外加嘌呤霉素进行筛选，获取带Cas9基因的iPS细胞系。
本发明的第三方面，提供一种鉴定如上述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的方法，其包括以下步骤中的一步或多步：
（a）对细胞进行Sanger测序，检测其中是否含有Cas9基因；
（b）对细胞进行扩增保种，然后进行mRNA提取、PCR鉴定，鉴定是否能正常表达GADPH和Cas9基因；
（c）对细胞进行扩增保种，然后进行总蛋白提取，然后进行蛋白印迹检测，鉴定是否能正常表达GADPH和Cas9蛋白。
本发明的第四方面，提供如上述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系用于构建建立疾病细胞模型的应用。
本发明的有益效果如下：本专利利用基因编辑方式将Cas9基因整合到人源iPS细胞基因组中，从而构建可以进行基因编辑的人源iPS细胞系（iPS-Cas9）。基于该iPS-Cas9细胞系，后续可以构建任何类型的基因突变iPS细胞，进而诱导其分化为特定的靶细胞，建立疾病细胞模型，进行疾病发病机理和药物筛选研究等，具有巨大的临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为px458_2A_GFP_sgRNA_TIA1质粒图谱；
图2为pAAVS1-PDi-CRISPRn质粒图谱；
图3为利用CRISPR/Cas9基因编辑将Cas9基因整合入AAVS1安全位点区示意图；
图4为嘌呤霉素药筛iPS-Cas9细胞流程图；
图5为iPS-Cas9细胞Sanger测序结果；
图6为逆转录PCR鉴定iPS-Cas9细胞中Cas9基因表达；
图7为蛋白印迹鉴定iPS-Cas9细胞中Cas9蛋白表达；
图8为光学显微镜观察iPS-Cas9细胞克隆团；
图9为免疫荧光鉴定iPS-Cas9细胞多能性标志蛋白表达；
图10为免疫荧光鉴定iPS-Cas9细胞胚胎体形成后不同胚层标志蛋白表达
图11为iPS-Cas9细胞染色体核型分析。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
一、人源可诱导多能性干细胞（iPS）培养
将克隆团样人源iPS接种在1% Matrigel孵育处理过的6孔板上，37 °C二氧化碳培养箱内培养，每天倒置显微镜观察生长状态，每天全量更换新鲜的E8培养基，发现有分化的细胞及时挑走，每间隔6天传代一次，传代稀释比例为6:1。为减少对iPS细胞的损伤，传代时使用0.25% EDTA处理3-5分钟，当克隆边缘部分开始卷起并快脱离培养皿底部时，用去离子的PBS洗1遍，然后用1 mL的 E8培养基轻轻吹打（不能超过6次），收集细胞接种到新的被1%Matrigel预处理过的6孔板上继续培养。在每次传代后的第1天，培养基中需要添加10 μMY-27632。
二、构建克隆载体
Addgene公司购买px458_2A_GFP_sgRNA_TIA1 （货号：106097）载体，该载体带有gRNA克隆位点和Cas9酶基因序列，如图1所示。
购买pAAVS1-PDi-CRISPRn （货号：73500）载体，该载体带有嘌呤霉素药物筛选标记和Cas9酶的基因序列，该序列两端含有人源细胞19号染色体第一个内含子AAVS1安全位点区序列同源臂，如图2所示。
合成带BbsI酶切位点的gRNA两条互补的寡核苷酸序列: 5'-CACCGGTCCCCTCCACCCCACAGTG-3' 和3'-CCAGGGGAGGTGGGGTGTCACCAAA-5'。合成后单链寡核苷酸序列分别加入一定体积去离子溶解，终浓度均为100 μM。然后分别各取2 μL加入到46μL的退火缓冲液（10 mM Tris pH=8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）中，充分混匀后95 °C孵育5分钟，然后取出让其自动降至室温，获得带BbsI酶切位点的双链gRNA。取5 μL，用去离子水按1:100稀释备用。用BbsI酶切px458_2A_GFP_sgRNA_TIA1载体，酶切后纯化测DNA 浓度，取50 ng的BbsI酶切后px458_2A_GFP_sgRNA_TIA1载体与1 μL的1:100稀释的双链gRNA进行T4DNA 连接酶连接10分钟，连接产物纯化后即获得克隆载体。
三、细胞电转
购买Lonza电转仪（型号：Nucleofector2B）配套干细胞电转试剂盒（货号：VPH-5012），按说明书操作配制电转液。即取18 μL的Supplement 1和 82 μL的Solution 1混匀，加入4μg 载体（2 μg克隆载体px458_2A_GFP_sgRNA_TIA1和2 μg载体pAAVS1-PDi-CRISPRn），充分混匀后室温放置20分钟。此时准备iPS单细胞悬液，细胞计数后，1500转/分钟离心5分钟获得1.2-2×106个细胞。用上述混液重悬iPS细胞，混匀后转移至电转杯。将电转杯放置到Lonza电转仪电转槽中，开机后选择B-016程序，点击Start开始电转。完成电转后，用带10 μM Y-27632的E8培养基重悬细胞后转移至新的培养皿中继续培养。如图3所示，通过基因编辑会在AAVS1安全位点区产生双链断裂结构（DSB），然后结合基因同源重组，可实现将嘌呤霉素药筛标记和Cas9基因整合入人源iPS细胞的基因组中。
四、嘌呤霉素筛选
如图4所示，细胞电转后24小时计为第0天，此时吸弃细胞上清。第0-2天，用带0.4 μg/mL 嘌呤霉素的E8培养基培养，每天换液。第2-3天，撤去嘌呤霉素，更换E8培养基恢复培养1天。第3-5天，用带0.6 μg/mL 嘌呤霉素的E8培养基培养，每天换液。第5-6天，撤去嘌呤霉素，更换E8培养基继续恢复培养1天。第6-8天，用带0.9 μg/mL 嘌呤霉素的E8培养基培养，每天换液。第8-9天，撤去嘌呤霉素，更换E8培养基继续恢复培养1天。第9天，将存活下来的iPS细胞消化后，吹散成单细胞，然后传代至直径为10 cm培养皿中。培养2-3天后，在普通光学显微镜下挑取20个克隆团，转移至24孔板继续培养，并对每个克隆团编号。继续培养6-8天后，将每个编号对应细胞消化后一式两份传至新的24孔板继续培养。待细胞达到60%愈合后，一份细胞使用Thermo公司的基因组提取试剂盒提取细胞的基因组DNA，然后将样本送公司进行Sanger测序分析，另一份细胞继续培养。如图5所示，结果显示经过嘌呤霉素药筛后的iPS细胞带有Cas9基因，测序结果出来后，挑选阳性克隆细胞进行扩增培养并保种。
五、iPS-Cas9细胞鉴定
1. 逆转录PCR检测
利用Trizol（英潍捷基，美国）提取各组细胞总的RNA，并测定OD，保证提取各组的RNAOD 260/OD280值在1.8和2.1之间，以保证其纯度。然后总RNA利用逆转录试剂盒（东洋纺，日本）进行反转录成cDNA，反应体系和反应程序参照产品说明书。cDNA用来做逆转录PCR，引物序列采用：
GADPH-F: CATGGCACCGTCAAGGCT
GADPH-R: GACGAACATGGGGGCATCAG
Cas9-F: AGGAAATCGGCAAGGCTACC
Cas9-R: ACCACCAGCACAGAATAGGC
反应体系参考SYBR试剂盒（宝日，日本）说明书。瞬离后上机， 94 °C预变性2 分钟, 反应35个循环 (94 °C, 30秒; 60 °C, 30 秒; 72 °C, 30 秒)。反应产物吸取6 μL加上2 μL的6×Loading Buffer混匀后进行2%的琼脂糖凝胶电泳并拍照。
如图6显示，鉴定结果显示iPS-Cas9细胞能正常表达GADPH和Cas9基因，阴性对照组iPS细胞仅能表达GADPH基因，不能表达Cas9基因。
蛋白印迹检测
待培养各组细胞达到愈合后，吸掉上清，PBS洗1遍。放置冰上操作，加入细胞裂解液(RIPA)裂解30分钟，收集裂解液，4 °C冷冻离心 （16000 转/分钟, 15分钟）收集上清，BCA定量试剂盒测定蛋白浓度后，-20 °C冰箱保存。跑胶前解冻后与溴酚兰 (4:1)混混合，加入β巯基乙醇后煮沸制样。各组分别用微量注射器取50 μg蛋白样进行12%十二烷基硫酸钠凝胶电泳，电泳后进行电转（按“滤纸-PVDF膜-胶-滤纸”的顺序叠好，电流恒流180 mA，电压120 V，湿转 2小时），将蛋白样转移到PDVF膜上。然后用5%脱脂奶粉对PDVF膜进行4 °C封闭处理1 小时，接着加入一抗：兔单克隆Cas9抗体 (1:5000)和鼠单克隆GADPH抗体 (1:1000)，4 °C孵育过夜。然后TBST洗5遍，每次10分钟，接着加入二抗：HRP标记羊抗兔IgG抗体(1:5000)和HRP标记羊抗鼠IgG抗体 (1:5000)室温孵育2小时。之后TBST洗5遍，每次10分钟，加入ECL发光液后在蛋白荧光成像系统下曝光并拍照。
如图7所示，iPS-Cas9细胞能正常表达GADPH和Cas9蛋白，阴性对照组iPS细胞仅能表达GADPH蛋白，不能表达Cas9蛋白。
通过以上实验结果表明，带Cas9基因的人源iPS细胞系被成功构建。
六、iPS-Cas9细胞多能性的鉴定
1. 普通光学显微镜观察iPS-Cas9细胞生长状态，如图8所示，结果显示iPS-Cas9细胞仍然保持克隆团样生长。
2. 采用细胞免疫荧光的方法鉴定多能性蛋白OCT4和SOX2的表达，如图9所示，结果显示，两种多能性蛋白均成阳性表达，且表达部位与细胞核位置重叠。
3. 利用胚胎体形成实验分析iPS-Cas9细胞的分化潜能，采用胚胎体形成实验结合分化诱导的方法诱导iPS-Cas9细胞向三胚层细胞分化。
胚胎体形成实验的具体过程如下：每个胚胎体由50 μL E8培养基中含有5000个iPS-Cas9细胞通过悬滴法培养3天形成。然后胚胎体被含50%的E8培养基和50%的分化培养基重悬，该50%的分化培养基包括：DMEM-F12，20%的胎牛血清，1%青霉素/链霉素，1×非必需氨基酸（NEAA），2 mM左旋谷酰胺，0.1 mM β-硫基乙醇。重悬后的胚胎体被转移至非粘附培养板上培养2天。然后，胚胎体被转移至Matrigel孵育过的24孔培养板上培养，持续培养14天。然后，细胞用4%多聚甲醛固定后进行后续细胞免疫荧光染色分析。
免疫荧光染色的具体过程如下：培养细胞达到40%愈合后，吸弃上清，PBS洗1遍。加入4%多聚甲醛室温下孵育15 分钟，然后PBS洗3遍，每次5分钟，再加入含有0.1% Triton-X100和3%的牛血清白蛋白的PBS室温进行膜通透化处理1小时。然后不洗涤直接加入一抗：兔抗OCT4抗体 (1:500)，鼠抗SOX2抗体 (1:200)，鼠抗NESTIN抗体 (1:200)，鼠抗SMA抗体(1:200)，和鼠抗AFP抗体 (1:500)，4 °C孵育过夜。然后PBS洗3遍，每次5分钟，接着加入二抗：Cy3标记羊抗兔IgG抗体 (1:1000)，Cy3标记羊抗鼠IgG抗体 (1:1000)和FITC羊抗鼠IgG抗体 (1:1000)室温孵育2小时。之后PBS洗3遍，每次5分钟，接着加入DAPI染色液室温避光孵育15分钟。最后PBS洗3遍，每次5分钟，直接倒置荧光显微镜下观察拍照。
如图10所示，细胞免疫荧光结果显示分化后的iPS-Cas9细胞能阳性表达外胚层标志蛋白NESTIN，中胚层标志蛋白 SMA，内胚层标志蛋白AFP。
4. 为了鉴定iPS-Cas9细胞的染色体结构稳定性，对其进行染色体核型分析。
染色体核型分析的具体实验过程如下：利用染色体核型分析来验证iPS-Cas9细胞的染色体稳定性。细胞用10 μg/mL的秋水仙胺在37 °C条件下处理60分钟。然后使胰蛋白酶处理获取单个细胞，并用0.075 M低渗的KCl处理细胞。然后用卡诺伊的固定液（含3：1的甲醇和乙酸）进行固定。最后对处于有丝分裂中期的染色体和G显带进行成像分析。
如图11所示，细胞染色体核型正常（46，XY）。
通过以上实验结果可表明Cas9基因整合进入人源iPS细胞基因组后，并不影响iPS细胞的多能性特性。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (9)

1.一种带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系。
2.如权利要求1所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列克隆至带有gRNA克隆位点和Cas9酶基因序列的载体上，得到克隆载体；
（2）将步骤（1）得到的克隆载体和带有药物筛选标记和Cas9酶的基因序列的载体共转入人源iPS细胞中；
（3）通过外加药物进行筛选，获取带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞；
步骤（2）中的药物筛选标记与步骤（3）中外加的药物相对应。
3. 根据权利要求2所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，能靶向人源iPS细胞AAVS1安全位点区的gRNA序列为: 5'-CACCGGTCCCCTCCACCCCACAGTG-3' 和3'-CCAGGGGAGGTGGGGTGTCACCAAA-5'。
4. 根据权利要求2所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，用BbsI酶切带有gRNA克隆位点和Cas9酶基因序列的载体，然后与带BbsI酶切位点gRNA序列行T4 DNA 连接酶连接，连接产物纯化后即为克隆载体。
5.根据权利要求2所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（2）中，通过细胞电转仪将步骤（1）得到的克隆载体和带有药物筛选标记和Cas9酶的基因序列的载体共转入人源iPS细胞中。
6.根据权利要求2所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中的药物筛选标记为嘌呤霉素药物筛选标记，步骤（3）中外加的药物为嘌呤霉素。
7.根据权利要求6所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（3）中，将步骤（2）得到的iPS细胞用带嘌呤霉素的培养基培养，筛选出将带有嘌呤霉素抗药性的iPS细胞即为带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞。
8.一种鉴定如权利要求1所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系的方法，其特征在于其包括以下步骤中的一步或多步：
（a）对细胞进行Sanger测序，检测其中是否含有Cas9基因；
（b）对细胞进行扩增保种，然后进行mRNA提取、PCR鉴定，鉴定是否能正常表达GADPH和Cas9基因；
（c）对细胞进行扩增保种，然后进行总蛋白提取，然后进行蛋白印迹检测，鉴定是否能正常表达GADPH和Cas9蛋白。
9.如权利要求1所述的带Cas9基因的人源可诱导多能干细胞系用于构建建立疾病细胞模型的应用。
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