CN108025188A

CN108025188A - 用于hiv感染的rna导向治疗的方法和组合物

Info

Publication number: CN108025188A
Application number: CN201680045342.2A
Authority: CN
Inventors: K·哈利利; W·胡; Y·张
Original assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2018-05-11
Also published as: KR102553518B1; DK3302709T3; MX2017015582A; WO2016196539A3; US20210052709A1; US20200282025A1; PL3302709T3; ES2886480T3; EP3302709A4; EA037359B1; AU2016270702B2; US11273209B2; US11298410B2; US20180296649A1; EA201890012A1; ZA201708236B; JP6968416B2; CA2987927A1; KR20180023911A; EP3302709B1

Abstract

用于特异性裂解逆转录病毒中靶标序列的组合物，包括编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关核酸内切酶的核酸、以及与逆转录病毒基因组中一个或多个靶标核酸序列互补的导引RNA序列。

Description

用于HIV感染的RNA导向治疗的方法和组合物

关于联邦资助研究的声明

本发明受到美国政府支持，在美国国立卫生研究院(NIH)给予Kamel Khalili(P30MH092177)和Wenhui Hu(R01NS087971)的资助下完成。美国政府可享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及特异性裂解逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)中靶标序列的组合物和方法。该组合物可包括编码成簇规律性间隔短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspace Short Palindromic Repeat,CRISPR)相关的核酸内切酶的核酸、以及与人免疫缺陷病毒中靶标序列互补的导引RNA序列，可给药至被HV感染或处于接触HIV感染风险下的受试者。

背景技术

自发现HIV-1发现以来的三十多年里，AIDS一直是主要的公共健康问题，全世界范围内，超过3530万人受其影响。由于HIV-1永久性整合入宿主基因组中，AIDS仍然保持不可治愈。目前，用于控制HIV-1感染并深刻阻碍AIDS发展的疗法(高活性抗逆转录病毒疗法或HAART)降低了细胞内支持HIV-1感染的病毒复制，并将血浆病毒血症降低至最低水平。但HAART无法成功阻抑组织内低水平的病毒基因组表达和复制，且无法成功地以被潜在感染的作为HIV-1蓄积池的细胞，例如，静息记忆T细胞、脑巨噬细胞、小神经胶质细胞、星形胶质细胞、以及肠相关淋巴样细胞为靶标。持续性HIV-1感染也与副发病变有关联，该副发病变包括心脏病和肾病、骨量减少、及神经障碍。对于以持续性病毒蓄积池为靶标的治愈性治疗策略存在持续需求。

目前，用于控制HIV-1感染并防止AIDS进展的疗法已经急剧降低了易受HIV-1感染的细胞中的病毒复制，但并未消除含有HIV-1前病毒DNA整合复本的潜在被感染细胞中的低水平的病毒复制。亟需发展以持续性病毒蓄积池为靶标的治愈性治疗策略，包括自宿主细胞的基因组根除前病毒DNA的策略。

近年来，已经研发出根除包括归位核酸内切酶(HE)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)、及CRISPR相关系统9(Cas9)蛋白在内的内源基因的若干新颖系统。

在CRISPR方法中，,基因编辑复合体被组装，包括Cas9核酸酶和与靶标病毒DNA序列互补的导引RNA (gRNA)。该gRNA引导该Cas9核酸酶与含有该靶标序列的病毒DNA链啮合，并裂解该病毒DNA链。Cas9/gRNA基因编辑复合体经一个或多个突变引入该病毒DNA中。

使用HE从遗传学角度打断被整合的HIV-1前病毒以将所保全的病毒蛋白序列作为靶标的可行性已有报导。以HIV-1宿主共受CCR5基因为靶向的ZFN已经进入HIV/AIDS治疗的2期临床试验。实验中已经显示，TALEN有效地在预期位点裂解CCR5。Cas9/gRNA编辑复合体也已经被用来打断HIV-1进入共受体(CCR5、CXCR4)和前病毒结构性蛋白(Manjunath etal.,Viruses,14；5(11):2748-2766(2013)；Stone et al.,Curr.Opin.HIV AIDS.8(3):217-223(2013)；Wang et al.,PLoS One.26；9(12):e115987(2014))。然而，CCR5并非仅仅用于HIV-1感染的受体，其还具有多种其它细胞功能。

发明内容

本发明提供涉及治疗和预防逆转录病毒(尤其是人免疫缺陷病毒HIV感染)的组合物和方法。该组合物和方法攻击已经被整合入宿主细胞的基因组内的前病毒HIV。

具体来说，本发明提供组合物，该组合物包括编码CRISPR相关的核酸内切酶的核酸序列、以及一种或多种编码gRNA的单离的核酸序列，其中，各gRNA与逆转录病毒基因组中的靶标序列互补。优选的具体例中，该组合物中包括两种gRNA，且各gRNA将Cas核酸内切酶导向被整合的逆转录病毒DNA HIV DNA中的不同靶标位点。将在切割位点之间延伸的DNA删除，造成该HIV基因组被部分或全部切除。最有效的gRNA组合包括一对gRNA，其中，一个gRNA以LTR区域中的一位点为靶标，而另一个以结构性基因中的一位点如gag或pol为靶标；以及一对gRNA，其中，两个gRNA均以LTR中的位点为靶标。

本发明还提供一种通过将哺乳动物细胞暴露于包括一种或多种编码基因编辑复合体的单离的核酸的组合物，而令该细胞中的逆转录病毒失活的方法。该基因编辑复合体包括一CRISPR相关的核酸内切酶以及一种或多种gRNA，其中，各gRNA与该逆转录病毒中的靶标序列互补。

本发明进一步提供一种医药组合物，用于令哺乳动物受试者体内被整合的逆转录病毒前病毒DNA失活。该组合物包括编码Cas核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种编码至少一种gRNA的单离的核酸序列，其中，该gRNA与前病毒逆转录病毒DNA如HIV DNA中的靶标序列互补。优选以该逆转录病毒基因组中不同位点为靶向的成对gRNA。该单离的核酸序列包括在至少一种表达载体中。

本发明再进一步提供治疗被逆转录病毒如HIV感染的哺乳动物受试者的方法。该方法包括下述步骤：确认哺乳动物受试者被HIV感染，给药有效量的先前阐明的医药组合物，以及治疗该哺乳动物受试者的HIV感染。

本发明还提供一种治疗方法，用以降低处于逆转录病毒(如，HIV)感染下的哺乳动物受试者的感染风险。该方法包括下述步骤：确认哺乳动物受试者处于HIV感染的风险下，给药有效量的先前阐明的医药组合物，以及降低哺乳动物受试者感染HIV的风险。

本发明进一步提供一种用于治疗和预防HIV感染的试剂盒。该试剂盒包括测得量的组合物，该组合物包含至少一种编码CRISPR相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种编码一种或多种gRNA的核酸序列，其中，该gRNA与HIV中的靶标位点互补。或者，该试剂盒可包括一种或多种编码该核酸的载体。该试剂盒亦可含有包装材料、具有使用说明书的包装插页、无菌液体、注射器、及/或无菌容器。

附图说明

图1A显示酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)、单导引RNA(sgRNA)和前间区序列邻近基序(PAM)的图解，显示位于来自该NGG或NAG以及sgRNA序列的两条DNA链的第三个核苷酸处的切割位点。该sgRNA由含有20bp间区序列(种子序列或靶标序列)及12bp的CRISPR RNA (crRNA)、茎环(GAAA)和反式激活cRNA(tracRNA)构成。

图1B显示表达spCas9的慢病毒载体(上图)和表达sgRNA的慢病毒载体(下图)的示意图。该慢病毒报告载体(上图)购自Biosettia，表达用于免疫检测的3xFlag、用于简易效价和FACS分析的红色报告荧光蛋白(RFP)、以及用于自裂解以阻止RFP对Cas9功能的潜在效果的T2A肽。该表达sgRNA的慢病毒载体是从Addgene载体(#50946)修饰而得，显示BbsI克隆位点和抗生素选择标记物嘌呤霉素(Puromycin)以及用于简易效价和FACS分析的蓝色报告荧光蛋白(BFP)。

图1C显示HIV-1基因组的图解，显示所选择的以HIV-1LTR的Gag(A至D)和Pol(A、B)区域为靶向的gRNA。

图1D显示以HIV-1LTR的U3区域内的400bp为靶向的sgRNA的详细图解。位于正义链的具有绿色PAM(下划线且加粗)的种子序列和位于反义链的红色PAM(下划线且加粗)如图示标记。它们中的大多数亦可与Cas9切口酶和RNA引导FokI核酸酶(RFN)配对，这最高可将潜在脱靶效应减少1500倍。对该400bp区域的选择是基于其在当下所用的所有用于基因和sgRNA传送的慢病毒载体中的缺失而做出的。这一选择将阻止通过Cas9/gRNA进行的该慢病毒载体的自裂解。

图1E显示含有源自人HIV-1_NL4-3载体的增强萤火虫荧光素酶(eLuc)的EcoHIV报告载体的图解。该eLuc基因被插入Env与Nef之前，且在Nef之前具有自裂解2A肽，同时，HIV-1的p120替换为来自同向性鼠白血病病毒的gp80。

图2A和2D显示通过EcoHIV-荧光素酶报告基因检验进行的单sgRNA筛选。以EcoHIV-eLuc报告基因、pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP和所标注的sgRNA表达慢病毒载体转染HEK293T细胞。2天后，使用ONE-Glo^TM荧光素酶检验系统测量细胞裂解液中的荧光素酶活性。数据表示4种独立转染的均值±SE。

图2B显示Gag-D与任何LTR-sgRNA的成对sgRNA将荧光素酶活性降低了64％至96％。使用EcoHIV-eLuc报告基因、pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP和所标注的sgRNA表达慢病毒载体共转染HEK293T细胞。2天后，使用ONE-Glo^TM荧光素酶检验系统测量细胞裂解液中的荧光素酶活性。数据表示4种独立转染的均值±SE。

图2C显示LTR-3与任何Gag-sgRNA或的Pol-sgRNA成对sgRNA将荧光素酶活性降低了73％至93％。使用EcoHIV-eLuc报告基因、pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP和所标注的sgRNA表达慢病毒载体共转染HEK293T细胞。2天后，使用ONE-Glo^TM荧光素酶检验系统测量细胞裂解液中的荧光素酶活性。数据表示4种独立转染的均值±SE。

图3A显示，PCR基因分型证实了5’-LTR靶向位点与Gag-D切割位点之间的HIV-1DNA被根除。上图：PCR引物的定位。下图：与多种以LTR为靶向的sgRNA配对的GagD sgRNA。使用EcoHIV-eLuc报告基因、pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP和所标注的gRNA表达载体共转染HEK293T细胞。2天后，使用50mM NaOH将该细胞于95℃裂解10分钟，并以1M Tris-HCl中和。粗提取物直接用于PCR，PCR使用Terra PCR直接聚合酶混合液(Clontech)以及覆盖5’-LTR和5’-局部Gag(1364bp)的PCR引物T361/T458进行，其在以空sgRNA表达载体转染的对照样品中生产1.35kb的片段。

图3B显示，PCR基因分型证实了5’-LTR靶向位点与Gag-D切割位点之间的HIV-1DNA被根除。上图：PCR引物的定位。下图：与多种以LTR为靶向的sgRNA配对的GagD sgRNA。使用EcoHIV-eLuc报告基因、pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP和所标注的gRNA表达载体共转染HEK293T细胞。2天后，使用50mM NaOH将该细胞于95℃裂解10分钟，并以1M Tris-HCl中和。粗提取物直接用于PCR，PCR使用Terra PCR直接聚合酶混合液(Clontech)以及覆盖3’-LTR和除局部5’-Gag序列外全体HIV-1基因组的PCR引物T758(核苷酸796至817)/T645(以3’LTR之后的载体序列为靶向)进行，其在以空sgRNA表达载体转染的对照样品中生产在常规PCR条件下不可检出的预测的9.5kb的片段。

图3C显示，PCR基因分型证实了LTR-3靶向位点与Gag或Pol靶向位点之间的HIV-1DNA被根除。上图：PCR引物的定位。下图：与LTR-1、2、3配对的GagD或与多种以Gag或为Pol靶向的sgRNA配对的sgRNA。使用EcoHIV-eLuc报告基因、pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP和所标注的gRNA表达载体共转染HEK293T细胞。2天后，使用50mM NaOH将该细胞于95℃裂解10分钟，并以1M Tris-HCl中和。粗提取物直接用于PCR，PCR使用Terra PCR直接聚合酶混合液(Clontech)以及覆盖5’-LTR与5’-基因组序列之间的序列(左图)覆盖3’-基因组序列与3’-LTR之间的序列(右图)的PCR引物进行。

图3D显示在通过PCR基因分型进行的有效gRNA的验证中使用的PCR引物的定位及Gag/Pol gRNA靶向位点的图解。

图3E、3F是显示与多种LTR-gRNA配对的GagD的结果的散点图。

图3G、3H是显示与多种以Gag和Pol为靶向的gRNA配对的LTR-R的结果的散点图。检测到了5’LTR-Gag或Gag-3’LTR的删除。使用NIH Image J程序将野生型(WT)、删除和插入的谱带密度定量。凝胶下方的数字表明，归一化至使用Cas9特异性引物T477/T478的Cas9PCR产物后，相对于空gRNA对照的WT谱带变化(％)，以及插入谱带和删除谱带与WT谱带相比的倍数变化。由相应gRNA诱发的剧烈变化以方框突出标示。该方框表明所选择的用于TA克隆和Sanger测序的样品。

图3I、3J显示通过使用覆盖结构性区域和3’-LTR的其它PCR引物的直接PCR基因分型进行的对有效gRNA的进一步验证。图3I显示，位于该gRNA GagD的5’上游的正向引物(T758)与位于该载体下游的3’末端LTR上的反向引物(T645)配对。图3J显示，位于该gRNAGagD的5’上游的正向引物(T758)与位于3’末端LTR的R区域上的反向引物(T422)配对。箭头标注非特异性谱带(ns)。

图4显示，代表性的TA克隆和Sanger测序确认了LTR-1与LTR-3之间的296bp删除和两个切割位点之间的180bp额外插入。如图3A中所揭示的实施样品制备和直接PCR。提取切割后的PCR片段，用于TA克隆和Sanger测序。红色箭头指出位于自PAM起第三个核苷酸处的预测的切割位点。下划线的红色显示该PAM序列。

图5A显示HIV-1基因组的图示，包括成功地以具有Cas9/gRNA复合体的病毒LTR序列(侧翼整合有前病毒)为靶向的策略和预测结果。

图5B显示该LTR的详细结构。

图5C显示靶标位点的序列及其在LTR中的定位。

图6A显示Jurkat 2D10报告基因细胞系的图解，包括对所整合的HIV-1报告基因序列的说明。

图6B显示说明PMA/TSA诱发的潜伏前病毒序列的再激活的荧光显微照片。

图6C显示流式细胞分析直方图，表示PMA/TSA诱发的潜伏前病毒序列的再激活。

图7A显示单细胞克隆体筛选的结果。

图7B显示根据对单细胞克隆体筛选获得的克隆体的流式细胞分析而对最佳克隆体的确认。

图7C显示FLAG-Cas9的例示性西方墨点法分析(上图)以及gRNA表达的RT-PCR琼脂糖凝胶电泳(下图)。

图8A显示在对将HIV-1前病毒基因组从宿主DNA根除的PCR分析中使用的引物的定位。该引物对于前病毒Env基因序列基序(RRE)、侧翼整合有报告基因前病毒的基因组序列(染色体16，MSRB1基因)、LTR和对照β-肌动蛋白基因是特异性的。

图8B显示PCR反应的琼脂糖凝胶电泳照片，箭头所指为由于HIV-1序列的根除而消失的谱带位点。

图8C显示在优化用于较短产物的条件下的长范围PCR数据，令位于该整合位点的前病毒套索序列得以检出。

图8D显示前病毒套索的测序结果。

图9A显示Jurkat 2D10单细胞克隆体的荧光分析，该克隆体已经感染HIV-1NL-4-3-EGFP-P2A-Nef报告病毒，且以荧光分析的形式监控感染进展18天。

图9B显示西方墨点法，显示所测试克隆体中的Cas9-FLAG表达；

图9C显示，所选择的克隆体中，gRNA表达的逆转录PCR的琼脂糖凝胶电泳照片。

图10A显示以表达RFP-Cas9及/或LTR A/B’gRNA的慢病毒转染的Jurkat 2D10细胞的荧光显微照片。

图10B显示，以PMA/TSA诱发后，RFP-Cas9及/或LTR A/B’gRNA表达和病毒再活化的流式细胞分析。

图11A显示LTR A和LTR B’的序列。

图11B显示在表达Cas9和LTR A/B’后，脱靶indel的Surveyor检验分析。

图11C显示脱靶indel的Sanger测序分析结果。

图11D显示HIV-1报告整合位点在染色体16中MSRB1基因的第二外显子中的定位、以及相邻基因。

图11E显示对照组中与表达Cas9/LTR AB’的细胞中相邻基因的表达的qRT-PCR比较结果。

图12A至12C显示相应gRNA靶标位点之间的预计片段被证实已删除(图12A至12C)以及多种额外插入(图12B、12C)的代表性样品的TA克隆和Sanger测序的图解。PAM序列高亮，且剪刀标注自PAM起的第三个核苷酸。箭头指向裂解和结扎后的接合位点。

图13A至13E显示EcoHIV-萤火虫荧光素酶稳定HEK293T细胞系的构建。在6孔板的一孔中使用3μg的pEcoHIV-eLuc质粒和1μg的VSV-G质粒转染HEK293T细胞48小时后，收集EcoHIV-eLuc病毒。将等体积的病毒上清液(250μl)加入12孔板中的HEK293T细胞(2x10⁴/孔)中。48小时后，使用ONE-Glo荧光素酶检验(Promega)测量的eLuc荧光素酶活性比不经病毒处理的对照HEK293T细胞高105倍。随后，将单细胞在4个96孔板中在极限稀释下培养。2至3周后，单离存活的细胞集落，并通过ONE-Glo荧光素酶检验来测试eLuc报告基因活性(图13A,13B)以及通过使用引物T361(5’-gatctgtggatctaccacacaca-3’)和T458(5’-cccactgtgtttagcatggtatt-3’)的直接PCR基因分型来验证EcoHIV-eLuc转基因(图13C-13E)。第一轮实验中单细胞衍生的13种克隆体中的一半(图13A，代码为1016)以及第二轮中20种克隆体中的一半(图13B，1021)显示了多种程度的固有eLuc活性。它们中仅两种(1016-11和1021-19)对使用TNFα(10ng/ml)和PMA(10ng/ml)进行的刺激有显着响应。除了可能在整合过程中丢失了Gag序列单仍经由可变剪接而转录eLuc的克隆体1021-6(绿色方块)外，表达eLuc的克隆体全部含有该转基因(图13C至13E)。两种克隆体(1016-6和1016-9)含有该转基因，但即使在以潜能反转剂如TNFα/PMA和其它处理后仍显示无eLuc活性(图13A和13D中的红色方块)。因此，选择并保持那些具有eLuc活性的克隆体用于进一步的研究。由于毒性病毒蛋白的连续生成，这些克隆体中的一些不能被适当地通过；而一些克隆体对即使是以lipofectamine转染试剂盒进行的转染仍有抗性。

图14A至14D显示使用EcoHIV-萤火虫荧光素酶稳定HEK293T细胞系进行的gRNA效能筛选的结果。图14A、14B：以pCW-Cas9-嘌呤霉素慢病毒以10MOI进一步转染EcoHIV-eLuc稳定表达克隆体，并以嘌呤霉素(1μg/ml)选择2周。以所标注的gRNA表达载体转染细胞。2天后，实施ONE-Glo荧光素酶检验。图14C、14D：以所标注的gRNA表达载体和pLV-EF1α-spCas9-T2A-RFP载体共转染EcoHIV-eLuc稳定表达细胞。48小时后，使用ONE-Glo荧光素酶检验来测量荧光素酶活性。数据表示4中独立转染的均值±SEM，以eLuc活性相对于空gRNA零组的百分比变化来表示。

具体实施方式

本发明至少部分地基于下述发现：可通过使用单一构型和复合构型的RNA引导的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas 9核酸酶系统(Cas9/gRNA)将被整合的人免疫缺陷病毒(HIV)基因组自被HIV感染的细胞中消除。

定义

除非明确排除，本文中使用的全部科技术语具有本发明所属领域技术人员通常所理解者相同的意义。尽管在实践中可使用与本文中揭示者相似或等效的任何方法和材料来测试本发明，但优选本文中揭示的材料和方法。在说明和主张本发明时，使用了下述术语。也应理解，本文中使用的术语仅用于揭示特定具体例的目的，而非意图限制。

本文中揭露的所有基因、基因名、和基因产物意图对应于来自本文中揭露的组合物和方法中任何适用物种的同源染色体。应理解，当来自特定物种的基因或基因产物被揭露时，这一揭露仅用于例示，而不理解为限制，除非其语境中明确指明。因此，例如，对于本文中揭露的基因基因产物，意图涵盖同源基因及/或来自另一物种的直系同源基因和基因产物。

本文中使用的冠词“一(a)”和“一(an)”是指该冠词的语法宾语的一个或超过一个(即，至少一个)。举例来说，“一元件”意为一个元件或超过一个元件。因此，例如，“一细胞”的表述包括相同类型的多个细胞。此外，就详细说明书及/或权利要求书中使用的术语“包括”、“具有”、“具备”或其变体的包括程度而言，这些术语倾向于以与术语“包含”相似的模式而包括在内。

本文中，关于对项目、组合物、仪器、方法、过程、系统等的元件的定义或揭示，术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”或“包含(comprised)”及其变体意为包含的或是开放的，允许额外的元件，从而表明，所定义或揭示的项目、组合物、仪器、方法、过程、系统等包括那些具体化的元件，或者，视情况而定，其等效物，以及可被包括且仍落入所定义的项目、组合物、仪器、方法、过程、系统等范畴/定义内的那些元件。

本文中，当“约”用于指代可测量的值如数量、时距等时，“约”意为涵盖具体化的值±20％、±10％、±5％、±1％、或±0.1％的变动，且这些变动适于实施所揭露的方法。或者，特别是杜宇生物学系统或过程，该术语可意为处于数值的5倍、以及2倍的数量级内。若在申请书和权利要求书中揭示了特定的数值，则除非明确指定，否则术语“约”位于处于该特定数值应该被认为的可接受的误差范围内。

“编码”指的是多核苷酸中具体序列如基因、cDNA、或mRNA的固有性质，其在生物学过程中用作合成具有所定义的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或所定义的氨基酸序列并具有由此又来的生物学性质的其它聚合物和大分子的模板。因此，若mRNA对应于一基因的转录和转译在细胞和其它生物学系统中产生了蛋白质，则该基因编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列一致且一般提供于序列表中的编码链，以及用作基因或cDNA转录目标的非编码链，均可指代为编码该蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。

化合物的“有效量”或“治疗有效量”是指，足以对给药该化合物的受试者提供有益效果的该化合物的量。传送运载剂的“有效量”是该量足以有效地结合或传送化合物。

本文中，术语病毒如HIV的“根除”意为该病毒不能复制，该基因组被删除、片段化、降解、遗传上失活、或组装病毒被传播或传染至然和其它细胞或受试者并导致该病毒在体内清除的其它物理、生物学、化学或结构性表现。一些情况下，病毒基因组的片段是可检出的，但该病毒不能复制或感染等。

“表达载体”指的是包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含可操作地链接之待表达核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；其它用于表达的元件可由该宿主细胞或体外表达系统供给。表达载体包括该领域中已知的全部，如合并有重组多核苷酸的粘粒、质粒(如，裸质粒或包含在脂质体中)和病毒(如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、及腺相关病毒)。

“同源”指的是两种多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列一致性。当两个被比较序列的位置均被相同碱基或氨基酸单体次单元所占据时，如，若两个DNA分子中各自的一个位置均被腺嘌呤所占据，则这两个分子在该位置是同源的。两个序列间的同源性百分比是下述函数：这两个序列共有的匹配位置或同源位置的数目除以所比较的位置数，再乘以100。例如，如果两个序列中10个位置中的6个匹配或同源，则该两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC与TATGGC具备50％同源性。通常，在将两个序列对准以给出最大同源性时进行比较。

“单离的”意为从天然状态改变或移除。例如，天然地存在于活体动物体内的核酸或肽不是“单离的”，但部分或全部地与其天然状态下的共存材料分隔的相同核酸或肽是“单离的”。单离的核酸或蛋白质可以基本纯化的形式存在，或可存在于非原生环境如宿主细胞内。

在本发明的语境中，使用下述常见的核酸碱基缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，而“U”指的是尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的退化版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”亦可包括内含子，其包括之程度为该编码蛋白质的核苷酸序列可以是含有内含子的一些版本。

本文中，术语“患者”、“受试者”、“个体”等可互换地使用，指的是受本发明方法检验的任何动物或其细胞，无论其在体外或原位。某些非限制性具体例中，该患者、受试者或个体是人。

组合物的“肠胃外”给药包括，例如，皮下(s.c.)注射、静脉(i.v.)注射、肌肉(i.m.)注射、或胸骨内注射，或输液技术。

如本文中所使用，术语“多核苷酸”、“核酸序列”及“基因”可互换地使用，且包括互补DNA (cDNA)、天然及/或修饰单体或链接的线性或环状寡聚物或聚合物，包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、其取代形式和α-异头物形式、肽核酸(PNA)、锁定的核酸(LNA)、硫逐磷酸酯、甲基磷酸酯等。本文中，术语“多核苷酸”定义为核苷酸的链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文中，核酸与多核苷酸可互换地使用。该领域技术人员具有下述通常知识：核酸是多核苷酸，其可水解为单体“核苷酸”。该单体核苷酸可水解为核苷。多核苷酸包括，但不限于，通过该领域可使用的任何手段获得的所有核酸序列，这些手段包括，但不限于，重组手段，即，使用普通颗粒技术和PCRTM等从重组库或细胞基因组进行的核酸序列的克隆；以及合成手段。该核酸序列可以是“嵌合的”，即由不同区域构成。在本发明的语境中，“嵌合的”化合物是寡核苷酸，其含有两个或多个化学区域，例如，DNA区域、RNA区域、PNA区域等。每一化学区域由至少一种单体单元即核苷酸构成。这些序列典型包含至少一种区域，其中，该序列经修饰以展现一种或多种所希望的性质。

至于核苷酸的“类似物”，包括具有修饰碱基部分及/或修饰糖部分的合成核苷酸，如，Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980；Freier&Altmann,Nucl.Acid.Res.,1997,25(22),4429-4443,Toulmé,J.J.,Nature Biotechnology 19:17-18(2001)；Manoharan M.,Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139(1999)；FreierS.M.,Nucleic Acid Research,25:4429-4443(1997)；Uhlman,E.,Drug Discovery&Development,3:203-213(2000)；Herdewin P.,Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.,10:297-310(2000))中揭示的；以及2’-O,3’-C-链接的[3.2.0]双环阿糖核苷类(见，如，N.KChristiensen.,et al.,J.Am.Chem.Soc.,120:5458-5463(1998)。这些类似物包括被设计为提升结合性质如双链或三链稳定性、特异性等的合成核苷酸。

当术语“变体”用于多核苷酸序列的语境中时，该术语可涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。这一定义亦可包括，例如，“等位基因”、“拼接”、“物种”、或“多态的”变体。拼接变体可具有与参考分子的显着一致性，但由于mRNA加工过程中外显子的交替拼接，通常会具有更大或更小数量的多核苷酸。相应的多肽可具有额外的功能域或缺乏域。物种变体是从一个物种变为另一个的多核苷酸序列。本发明中特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可导致核酸序列中的至少一个突变，且可导致变异mRNA或其结构或功能可能被改变或未被改变的多肽。任何给定的天然基因或重组基因可不具有或具有一个或很多等位基因形式。引发变体产生的常见的突变性变化通常归因于核苷酸的天然删除、加成、或替代。这些类型的变化各自可单独、或与其它组合在给定序列中出现一次或多次。

除非具体注明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的退化版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”亦可包括内含子，其包括之程度为该编码蛋白质的核苷酸序列可以是含有内含子的一些版本。

本文中，术语“肽”、“多肽”、及“蛋白质”可互换地使用，指的是由通过肽键共价链接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，且蛋白质或肽序列可包含的氨基酸的最大数目并不设限。因此，例如，术语寡核苷酸、蛋白质和酶包括在多肽或肽的定义中，而无论其是使用重组技术、化学或酶促合成生产的或是天然出现的。多肽包括包含通过肽键彼此接合的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质。本文中，该术语指的是短链，例如，该领域中，其通常也指代为肽、寡肽和寡聚物；以及较长的链，该领域中，其通常指代为存在多种类型的蛋白质。“多肽”包括，例如，生物学活性片段、实质上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白。这一术语也包括已经被修饰或衍生的多肽，该修饰或衍生通过如糖基化、酰化、磷酸化等进行。多肽包括天然多肽、重组肽、合成肽、或其组合。

如本文中所使用，多肽的“变体”指的是一个或多个氨基酸残基发生变异的氨基酸序列。该变体可具有“保守性”变化，其中，被取代的氨基酸具有相似的结构性或化学性质(如，以异亮氨酸替换亮氨酸)。更罕见地，变体可具有“非保守性”变化(如，以色氨酸替换甘氨酸)。类似的较小变动亦可包括氨基酸删除或插入、或两者。确定哪个氨基酸残基可被取代、插入、或删除而不破坏生物学活性的指南可使用该领域中广为人知的计算机程序如，LASERGENE软件(DNASTAR)中找到。

“治疗性”处理是给予展现病理迹象的受试者的用于衰减或消除那些迹象用途的处置措施。

如本文中所使用，短语“治疗有效量”指的是足以或有效防止或治疗(延缓或防止其发作、防止其进展、抑制、降低或反转)疾病或病症的量，包括缓解此类疾病症状的量。

“治疗”是以防止病变发展或改变病变的病理或症状为意图而实施的干预措施。据此，“治疗”指的是治疗性处理和预防性或防止性措施。“治疗”亦可指定为姑息护理(palliative care)。需要治疗的那些包括已经具有该病变的，以及待防止其体内病变的。据此，“治疗”一状态、病变或病症包括：(1)防止或延迟可能苦于或易患该状态、病变或病症但尚未经历或显现该状态、病变或病症的临床或亚临床症状的人或其它哺乳动物体内该状态、病变或病症的临床症状的出现及发展；(2)抑制状态、病变或病症，即，迟滞、减轻或延缓疾病或其至少一种临床或亚临床症状的发展或复发(在维持治疗的例子中)；或(3)减轻疾病，即，造成状态、病变或病症或其至少一种临床或亚临床症状的退行。对于待治疗个体的益处是统计学显着的或至少对于该患者或医师来说是可察觉的。

“载体”是物质的组合物，其包含单离的核酸且可用以将该单离的核酸传送至细胞内部。多种载体是该领域中已知的，其包括，但不限于，线性多核苷酸、与离子性化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、及病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语也应解释为包括促进核酸转移入细胞内的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括，但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

范围：贯穿本揭示內容，本发明的多个方面可以范围格式表示。应理解，以范围格式进行的描述仅为便利和简洁起见，而不应视为对本发明范畴的刚性限制。据此，以范围格式进行的描述应视为具有具体揭露的所有可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如，以范围如从1至6进行的描述应被视为具有具体揭露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的个体数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。这一规则无视该范围之广度而采用。

若以Swiss Prot.或GENBANK登录号具体地指代任何氨基酸序列，则该序列通过引用而并入本文。与该登录号相关的信息，如信号肽、细胞外域、跨膜域、启动子序列和转译起始的鉴定，也通过引用而以其整体并入本文。

CRISPR-核酸酶组合物

已经显示，Cas9技术在根除HIV-1蓄积池尤其是以LTR为靶向的根除中的应用，是治疗或可能治愈AIDS的由前突的策略。Hu,et al.,PNAS 2014,111:114616中揭露，表达以该HIV-1LTR中的位点为靶标的Cas9/gRNA的质粒对人细胞培养物的稳定转染，成功地根除了部分及/或整个HIV-1基因组，而不损害宿主细胞功能。该靶标位点称为LTR-A、LTR-B、LTR-C、及LTR-D。以LTR中的两个不同位点为靶向，在产生删除中尤其有效，其中，该删除足以延及构建全部或实质上全部的前病毒DNA序列的切除。Cas9/gRNA在细胞中的事先存在也防止了新的HIV-1感染。

HIV和其它逆转录病毒是高度易突变的，故对更广谱的Cas9/gRNA试剂和以被整合的HIV基因组为靶向的方法存在需求。尤其有用的是有效地以HIV的结构性基因如gag和pol为靶标的Cas9/gRNA试剂。

据此，本发明的具体例指向用于在体内外治疗高度易变及/或潜伏的病毒或将该病毒自宿主细胞根除的组合物和方法。本发明的方法可用来从宿主移除病毒或其它异源遗传物质，而不干扰宿主遗传物质的完整性。核酸酶可用来以病毒核酸为靶标，从而干扰病毒复制、或转录、甚或将该病毒遗传物质从宿主基因组切除。该核酸酶可具有特异性靶向，从而当病毒核酸作为颗粒而存在于细胞内或被整合至宿主基因组内时，该酶仅移该除病毒核酸而不对宿主材料起作用。以该病毒核酸为靶向可使用序列特异性部分完成，该序列特异性部分为，例如以病毒遗传物质为靶标并通过该核酸酶破坏该遗传物质但不以宿主细胞的基因组为靶标的导引RNA。一些具体例中，使用同时以病毒遗传物质为靶标并选择性地编辑或摧毁该病毒遗传物质的CRISPR/Cas核酸酶和导引RNA(gRNA)。CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是保护细菌不被噬菌体感染的细菌免疫系统的天然出现的元件。该导引RNA将CRISPR/Cas复合体集中至病毒靶标序列。该复合体的结合将该Cas核酸内切酶集中至病毒基因组靶标序列，造成该病毒基因组的断裂。其它可使用的核酸酶系统包括，例如，锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、兆核酸酶、或可用来降解或干扰病毒核酸而不干扰宿主遗传物质的常规功能的任何其它系统。

本文中呈现的组合物可用来以多种形式或位于病毒生命循环中任何阶段的病毒核酸为靶标。作为靶标的病毒核酸可作为独立的颗粒存在于宿主细胞内。优选的具体例中，该病毒感染是潜伏性的，且该病毒核酸被整合入宿主基因组内。任何适当的病毒核酸均可作为靶标用于裂解和消解。

CRISPR/Cas系统：该CRISPR-Cas系统包括，包含CRISPR相关核酸酶如Cas9的基因编辑复合体、以及与位于DNA链上的靶标序列如被整合至哺乳动物基因组内的前病毒DNA中的靶标序列互补的导引RNA。一个例示性基因编辑复合体显示于图1A中。该基因编辑复合体可理解靶标序列中的DNA。这一裂解可随后将多种突变引入该前病毒DNA中，导致HIV前病毒的失活。这些突变借以令该前病毒失活的机制可变。例如，该突变可影响前病毒复制和病毒基因表达。该突变可被定位在调节性序列或结构性基因序列中，并导致HIV的缺陷性生产。该突变可包含删除。该删除的大小可从单个核苷酸碱基至约10,000个碱基对的范围内改变。一些具体例中，该删除可包括全部或实质上全部的被整合的逆转录病毒核酸序列。一些具体例中，该删除可包括整个被整合的逆转录病毒核酸序列。该突变可包含插入，换言之，将一个或多个核苷酸碱基对加至该前病毒序列中。所插入序列的大小亦可变，例如，自约一个碱基对至约300个核苷酸碱基对。该突变可包含点突变，换言之，将单个核苷酸替换为另一核苷酸。可用的点突变是具有功能性结果的那些，例如，导致氨基酸密码自转变为终止密码子的突变或导致非功能性蛋白质产生的突变。

通常，CRISPR/Cas蛋白包含至少一个RNA识别及/或RNA结合域。RNA识别及/或RNA结合域与导引RNA相互作用。CRISPR/Cas蛋白亦可包含核酸酶域(即，DNase或RNase域)、DNA结合域、螺旋酶域、RNase域、蛋白质-蛋白质相互作用域、二聚体化功能域、以及其它域。

於具体例中，该CRISPR/Cas样蛋白可以是野生型CRISPR/Cas蛋白、经修饰的CRISPR/Cas蛋白、或野生型或经修饰的CRISPR/Cas蛋白的片段。该CRISPR/Cas样蛋白可经修饰，以增加核酸结合亲和性及/或特异性、改变酶促活性、及/或改变该蛋白质的另一性质。例如，该CRISPR/Cas样蛋白的核酸酶(即，DNase、RNase)域可经修饰、删除、或失活。或者，该CRISPR/Cas样蛋白可被截短，以移除对于该融合蛋白并非必需的域。该CRISPR/Cas样蛋白亦可经截短或修饰，以优化该融合蛋白的效应子域的活性。

具体例中，该CRISPR/Cas系统可以是I型、II型、或III型系统。适当的CRISPR/Cas蛋白的非限制性实例包括Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、及Cu1966。

一种具体例中，RNA引导的核酸内切酶源自II型CRISPR/Cas系统。其它具体例中，该RNA引导的核酸内切酶源自Cas9蛋白。该Cas9蛋白可来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属(Streptococcus sp.)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、原始链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、硒还原芽孢杆菌(Bacillusselenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、微颤菌(Microscilla marina)、伯克氏菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极单胞菌属(Polaromonas sp.)、海洋固氮蓝藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆藻属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobiumarabaticum)、耐热菌(Ammonifex degensii)、热角军纤维素菌(Caldicelulosiruptorbecscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldiamagna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、热丙酸盐暗色厌氧香肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、着色菌(Allochromatiumvinosum)、海杆菌属(Marinobacter sp.)、嗜盐亚消化球菌(Nitrosococcus halophilus)、海洋亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、水稻纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobiumevestigatum)、鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospiraplatensis)、节旋藻属(Arthrospira sp.)、螺旋藻属(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、石袍菌(Petrotogamobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、或藻青菌(Acaryochloris marina)。

一些具体例中，该CRISPR/Cas样蛋白可源自野生型Cas9蛋白或其片段。其它具体例中，该CRISPR/Cas样蛋白可源自经修饰的Cas9蛋白。例如，Cas9蛋白的氨基酸序列可经修饰，以改变该蛋白的一种或多种性质(如，核酸酶活性、亲和性、稳定性等)。或者，可将Cas9蛋白的不牵涉入RNA引导裂解的域从该蛋白消除，因此，经修饰的Cas9蛋白比野生型Cas9蛋白小。

一种例示性和优选的CRISPR相关的核酸内切酶是Cas9核酸酶。该Cas9核酸酶可具有与野生型酿脓链球菌序列一致的核苷酸序列。一些具体例中，该CRISPR相关的核酸内切酶可以是来自其它物种如其它链球菌种如嗜热链球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌，或其它定序的细菌基因组和古生菌，或其它原核微生物的序列。或者，该野生型酿脓链球菌Cas9序列可经修饰。该核酸序列可以是经优化用于在哺乳动物细胞内有效表达即“人源化”的密码子。人源化Cas9核酸酶序列可以是，例如，由Genbank登录号KM099231.1GI:669193757、KM099232.1GI:669193761、或KM099233.1GI:669193765中列举的任何表达载体编码的Cas9核酸酶序列。或者，该Cas9核酸酶序列可以是，例如，可商购的载体如来自Addgene(Cambridge,MA)的PX330或PX260中含有的序列。一些具体例中，该Cas9核酸内切酶可具有作为Genbank登录号KM099231.1GI:669193757、KM099232.1GI:669193761、或KM099233.1GI:669193765的任何Cas9核酸内切酶序列或PX330或PX260(Addgene,Cambridge,MA)的Cas9氨基酸序列的片段的变体的氨基酸序列。该Cas9核苷酸序列可经修饰，以编码Cas9的生物学活性变体，且这些变体可具有或可包括，例如，凭借含有一个或多个突变(如，加成、删除、或替代突变或这些突变的组合)而不同于野生型Cas9的氨基酸序列。替代突变的一个或多个可以是替代(如，保守氨基酸替代)。例如，Cas9多肽的生物学活性变体可具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与野生型Cas9多肽的序列一致性为至少或约50％(如，至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％的序列一致性)。保守氨基酸替代典型包括下述基团间的替代：甘氨酸与丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸与亮氨酸；天冬氨酸与谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸与苏氨酸；赖氨酸、组氨酸与精氨酸；以及，苯丙氨酸与酪氨酸。该Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非天然出现的氨基酸残基。天然出现的氨基酸残基包括天然地由遗传密码编码的那些以及非标准氨基酸(如，具有D-构型而非L-构型的氨基酸)。本发明单独肽亦可包括作为标准残基修饰版本(如，可使用吡咯赖氨酸替换赖氨酸，以及使用硒代半胱氨酸替换半胱氨酸)的氨基酸残基。非天然出现的氨基酸残基是那些自然界中尚未发现但符合氨基酸的基本公式且可并入肽中的氨基酸残基。这些包括D-别异亮氨酸((2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸)以及L-环戊基甘氨酸((S)-2-氨基-2-环戊基乙酸)。其它的实例可查阅教科书或网站(目前由加州理工学院维护的显示已经成功并入功能性蛋白中的非天然氨基酸结构的网站)。

Cas9核酸酶序列可以是突变序列。例如，Cas9核酸酶可在牵涉入链特异性裂解的保守HNH和RuvC域中发生突变。例如，RuvC催化域中天冬氨酸盐至丙氨酸(D10A)的突变令该Cas9核酸酶突变体(Cas9n)将DNA切口而非裂解，以获得单链断裂，且后续通过HDR进行的优先修复可潜在地降低来自脱靶双链断裂的不希望的插入删除(indel)突变的发生频率。

本发明合并了对Hu,et al,PNAS 2014,111:114616中所揭露的Cas9/gRNA系统的若干进展。在实施例中揭露的实验中证实，额外的高特异性靶标序列存在于HIV-1LTR和HIV-1的结构性基因中。这些靶标序列(也指代为靶标“位点”)由Cas9/gRNA有效地编辑，造成潜伏性感染的哺乳动物细胞内病毒基因表达和复制的失活。发现，这些额外的Cas9/gRNA构造中的某些及其组合造成全部或部分的被整合的HIV前病毒DNA被从该宿主细胞的基因组清除。在HIV基因组的清除或根除的产生中，其中一个成员指向LTR靶标位点且另一个成员指向结构性基因靶标位点的成对构造尤其有效。这是第一个范例，说明LTR位点和结构性基因上的组合攻击可产生对被整合的HIV DNA的介入拉伸。本发明因此极大拓展了可用以将宿主细胞内被整合的HIV DNA为靶标的Cas9/gRNA组合物谱。

据此，本发明提出用于令整合入宿主细胞的前病毒DNA失活的组合物，该组合物包括编码CRISPR相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及一种或多种编码一种或多种与HIV或另一逆转录病毒中的靶标序列互补的gRNA的单离的核酸序列。

gRNA包括成熟crRNA，其含有约20个碱基对(bp)的独特靶标序列(称为间隔序列)、以及用作pre-crRNA的核糖核酸酶III辅助加工导引的反式激活小RNA(tracrRNA)。该crRNA:tracrRNA双链经由该crRNA上该间隔序列与该靶标DNA上的互补序列(称为前间隔序列)的互补性碱基配对而引导Cas9以DNA为靶标。Cas9识别三核苷酸(NGG)前间隔序列邻近基序(PAM)，从而指定切割位点(自PAM起的第三个核苷酸)。本发明中，该crRNA和tracrRNA可被单独表达，或经由合成茎环(AGAAAU)而设计为人工融合gRNA，以模拟天然crRNA/tracrRNA双链。该gRNA可经合成或体外转录，用于直接RNA转染或被U6或H1促进的RNA表达载体表达。

本发明的组合物中，每一gRNA包括与逆转录病毒中靶标序列互补的序列。该例示性靶标逆转录病毒是HIV，但本发明的组合物亦可用于以另一逆转录病毒如HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)-1为靶向。

本发明的一些例示性gRNA与HIV的长端重复序列(LTR)区域中的靶标序列互补。LTR被再分成U3区域、R区域和U5区域。HIV-1的U1区域、R区域、U5区域的构型显示在图3A中。LTR含有基因表达所需的全部信号，且牵涉入前病毒至宿主细胞的基因组内的整合中。例如，基础或核心启动子、核心增强子和调整区域在U3中发现，而反式激活响应元件在R中发现。HIV-1中，U5区域包括若干子区域，例如，TAR或反式作用响应元件，其牵涉入转录激活中；Poly A，其牵涉入二聚体化和基因组封装中；PBS或引物结合位点；Psi或封装信号；DIS或二聚体起始位点。据此，一些具体例中，gRNA靶标序列包含一个或多个位于HIV前病毒DNA的LTR区域中的靶标序列、以及一个或多个位于HIV前病毒DNA的结构性基因及/或非结构性基因中的靶标。其它具体例中，gRNA靶标序列包含一个或多个位于HIV前病毒DNA的LTR区域中的靶标序列、以及一个或多个位于结构性基因中的靶标。另一具体例中，gRNA靶标序列包含一个或多个位于HIV前病毒DNA的LTR区域中的靶标序列、以及一个或多个位于HIV前病毒DNA的非结构性基因中的靶标。再一具体例中，gRNA靶标序列包含一个或多个位于HIV前病毒的结构性基因中的靶标序列、以及位于HIV前病毒DNA的非结构性基因中的靶标。再一具体例中，gRNA靶标序列包含一个或多个位于HIV前病毒的非编码基因中的靶标序列、以及一个或多个位于HIV前病毒DNA的编码基因中的靶标。又一具体例中，gRNA靶标核酸序列包含一个或多个位于第一基因中的靶标核酸序列、以及一个或多个位于第二基因中的靶标核酸序列；或，一个或多个位于第一基因中的靶标核酸序列、以及一个或多个位于第三基因中的靶标核酸序列；或，一个或多个位于第一基因中的靶标核酸序列、一个或多个位于第二基因中的靶标核酸序列、以及一个或多个位于第三基因中的靶标核酸序列；或，一个或多个位于第二基因中的靶标核酸序列、以及一个或多个位于第三基因或第四基因中的靶标核酸序列；或其任何组合。可见，靶标核酸序列的任何组合均可使用，且仅受限于该领域技术人员的想象力。

在实施例中揭露的实验结果中，发现位于LTR的U3、R、及U5区域中的某些序列是可用的靶标序列。与这些靶标序列互补的gRNA标注于实施例2的图1D和图3A中、实施例3的图11A中、以及实施例4的表1中。它们包括LTR 1、LTR 2、LTR 3、LTR A、LTR B、LTR B’、LTR C、LTR D、LTR E、LTR F、LTR G、LTR H、LTR I、LTR J、LTR K、LTR L、LTR M、LTR N、LTR O、LTRP、LTR Q、LTR R、LTR S、AND LTR T。这些gRNA的序列显示于图11A、12A、12B和12C中。本发明的组合物包括这些例示性gRNA，但并不限于它们，且可包括与HIV LTR中的任何适当靶标位点互补的gRNA。

本发明的一些例示性gRNA以HIV的蛋白编码基因组中的序列为靶标。发现，编码结构性蛋白gag的基因中的序列是可用的靶标序列。与这些靶标序列互补的gRNA包括Gag A、Gag B、Gag C、和Gag D。它们在HIV-1基因组的靶标位点标注在图3A中，而它们的核酸序列显示于表1中。有用的靶标序列亦可在编码结构性蛋白pol的基因中发现。与这些靶标序列互补的gRNA包括Pol A和Pol B。它们在HIV-1基因组中的靶标位点标注在图3A中，而它们的核酸序列显示于表1中。用于与HIV-1包膜蛋白中的靶标位点互补的gRNA的序列亦显示于表1中。

据此，本发明的组合物包括这些例示性gRNA，但并不限于它们，且可包括与HIV的蛋白编码基因中的任何适当靶标位点互补的gRNA，包括，但不限于，那些编码结构性蛋白tat、以及辅助蛋白vif、nef(阴性因子)、vpu(病毒蛋白U)、vpr、和tev的基因。

根据本发明的导引RNA序列可以是正义序列或反义序列。导引RNA序列通常包括前间隔序列邻近基序(PAM)。该PAM的序列可依据所使用的CRISPR核酸内切酶的特异性需求而改变。在源自酿脓链球菌的CRISPR-Cas系统中，靶标DNA典型地即刻领先于5’-NGG前间隔序列邻近基序(PAM)。因此，对于酿脓链球菌Cas9，PAM序列可以是AGG、TGG、CGG或GGG。其它Cas9直系同源物可具有不同的PAM特异性。例如，来自嗜热链球菌的Cas9需要用于CRISPR 1的5’-NNAGAA以及用于CRISPR3的5’-NGGNG，而脑膜炎奈瑟氏菌则需要5’-NNNNGATT。该导引RNA的特异性序列可变，但无论该序列如何，有用的导引RNA序列将是那些最小化脱靶效应并同时实现高效率及基因性整合的逆转录病毒如HIV的切除的序列。导引RNA序列的长度可自约20至约60或更多个核苷酸内改变，例如，约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约45、约50、约55、约60或更多个核苷酸。可用的选择方法鉴定了在外来病毒基因组与包括内源性逆转录病毒DNA的宿主细胞的基因组之间具有极低同源性的区域，包括使用12-bp+NGG靶标选择准则以排除对人转录组(甚至罕见地)未转译基因组位点的脱靶的生物信息学筛选；避免HIV LTR启动子(潜在地保存在宿主基因组中)内的转录因子结合位点；以及WGS、Sanger测序和SURVEYOR检验，以鉴定并排除潜在的脱靶效应。

该导引RNA序列可配置为单一序列或配置为一个或多个不同序列的组合如复合构型。复合构型可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个不同导引RNA的组合。

在实施例2和3中揭露的实验中，发现，当以复合方式表达即在同一细胞中同步表达时，gRNA的组合尤其有效。在许多情况下，该组合产生了对在靶标位点之间延伸的HIV前病毒的切除。该切除可归咎于，由Cas9在多个靶标位点的每一处引发的裂解之间的序列被删除。这些gRNA的成对组合中，一个成员与逆转录病毒的LTR中的靶标位点互补，且另一个成员与gRNA互补，其中，该gRNA与该逆转录病毒的结构性基因中的靶标位点互补。例示性有效组合包括Gag D与LTR 1、LTR 2、LTR 3、LTR A、LTR B、LTR C、LTR D、LTR E、LTR F、LTR G、LTR H、LTR I、LTR J、LTR K、LTR L、LTR M、LTR N、LTR O、LTR P、LTR Q、LTR R、LTR S、或LTRT中的一个组合。例示性有效组合亦包括LTR 3与LTR-1、Gag A、Gag B、Gag C、Gag D、Pol A、或Pol B中的一个组合。

LTR A与LTR B’的组合还造成HIV-1基因组的节段的切除，如实施例3中所示。本发明的组合物被限制为这些组合，但包括与HIV-1前病毒中两个或多个不同靶标位点互补的gRNA的任何适当组合。

某些具体例中，靶标核酸序列包含位于该逆转录病毒基因组的编码和非编码核酸序列中的一个或多个核酸序列。该靶标核酸序列可定位于编码结构性蛋白、非结构性蛋白或其组合的序列内。该编码结构性蛋白的序列包含编码Gag、Gag-Pol前体、Pro(蛋白酶)、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env或其组合的核酸序列。该编码非结构性蛋白的序列包含编码调节蛋白如Tat、Rev，辅助蛋白如Nef、Vpr、Vpu、Vif，或其组合的核酸序列。

某些具体例中，gRNA序列与编码Gag、Gag-Pol前体、Pro、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env、Tat、Rev、Nef、Vpr、Vpu、Vif或其组合的靶标核酸序列的序列一致性为至少75％。

某些具体例中，gRNA序列与编码Gag、Gag-Pol前体、Pro、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env、Tat、Rev、Nef、Vpr、Vpu、Vif或其组合的靶标核酸序列互补。

其它具体例中，该gRNA核酸序列与包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57或其任何组合的序列的序列一致性为至少75％。其它具体例中，gRNA核酸序列包含SEQ ID NO:1至SEQID NO:57。

另一具体例中，核酸序列包含一序列，该序列与包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57或其任何组合的序列的序列一致性为至少75％。其它具体例中，gRNA核酸序列包含SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:57。

其它具体例中，用于令整合入潜在感染逆转录病毒的宿主细胞内的逆转录病毒DNA失活的组合物包含：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，该gRNA与该被整合的逆转录病毒DNA中的靶标序列互补，其中，该逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。该至少一种gRNA至少包括与被整合的逆转录病毒DNA中的靶标序列互补的第一gRNA；以及与被整合的逆转录病毒DNA中的另一靶标序列互补的第二gRNA，藉此移除两个gRNA之间的介入序列。

某些具体例中，靶标核酸序列包含一个或多个位于人免疫缺陷病毒(HIV)前病毒DNA的长端重复序列(LTR)区域中的序列、以及一个或多个位于该HIV整合DNA的结构性及/或非结构性基因中的靶标；或，一个或多个位于第二基因中的靶标；或，一个或多个位于第一基因中的靶标、以及一个或多个位于第二基因中的靶标；或，一个或多个位于第一基因中的靶标、一个或多个位于第二基因中的靶标、以及一个或多个位于第三基因中的靶标；或，一个或多个位于第二基因中的靶标、以及一个或多个位于第三基因或第四基因中的靶标；或其任何组合。

另一具体例中，用于在体内外根除逆转录病毒的组合物包含：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，该gRNA与逆转录病毒基因组中的靶标序列互补，其中，该逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。多种具体例中，该至少一种gRNA至少包括与HIV基因组中的靶标序列互补的第一gRNA；以及，与HIV基因组中另一靶标序列互补的第二gRNA，藉此移除两个gRNA之间的介入序列。

另一具体例中，组合物包含编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少两种导引RNA(gRNA)，该gRNA各自与逆转录病毒基因组中的不同靶标序列互补，其中，该逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。于具体例中，该至少一种gRNA至少包括与HIV基因组中的靶标序列互补的第一gRNA；以及，与HIV基因组中另一靶标序列互补的第二gRNA，藉此移除两个gRNA之间的介入序列。

某些具体例中，靶标核酸序列包含一个或多个位于逆转录病毒基因组的编码和非编码核酸序列中的核酸序列。该靶标核酸序列可定位在编码结构性蛋白、非结构性蛋白或其组合的序列中。该编码结构性蛋白的序列包含编码Gag、Gag-Pol前体、Pro(蛋白酶)、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env或其组合的核酸序列。该编码非结构性蛋白的序列包含编码调节蛋白如Tat、Rev，辅助蛋白如Nef、Vpr、Vpu、Vif，或其组合的核酸序列。

某些具体例中，gRNA序列与编码Gag、Gag-Pol前体、Pro、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env、Tat、Rev、Nef、Vpr、Vpu、Vif或其组合的互补性靶标核酸序列的序列一致性为至少75％。

据此，本发明也包含令整合入潜伏性感染逆转录病毒的宿主细胞的基因组内的前病毒DNA失活的方法，该方法包括下述步骤：以包含CRISPR相关的核酸内切酶以及至少一种与前病毒DNA中靶标位点互补的gRNA的组合物处理该宿主细胞；表达包括该CRISPR相关的核酸内切酶及至少一种gRNA的基因编辑复合体；以及，令该前病毒DNA失活。优选先前枚举的gRNA和Cas9核酸内切酶。另一优选具体例中，在体外或体内处理宿主细胞的步骤包括以至少两种gRNA进行处理，其中，该至少两种gRNA各自与该前病毒DNA中的不同靶标核酸序列互补。尤其优选至少两种gRNA的组合，包括一组成物，在该组合物中，至少一种gRNA与逆转录病毒的LTR中的靶标位点互补，且至少一种gRNA与该逆转录病毒的结构性基因中的靶标位点互补。HIV是优选的逆转录病毒。

另一具体例中，用于在体外或体内根除逆转录病毒的组合物包含：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，该gRNA与逆转录病毒基因组中的靶标序列互补，其中，该逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)；以及，该gRNA至少包括与HIV基因组中的靶标序列互补的第一gRNA、以及与HIV基因组中的另一靶标序列互补的第二gRNA，藉此移除两个gRNA之间的介入序列。该靶标核酸序列包含一个或多个位于HIV基因组的编码和非编码核酸序列中的核酸序列。一种具体例中，该靶标序列包含一个或多个HIV基因组中的核酸序列，包含：长端重复序列(LTR)核酸序列，编码结构性蛋白、非结构性蛋白或其组合的核酸序列。某些具体例中，该编码结构性蛋白的核酸序列包含编码Gag、Gag-Pol前体、Pro(蛋白酶)、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env或其组合的核酸序列。多种具体例中，该编码非结构性蛋白的核酸序列包含编码调节蛋白、辅助蛋白或其组合的核酸序列。调节蛋白的实例包括：Tat、Rev或其组合。辅助蛋白的实例包含Nef、Vpr、Vpu、Vif或其组合。某些具体例中，gRNA核酸序列包含一与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57的序列一致性为至少75％的核酸序列。某些具体例中，gRNA核酸序列包含一包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57的核酸序列。

某些具体例中，单离的核酸序列包含编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，该gRNA与逆转录病毒基因组如HIV中的靶标核酸序列互补。

当将该组合物作为核酸给药或包含在表达载体中给药时，该CRISPR核酸内切酶可由与该导引RNA序列相同的核酸或载体编码。或者或此外，该CRISPR核酸内切酶可在与该gRNA序列物理单离的核酸中或独立的载体中被编码。

修饰或突变的核酸序列：一些具体例中，本文中例示的任何核酸序列可经修饰或从原生核酸序列衍生，例如，通过引入核酸碱基、骨架等的突变、删除、替代、修饰而进行。该核酸序列包括载体、基因编辑剂、gRNA、tracrRNA等。一些预设用于本发明的经修饰的核酸序列的实例包括那些包含经修饰的骨架如硫逐磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲酯甲基、短链烷基或环烷基糖间链接、或短链杂芳族或杂环状糖间链接的核酸序列。一些具体例中，经修饰的寡核苷酸包含那些具有硫逐磷酸酯类骨架的和那些具有杂原子骨架、CH₂--NH--O--CH₂、CH、--N(CH₃)--O--CH₂[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、CH₂--O--N(CH₃)--CH₂、CH₂--N(CH₃)--N(CH₃)--CH₂和O--N(CH₃)--CH₂--CH₂骨架的，其中，该原生磷酸二酯类固件表示为O--P--O--CH。De Mesmaeker et al.Acc.Chem.Res.1995,28:366-374中揭露的酰胺类骨架也在本文中例示。一些具体例中，核酸序列具有吗啉基骨架结构(Summerton and Weller，US 5,034,506)；肽核酸(PNA)骨架，其中寡核苷酸的磷酸二酯类骨架被替换为聚酰胺骨架，核酸碱基直接或间接键结至该聚酰胺骨架的氮杂氮原子(Nielsen et al.Science1991,254,1497)。该核酸序列亦可包含一个或多个经取代的糖部分。该核酸序列亦可具有替代呋喃戊糖基的糖模拟物，如环丁基。

此外，或者，该核酸序列亦可包括核酸碱基(该领域中一般简称为“碱基”)修饰或替代。如本文中所使用，“未修饰的”或“天然的”核酸碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核酸碱基包括仅稀少地或短暂地见于天然核酸中的核酸碱基，如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶尤其是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2’-去氧胞嘧啶，且该领域中一般称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合成核酸碱基如2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、N₆-(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤(Kornberg,A.,DNA Replication,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1980,pp75-77；Gebeyehu,G.,et al.Nucl.Acids Res.1987,15:4513)。可包括该领域中已知的“万用”碱基，如肌苷。已经显示，5-Me-C替代将核酸双链的稳定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,in Crooke,S.T.and Lebleu,B.,eds.,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)。

本发明的核酸序列的另一修饰牵涉将一个或多个增强寡核苷酸活性或细胞摄取的部分或缀合物化学地链接至该核酸序列。这些部分包括，但不限于，脂质部分如胆固醇部分、胆甾醇基部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86,6553)、胆酸(Manoharan et al.Bioorg.Med.Chem.Let.1994,4,1053)、硫醚如己基-S-三苯甲硫醇(Manoharan et al.Ann.N.Y.Acad.Sci.1992,660,306；Manoharan etal.Bioorg.Med.Chem.Let.1993,3,2765)、硫代胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.AcidsRes.1992,20,533)、脂肪族链如十二碳醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.EMBOJ.1991,10,111；Kabanov et al.FEBS Lett.1990,259,327；Svinarchuk et al.Biochimie1993,75,49)、磷脂如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙铵盐(Manoharan et al.Tetrahedron Lett.1995,36,3651；Shea et al.Nucl.AcidsRes.1990,18,3777)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.Nucleosides&Nucleotides1995,14,969)、或金刚烷乙酸(Manoharan et al.Tetrahedron Lett.1995,36,3651)。

给定的核酸序列中所有位置皆待经均匀修饰并不是必需的，事实上，超过一种前述修饰可并入单个核酸序列中，或甚至并入核酸序列的单个核苷酸内。

一些具体例中，该RNA分子如、crRNA、tracrRNA、gRNA被设计为包含一种或多种经修饰的核酸碱基。例如，RNA分子的已知修饰可在诸如Lewis编撰的《Genes VI》第9章(“Interpreting the Genetic Code”)(1997,Oxford University Press,New York)和Grosjean与Benne编撰的《Modification and Editing of RNA》(1998,ASM Press,Washington DC)中找到。经修饰的RNA组分包括下列：2’-O-甲基胞苷；N⁴-甲基胞苷；N⁴-2’-O-二甲基胞苷；N⁴-乙酰胞苷；5-甲基胞苷；5,2’-O-二甲基胞苷；5-羟基甲基胞苷；5-甲酰基胞苷；2’-O-甲基-5-甲酰基胞苷；3-甲基胞苷；2-硫代胞苷；赖胞苷(lysidine)；2’-O-甲基尿苷；2-硫代尿苷；2-硫代-2’-O-甲基尿苷；3,2’-O-二甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；4-硫代尿苷；核糖基胸腺嘧啶；5,2’-O-二甲基尿苷；5-甲基-2-硫代尿苷；5-羟基尿苷；5-甲氧基尿苷；尿苷-5-氧乙酸；尿苷-5-氧乙酸甲酯；5-羧甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基尿苷；5-甲氧基羰基甲基-2’-硫代尿苷；5-氨甲酰基甲基尿苷；5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷；5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯；5-氨甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨甲基尿苷；5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷；5-甲基氨甲基-2-硒杂尿苷；5-羧甲基氨甲基尿苷；5-羧甲基氨甲基-2’-O-甲基-尿苷；5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷；二氢尿苷；二氢核糖基胸腺嘧啶；2’-甲基腺苷；2-甲基腺苷；N⁶,N-甲基腺苷；N⁶,N⁶-二甲基腺苷；N⁶,2’-O-三甲基腺苷；2-甲基硫-N⁶,N-异戊烯基腺苷；N⁶-(顺-羟基异戊烯基)-腺苷；2-甲基硫-N⁶-(顺-羟基异戊烯基)-腺苷；N⁶-环氧丙基氨甲酰基)腺苷；N⁶-苏氨酰基氨甲酰基腺苷；N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰基氨甲酰基腺苷；2-甲硫基-N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰基氨甲酰基腺苷；N⁶-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷；2-甲硫基-N⁶-羟基正缬氨酰基氨甲酰基腺苷；2’-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；肌苷；2’-O-甲基肌苷；1-甲基肌苷；1,2’-O-二甲基肌苷；2’-O-甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；N²-甲基鸟苷；N²,N²-二甲基鸟苷；N²,2’-O-二甲基鸟苷；N²,N²,2’-O-三甲基鸟苷；2’-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；7-甲基鸟苷；N²,7-二甲基鸟苷；N²,N²,7-三甲基鸟苷；怀俄苷(wyosine)；甲基怀俄苷；修饰不足的羟基怀丁苷；怀丁苷(wybutosine)；羟基怀丁苷；过氧怀丁苷；辫苷(queuosine)；环氧辫苷；半乳糖基辫苷；甘露糖基辫苷；7-氰基-7-去氮鸟苷；arachaeosine[亦称7-甲酰氨基-7-去氮鸟苷]；和7-氨甲基-7-去氮鸟苷。

本发明的单离的核酸分子可通过标准技术生产。例如，可使用聚合酶链反应(PCR)技术来获得含有本文中揭示的核苷酸序列的单离的核酸。多种PCR方法揭示于，例如，Dieffenbach和Dveksler编撰的《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer:ALaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995)中。通常，采用来自感兴趣区域末端的或超出该区域的序列来设计寡核苷酸引物，该引物在序列上与待扩增的模板的相反链一致或类似。也可使用多种PCR策略，通过该策略，可将位点特异性的核苷酸序列修饰引入模板核酸中。

单离的核酸亦可化学合成为单个核酸分子(如，使用自动DNA合成使用亚磷酰胺技术以3’至5’方向合成)，或合成为一系列寡核苷酸。例如，可合成一对或多对的长寡核苷酸(如，>50至100个核苷酸)，其含有所希望的序列，每一对含有互补性的短节段(如，约15个核苷酸)，因此，当该寡核苷酸对被退火时，形成双链。使用DNA聚合酶来延展该寡核苷酸，自每一寡核苷酸对均获得单链、双链核酸，该核酸随后被结扎入载体中。

本发明还包括令哺乳动物受试者体内被整合的前病毒HIV DNA失活的医药组合物。该组合物包括编码Cas核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种编码至少一种与前病毒HIV DNA中的靶标序列互补的gRNA的单离的核酸序列；该单离的核酸序列包括于至少一种表达载体中。优选的具体例中，该医药组合物包括第一gRNA和第二gRNA，其中，如先前所述，该第一gRNA以HIV LTR中的位点为靶向，而该第二gRNA以HIV结构性基因中的位点为靶向。

该医药组合物中内含的例示性表达载体包括质粒载体和慢病毒载体，但本发明并不限于这些载体。大量宿主/表达载体组合可用来表达本文中揭示的核酸序列。适当的表达载体包括，而不限于，源自诸如噬菌体、杆状病毒、及逆转录病毒的质粒和病毒载体。大量载体和表达系统可自Novagen(Madison,WI)、Clontech(Palo Alto,CA)、Stratagene(LaJolla,CA)、及英杰/生命技术公司(Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad,CA))等公司商购。标记物基因可将一可选择的表型赋予宿主细胞。例如，标记物可赋予对杀虫剂的耐药性，如对抗生素(如，卡那霉素、G418、争光霉素、或潮霉素)的耐药性。表达载体可包括一标签序列，该标签序列被设计用以促进对所表达的多肽的操控或检测(如，纯化或定位)。标签序列，如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血细胞凝集素、或Flag^TM标签(Kodak,New Haven,CT)序列典型被表达为与所编码的多肽融合。这些标签可被插入该多肽内的任何位置，包括羧基端和氨基端。

该载体亦可包括调节性区域。术语“调节性区域”指的是核苷酸序列，该核苷酸序列影响转录或转译的启动和速率、以及转录和转译产物的稳定性及/或移动性。调节性区域包括，而不限于，启动子序列、增强子序列、响应元件、蛋白识别位点、可诱导元件、蛋白结合序列、5’和3’未转译区域(UTR)、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、核定位信号、及内含子。

若需要，本发明的多核苷酸亦可与微传送载具如阳离子脂质体和腺病毒载体合用。对于用于脂质体制备、靶向及内容为传送的综述，见Mannino and Gould-Fogerite,BioTechniques,6:682(1988)。亦可见Felgner and Holm,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):21(1989)和Maurer,R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus,11(2):25(1989)。

本发明的组合物造成对前病毒HIV-1激活的阻抑，或所整合的HIV-1的部分或全部切除(实施例2和3)，本发明提供一种治疗被逆转录病毒如HIV感染的哺乳动物受试者的方法。该方法包括下述步骤：确定哺乳动物受试者被逆转录病毒感染，给药有效量的先前揭示的医药组合物，以及，治疗该哺乳动物受试者的逆转录病毒感染。

该方法代表对被整合的前病毒问题的技术手段，该技术手段是治疗和预防AIDS和其它逆转录病毒疾病所必需的。在HIV感染的极性期内，HIV病毒颗粒计入表达适宜的CD4受体分子的细胞内。一旦该病毒已经进入宿主细胞，编码HIV的逆转录酶即生成HIV RNA的前病毒DNA复本，且该前病毒DNA变为被整合入该宿主细胞的基因组DNA中。正是这一被该宿主细胞复制的HIV前病毒导致了新的HIV病毒体的释放，而该病毒体可随后感染其它细胞。

初次HIV感染在几周至几个月内平息，且典型后续为可能持续长达10年的临床长“潜伏”期。在此潜伏期内，可能没有临床症状或在外周血单核细胞中没有可检测的病毒复制，且在外周血中具有极少或没有可培养的病毒。但是，该HIV病毒以非常低的水平持续繁殖。在已经使用抗逆转录病毒疗法治疗的受试者体内，这一潜伏期可能延续数十年甚至更久。抗逆转录病毒疗法不阻抑低水平的病毒基因组表达，也不能有效地以被潜伏性感染的细胞如休眠记忆T细胞、脑巨噬细胞、小神经胶质细胞、星形胶质细胞及肠相关淋巴样细胞为靶标。因为本发明的组合物可令HIV前病毒失活或经其切除，采用该组合物的方法构成了对抗HIV感染的新的作用渠道。

当稳定地在潜在宿主细胞内表达时，本发明的组合物减轻或防止由逆转录病毒如HIV-1造成的新的感染(实施例3)。据此，本发明还提供一种用以降低处于感染风险下的哺乳动物受试者体内逆转录病毒感染如HIV感染风险的方法。该方法包括下述步骤：确定哺乳动物受试者处于HIV感染风险下，给药有效量的先前揭示的医药组合物，以及，降低该哺乳动物受试者的HIV感染风险。优选地，该医药组合物包括一种载体，该载体提供对至少一种先前枚举的稳定及/或可诱导的表达。

可使用该领域技术人员已知的多种途径制备根据本发明的医药组合物。例如，上述核酸和载体可配制于组合物中，该组合物可应用至组织培养中的细胞或给药至患者或受试者。这些组合物可以医药领域中已知的模式制备，且可通过多种途径给药，该途径取决于所希望的是局部给药或全身给药且取决于待处理的区域。给药可以是外部给药(包括眼部给药和给药至粘膜，包括鼻腔给药、阴道给药和直肠给药)、肺部给药(如，通过粉末或气溶胶的吸入或吹入，包括通过喷雾器进行；气管内给药、鼻内给药、表皮给药和透皮给药)、眼部给药、口服或肠胃外给药。用于眼部传送的方法包括外用给药(滴眼液)、通过气囊导管或通过外科手术置于饥饿墨囊内的眼部植入物进行的结膜下、眼周或玻璃体内注射或引入。肠胃外给药包括静脉、动脉、皮下、腹膜或肌肉注射或输液；或颅内给药，如鞘内或心室内给药。肠胃外给药可以是快速灌注方式，或可以是，例如，通过连续灌注泵进行。用于外用给药的医药组合物和配方可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂、粉剂等。传统医药载剂、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必需的或视需要使用。

本发明还包括医药组合物，其含有，作为活性成分，与一种或多种医药上可接受的载剂组合的本文中揭示的核酸和载体。本文中，术语“医药上可接受的”(或“药理上可接受的”)指的是，当酌情给药至动物或人时，并不产生副作用、过敏反应或其它不良反应的分子整体和组合物。本文中，术语“医药上可接受的载剂”包括可作为医药上可接受物质的介质而使用的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂等。在制作本发明的组合物时，典型将该活性成分与赋形剂混合，以赋形剂稀释或使用诸如胶囊、片、袋、纸张、或其它容器形式的此载剂封闭。当该赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体材料(如，生理盐水)，用作该活性成分的载具、载剂或介质。因此，该组合物可以是片剂、烷基、粉剂、菱锭剂、袋剂、锭剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶剂、糖浆剂、气溶胶剂(作为固体或处于液体介质内)、洗剂、乳霜、凝胶、软胶囊和硬胶囊、栓剂、无菌注射液、和无菌封装粉末的形式。如该领域已知的，稀释剂的类型可依据想要采取的给药途径而变。所得组合物可包括额外的剂，如防腐剂。一些具体例中，该载剂可以是，或可以包括，基于脂质或基于聚合物的胶体。一些具体例中，该载剂可以是配制为脂质体、水凝胶、微颗粒、纳米颗粒、或嵌段共聚物胶束的胶体。注意，该载剂材料可形成胶囊，且该材料可以是基于聚合物的胶体。

本发明的核酸序列可以传送至受试者的适宜细胞。这可通过例如使用聚合性、生物可降解微颗粒或微胶囊传送载具实现，其中，该载具的尺寸最适用于通过噬菌细胞如巨噬细胞的吞噬作用。例如，可使用直径大约为1至10μm的PLGA(聚-丙交酯-共-乙交酯)微颗粒。该多核苷酸被封装在这些微颗粒中，该微颗粒被巨噬细胞摄取并在该细胞内逐步被生物降解，从而释放多核苷酸。一旦被释放，该DNA即在该细胞内被表达。第二种类型的微颗粒并非意图被细胞直接摄取，而是主要用作核酸的缓释蓄积池，该核酸仅在通过生物降解而自该微颗粒释放后被细胞摄取。因此，这些聚合性颗粒应足够大至妨碍吞噬作用(即，大于5μm，优选大于20μm)。另一种实现该核酸的摄取的途径是使用脂质体，优选通过标准方法使用。可将该核酸并入这些传送载具中，或与组织特异性抗体一起并用，该抗体是，举例而言，以作为HIV感染的一般潜在蓄积池的细胞类型如脑巨噬细胞、小神经角质细胞、星形胶质细胞、及肠相关淋巴样细胞为靶标的抗体。或者，可制备由质粒或通过静电力或共价力附接至聚-L-赖氨酸的其它载体构成的分子复合体。聚-L-赖氨酸结合至可结合至靶标细胞上的受体的配位子。“裸DNA”(即，不具有传送载具)至肌肉内、皮内、或皮下位点的传送，是实现体内表达的另一手段。在相关的多核苷酸(如，表达载体)中，编码包含编码CRISPR相关的核酸内切酶的序列的单离的核酸序列以及导引RNA的核酸序列，被可操作地链接至启动子或增强子-启动子组合。启动子和增强子如上文所述。

一些具体例中，本发明的组合物可配制为纳米颗粒，例如，由与DNA复合的高分子量线性聚乙烯亚胺(LPEI)芯以及环绕该芯的聚乙二醇改性(PEG化)低分子量LPEI壳体构成的纳米颗粒。

该核酸和载体也可应用至装置(如，导管)的表面或包含在泵、贴、或其它药物传送装置中。本发明的核酸和载体可在医药上可接受的赋形剂或载剂(如，生理盐水)的存在下，单独给药或以以混合物方式给药。该赋形剂或载剂是基于给药模式和给药途径而选择的。适当的医药载剂、以及医药制剂中所使用的医药必需品揭示于本领域的注明参考书《雷明顿医药科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin))以及USP/NF(《美国药典和国家处方集》(United States Pharmacopeia and the National Formulary))中。

一些具体例中，该组合物可配制为纳米颗粒，该纳米颗粒封装编码Cas9或变体Cas9的核酸、以及至少一种与靶标HIV互补的gRNA序列；或其可包括编码这些组分的载体。或者，该组合物可配制为纳米颗粒，该纳米颗粒封装由本发明的一种或多种核酸组合物编码的CRISPR相关的核酸内切酶多肽。

无论组合物是作为核酸或是多肽给药，它们均以促进哺乳动物细胞对其摄取的方式配制。可用的载体系统和配方如上文所述。一些具体例中，该载体可将该组合物传送至特定的细胞类型。但本发明并非受限于此，也可采用其它DNA传送方法，如使用诸如磷酸钙、DEAE葡聚糖、脂质体、脂质复合体、表面活性剂和全氟液体化学品进行的化学转染，以及物理传送方法如电穿孔、微量注射、弹道颗粒、和“基因枪”系统。

其它具体例中，该组合物包含已经使用一种或多种Cas/gRNA载体改造或转染的细胞。一些具体例中，本发明的方法可通过间接体内方式使用。换言之，受试者的细胞可自其身体移除，在培养中以该组合物处理以切除例如HIV病毒序列，并将经处理的细胞送回受试者体内。该细胞可以是该受试者的细胞，或他们可以是单体型匹配的或细胞系。可辐照该细胞以防止复制。一些具体例中，该细胞是人类白细胞抗原(HLA)匹配的、自体的、细胞系、或其组合。其它具体例中，该细胞可以是干细胞，例如，胚胎干细胞或人工多能干细胞(诱导多能干细胞(iPS细胞))。已经从众多动物物种包括人类构建了胚胎干细胞(ES细胞)和人工多能干细胞(诱导多能干细胞，iPS细胞)。这些类型的多能干细胞将会是用于再生医学的最有用的细胞来源，因为，通过对它们的分化进行适宜的诱导，这些细胞能分化为几乎所有器官，同时保持它们活跃分化的能力并维持它们的多能性。特别地，与通过摧毁胚胎生产的ES细胞相比，iPS细胞能从自源体细胞构建，并因此不大可能造成伦理和社会问题。再者，iPS细胞是自源性细胞，这令其可能避免排异反应，而排异反应是再生医学或移植疗法的最大阻碍。

可通过该领域中已知的方法如传送siRNA的方法，容易地将该单离的核酸传送至受试者。一些方面，该Cas可以是其中包括Cas分子活性域的片段，由是削减了分子的尺寸。因此，临床上可使用Cas9/gRNA分子，类似于现有基因疗法所采取的途径。特别地，可研发用于受试者的Cas9/多样gRNA稳定表达肝细胞或用于细胞移植疗法的iPS细胞、以及疫苗。

根据所创建的方法，制备用于再输注的转导细胞。在约2至4周时间的培养后，细胞的数目可达1×10⁶和1×10¹⁰个。就此而言，不同患者之间以及不同细胞类型之间的细胞的生长特征可变。将该转导细胞再输注之前约72小时，取等量小样进行表型分析并计算表达该治疗剂的细胞的百分比。对于给药，以通过该细胞类型的LD₅₀、对该细胞类型在适用于该患者体重和整体健康状况的多种浓度下的副作用来确定的速率对本发明的细胞给药。给药可经单剂或多剂完成。成人干细胞亦可使用刺激其自组装或间隔序列产生并离开的外源性执行因子动员，该组织包括，但不限于，骨髓和脂肪组织。

治疗的方法

某些具体例中，令细胞或受试者体内的逆转录病毒基因组失活的方法，包含令该细胞与医药组合物接触或将该医药组合物给药至该受试者，其中，该医药组合物包含治疗有效量的编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，该gRNA与逆转录病毒基因组中的靶标核酸序列互补。

其它具体例中，抑制细胞或受试者体内的逆转录病毒复制的方法，包含令该细胞与医药组合物接触或将该医药组合物给药至该受试者，其中，该医药组合物包含治疗有效量的编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，该gRNA与逆转录病毒基因组中的靶标核酸序列互补。

在治疗逆转录病毒感染如HIV感染的方法中，可使用标准临床测试如用以检测HIV抗体或HIV多肽p24在受试者血清中的存在的免疫检验、或通过HIV核酸扩增检验来鉴别受试者。提供给受试者并导致该感染症状的完全消退、该感染症状的严重性下降、或减缓该感染进展的此组合物的量被视为治疗有效量。本发明的方法也可包括用以帮助优化剂量和给药时间以及预期后果的监控步骤。本发明的一些方法中，首先可确定患者是否具有潜伏性HIV感染，随后确定是否使用本文中揭示的一种或多种组合物治疗该患者。一些具体例中，该方法可进一步包括下述步骤：确定由该患者携带的特定HIV的核酸序列，随后设计待与那些特定序列互补的导引RNA。例如，可确定受试者的LTR U3、R或U5区域，或pol、gag、或env基因区域的核酸序列；随后，设计或选择待与该患者的序列精确互补的一种或多种gRNA。本发明提供的新颖的gRNA极大增强了制订有效治疗的机会。

在降低HIV感染风险的方法中，处于HIV感染风险下的受试者可以是，例如，任何从事不安全性行为的性活跃个体，即从事性活动而不使用安全套的个体；具有另一性传播感染的性活跃个体；静脉吸毒者；或未受割礼的男性。处于HIV感染风险下的受试者可以是，例如，其职业可能将他或她带至与HIV感染人群接触的个体，如医护工作者或现场急救人员。处于HIV感染风险下的受试者可以是，例如，监禁场所的同住人员或性工作者，换言之，以性活动获取货币性收益或非货币性收益如食品、药品或居所的个体。

本发明以包括一种试剂盒，该试剂盒包含编码CRISPR相关的核酸内切酶如Cas9核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种编码与HIV前病毒中靶标序列互补的gRNA的单离的核酸序列。或者，至少一种该单离的核酸序列可编码在载体如表达载体中。该试剂盒的可能用途包括治疗或预防HIV感染。该试剂盒优选包括使用说明书、注射器、传送装置、缓冲液无菌容器和稀释剂、或治疗或预防所需的其它试剂。该试剂盒亦可包括，如适用于所希望的用途，适当的稳定剂、载剂分子、芳香剂等。

尽管上文已经揭示了本发明的多种具体例，应理解，它们仅通过实例的途径表示而非限制。根据本文中所揭露的内容，可对所揭露的具体例做出大量改变而不悖离本发明的精神或范畴。因此，本发明的广度和范畴不应为上文揭示的任何具体例所限。

本申请中引用的所有出版物和专利通过引用而并入本文，从而以每一出版物或专利被单独表示的程度用于全部目的。通过读本文件中各种参考文献的引用，申请人并不承认任何特定参考文献是本发明的“现有技术”。

[实施例]

实施例1：材料和方法

慢病毒载体中sgRNA的克隆：使用最佳程度的高效和高度特异性的生物信息学spCas9-sgRNA设计工具，我们设计了位于HIV-1LTR-U3区域内的20个sgRNA靶标位点，以及用于Gag的4种sgRNA、用于Pol的2种sgRNA和用于Env的2种sgRNA(表1)。我们将这些sgRNA种子序列全部克隆入从sgRNA慢病毒载体(Addgene#50946)修饰的修饰sgRNA表达pKLV-Wg慢病毒载体中(图1B)。简而言之，pKLV-Wg载体以BbsI消解并以热敏磷酸酶(AntarcticPhosphatase)处理，且线性化的载体以核苷酸快速移除试剂盒(Qiagen)纯化。将等量的正义导引和反义导引(100μM，1μl)与多核苷酸激酶(PNK，1μl)、1x PNK缓冲液和1mM ATP混合，在37℃培养30分钟，之后在PCR机械中退火(95℃，5分钟；-1℃/循环15秒，70次循环)。以1:100稀释经磷酸化的寡核苷酸双链(10μM)，以获得工作溶液(100nM)。随后，将1μl寡核苷酸双链(0.1pmol)与3.5μl BbsI消解的pKLV-WG载体(0.015pmol)、5μl 2x T7连接酶反应缓冲液和0.5μl T7DNA连接酶(NEB)混合。将该混合物于室温培养15至30分钟，在冰上骤冷，随后转化为Stabl3胜任细胞。选取2至4种克隆体进行PCR，该PCR使用T351(U6/5’)和sgRNA反向引物完成。令2种PCR阳性克隆体在LB/Amp培养基中于37℃生长过夜。次日，将小规模制备的质粒DNA送至Genewiz Inc.，使用T428(hU6-序列/5'/F)进行测序。通过使用GeneRunner程序进行的序列分析证实，整个sgRNA表达组件包括U6启动子、sgRNA和poly T终止子。

EcoHIV-荧光素酶报告基因检验：在96孔板内，37℃下，在5％CO₂的潮湿气氛中，在含有10％FBS和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的高葡萄糖DMEM中培养HEK293T细胞(5x 10e4/孔)。次日，通过标准磷酸钙沉淀使用EcoHIV-eLuc报告基因载体、pLV-Cas9-RFP载体、和所标注的表达sgRNA的pKLV-Wg载体共转染该细胞。转染2天后，使用ONE-Glo荧光素酶检验系统(Promega)制备细胞裂解液，并在2104多标记微孔板检测仪(PerkinElmer)中测量荧光。数据表示4种独立转染的均值±SE。计算单个或成对的sgRNA与空sgRNA载体对照相比的相对变化。

PCR基因分型、TA克隆和Sanger测序：以EcoHIV-eLuc报告基因、pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP和所标注的gRNA表达载体于96孔板中共转染HEK293T细胞。2天后，以90μl的50mMNaOH在95℃裂解细胞10分钟，并以10μl的1M Tris-HCl中和。粗提取物直接用于PCR，该PCR使用Terra PCR直接聚合酶混合液(Clontech)和所标注的PCR引物完成。进行35次循环的两步标准PCR，该PCR包括：68℃退火/延伸，1分钟；以及98℃，15秒。产物以1.5％琼脂糖凝胶解析。将感兴趣的谱带凝胶纯化，并克隆至pCRII T-A载体(Invitrogen)中，通过在Genewiz使用通用T7及/或SP6引物测序而测得每个克隆体的核苷酸序列。

实施例2：HIV-1gRNA筛选和体外HIV-1根除的功能表征

为了拓展对CRISPR介导的HIV前病毒基因组编辑有效的gRNA谱，发现并筛选候选gRNA在阻抑HIV表达中的有效性及其诱发宿主细胞中HIV-1前病毒基因组的删除或根除的能力。

通过生物信息学过程发现对于HIV-1基因组中的靶标位点为特异性的备选gRNA。选择最有可能提供有效基因编辑的gRNA，且该gRNA具有最小脱靶潜力，换言之，对宿主基因组中的位点造成损害的潜力。用于备选gRNA的位于LTR的U3调节性区域内的靶标位点种子序列显示于图1D中。该gRNA包括LTR 1、LTR 2、LTR 3、LTR A、LTR B、LTR C、LTR D、LTR E、LTR F、LTR G、LTR H、LTR I、LTR J、LTR K、LTR L、LTR M、LTR N、LTR O、LTR P、LTR Q、LTRR、LTR S、LTR T。这些gRNA的序列显示于表1中。这些备选gRNA中的大多数可配对用于与Cas9切口酶和RNA引导FokI核酸酶合用，可将潜在的脱靶效应降低1,500倍。以结构性gag和pol基因中的位点为靶向的备选gRNA在图1C和3A中以箭头标注。这些gRNA包括gag A、gagB、gag C、gag D、pol A、及pol B。它们的序列显示于表1中。如图1B中的下图所示，备选gRNA被克隆入慢病毒报告基因载体中。如图1B中的上图所示，spCas9也被克隆入慢病毒报告基因载体中。

使用HIV报告基因构造——EcoHIV-eLuc——用于sPCas9的报告基因表达构造，以及一种或两种用于gRNA的报告基因表达构造转染HEK293T宿主细胞。对照细胞接受对照构造(“LTR O”)。2天后，使用ONE-GLO^TM荧光素酶检验系统测量细胞裂解液中的荧光素酶活性。

如通过荧光骨扫描表达的降低所测定的，单独给药的大多数备选LTR gRNA在阻抑宿主细胞中HIV-1的表达方面有效(图2A)。这些gRNA随后被共转染入具有以gag或pol基因中的位点为靶向的gRNA的多种组合中。显示在图2B和2C中横坐标上的组合包括Gag D与LTR1、LTR 2、LTR 3、LTR A、LTR B、LTR C、LTR D、LTR E、LTR F、LTR G；LTR H、LTR I、LTR J、LTRK、LTR L、LTR M；LTR N、LTR O、LTR P、LTR Q、LTR R、LTR S、或LTR T之一的组合；以及LTR 3与Gag A、Gag B、Gag C、Gag D、Pol A、或Pol B之一的组合。

大多数的单一gRNA(图2A)抑制了本构荧光素酶活性，但一些gRNA增强了报告基因活性，甚至无效。该数据提示，在LTR内的单一位点编辑诱发了InDel突变，而该突变可能影响用于HIV-1LTR启动子活性的转录活化因子或阻抑因子的结合。

但是，Gag-D的gRNA与任何LTR-gRNA的配对均将荧光素酶活性降低了64至96％(图2B)。这些数据表明，所设计的gRNA全部有效地在质粒水平上诱发了靶标位点的基因编辑。Gag与任何LTR-sgRNA的组合将删除LTR的核酸启动子，并因此诱发启动子活性的急剧下降。剩余的报告基因荧光素酶活性可反映不含spCas9或两种sgRNA的小集落的EcoHIV报告仅表达细胞。注意，下降效率需要相同细胞内存在全部4种质粒：EcoHIV-eLuc、spCas9、两种sgRNA。

与任何所涉及的Gag或Pol gRN配对的ALTR-3gRNA也将荧光素酶报告基因活性急剧降低了73至93％(图2C)。这些数据表明，全部所涉及的以结构性Gag或Pol区域为靶向的gRNA有效地在质粒水平上诱发了靶标位点的基因编辑。LTR-3与结构性区域内任何sgRNA的组合将会删除LTR的核心启动子以及切割位点之间的结构性基因组，并因此诱发启动子活性的急剧下降。这一概念验证可应用于任何LTR-sgRNA以及以两端LTR之间的结构性区域如Gag、Pol和Env或任何其它非结构性区域为靶向的任何其它sgRNA。残留的报告基因荧光素酶活性可反映不含spCas9或两种sgRNA的小集落的EcoHIV报告仅表达细胞。注意，下降效率需要相同细胞内存在全部4种质粒：EcoHIV-eLuc、spCas9、两种sgRNA。

之后，确定对HIV-1表达的阻抑是否反映HIV-1前病毒基因组节段的删除。以EcoHIV-eLuc报告基因、pLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP和gRNA表达载体转染HEK293T细胞。2天后，以50mM NaOH在95℃裂解细胞10分钟，并以1M Tris-HCl中和。粗提取物直接用于使用Terra PCR直接聚合酶混合物(Clontech)和所标注的PCR引物进行的PCR。

当使用第一组引物时(图3A)，切割所设计的靶向位点后的PCR片段显示了20种LTRsgRNA中的17种的预设尺寸。仅LTR-F、LTR-G和LTR-K未展现根除，表明它们不能裂解5’-LTR或裂解效率较低。这与图2A中显示的使用LTR-F、LTR-G及LTR-K单一sgRNA转染所获得的无效或低效结果相一致。在有效的sgRNA中，sgRNA LTR具有最高的通过切割片段与相应未切割片段的比值检测的切割效率。有趣的是，在大多数配对中观察到了额外的大于预设切割片段尺寸的谱带。

当使用第二组引物时(图3B)，在全部样品中均观察到两条表示非特异性PCR产物的弱谱带。但是，在切割所设计的靶向位点后的独特的PCR片段显示了20种LTR sgRNA中的16种的预设尺寸。在有效的sgRNA中，sgRNA LTR-Q、L、B、S、O、C、I具有最高的通过预设PCR片段的强度检测的切割效率。

接着，检查以LTR为靶向的sgRNA与多种结构性基因的组合。该组合标注于图3C中。在LTR-1sgRNA、LTR-2sgRNA、LTR-3中，LTR-1显示最优效率。Gag-A、C、D和Pol-A、B展现了强烈的根除效率。Gag-B显示无裂解(为PCR重复所证实，右图)。再一次地，在用于5’LTR裂解的配对中，观察到了额外的尺寸大于预设切割片段的谱带。

还发现，与LTR U3区域内的靶标位点互补的gRNA对也造成了HIV-1前病毒基因组中的删除。如先前所述实施样品的制备和直接PCR。提取切割后的PCR片段，进行TA克隆和Sanger测序(图4)。代表性的TA克隆和Sanger测序证实，LTR-1与d LTR-3之间被删除了296bp，且两个切割位点之间被额外插入了180bp。15种克隆体的测序显示相似的完美结扎模式，且两个切割位点之间并无任何插入删除突变。通过NCBI Blast，该额外的180bp插入序列与载体序列匹配。

总体来看，该结果显示，大多数的备选gRNA在根除所选择的两个靶向位点之间的预设HIV-1基因组序列方面和阻抑前病毒表达方面有效，如通过荧光素酶报告基因活性所显示的。特别地，病毒结构性gRNA与一种或两种LTR gRNA的组合提供了更高效的基因组根除。这些实验的结果拓宽了能用于CRISPR系统中以造成HIV-1基因组有效裂解的gRNA谱。

实施例3：用于使用CRISPR/Cas9基因编辑系统从潜伏性感染的T细胞根除被整合的HIV-1基因组的新颖gRNA组合和载体系统

以进一步拓宽对抗HIV-1的有效gRNA谱以及增加将gRNA和Cas9传送至细胞的灵活性为目标，进行实验。

首先测试组合治疗策略。该治疗采用gRNA LTR B’与LTR A的新颖组合，该组合先前揭示于Hu,et al,2014中。LTR A和LTR B’的序列显示于图11A中，它们在HIV-1LTR中的位置标注在图5A至5D中。

Cas9、LTR A和LTR B’gRNA的组合表达废止了潜伏性HIV前病毒的活性，并造成前病毒序列的切除：在Jurkat2D10报告基因T细胞系中进行实验，该实验以图解法表示在图6A中。这一细胞系含有被整合的、转录潜伏性HIV-1前病毒，且eGFP代替Nef作为前病毒活化的报告基因。由使用佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-醋酸酯(PMA)或曲古抑菌素A(TSA)的治疗诱发活化。该被整合的HIV-1报告基因序列显示在图6A中。被诱导的(右图)和未被诱导的(左图)2D10细胞的荧光显微照片显示在图6B中。被诱导的(右图)和未被诱导的(左图)2D10细胞的流式细胞检测分析显示在图6C中。

使用10μg的对照pX260质粒或各5μg的pX260LTR-A和pX260LTR-B’质粒(NeonSystem,Invitrogen,3×10ms/1350V脉冲)对2D10报告细胞(2×10⁶个/情况)进行电穿孔。48h后，将培养基替换为含有嘌呤霉素0.5μg/ml的培养基。进行一种的选择之后，移除嘌呤霉素，令细胞再生长一周。该细胞也表达FLAG标记的Cas9。

之后，将细胞稀释为10细胞/ml的浓度，并以50μl/孔置于96孔板中。2周后，使用Guava EasyCyte Mini流式细胞仪筛选单个细胞克隆体的GFP标记的HIV-1报告基因再激活(12h PMA 25nM/TSA 250nM处理)。

将表达Cas9、LTR A和LTR B’的克隆体与仅表达Cas9的克隆体比较(图7A至7C)。发现，仅有表达Cas9、LTR A和LTR B’的克隆体未在PMA诱导后成功显示HIV-1报告基因再激活(图7B，下图)。相比之下，仅表达Cas9的克隆体确实显示了HIV-1报告基因再激活，这为EGFP表达所证明(图7B，上图)。

之后，确定潜伏性报告基因HIV-1前病毒再激活的废止是否可归因于前病毒序列从宿主基因组的成功切除。令源自在先前实验中分析的克隆体的DNA进行PCR，以扩增该前病毒env基因序列基序RRE、或位于被整合的报告基因前病毒侧翼的基因组序列(MSRB1基因)。该引物的T定位显示于图8A中。

PCR分析显示，表达Cas9及LTR A/B’组合的克隆体未成功显示包括RRE和MSRB1在内的PCR产物，表明包括那些序列的DNA被切除。相反，RRE和MSRB1被扩增，且在仅表达Cas9的克隆体中可容易地检测到(图8B)。长范围PCR基因分型证实，LTR A/B组合的表达导致了在5’U3区域与3’U3区域间延伸的652bp序列被切除(图8C)。对来自染色体16中整合基因座的裂解套索的测序，进一步证实了该切除(图8D)。合起来，该结果证实，由LTR A/B’和Cas9表达造成的潜伏性HIV-1前病毒再激活的废止，是由于前病毒序列被从宿主基因组切除而造成的。

还发现，LTR A/B’和Cas9的稳定表达保护2D10克隆体不产生HIV-1的新感染。通过西方印迹法表征克隆体的Cas9表达(图9B)，并通过反向PCR分析来表征LTR B’的表达(图9C)。该克隆体以HIV-1NL4-3-EGFP-P2A-NEF报告病毒感染，并通过FACS分析监控感染的进展。仅有表达LTRA/B’和Cas9两者的克隆体抵抗了HIV-1感染。这通过EGFP表达水平相对于缺乏LTR A/B’(ctrl 7)或Cas 9(AB 8)的克隆体剧烈降低而显示(图9A)。

以慢病毒传送Cas9/gRNA令对前病毒序列的有效且事件受控的靶向成为可能：之后，确定慢病毒载体能否用于宿主细胞中Cas9/gRNA组分的表达。慢病毒载体提供通用且灵活的表达手段，且可使用多种药物可诱导的慢病毒载体。以表达RFP-Cas9(红色荧光)及/或LTR A/B’gRNAs(BFP标记物，蓝色荧光)的慢病毒以MOI 5转导Jurkat 2D10(图10A)。72小时后，使用PMA/TSA处理将GFP报告病毒再次激活，并通过流式细胞分析定量。散点图分析显示于图10B中。HIV活化因为散点图在诱导时的上移(绿色)而可检测(如，图10B左上图对左下图)。可见，仅有使用Cas9和LTR A/B’转导的细胞显示了显着的并未展现该绿色上移的细胞分数(图10B，右下图)。结果证实，可通过慢病毒载体有效地传送Cas9/gRNA。

Cas9/LTR A/B’的表达未造成可检测的脱靶效应且对邻近基因表达的改变极小：如果通过CRISPR编辑进行的HIV-1前病毒的有效切除伴随有在含有类似于靶标序列的序列的正常宿主基因中的诱导突变，则该切除近乎无用。在HIV-1基因组已经被成功根除的Jurkat克隆体中，检查六个用于LTR A/B’的预设/可能的脱靶位点。LTRA和LTRB’的序列显示在图11A中。无论通过Surveyor检验反应(图11B)或Sanger测序(图11C)，均未显示插入删除突变。HIV-1报告基因整合位点在染色体16中MSRB1基因的第二外显子中的定位、以及邻近基因，显示在图11D中。在HIV-1序列根除后，通过qRT-PCR测量与该整合位点邻近的基因的水平，并将该水平与对照细胞细胞中的表达水平比较。在图11E中，该结果显示，使用Cas9和LTR A/B’进行的有效处理，对于与被切除的HIV序列相邻的基因的表达上并无重大影响。

实施例4：对以规则性和结构性HIV-1病毒基因组为靶向的导引RNA用于医治AIDS的功能筛选

本研究中，以HIV-1LTR和病毒结构性区域为靶向的最佳gRNA被证实，可有效地根除HIV-1基因组的gRNA配对得以优化。

使用生物信息学共价设计高特异性的gRNA，并使用高通量HIV-1荧光素报告基因检验和快速直接PCR基因分型来评估该gRNA引导Cas9以裂解HIV-1前病毒DNA的能力。

表1.用于以HIV-1LTR、Gag和Pol为靶向的gRNA的寡核苷酸，以及PCR引物

结果

对高效和低脱靶的sgRNA的生物信息学筛选。靶标gRNA的效率和特异性对于Cas9/gRNA在感染性疾病中的应用是关键关注点。已经研发出几种用于设计和选择用于spCas9-gRNA系统的gRNA的计算程序，其中，使用20bp种子序列和NRG PAM。尽管大多数gRNA设计程序被研发用以预测脱靶效应，仍有非常少的程序能预测裂解效率。采用下述标准，将20种以HIV-1LTR为靶向的gRNA设计为具有高评分的裂解效率和对人类基因组(表1)的特异性：(1)以LTR-U3启动子的-18至-418bp区域为靶向，以打断HIV-1初始转录(并阻抑病毒产生)，而在大多数LV中这一400bp区域被排除，因此避免了LV自裂解；(2)避免可能由于高同源性而影响宿主细胞基因表达的转录因子结合位点(图1C)；(3)匹配LTR的两端，以令LTR之间的前病毒DNA的整体消除成为可能；(4)脱靶评分为大于50％；以及(5)对于双spCas9切口酶或二聚体RNA引导的FokI核酸酶的适用性。一些以结构性区域Gag和Pol为靶向的gRNA(图1C)具有获得gRNA最优组合以根除整个HIV-1基因组的希望。由于不同品系间Env结构性序列的较低保守性，因此不选择这一结构性区域。基于下述原因，独立选择用于表达spCas9和gRNA的LV基因传送系统(图1B)：(1)在难以转染的HIV潜伏性细胞系、动物研究和潜在临床应用中，LV自身提供多种益处的高效基因疗法(integration-free LV；Hu P,et al.Mol TherMethods Clin Dev 2015,2:15025；Liu KC,et al.Curr Gene Ther 2014,14:352-364)；(2)独立的spCas9LV确保了对大尺寸spCas9基因的良好的封装效率；(3)独立的表达gRNA的LV可用于将多样gRNA表达级联克隆入一种载体中，以获得良好的封装效率。

在HEK293T细胞中进行功能筛选以鉴别有效的gRNA。对于最佳靶标的快速功能筛选，使用高通量Envision多板酶标仪实施EcoHIV-eLuc报告基因检验。基于下述缘由选择该EcoHIV-eLuc报告基因：(1)其含有HIV-1复制所需的除HIV Env外的全部组分；(2)由于Env删除，其便于以生物安全等级II容器处置；以及(3)生物发光比荧光更敏感，且该eLuc包含基因可用来见得少于10个的单个细胞(Song J,et al.J Gen Virol 2015,96:3131-3142)。因为使用成本有效的磷酸钙沉淀方法的转染效率高，所以选择HEK293T细胞系。使用单一gRNA转染发现，大多数以LTR启动子和该结构性区域为靶向的gRNA仅会导致EcoHIV前病毒报告基因生产的边际下降，但启动子活性有某种程度的增长，或无效(图2A、2B)。启动子活性的该增长与最近的报导相一致，该报导指出，神经元早期响应基因的启动子中的spCas9/gRNA诱导的DSB刺激它们的表达(Madabhushi R,et al.Cell 2015,161:1592-1605)。假定单一gRNA诱导靶标位点的单一切割，在靶标区域内生成InDel突变及/或造成LTR两端之间的整个前病毒DNA的删除。启动子中的突变可能影响转录活化因子及/或阻抑因子的功能活性，这可能导致转录活性的增加或降低。结构性区域中的突变可能造成HIV-1结构性蛋白开放阅读框的位移，并因此降低eLuc报告基因的表达。

为了获得对用于功能性裂解的有效gRNA的更可靠且敏感的筛选，共转染该成对的gRNA：每一LTR gRNA vs.以该结构性区域为靶向的一种gRNA。使用这一策略，观察到了报告病毒更剧烈的减少，这是由于5’或3’LTR与该结构性区域之间的大片段被删除。如图2B中显示的一实施例，GagD与任一LTR-gRNA之间的所有组合均显着降低eLuc表达(64至96％)，这比使用单一gRNA更强烈。半数的LTR-gRNA(10/20)显示，eLuc活性降低了>90％。同样，如图2C中显示的另一实施例，与任一GagA-D或PolA-B配对的LTR-R gRNA将荧光素酶报告基因活性显着降低至7至23％。对用于配对的GagD或LTR-R的选择还基于其可用于金黄色酿脓葡萄球菌Cas9系统的PAM位点和它们的适用于HIV-1潜伏性细胞系的靶向位点(Jadlowsky JK,et al.Mol Cell Biol 2014,34:1911-192)以及Tg26转基因小鼠(Kopp JB,et al.ProcNatl Acad Sci U S A 1992,89:1577-1581)，其中，部分的Gag和整个Pol序列被删除。这些数据提供证据证明，LTR-gRNA与结构性gRNA的组合是使用高通量HIV-1eLuc报告基因检验来筛选有效gRNA的更好且更容易的策略。所设计的gRNA全部可用于降低EcoHIV-eLuc报告基因的表达，这与通过生物信息学分析获得的高评分效率预测相一致。

使用直接PCR基因分型鉴别有效的gRNA。为了验证这些备选gRNA是否具有如所设计的裂解适宜靶标的功能，使用具有成对gRNA以及如所标注的相应PCR引物的DNA样品实施直接PCR基因分型分析(图3D)。该直接PCR途径并不需要DNA提取和纯化，并因此更便于基因型筛选。当使用一种以结构性区域为靶向的gRNA来与LTR靶向位点配对时，PCR基因分型显然生成新片段(为了便于表述，指定为删除)，该新片段源自在删除5’LTR至Gag之间的片段后剩余(残留)的病毒LTR和Gag序列(图3E，引物T361/T458)。与eLuc报告基因检验一致，几乎所有的gRNA皆诱发各种程度的野生型谱带的减少，由于其大小(1.3kb)，该谱带可在标准PCR条件下在5’-LTR/Gag上轻易地扩增。裂解之后，在大多数组合中检测到了如所设计的各种程度的删除(图3E)。有趣的是，在大多数组合中，在5’-LTR-Gag裂解时观察到了大于预设删除的其它片段(指代为插入)(图3E)。野生型谱带强度的定量分析显示，LTR-O具有最高的效能，之后为I、C、A，如方框中所示(图3E)。这一野生型谱带裂解效率模式并不完全与eLuc报告基因活性的下降模式(图2B)相关联，很可能是因为在混合群落中，小尺寸的产物通常更容易进行PCR产物的扩增。另一方面，一些配对中野生型谱带的微弱下降可能是gRNA靶标位点内不同程度的未产生任何片段化删除或插入的小InDel突变(一些核苷酸内)的结果。为了避免PCR优先扩增的潜在影响，使用覆盖3’-LTR和Gag的引物实施PCR基因分型(图3E、3I、3J)，预期其生成7kb野生型PCR产物，而该产物不大可能通过所使用的PCR设定扩增。通过单一PCR产物所检测的gRNA中的片段化删除模式(图3E、3I、3J)与通过相对比值改变而显露的模式相一致(图3E)。在全部四组PCR基因分型反应中，LTR-K与GagD的配对均未展现删除或插入的片段化谱带(图3E、3F、3I、3J)，这与野生型谱带仅下降7％相关联(图3E)。在一组PCR反应中，LTR-F与GagD的配对显示弱的删除谱带(3I)，这与野生型谱带下降17％相关联(图3E)。LTR-G、P与GagD的配对显示，野生型谱带下降了约50％，这是5’-LTR-Gag裂解(图3E)或Gag-3’-LTR裂解(图3F、3I、3J)中该删除的结果。当使用LTR-R与GagA至D及PolA至B中的任何一种配对时，使用所标注的相应引物的PCR基因分型也在除Gag-B gRNA外的全部测试gRNA中，不同程度地生成了预测的新片段(删除)(图3G、3H)和在5’-LTR/Gag上的额外插入(图3G)，这展现了非常弱的编辑能力(图3G)。但是，这些具有若或如删除基因分型的组合仍全部显示剧烈下降的EcoHIV-eLuc报告基因活性(图2B)。这可能归因于两种gRNA质粒无一或仅一种被转染至相同细胞内，其中，该单一gRNA在诱导小的InDel突变中保持高度有效。综合来看，这些数据证实，直接PCR基因分型提供一种可靠且快速的用以验证片段性删除及/或插入的存在的工具。但是，使用多种gRNA进行的对有效HIV-1根除的评估，需要联合通过病毒报告基因检验测定的功能降低与通过5’-LTR或3’-LTR引导的PCR基因分型测定的前病毒DNA片段性切除。

通过TA克隆和Sanger测序验证片段性插入/删除突变。为了进一步验证spCas9/gRNA的裂解效率并检查裂解后删除/插入突变的情况，选择三种代表性的PCR基因分型样品进行TA克隆和Sanger测序。LTR-R/GagA的成对表达造成LTR-R与GagA靶标位点之间519-bp的片段被删除(图12A)。LTR-L/GagD共表达(图12B)及LTR-M/GagD共表达(图12C)分别导致每一对靶标位点之间772-bp或763-bp的片段被删除。再者，它们造成不同程度或类型的小InDel。一些例子中，鉴别出了大的插入的额外序列(如，159至359bp)(图3E、12B、12C)。NCBIBlast分析显示，这些额外的序列源自外源性载体而非内源性宿主细胞基因。这些结果表明，这些备选gRNA的大多数可有效地介导通过切除或插入/删除进行的被整合HIV基因组的靶向断裂。

讨论

多样gRNA可诱导靶标位点之间大片段的删除(Hu W,et al.Proc Natl Acad SciU S A2014,111:11461-11466)，这提供了可靠的用于评估Cas9/gRNA的DNA裂解效率的措施。本研究中，通过筛选26种gRNA的多种多样性而进一步验证了这一概念证明。表明，大多数所涉及的gRNA在根除两个所选择的靶标位点之间的预设HIV-1基因组序列方面高度有效，导致HIV-1报告病毒的显着切除。特别地，病毒结构性gRNA与一种或两种LTR gRNA的组合提供了高得多的基因组根除效率，以及使用直接PCR基因分型和高通量报告基因筛选的更容易实现的途径。被选择在这一研究中用于切除HIV-1前病毒DNA的gRNA的有效性和特异性，使人看到了使用Cas9/gRNA技术应成功进行临床前动物研究和临床患者研究的希望，因为：(1)这些gRNA可用作即用型选择来源以研发病毒和非病毒基因疗法；(2)对于个体HIV-1患者，这些gRNA可作为主体用来筛选被特异性地设计用于任何HIV-1隔离群的新gRNA，而无论该HIV-1是否具有高突变率；(3)容易的gRNA克隆、快速的报告基因筛选和可靠的直接PCR基因分型提供了使用Cas9/gRNA进行个性化医疗的实际应用的可行性。

在裂解预期的靶标位点方面，并不是全部所设计的gRNA都展现所需要的活性。迄今为止，已经研发了若干用来评估以Cas9/gRNA技术诱导的基因组编辑效率的途径。已经使用宿主基因基因组作为设计靶标，测试了用于持续改进的预测效率的计算机程序(DoenchJG,et al.Nat Biotechnol 2014,32:1262-1267；Gagnon JA,et al.PLoS One 2014,9:e98186；Liu H,et al.Bioinformatics 2015)，但这些程序在用于外源性基因组如感染性病毒时，可能并不可靠。经由PCR克隆进行的对靶标区域的Sanger测序提供了用于测定基因组编辑效率的高灵敏度和特异性(Sander JD,et al.Nat Biotechnol 2011,29:697-698)，但是，对于高通量筛选来说，这一方法太过消耗人力。基于误配的Surveyor检验(Qiu P,etal.Biotechniques 2004,36:702-707；Kim JM,et al.Nat Commun 2014,5:3157；DahlemTJ,et al.PLoS Genet 2012,8:e1002861)和高分辨率熔体分析(Bassett AR,Liu JL.JGenet Genomics 2014,41:7-19)在检测小InDel突变方面敏感，但特异性差，这使得它们容易得出假阳性结果。限制性片段长度多态性(RFLP)检验需要存在具有该靶标区域的限制性酶位点，这在大多数情形下受限(Kim JM,et al.Nat Commun 2014,5:3157)。下一代测序提供了可靠且特异性的测量，但昂贵且耗时(Guell M,et al.Bioinformatics 2014,30:2968-2970)。近期，几种基于PCR的检验提供了容易且可靠的方法来定量编辑效率，但它们需要强健的引物设计、痕量分解、或毛细管测序器(Brinkman EK,et al.Nucleic AcidsRes 2014,42:e168；Carrington B,et al.Nucleic Acids Res 2015；Yu C,et al.PLoSOne 2014,9:e98282)。此处，构建快速、成本效益好且可靠的筛选平台，以使用高度敏感的高通量生物发光报告基因检验以及快速直接PCR基因分型来鉴别有效的gRNA。该报告基因检验依赖于对两个gRNA靶标位点之间的大片段的根除以及在每一gRNA位点处的小InDel突变。该片段性根除废止了启动子活性或报告基因表达，而InDel突变可改变启动子管理或诱导病毒蛋白的开放阅读框位移。所有这些事件将会后续影响该报告基因的活性。PCR基因分型依赖于剩余末端DNA之间的片段性裂解和有效的再结扎。经再结扎的PCR片段的存在，提供对两种gRNA的效率的积极证据。再结扎效率取决于细胞分裂，因此，在不分裂细胞的情形中，该PCR基因分型可能受限。此外，用于一些引物的PCR条件需要优化，以实现最佳的基因分型效率。

本研究的目标是，通过构建可靠且敏感的高通量检验来筛选并鉴别有效的gRNA。选择EcoHIV-eLuc报告基因在HEK293T细胞中的瞬时转染作为测试平台，这是因为小量的报告基因质粒与spCas9/gRNA组分(1:20)可确保表达该报告基因的全部细胞中的靶标裂解，并因此最大化荧光素酶报告基因检验和PCR基因分型的检测效率。相比之下，尽管基于HEK293T细胞的EcoHIV-eLuc稳定细胞系(图13A至13E、14A至14D)可能更接近HIV-1潜伏期的真实情境，但该细胞系在荧光素酶报告基因检验和PCR基因分型中均显示极差的检测灵敏度。这是因为，转染后总是存在表达EcoHIV-eLuc且不具有任何gRNA质粒的细胞，因此，即使在转染效率为高达80至90％时，eLuc报告基因仍不断被表达。该瞬时报告基因转染的其它优点包括容易设置，且转染和高通量发光测量的成本效益。重要的是，被鉴别的gRNA在真实的HIV潜伏性感染细胞或细胞系中仍有效，且可进一步用于动物研究和临床应用中。尽管瞬时转染的EcoHIV-eLuc报告基因(游离基因DNA)并不反映宿主基因组(细胞核)中的潜伏HIV前病毒DNA，但对于HIV前病毒(Hu W,et al.Proc Natl Acad Sci U S A2014,111:11461-11466)和其它病毒(Ramanan V,et al.Sci Rep 2015,5:10833；Yuen KS,et al.JGen Virol 2015,96:626-636)的游离基因DNA与核DNA，该spCas9/gRNA介导的基因编辑以相似的效率产生作用。此外，除了被整合的HIV-1前病毒DNA之外，游离基因DNA的有效裂解也令对于HIV(Hu W,et al.Proc Natl Acad Sci U S A2014,111:11461-11466)及其它传染性病毒(Peng C,Lu M,Yang D.Virol Sin 2015,30:317-325)的新感染的新颖预防性治疗称为可能。

对于不同gRNA的对比分析，一些混杂因素可能影响该瞬时转染效率和转基因表达。为了最小化这一影响，采取若干防范措施：1)制备该报告基因与spCas9质粒的预混液，以确保每一组gRNA中存在的这些共有质粒的量相等；2)使用海肾(Renilla)荧光素酶报告基因(1:100)进行转染效率的归一化；3)在96孔板中对全部gRNA实施大规模的转染，同时进行4至6组平行实验；以及4)每一实验中，所有数据均表达为与空gRNA对照相比的相对改变。

由于两端LTR的裂解，一种以该LTR区域为靶向的gRNA可消除整个前病毒DNA，但如EcoHIV-eLuc报告基因检验所示，根除效率并不明显。另外，因为使用覆盖该LTR的引物的标准PCR不能在将两个LTR靶标位点之间的片段删除后区分5’-LTR与3’-LTR，还需要长范围PCR来核实整个HIV-1前病毒DNA的根除(Hu W,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 2014,111:11461-11466)。两种以LTR区域为靶向的gRNA诱导了每一LTR区域内的片段性裂解，这将阻抑LTR启动子活性并降低HIV-1RNA稳定性，因此改善整体根除效率，如我们先前所演示(Hu W,et al.2014)。本研究中，测试新的原理验证：LTR与结构性区域之间的任一对gRNA均提供用来评估HIV-1根除效率的较佳途径。通过本方法，HIV-1报告基因病毒生产中剧烈的函数性降低是5’LTR+Gag、Gag+3’LTR和两端LTR的三种可能裂解的结果，且可通过灵敏且高通量的生物发光报告基因检验轻易地监控。通过使用覆盖该LTR和结构性区域的引物的标准和快速PCR基因分型，可有效且可靠地检测这些裂解。同样，两种LTR gRNA加上一种或两种结构性gRNA的鸡尾酒混合物可提供最优且经济的治疗法，以在临床前和临床环境下根除HIV-1基因组。

牵涉Cas9/gRNA技术的脱靶效应的潜力已经是基因组编辑领域的一个重点。已经研发严格的gRNA设计、功能筛选和Cas9技术修正，以增加基因组编辑的特异性。极少的关于被培养细胞中spCas9/gRNA的脱靶效应实例已经由全基因组测序(WGS)所证实(Hu W,etal.2014；Zuckermann M et al.Nat Commun 2015,6:7391；Smith C,et al.Cell StemCell 2014,15:12-13；Veres A,et al.Cell Stem Cell 2014,15:27-30；Yang L,etal.Nat Commun 2014,5:5507)。新研发的客观分析技术和进一步验证了这一spCas9-gRNA系统的高特异性(Ran FA,et al.Nature 2015,520:186-191；Tsai SQ,et al.NatBiotechnol 2015,33:187-197；Frock RL,et al.Nat Biotechnol 2015,33:179-186)。由于后生性保护，期待体内脱靶低得多。本研究中，分析了该外源性病毒DNA对宿主基因组的最高程度的效率和特异性。在gRNA筛选筛选过程中，没有观察到细胞毒性。已经显示，双spCas9切口酶和RNA引导FokI核酸酶将潜在的脱靶效应降低幅度高达1500倍(Ran FA,etal.Cell 2013,154:1380-1389；Mali P,et al.Nat Biotechnol 2013,31:833-838；Wyvekens N,et al.Hum Gene Ther 2015,26:425-431；Tsai SQ,et al.Nat Biotechnol2014,32:569-576)。

总之，大多数所设计的gRNA在根除位于所选择的两个靶向位点之间的预设HIV-1基因组序列并影响eLuc报告基因活性方面高度有效。特别地，病毒结构性gRNA与一种或两种LTR gRNA的组合提供了更高的基因组根除效率以及更容易的PCR基因分型途径。使用HIV-1eLuc报告基因检验和直接PCR基因分型进行的筛选提供了用以筛选有效HIV-1gRNA的可靠、快速且便利的途径。在个性化/精确医疗的新纪元，这可用来建立用于任何新HIV-1隔离种和其它传染性病毒的高通量gRNA库筛选。

本发明已经以例示性说明的方式予以揭示，且应理解，所使用的术语具有该词汇的说明性质而非限制。显然，鉴于上述教导，可对本发明进行多种修饰和变更。因此，应理解，本发明可在权利要求书的范畴内，而非在具体揭示的范围内予以实践。

Claims

1.一种组合物，用于令整合至潜在感染逆转录病毒的宿主细胞的基因组中的逆转录病毒DNA失活，该组合物包含：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，且所述gRNA与被整合的逆转录病毒DNA中的靶标序列互补，其中，该逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA包括至少一种与被整合的逆转录病毒DNA中的靶标序列互补的第一gRNA；以及与被整合的逆转录病毒DNA中另一靶标序列互补的第二gRNA，藉此移除两个gRNA之间的介入序列。

3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述靶标核酸序列包含HIV基因组的编码及非编码核酸序列中的一个或多个核酸序列。

4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述靶标核酸序列包含HIV中的一个或多个核酸序列，所述核酸序列包含：长端重复序列(LTR)核酸序列、以及编码结构性蛋白、非结构性蛋白或其组合的核酸序列。

5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述编码结构性蛋白的序列包含编码Gag、Gag-Pol前体、Pro(蛋白酶)、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env或其组合的核酸序列。

6.如权利要求4所述的组合物，其中，所述编码非结构性蛋白的序列包含编码调节蛋白、辅助蛋白或其组合的核酸序列。

7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述调节蛋白包含Tat、Rev或其组合。

8.如权利要求6所述的组合物，其中，所述辅助蛋白包含Nef、Vpr、Vpu、Vif或其组合。

9.根据权利要求3所述的组合物，其中，靶标核酸序列包含人免疫缺陷病毒(HIV)前病毒DNA的长端重复序列(LTR)区域的一个或多个序列、以及HIV整合DNA的结构性及/或非结构性基因中的一个或多个靶标；或者，第二基因中的一个或多个靶标；或者，第一基因中的一个或多个靶标以及第二基因中的一个或多个靶标；或者，第一基因中的一个或多个靶标、第二基因中的一个或多个靶标、及第三基因中的一个或多个靶标；或者，第二基因中的一个或多个靶标、以及第三或第四基因中的一个或多个靶标；或其任何组合。

10.根据权利要求3所述的组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57的序列一致性为至少75％。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57。

12.一种令哺乳动物细胞中被整合的逆转录病毒DNA失活的方法，包括下述步骤：将所述细胞暴露于组合物，所述组合物包含至少一种编码包含成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的基因编辑复合体的单离的核酸序列、以及至少一种与所述被整合的逆转录病毒DNA中的靶标核酸序列互补的导引RNA(gRNA)；表达该基因编辑复合体；以及，令该所述被整合的逆转录病毒DNA失活。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述被整合的逆转录病毒DNA是人免疫缺陷病毒(HIV)DNA，所述至少一种单离的核酸序列编码与HIV DNA的LTR区域中的靶标核酸序列互补的第一gRNA、以及与所述HIV DNA的结构性基因中的靶标核酸序列互补的第二gRNA。

14.如权利要求12所述的方法，其中，gRNA核酸序列包含序列，所述序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57的序列一致性为至少75％。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57。

16.一种用于令哺乳动物受试者的被整合的逆转录病毒DNA失活的医药组合物，包括：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列；至少一种编码导引RNA(gRNA)的单离的核酸序列，所述gRNA与逆转录病毒DNA中的靶标序列互补；所述单离的核酸序列包括于至少一种表达载体中。

17.如权利要求16所述的医药组合物，其中，所述被整合的逆转录病毒DNA是人免疫缺陷病毒(HIV)DNA，且所述至少一种gRNA包括与HIV DNA中的第一靶标序列互补的第一gRNA、以及与所述HIV DNA中的第二靶标序列互补的第二gRNA。

18.如权利要求16所述的医药组合物，其中，所述第一靶标序列位于HIV DNA的LTR区域，以及，所述第二靶标序列位于所述HIV DNA的结构性基因中。

19.如权利要求16所述的医药组合物，其中，gRNA核酸序列包含序列，所述序列SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:57的序列一致性为至少75％。

20.如权利要求19所述的医药组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57。

21.一种治疗感染人免疫缺陷病毒(HIV)的哺乳动物受试者的方法，包括下述步骤：确定哺乳动物受试者HIV感染，给药有效量的根据权利要求16所述的医药组合物，以及治疗所述哺乳动物受试者的HIV感染。

22.一种治疗处于人免疫缺陷病毒(HIV)感染风险下的哺乳动物受试者以降低其感染风险的方法，包括下述步骤：确定哺乳动物受试者处于HIV感染的风险下，给药有效量的根据权利要求16所述的医药组合物，以及降低所述哺乳动物受试者感染HIV的风险。

23.一种用于治疗或预防人免疫缺陷病毒(HIV)感染的试剂盒，包括测得数量的包含至少一种编码CRISPR相关的核酸内切酶的单离的核酸序列以及一种或多种导引RNA(gRNA)的组合物，其中，所述一种或多种gRNA各自与HIV基因组中的靶标位点互补；或编码一种或多种所述单离的核酸的载体；以及选自由下列各者所组成群組的一者或多者：包装材料、包含使用说明书的包装插页、无菌液体、注射器及无菌容器。

24.如权利要求23所述的试剂盒，其中，所述一种或多种gRNA包括与HIV基因组中的第一靶标序列互补的第一gRNA、以及与所述HIV基因组中的第二靶标序列互补的第二gRNA。

25.如权利要求23所述的试剂盒，其中，所述第一靶标序列位于所述HIV基因组的LTR区域中，且所述第二靶标序列位于所述HIV基因组的结构性及/或非结构性基因中。

26.一种用于令整合至潜在感染逆转录病毒的宿主细胞的基因组中的前病毒DNA失活的表达载体，其中，所述表达载体包含至少一种编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，所述gRNA与前病毒DNA中的靶标序列互补，以令整合至潜在感染逆转录病毒的宿主细胞的基因组中的前病毒DNA失活。

27.如权利要求26所述的表达载体，其中，所述至少一种gRNA包括至少一种与所述前病毒DNA中的第一靶标序列互补的第一导引gRNA；以及所述该前病毒DNA中的第二靶标序列互补的第二gRNA。

28.如权利要求26所述的表达载体，其中，所述第一靶标序列位于HIV基因组的LTR区域中，且所述第二靶标序列位于所述HIV基因组的结构性及/或非结构性基因中。

29.一种用于令整合至潜在感染逆转录病毒的宿主细胞的基因组中的逆转录病毒基因组失活的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含至少一种编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，所述gRNA与所述被整合的逆转录病毒基因组中的靶标序列互补，以令整合至所述潜在感染逆转录病毒的宿主细胞的基因组中的逆转录病毒基因组失活。

30.一种用于在体外或体内根除逆转录病毒的组合物，所述组合物包含：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少一种导引RNA(gRNA)，所述gRNA各自与逆转录病毒基因组中的靶标序列互补，其中，所述逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

31.如权利要求30所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA至少包括与HIV基因组中的靶标序列互补的第一gRNA；以及与所述HIV基因组中另一靶标序列互补的第二gRNA，藉此移除两个gRNA之间的介入序列被。

32.如权利要求30所述的组合物，其中，所述靶标核酸序列包含HIV基因组的编码及非编码核酸序列的一个或多个核酸序列。

33.如权利要求32所述的组合物，其中，所述靶标核酸序列包含HIV中的一个或多个核酸序列，所述核酸序列包含：长端重复序列(LTR)核酸序列、以及编码结构性蛋白、非结构性蛋白或其组合的核酸序列。

34.如权利要求33所述的组合物，其中，所述编码结构性蛋白的序列包含编码Gag、Gag-Pol前体、Pro(蛋白酶)、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env或其组合的核酸序列。

35.如权利要求33所述的组合物，其中，所述编码非结构性蛋白的序列包含编码调节蛋白、辅助蛋白或其组合的核酸序列。

36.如权利要求35所述的组合物，其中，所述调节蛋白包含Tat、Rev或其组合。

37.如权利要求35所述的组合物，其中，所述辅助蛋白包含Nef、Vpr、Vpu、Vif或其组合。

38.根据权利要求30所述的组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57的序列一致性为至少75％。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57。

40.一种用于在体外或体内根除逆转录病毒的组合物，所述组合物包含：编码成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列、以及至少两种导引RNA(gRNA)，所述gRNA各自与逆转录病毒基因组中的不同靶标序列互补，其中，所述逆转录病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。

41.如权利要求40所述的组合物，其中，所述至少一种导引RNAg(RNA)至少包括与HIV基因组中的靶标序列互补的第一gRNA；以及与HIV基因组中另一靶标序列互补的第二gRNA，藉此移除两个gRNA之间的介入序列。

42.如权利要求40所述的组合物，其中，所述靶标核酸序列包含HIV基因组的编码及非编码核酸序列的一个或多个核酸序列。

43.如权利要求42所述的组合物，其中，所述靶标核酸序列包含所述HIV基因组中的一个或多个核酸序列，包含：长端重复序列(LTR)核酸序列、以及编码结构性蛋白、非结构性蛋白或其组合的核酸序列。

44.如权利要求43所述的组合物，其中，所述编码结构性蛋白的序列包含编码Gag、Gag-Pol前体、Pro(蛋白酶)、逆转录酶(RT)、整合酶(In)、Env或其组合的核酸序列。

45.如权利要求43所述的组合物，其中，所述编码非结构性蛋白的序列包含编码调节蛋白、辅助蛋白或其组合的核酸序列。

46.如权利要求45所述的组合物，其中，所述调节蛋白包含Tat、Rev或其组合。

47.如权利要求45所述的组合物，其中，所述辅助蛋白包含Nef、Vpr、Vpu、Vif或其组合。

48.根据权利要求40所述的组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57的序列一致性为至少75％。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中，gRNA核酸序列包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57。