EA028902B1

EA028902B1 - Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и дифференцированных клеток

Info

Publication number: EA028902B1
Application number: EA201300780A
Authority: EA
Inventors: Мигель Эстебан; Йоханнес Гриллари; Регина Гриллари; Дуаньцин Пэй; Тин Чжоу
Original assignee: Университет Фюр Боденкультур Вена; Гуанчжоу Институт Ов Байомедисин Энд Хелт
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2011-12-23
Publication date: 2018-01-31
Also published as: BR112013016592B1; PT2658965E; ES2575605T3; JP2017169574A; CA2823265C; JP2014501114A; EP2658965B1; US20130323782A1; EA201300780A1; CA2823265A1; BR112013016592A2; DK2658965T3; US9926532B2; WO2012089669A1; EP2658965A1

Abstract

Изобретение раскрывает способ получения представляющих интерес дифференцированных клеток, который включает размножение отслоившихся соматических мочевых клеток из мочевыводящих путей или мочи и получение дифференцированных клеток из данных размноженных клеток путем перепрограммирования данных клеток в индуцированные полученные из мочи плюрипотентные стволовые клетки (UiPSCs) и дифференцировки этих UiPSCs в представляющие интерес клетки, где указанное перепрограммирование осуществляется при помощи смеси экзогенных перепрограммирующих факторов, включающей факторы, выбранные из семейства генов Oct, семейства генов Klf, семейства генов Sox и семейства генов Мус. Дифференцированные клетки могут быть получены путем дифференцировки перепрограммированных iPSCs или путем прямого перепрограммирования мочевых клеток.

Description

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ

(45) Дата публикации и выдачи патента 2018.01.31

(21) Номер заявки 201300780

(22) Дата подачи заявки

2011.12.23

(51) Ιηί. С1. (42Ν5/0789 (2010.01) (Ί2Ν 5/074 (2010.01)

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК

028902 Β1

(31) РСТ/СХ2010/002226; 11152519.2

(32) 2010.12.31; 2011.01.28

(33) СХ; ЕР

(43) 2013.11.29

(86) РСТ/ЕР2011/073962

(δϊ) ΧΥΟ 2012/089669 2012.07.05

(71) (73) Заявитель и патентовладелец:

УНИВЕРСИТЕТ ФЮР

БОДЕНКУЛЬТУР ВЕНА (АТ);

ГУАНЧЖОУ ИНСТИТУТ ОВ

БАЙОМЕДИСИН ЭНД ХЕЛТ (СХ)

(72) Изобретатель:

Эстебан Мигель (СХ), Гриллари

Йоханнес, Гриллари Регина (АТ), Пэй

Дуаньцин, Чжоу Тин (СХ)

(74) Представитель:

Саломатина И.С. (Κϋ)

(56) ΖΗΟυ ΗΟΝΟΥΑΝ ЕТ АЬ.: "Еуо1ийоп οί шйисеД ршйро1еп1 к!ет се11 !есЬпо1оду.", ΟυΚΚΕΝΤ ΟΡΙΝΙΟΝ ΙΝ ΗΕΜΑΤΟΕΟΟΥ ШЬ 2010 ΕΝΚΌ- ΡυΒΜΕΌ:20442654, νοί. 17, по. 4, 1и1у 2010 (2010-07), радек 276-280, ΧΡ009149201, Ι88Ν: 1531-7048, раде 277 - раде 279

ΑΟ-Α1-20100652.49

ΖΗΑΝΟ Υ. ЕТ АЬ.: "иппе 1)еп\еД Се11к аге а Ро1епйа1 8оигсе ίοτ ито1од1са1 Тьккие Кесопкйисйоп", ΙΟυΚΝΑΣ ΟΡ υΚΟΕΟΟΥ,

Ε^ΡΙΝ^'Π’ №ΙΕΜΑΜ8 & ΑΙΡΚΙΝ8. ΒΑΕΤΙΜΟΚΕ, ΜΌ, υ8, νοί. 180, по. 5, 1 ШуетЪег 2008 (2008-11-01), радек 2226-2233, ΧΡ025507309, Ι88Ν: 0022-5347, ΌΟΙ: ΌΟΙ:10.1016/ υυΚΟ. 2008.07.023 [тейтеуеД оп 2008-09-20] раде 2226, рагадгарЬ 2; Пдиге 2; !аЪ1е 2

ΒΚΟ\Υ\ ΜΑΤΤΙΙΙΑΥ Е. ЕТ ΑΒ: "1)еп\аИоп οί ПИисеД Р1ипро1еп1 8!ет Се11к йот Интал РепрЬега1 Βίοοά Т ЬутрЬосу1ек", ΡΕΟ8 ΟΝΒ, νοί. 5, по. 6, .Типе 2010 (2010-06), ΧΡ009149252, Ι88Ν: 1932-6203, раде 7-8; йдигек 1, 5

ΑΟ-Α2-2008153685

ΑΑ8ΕN ΊΚΟΝΌ ЕТ ΑΌ.: ЛкоИЕоп апД сиШуайоп οί Ьитап кетайпосу1ек йгот ккт ог р1искеД Ьаьг йог !Ье депетайоп οί шДисеД р1ийро1еп1 к!ет се11к", ^ТОКЕ ΡΚΟΤΟСΟ^8, ^ТОКЕ ΡυΒΌΙ8ΗΙΝΟ ΟΚΟυΡ, ОВ, νοί. 5, по. 2, 1 1апиату 2010 (2010-01-01), радек 371-382, ΧΡ009156425, Ι88Ν: 1750-2799 раде 372, со1итп 1, рагадгарЬ 2

ΜΙΥΟ8ΗΙ К. ЕТ ΑΌ.: "ОепегаПоп οί Ьитап шДисеД р1ийро1еп1 к!ет се11к йот ога1 тисока", ΙΟυΚΝΑΌ ΟΡ ΒЮ8СIΕNСΕ ΑΝΌ ΒЮΕNΟINΕΕΚINΟ, Ε^8ΕVIΕΚ, ΑΜ8ΤΕΚ^ΑΜ, ΝΌ, νοί. 110, по. 3, 1 8ер!етЪег 2010 (2010-09-01), радек 345-350, ΧΡ027228230, Ι88Ν: 1389-1723 [тейтеуеД оп 2010-04-08] раде 346

ΖΗΟυ ΉΝΟ ЕТ ΑΕ: "Оепетайоп οί шДисеД р1ийро1еп1 к!ет се11к Ьгот шгпе.", ΙΟυΚΝΑΕ ΟΡ ТЛЕ ΑΜΕΚIСΑN 8ΟСIΕΤΥ ΟΡ ΝΈΡΗΚΟΕΟΟΥ : ίΑ8Ν ШЬ 2011 ΌΝΚΌ- ΡυΒΜΕ^:21636641, νοί. 22, по. 7, 1и1у 2011 (2011-07), радек 1221-1228, ΧΡ9156388, Ι88Ν: 1533-3450 !Ье \\1ю1е Доситеп!

028902 Β1

(57) Изобретение раскрывает способ получения представляющих интерес дифференцированных клеток, который включает размножение отслоившихся соматических мочевых клеток из мочевыводящих путей или мочи и получение дифференцированных клеток из данных размноженных клеток путем перепрограммирования данных клеток в индуцированные полученные из мочи плюрипотентные стволовые клетки (υίΡ8&) и дифференцировки этих υίΡ8Οϊ в представляющие интерес клетки, где указанное перепрограммирование осуществляется при помощи смеси экзогенных перепрограммирующих факторов, включающей факторы, выбранные из семейства генов ΟΛ, семейства генов Κ1ί, семейства генов 8ох и семейства генов Мус. Дифференцированные клетки могут быть получены путем дифференцировки перепрограммированных ίΡδΓ'δ или путем прямого перепрограммирования мочевых клеток.

028902

Изобретение имеет отношение к индуцированным плюрипотентным клеткам и дифференцированным клеткам и способам их получения.

Уровень техники

Эмбриональными стволовыми клетками (Е8Сз) являются клетки, происходящие из бластоцистов, полученных при оплодотворении ίη νίίτο, которые обладают способностью к самообновлению и подвергаются дифференцировке в зрелые клетки любого типа в организме млекопитающих, например, человека (это свойство известно как "плюри-потентность"). При определенных условиях культивирования Е8Сз можно поддерживать в недифференцированном состоянии в течение длительного времени без потери их плюрипотентных характеристик. Благодаря этим свойствам клетки Е8Сз вызвали огромный интерес в регенеративной медицине. Потенциально ткани, полученные из Е8Сз, можно было бы использовать для клинического лечения людей (при острых заболеваниях либо генетических и дегенеративных заболеваниях). Е8Сз также можно было бы использовать для скрининга лекарственных препаратов, к примеру, для исследования тканеспецифической восприимчивости к лечению, и для моделирования генетических заболеваний ίη νίίτο. Однако тяжелые этические и практические (риск иммунного отторжения) ограничения сильно мешают применению Е8Сз в клинике, а во многих странах и исследованиям.

Недавнее открытие того, что соматические клетки могут быть трансформированы в 1Р8С5 при помощи экзогенных факторов (этот метод также называют "ядерным перепрограммированием под действием экзогенных факторов" (ТакайазЫ апд Уатапака, Се11 2006: 126:663-76) способен изменить текущее восприятие персонализированной медицины, а также может обеспечить ценные модели заболеваний человека ίη νίίτο (Уатапака апд В1аи, 2010, №йиге 465, 704-712; Пап еί а1., 2010, ТйготЪ Ηаетοзί 104, 3944).

Примечательно, что 1Р8Сз подобны Е8Сз и обладают потенциалом к применению при лечении конкретных пациентов, тем самым избегая риска иммунного отторжения. Благодаря этим характеристикам гР8Сз привлекают большое внимание во всем мире. Получение 1Р8С3 требует взятия ткани от донора, размножения донорских клеток ш νίίτο и воздействия на клетки коктейля из экзогенных факторов, которые предоставляются клеткам в виде очищенных белков, белковых экстрактов, молекул РНК, невстраивающихся плазмид, вирусов (например, ретровирусов, лентивирусов, аденовирусов, вируса Сендай), вместе с химическими коктейлями или без них и с варьированием условий культивирования клеток.

Применение этих факторов оказывает такое действие, что постепенно появляются колонии с Е8Сподобной морфологией. Эти колонии являются колониями клеток 1Р8С, которые можно отобрать и затем размножить и изучить с тем, чтобы проверить, что они ведут себя подобно Е8Сз.

До сих пор клетки 1Р8С человека получали с использованием донорских клеток из кожи (фибробластов и кератиноцитов), амниотической жидкости, внезародышевых тканей (плаценты и пуповины: Са1 еί а1., 2010, ί Βίο1 Сйет 285, 11227-11234), пуповинной крови, надкостницы, зубной ткани, жировой ткани, нервных стволовых клеток, гепатоцитов, мезенхимальных стволовых клеток из амниона и клеток периферической крови (Уе апд Сйепд, 2010, Кедеп Мед 5, 521-530; Са1 еί а1., 2010, ί Βίο1 Сйет 285, 1122711234). Перепрограммирование клеток из этих тканей происходило с различной частотой, указывая на то, что имеет значение происхождение клеток ("донорских клеток"). Вследствие неоднородности донорских клеток, используемых в настоящее время для получения 1Р8С, трудно установить стандарты для постановки сравнительных тестов с 1Р8С3 и Е8Сз и получения значимых выводов из результатов тестирования.

Идеальный тип донорских клеток для получения гР8Сз должен быть легко доступным, легко перепрограммироваться и быть универсальным (любого возраста, пола, этнической группы и состояния организма). В настоящее время источником клеток для перепрограммирования чаще всего служат фибробласты, но они требуют не только неудобного взятия биопсии, которое должно выполняться специалистом в асептических условиях, но также продолжительной экспансии перед использованием. У них также есть риск соматических клеточных мутаций при воздействии света и радиации, и процедура противопоказана при тяжелых заболеваниях кожи и ожогах. Недавно сообщалось, что три исследовательские группы достигли перепрограммирования клеток периферической крови без необходимости в мобилизации клеток СБ34+ (Ьсй е1 а1., 2010, Се11 8ίет Се11 7, 15-19; 8ек е1 а1., 2010, Се11 8ίет Се11 7, 11-14; 81аегк е1 а1., 2010, Се11 8ίет Се11 7, 20-24). В работе Вго\\п еί а1., 2010, РЕ8 ОИЕ, 2010, 6, 1-9, описано получение гР8Сз из Т-лимфоцитов периферической крови. Поскольку эти процедуры являются минимально инвазивными, требуют небольшого количества крови и они не нуждаются в длительном культивировании клеток, то они представляют значительный прогресс, несмотря на то, что их эффективность очень низка. Однако основными донорскими клетками, которые используются согласно этим сообщениям, являются зрелые Т-клетки, несущие специфические перестройки Т-клеточных рецепторов, что нежелательно при некоторых возможных клинических применениях. К тому же Т-клетки не несут полной генетической информации, необходимой для неограниченной дифференцировки в любой тип клеток.

Кроме того, в отдельных случаях взятие/сдача донорской крови не свободны от этических проблем, например, из-за религиозных убеждений, и может оказаться не-осуществимой у пациентов с инфекционными заболеваниями, заболеваниями крови или иммунодепрессией. В последних случаях следует учитывать такие заболевания, которые влияют на свертывание крови (например, гемофилия), лейкемию и гене- 1 028902

тическую или приобретенную (например, при раке и СПИДе) иммунодепрессию.

В поисках новых тканей для перепрограммирования клетки 1Р8С также получали из мозговых оболочек (Οίη е! а1., 2008, 1 ΒίοΙ СЬет 283, 33730-33735) и эпителиальных клеток молочной железы мышей (Ы е! а1., 2010, Се11 81ет Се11 7, 51-63), а у людей - из стволовых клеток надкостницы и жировой ткани (Е51еЬап е! а1., 2010, Се11 81ет Се11 6, 71-79), матрикса пуповины и плаценты (Са1 е! а1., 2010, 1 Βίο1 СЬет 285, 11227-11234).

Сущность изобретения

Чтобы ускорить продвижение к будущему применению технологии гР§С, нужно получить клетки 1Р8С, а также дифференцированные клетки любого типа, происходящие из них ткани или органеллы из донорских клеток, представляющих универсальный источник, а также дифференцированные клетки, происходящие непосредственно из таких донорских клеток. Кроме того, поскольку при выделении донорских клеток для получения ίΡδί'Χ методами предшествующего уровня техники обычно требуется инвазивная стадия для получения нужной донорской ткани, то авторы изобретения попытались получить клетки 1Р8С из неинвазивного источника, и разработать способы получения таких ίΡδί'Χ.

В \νϋ 2008/153685 описан способ получения культуры клеток-предшественников из мочи (БРСк) путем получения образца мочи и последующего выделения мочевых клеток-предшественников из образца. Клетки-предшественники обладают способностью к дальнейшей дифференцировке в другие типы клеток.

Для получения культуры дифференцированных клеток в νθ 2010/065239 предлагается выделять стволовые клетки из мочи, а затем подвергать их дифференцировке их в определенные типы клеток.

Общим для этих способов является то, что дифференцировка полученных из мочи клеток допускает лишь ограниченное число типов клеток.

Целью изобретения является обеспечение способа получения, из неинвазивного источника клеток, плюрипотентных клеток с неограниченной способностью к дифференцировке в отношении получаемого конечного типа клеток.

Для решения проблемы, лежащей в основе изобретения, авторы изобретения рассмотрели критерии, которым должен соответствовать идеальный источник клеток, выделяемых из отдельных лиц, а затем перепрограммируемых в гР§С8 (которые могут дифференцироваться в любой определенный тип клеток) либо прямо подвергающихся дифференцировке ("трансдифференцировке", т.е. дифференцирующихся непосредственно, без промежуточной стадии получения 1Р8С) в определенные типы клеток, ткани или органоиды: клетки должны быть легко доступными без связанного с этим риска или только с минимальным риском, они должны быть в наличии в достаточном количестве, универсально присутствовать и у мужчин, и у женщин (без ограничений в отношении этических проблем, расы, возраста либо состояния здоровья или заболевания), и они должны быть восприимчивыми к перепрограммированию с хорошей эффективностью. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что соматические клетки, т.е. терминально дифференцированные клетки, из такого неинвазивного источника, как моча, могут быть успешно перепрограммированы в 1Р§С8 или в определенные нужные клетки или линии клеток.

Изобретение касается способа получения нужных дифференцированных клеток из донорских клеток другого клеточного типа, который включает:

ί) размножение клеток из источника клеток, полученного от донора неинвазивным способом, причем данный источник клеток выбран из мочи, кала, слюны, волос, выделений из носа, ушной серы, слезной жидкости или из вагинального тракта, и

ϊϊ) получение дифференцированных клеток из данных размноженных клеток путем:

a) перепрограммирования данных клеток в клетки гР§С8 и последующей дифференцировки гР§С8 в нужные клетки, или же

b) прямого перепрограммирования данных клеток в нужные дифференцированные клетки.

В соответствии с предпочтительным воплощением донорские клетки, полученные на стадии ί), представляют собой отслоившиеся клетки из мочевыводящего тракта, которые присутствуют в моче (в дальнейшем эти клетки именуются "мочевыми клетками").

В дальнейшем клетки гР§С8, происходящие из мочевых клеток, именуются "ЦгРЗСк" (если не оговорено иначе, например, в отношении использования ИгРЗСк этот термин также охватывает клетки 1Р8С8, происходящие из других полученных неинвазивным путем донорских клеток).

В том воплощении, в соответствии с которым источником клеток является моча, стадия ί) может выполняться известными способами, которые, как правило, включают следующие под стадии:

a) взятие мочи у донора,

b) выделение отслоившихся клеток из мочи, и

c) размножение данных отслоившихся клеток.

Отслоившиеся клетки ίί) могут быть представлены клетками любого типа, встречающегося в моче, которые поддаются перепрограммированию.

В соответствии с некоторыми воплощениями отслоившиеся клетки представлены эпителиальными клетками, например, клетками почечных канальцев типа отслоившихся эпителиальных клеток проксимальных канальцев человека (НЕРТЕСк).

- 2 028902

В соответствии с другими воплощениями отслоившиеся клетки представлены фибробластоидными клетками. А в следующих воплощениях отслоившиеся клетки представлены клетками типа клетокпредшественников, эндотелиальных клеток, гладко-мышечных клеток или интерстициальных клеток, как описано в Ζΐκπίβ е! а1., 2008, 1 Ито1 180, 2226-2233).

Клетки ίί) также могут быть представлены отслоившимися раковыми клетками, например, клетками рака почек или рака мочевого пузыря.

После сбора мочи мочевые клетки центрифугируют и обогащают клетки нужного типа, например, НЕРТЕСк или фибробластоидные клетки, путем культивирования в среде, способствующей их росту, при этом предотвращается рост клеток нежелательного клеточного типа.

Такие среды известны из литературы и/или коммерчески доступны. В качестве примера: среды, удовлетворяющие специфические потребности эпителиальных клеток, включают, без ограничения, базальную среду для почечного эпителия (КЕВМ) и набор §щд1еЦио! Κίΐ СС-4127 КЕОМ, обе от фирмы Ьоп/а. среду ЕрЮКО от МйНроте, базальную среду для клеток почечного эпителия (АТСС), другие среды для эпителиальных клеток, включая среды для эпителиальных клеток дыхательных путей или молочной железы, например, среды от фирмы Ьо^а, АТСС или Се11аррНса!юпк, либо их комбинации. А также среды на основе той, что описана в Жекег е! а1., 2008 (Ат 1 Рйукю1 Кепа1 Рйукю1 295, Р1365-1375).

Примером среды, подходящей для обогащения фибробластоидных клеток из мочи, является среда для роста фибробластов РОМ®-2, также от фирмы Ьоп/а.

Помимо мочевых клеток, которые являются предпочтительными донорскими клетками для применения в способах изобретения, можно размножить и перепрограммировать в ίΡδί'Τ или прямо подвергнуть дифференцировке в нужный тип клеток и другие клетки, полученные от индивидуальных доноров неинвазивным способом, например, клетки, полученные из кала, слюны, волос, выделений из носа, ушной серы или вагинального тракта. Способы выделения и размножения таких клеток известны, например, для отслоившихся клеток из толстой кишки в кале (Вапйа1е!оуа е! а1., 2002, Арпик 110, 239-246), или для дермальных клеток из волосяных сосочков (ХУаггеп е! а1., 1992, 1 1пуек! Эегта1о1 98, 693-699).

Другим полезным источником клеток является та жидкость, которая во время гемодиализа вводится в брюшную полость для обмена веществ с кровью через кровеносные сосуды в брюшине, при этом кровь фильтруется "аналогично" тому, что и в почках. Эту жидкость можно собрать, причем известно, что она содержит много клеток.

Термин "перепрограммирование" [(стадия ίί), воплощение а)] принят в данной области для обозначения трансформации соматических клеток в ίΡδί'Τ при помощи экзогенных факторов.

В экспериментах настоящего изобретения перепрограммирование мочевых клеток в ШРЗСк осуществлялось с помощью ретровирусных векторов, доставляющих четыре фактора перепрограммирования: §ох2, Ос!4, Κ114 и с-Мус ("факторы Уатапака" или "коктейль Уатапака"), как впервые описано в ТакайакЫ апй Уатапака, 2006, Се11 126:663-76).

В принципе можно использовать любой метод перепрограммирования, который способен трансформировать донорские клетки, в частности мочевые клетки, в 1Р§Ск, в частности ЦтР§Ск.

Перепрограммирование может осуществляться с помощью одного или нескольких факторов, выбранных из семейства генов Ос!, семейства генов Κ1ί и семейства генов §ох. Кроме того, комбинации факторов может включать один или несколько продуктов генов из семейства генов Ос!, семейства генов Κ1ί, вместе с цитокином. Цитокин может быть представлен по крайней мере основным фактором роста фибробластов (ЬРОР) и/или фактором стволовых клеток (§СР).

Предпочтительно эти факторы вставлены в невирусные экспрессионные векторы, которые вводятся в соматические клетки.

Если клетки и!Р§С или дифференцированные клетки из них предназначаются для терапевтического применения, то применяются методы, в которых не используются онкогены и/или которые не связаны со встраиванием ДНК, кодирующей фактор перепрограммирования, в геномную ДНК индивида.

Таким образом, в предпочтительных способах изобретения для получения ШРЗСк или дифференцированных клеток из них для терапевтических целей не используются лентивирусы или ретровирусы или же используются вирусы, модифицированные таким образом, чтобы свести к минимуму или полностью исключить риск встраивания трансгенов в геном и связанные с этим нежелательные побочные эффекты. К тому же нужно иметь в виду, что встраивание трансгена несет риск инсерционного мутагенеза, что может быть связано с онкогенностью у проходящих лечение пациентов.

Предпочтительными способами получения клеток ЦтР§Ск для терапевтического применения являются те, в которых не происходит встраивания перепрограммирующих генов в геном (см. обзор §ип е! а1., 2010, Се11 Сус1е 9:5, 880-885) и/или те, в которых не применяются онкогены типа Κ114 или с-Мус, например:

с использованием вырезаемых рекомбиназой Сге лентивирусов (§о1йпег е! а1.,2009, Се11 136:964-77); с использованием только ОСТ4, §0X2 и ΝΑΝΟΟ, но без с-Мус и Κ1ί4 (Ы е! а1., 2010, Се11 Кергодгат. 12(3):237-47);

получение клеток !Р§ человека без использования вирусов и трансгенов с помощью эписомных векторов на основе о^^Р/ЕВNΑ1 (ядерного антигена-1 Ерк!е1п-Ватт), кодирующих перепрограммирующие

- 3 028902

факторы Ос!4, §ох2, Κ1£4, с-Мус, Ыапод, Ып28 и §У40ЬТ (Уи е! а1., 2009, §с1епсе 324:797-801);

методы перепрограммирования без использования вирусов с помощью экспрессирующих транспозон рфдуВас векторов, несущих полицистронный трансген факторов Уатапака (\Уок)еп е! а1., 2009, Ыа!иге 458:766-70); или не вирусной мини-кольцевой ДНК (Да е! а1., 2010, Ыа! Мебюбк 7(3): 197-9);

методы на основе рекомбинантных белков, например, обработка клеток четырьмя факторами Уатапака в виде рекомбинантных белков, конъюгированных с проникающим в клетки пептидом (срр) (Κίηι е! а1., 2009, Се11 §!ет Се11 4:472-6); воздействие на клетки коктейлем из экзогенных факторов, которые клетки получают в виде очищенных белков или белковых экстрактов с предварительной химической обработкой или без неё (Ско е! а1., 2010, В1ооб 116, 386-395; Нап е! а1., 2010, РЬо8 Опе, 5(8):е12297; §о1апк1 апб Ьее, 2010, СкетЪюскет 11, 755-757);

с добавлением небольших молекул, например, вальпроевой кислоты, ингибитора деацетилазы гистонов (Ниап§£и е! а1., 2008, Ыа! Вю!ескпо1 26:795-7; НиапдГи е! а1., 2008, Ыа! Вю!ескпо1 26:1269-75); или ряда других небольших молекул, например, ингибиторов киназы-3 гликогенсинтазы (Ο8Κ-3), ингибиторов пути ΜΕΚ-ΕΚΚ и пути ΤΟΡβ для повышения эффективности или взамен некоторых факторов перепрограммирования (Ьт е! а1., 2009, Ыа! Ме!кобк 6:805-8; Ы е! а1., 2009, Се11 §!ет Се11 4:16-9; δΐιί е! а1.,

2008, Се11 §!ет Се11 2:525-8; 1с1йба е! а1., 2009, Се11 §!ет Се11 5:491-503); или с добавлением витамина С (Ек!еЪап е! а1., 2010, Се11 8!ет Се11 6, 71-79);

с добавлением небольшой интерферирующей РНК (ниРНК), например, ниРНК к р53, для улучшения эффективности перепрограммирования факторами Уатапака (2као е! а1., 2008, Се11 §!ет Се11 3: 4759);

с добавлением микроРНК (миРНК) в перепрограммирующий коктейль (например, ^йкоп е! а1.,

2009, §!ет Се11к Пеу 18:749-58; 1ибкоп е! а1., 2009, Ыа! Вю!ескпо1. 27(5): 459-461);

с введением мРНК или модифицированной мРНК, кодирующей факторы перепрограммирования (УаклЪоу е! а1., 2010, Вюскет Вюркук Кек Соттип 394, 189-193), причем в случае модификации она должна усиливать трансляцию и/или устойчивость, например, как описано в 1<о\уа1кка е! а1., 2008, ΚΝΆ 14(6): 1119-31.

Безопасность/и/или эффективность перепрограммирования можно еще больше оптимизировать путем изменения среды культивирования или условий, например, замены среды, содержащей сыворотку, на Кпоск Ои! 8егит Кер1асетеп! (ΚδΚ, 1пукгодеп), либо изменения условий (например, уменьшения оксигенации с использованием специальных инкубаторов, в которых можно контролировать содержание кислорода).

Оптимизация может осуществляться, например, путем проведения серийных экспериментов для данной размноженной популяции мочевых клеток. В качестве примера: мочевые клетки от нескольких индивидов можно культивировать в различных средах (например, в среде для эпителиальных клеток или для фибробластов), а затем инфицировать ретровирусами, продуцирующими экзогенные факторы, чтобы подобрать клеточные популяции, которые легче всего перепрограммируются. После инфицирования можно использовать различные коктейли сред (с изменениями в различные моменты времени), содержащие сыворотку или лишенные сыворотки, с добавлением химикатов (см. выше) или без них, чтобы посмотреть, при каких условиях достигается оптимальная эффективность. Кроме того, клетки можно инфицировать различными комбинациями факторов, к примеру, 4 факторами Уатапака с Ыапод или без него (или с другими факторами, например, микроРНК). Также можно проверить, при скольких циклах инфи-цирования (1, 2 или 3) получаются наилучшие результаты. Если же клетки растут на питающих клетках, то можно использовать различные типы питающих слоев, например, фибробласты мыши, фибробласты человека, амниоциты, амниотические оболочки и др.

Прямое перепрограммирование донорских клеток без получения сначала клеток тР§С в нужные дифференцированные клетки [стадия ίί), воплощение Ъ)] также известно как "трансдифференцировка", что означает переход клеток или ткани из одного дифференцированного состояния в другое (У1етЪискеп апб \\епиу. 2011, Ыа! Вю!ескпо1. 2011, 29(10):892-907.

В этом воплощении подвергают суперэкспрессии специфичные к типу клеток факторы транскрипции с помощью вирусных векторов, плазмидных векторов и т.д. таким же образом, как и факторы перепрограммирования для ίΡδ.

Для прямой трансдифференцировки мочевых клеток (или других неинвазивно полученных клеток) в нейроны можно использовать 3 фактора: Акс11, Вгп2 и Му!11, как описано для преобразования фибробластов человека в нейроны (У1етЪискеп е! а1., 2010, Ыа!иге 463, 1035-1041) или гепатоцитов в нейроны, как описано в Магго е! а1., 2011, §!ет Се11, 9(4):374-82.

В работе Е£е е! а1., 2011, Ыа! Се11 Вю1. 13(3):215-22 описан способ, посредством которого можно прямо перепрограммировать эмбриональные фибробласты мыши (МЕРк) в спонтанно сокращающиеся полоски дифференцированных кардиомиоцитов.

Для преобразования мочевых донорских клеток в кардиомиоциты можно использовать способ, который успешно применялся для получения кардиомиоцитов из мезодермы с помощью Оа!а4, ТЪх5 и Ва£60с (Такеиск е! а1., 2009, Ыа!иге 459, 708-711).

Трансдифференцировка в гематопоетические клетки может осуществляться при суперэкспрессии

- 4 028902

одного лишь ОсГ4 (δ/аЬо еГ а1., 2010, ЫаГиге 468, 521-526).

Скрининг на факторы, вызывающие трансдифференцировку мочевых клеток в нейроны, кератиноциты, фибробласты, кардиомиоциты, клетки печени, почки, крови и др., может осуществляться аналогично описанным выше методикам трансдифференцировки и первоначальной методике Уатаиака (ТакаказЫ аиб Уатаиака, 2006). Исходя из обширных знаний о специфичных к линиям клеток факторах транскрипции, можно протестировать такие факторы в сочетаниях (как в приведенных выше статьях) на их способность к прямой трансдифференцировке полученных из мочи клеток в сочетании с такими условиями культивирования, которые обычно применяются для поддержания и культивирования определенных представляющих интерес типов клеток. Серийные эксперименты согласно принципам, описанным выше для оптимизации эффективности перепрограммирования, также можно проводить и для оптимизации эффективности трансдифференцировки.

Хотя способ по изобретению предпочтительно применяется для получения клеток ШРЗСз или дифференцированных клеток из донорских клеток человека, он также может применяться на клетках от других млекопитающих (например, обезьян, лошадей, собак, кошек, свиней, крыс и мышей).

Получение нужных дифференцированных клеток, непосредственно или через промежуточные клетки И1Р8С, из отслоившихся мочевых клеток представляет собой универсальный и легко воспроизводимый способ получения Е§С-подобных клеток высокого качества. Он обладает тем преимуществом, что взятие донорских клеток может выполняться в любом месте и кем угодно, при условии, что предпринимаются минимальные меры гигиены, и от любого человека независимо от возраста, пола или состояния. Кроме того, в качестве источника клеток для перепрограммирования или трансдифференцировки моно использовать жидкость, перфузируемую в брюшину для возмещения потери почечной функции у пациентов с почечной недостаточностью, которым требуется диализ, или у пациентов после операции на мочевом пузыре, у которых не выделяется моча.

Способ по изобретению предоставляет уникальную возможность для сравнения способов перепрограммирования во всем мире и продвижения этой области к клиническому применению безопасных ίΡ8С§.

В принципе клетки ШРЗС или 1Р§С, полученные способом изобретения из других неинвазивно полученных донорских клеток, можно использовать для тех же целей, что и известные в данной области ίΡδί'Χ полученные из других типов клеток.

Выгодные характеристики ИтРЗСз делают их полезными как для исследований, так и с коммерческой перспективы, с которой, например, получения клеток ШРЗСз или происходящих из них клеток, клеточных линий, органелл или тканей от здоровых лиц или больных, например, в целях скрининга.

Клетки И1Р8С можно использовать для создания клеток для ремонта или замены тканей, при этом устраняются этические и иммунологические проблемы, связанные с использованием клеток Е§.

Клетки И1Р8С по изобретению и полученные из них ткани или органоиды, соответственно, особенно полезны для лечения пациентов с тяжелыми ожогами, которые будут обеспечены искусственной кожей, полученной из дифференцированных клеток, происходящих из мочевых клеток непосредственно или через ШРЗСз.

Для лечения заболеваний крови клетки ИтРЗСз или полученные из них диффе-ренцированные клетки либо клетки, полученные при прямой трансдифференцировке мочевых клеток, могут вводиться пациентам, страдающим, например, лейкемией, вызванной соматической мутацией.

При лечении гемофилии можно использовать генетически исправленные ИтРЗСз для аутологической трансплантации, а в случае заболеваний, уменьшающих количество иммунных клеток, как-то, например, при Ηΐν, можно использовать ШРЗСз, преобразованные в гематопоэтические клетки, для восполнения популяции иммунных клеток путем инфузии. При серповидно-клеточной анемии также можно использовать генетически исправленные 1Р8 (Наппа еГ а1., 2007, §шеисе 318, 1920-1923).

Клетки И1Р8С (или !Р§С, происходящие из других неинвазивно полученных донорских клеток) можно использовать, подобно известным в данной области 1Р§С8, при лечении терапии дегенеративных заболеваний, при которых разрушается или неправильно функционирует определенный тип клеток или ткани и организм неспособен восполнить их. При дегенеративных заболеваниях, например, болезни Паркинсона, лечение с помощью ИтРЗСз обеспечивает пораженный участок недифференцированными клетками, которые затем могут использоваться для восстановления пораженной ткани. Таким образом, терапия с помощью ИтРЗСз будет поставлять новые здоровые клетки или ткани для выполнения тех же самых функций. Клетки ИтРЗСз также могли бы использоваться для развития совершенно новых органов, которые будут совместимыми с пациентом и уменьшат вероятность отторжения трансплантата, поскольку они являются ауто-логичными клетками, т.е. клетками, происходящими от донорских клеток самого пациента, например, в случае диабета можно получать кластеры, подобные секретирующим инсулин островкам, как из !Р8С8 (ТаГе18к1 еГ а1., 2008, Ат 1 Рку§ю1 Веиа1 Рку§ю1 295, Р1365-1375).

Клетки И1Р8С также можно использовать (см. обзор по 1Р8С8 в Ьаи еГ а1., 2009, Р1000 ΒίοΙ Вер. 1: 84) для получения специфичных к заболеванию клеточных линий, применимых в качестве моделей заболеваний и/или для скрининга возможных лекарственных препаратов ίη νίΓτο и/или для исправления генетических дефектов при генной терапии. Получение терминально дифференцированных клеток (напри- 5 028902

мер, гепатоцитов или кардиомиоцитов) из клеток υίΡδϋ (или полученных путем трансдифференцировки непосредственно из мочевых клеток) позволит, к примеру, скрининг и дальнейшее профилирование соединений соответствующей клеточной линии, с целью определения специфичности пациента (при персонализированном лечении) или общей применимости соединения. В качестве примера: как описано в О1шо8 е! а1., 2008 (Зсьеисе, 321(5893): 1218-2), клетки υίΡδϋ можно использовать в качестве модели для семейной формы амиотрофического латерального склероза; либо в качестве модели или для лечения, соответственно, других генетических заболеваний, как описано в Рагк е! а1., 2008 (Се11, 134(5):877-8), которые получали клетки ίΡδ от пациентов с 10 различными генетическими заболеваниями, включая болезнь Паркинсона, диабет 1-го типа, мышечную дистрофию Дюшенна и Беккера, связанный с дефицитом аденозиндезаминазы тяжелый комбинированный иммунодефицит, синдром ЗсктасЬтаи-ВоФаиΌίαιηοηά. болезнь Гоше 111 типа, болезнь Хантингтона, синдром Дауна и носительство синдрома ЬекскΝνΐιαη. Кроме того, можно создавать модели спинальной мышечной атрофии и болезни Паркинсона на основе клеток человека аналогично тому, как описано в ЕБей е! а1., 2009 (№!иге, 457(7227):277-8) и §о1йпег е! а1., 2009 (Се11, 136(5): 964-77), или же можно использовать υίΡδί'Χ полученные из клеток пациента с гомозиготной бета-талассемией аналогично тому, как описано в Уе е! а1., 2009 (Ргос №11 Асай 8с1 υδΑ, 106 (24):9826-3) для ίΡδί'Χ полученных из кожных фибробластов, которые впоследствии дифференцировались в продуцирующие гемоглобин гематопоэтические клетки. Такие υίΡδί'Χ после генной инженерии, могут давать аутологичные гематопоэтические клетки, которые нормально функционируют. Клетки Е|Р5С также можно использовать для коррекции генетических дефектов у больных анемией Фанкони, как описано в йауа е! а1., 2009 (№!иге, 460(7251):53), которые получали клетки ίΡδ из кожных фибробластов, взятых у больных анемией Фанкони, проводили коррекцию с помощью лентивирусных векторов, кодирующих ΡΑNСΑ и ΡΑNС^₂, а затем получали соматические клетки, которые фенотипически были свободны от болезни.

Клетки ΟΡδί/ можно использовать так же, как и ίΡδ, полученные Ьее е! а1., 2009 (№!иге, 461 (7262) :402), которые получали клетки ίΡδ от пациентов с семейной дисаутономией (ΡΌ), подвергали их повторной дифференцировке и использовали как модель ίη уйго для скрининга вероятных препаратов.

Другим примером заболевания, при котором клетки υίΡδί'.' могут иметь большое значение в качестве модели заболевания, является синдром Ργ;·^γ \νί11ί (Уапд е! а1., 2010, 1 Вю1 СЬет 285, 40303-40311). Другим примером генетических заболеваний, при которых большое значение может иметь генная терапия с использованием ^ΡδΟΧ является буллезный эпидермолиз (например, путем перепрограммирования с помощью мРНК К14, как описано в Vа11у е! а1., 2010, Нит Мо1 Сепе! 19, 4715-4725; е! а1., 2008, 1 1пуе8! Эегта1о1 128, 568-574). В общем, генная терапия на основе генетически сконструированных ΟΡδί/ имеет наибольший потенциал для лечения заболеваний, вызванных нарушением одного гена; на сегодняшний день описано ок. 4000 таких генетических заболеваний.

В вышеприведенных моделях заболеваний, в которых применяются терминально дифференцированные клетки, такие клетки, в качестве альтернативы получению из ^ΡδίΆ могут быть получены путем прямого перепрограммирования донорских клеток. В настоящем изобретении "прямое перепрограммирование" применяется в качестве синонима "трансдифференцировке", как она определена здесь.

Если донорские клетки представлены раковыми клетками, например, клетками рака почек или мочевого пузыря, предположительно на ранних стадиях рака, то υίΡδί','δ или диффференцированные из них клетки применимы в качестве модели соответствующего рака.

Генная терапия включает введение, изменение или удаление одного или нескольких генов в клетках индивида для того, чтобы исправить генетический эффект, вызывающий заболевание. До сих пор лечение предусматривалось в основном для моногенных заболеваний, вызванных мутациями в отдельных генах. Наиболее распространенная форма генной терапии включает введение функциональных генов в неопределенное место в геноме для того, чтобы заменить мутировавший ген. Мутация может быть и непосредственно исправлена.

Для применения в генной терапии генетически модифицированные клетки представлены υ^ΡδСδ или дифференцированными клетками, полученными из них (или полученными при прямом перепрограммировании донорских клеток); с другой стороны, хотя и менее предпочтительно, можно генетически модифицировать размноженные донорские клетки перед перепрограммированием. В рамках изобретения генетически модифицированные клетки должны использоваться преимущественно при соматической генной терапии. Поскольку коррекция генетических дефектов осуществляется ш уйго перед повторной инфузией или трансплантацией υίΡδί','δ или полученных из них дифференцированных клеток (или полученных при прямом перепрограммировании донорских клеток), то риск переноса генов в гаметы сводится к минимуму. Исправленные клетки вводятся или трансплантируются в виде дифференцированных клеток, полученных из ^ΡδΟΆ (или подвергнутые прямой транедифференцировке без предварительного перепрограммирования ίΡδ) для того, чтобы дополнить или заменить нефункци-онирующую ткань или орган. Корректирующий ген может быть введен в клетки известными методами, например, с помощью вирусных векторов (модифицированных таким образом, чтобы свести к минимуму риск реактивации), включая ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, лентивирусы, вирус №^δ δ^ρ^χ, или с помощью плазмидных векторов или даже голой ДНК.

- 6 028902

Коррекция генных дефектов может осуществляться различными способами, например, путем введения ДНК, кодирующей правильно функционирующий ген, нокаута мутировавшего гена путем введения ниРНК или миРНК, использования белков ζίηα йидег для нокаута или рекомбинации либо с помощью векторов, позволяющих явление транс-сплайсинга.

Можно ожидать, что благодаря неинвазивному способу получения донорских клеток может установиться высокое признание у здоровых людей того, чтобы заранее и профилактически подготовить и хранить υίΡδϋδ, полученные из своей собственной мочи, а также производные клеточные линии, органоиды или ткани типа искусственной кожи, что должно способствовать быстрому использованию в случае возникновения тяжелого заболевания или травмы типа ожога.

Фибробласты, кератиноциты или искусственная кожа, созданная из клеток υίΡδϋ (Вйоикоуа е! а1., 2010, 1 1пуе51 Эегта1о1. Эес 9), например, полученных из донорских клеток лиц с различными типами кожи, также могут применяться в косметической промышленности для тестирования.

Клетки υίΡδΟ также могут применяться для клонирования животных, особенно млекопитающих, например, скаковых лошадей или домашних животных.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Окрашенные гематоксилином/эозином срезы тератом, содержащих сложные производные 3 зародышевых слоев, произведенные с 2 репрезентативными клонами υίΡδΟ.

Фиг. 2. А. Фазово-контрастные и иммунофлуоресцентные снимки нейронных клеток, полученных по приведенной методике из репрезентативного клона υίΡδΟ В. Репрезентативный клон υίΡδΟ подвергали дифференцировке в кардиомиоцитные клетки по приведенной методике. Фазово-контрастные, окрашенные ΡΑδ и иммунофлуоресцентные снимки. С. Репрезентативный клон υίΡδΟ подвергали дифференцировке в гепатоцитные клетки по приведенной методике. Фазово-контрастные, окрашенные ΡΑδ и иммунофлуоресцентные снимки. Ό. Потенциалы действия при измерении на кардиомиоцитах, полученных из репрезентативного клона υίΡδΟ.

Примеры

Материалы и методы

Иммунофлуоресцентная микроскопия.

Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи, отмывали, блокировали и пермеабилизировали в блокирующем растворе (ΡΒδ, содержащий 3% нормальной козьей сыворотки и 0,2% тритона Х-100) в течение 30 мин. Затем их инкубировали с первичными антителами в блокирующем растворе при 4°С в течение ночи, дважды отмывали и инкубировали с соответствующими вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки отмывали дважды и окрашивали ΌΑΡΙ (δίβΐηα) в течение 5 мин, а затем рассматривали и фотографировали с помощью конфо-кального микроскопа ΤΟδ δΡ2 δрес!^а1 (Ьеюа М1сгоку5!ет8 ОтЬН, АеО1аг, Оегтаиу).

Перед иммунофлуоресценцией вырезали сокращающиеся участки ножницами, собирали в пробирку на 1,5 мл, заполненную ΡΒδ с низким содержанием кальция, и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Эти скопления клеток переносили в ферментный буфер, содержащий 0,5-1 мг/мл коллагеназы 2, и инкубировали при 37°С в течение 30-40 мин. Расщепление останавливали с помощью смеси ЭМЕМ/Нат'к Р12 1:1 (Нус1опе), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ΡΒδ; ΡΑΑ), δ^η§1е^ио! Κίΐ СС4127 КЕОМ (Ъогоа). Затем образцы центрифугировали, а осадок ресуспендировали в смеси ЭМЕМ/Нат'к Ρ12 1:1 (Нус1опе), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ΡΒδ; ΡΑΑ), δ^η§1е^ио! Κίΐ СС4127 КЕОМ (Ъогоа). Суспензии клеток высеивали на покрытые желатином покровные стекла и культивировали при 37°С в течение по меньшей мере 2 дней перед фиксацией и иммунофлуоресценцией.

Тканеспецифическая дифференцировка и электрофизиологические измерения.

Дифференцировка в нейроны, гепатоциты и кардиомиоциты проводилась, как описано ранее (Гапкηΐζ е! а1., 2007, δΐет Се11з 25, 1511-1520; δτηιμ е! а1., 2009, Се11 Кек 19, 1233-1242; Ζ^ί е! а1., 2009, СпсШа0оп 120, 1513-1523). N2 и В27 приобретали у фирмы ПкПгодеп. гепарин - δίβΐηη. ЕОР - К&Э δу5ΐет5. Активин А и онкостатин М приобретали у К&Э δу5ΐет5 (М1ппеароЙ5, М^ υδΑ), ΒМΡ2, ΡΟΡ4, НОР и КОР - кергоТеск (Коску НШ, υδΑ) и дексаметазон - Егоо Ы1с δ^ιη^δ (Рагтш§4а1е, υδΑ). КЬМ1 1640, Ьера!оΖΥМЕ-δΡΡ, окрашивание перйодной кислотой по Шиффу (ΡΑδ) проводили с помощью набора от фирмы Ρо1у5с^еηсе5 (Аатп§!оп, υδΑ). Электрофизиологические характеристики полученных из ^ΡδС кардиомиоцитов (день 23) снимали стандартным методом пэтч-клампа на целых клетках для записи фенотипа потенциалов действия (НЕКА 1пк1гитеп!5 1пс., δоиΐЬЬо^о, МΑ) (СЬап е! а1., 2009, 1 Сагйюуакс Е1ес1горЬу5ю1 20, 1048-1054). Пэтч-пипетки делали из тонкостенных трубок на 1,5 мм из боросиликатного стекла при помощи съемника микропипеток Р-97 фирмы διιΙ^Γ и они обычно имели сопротивление в 3-5 МО при заполнении внутренним раствором, содержащим (мМ): 110 К+ аспартата, 20 КС1, 1 МдС1₂, 0,1 №-ΟΤΡ, 5 Мд-ΑΤΡ, 5 №₂-фосфокреатина, 5 ЕОΤΑ, 10 НЕΡЕδ, доведенным до рН 7,3 с помощью КОН. Наружный омывающий раствор Тироде состоял из (мМ): 140 №С1, 5 КС1, 1 МдС1₂, 0,4 ΚΉ₂ΡΟ₄, 1,8 СаС1₂, 10 глюкозы, 5 НЕΡЕδ, доведенным до рН 7,4 с помощью №ЮН. Спонтанную электрическую активность измеряли в то время, когда полученные из ίΡδΟ кардиомиоциты оставались пассивными без подачи тока. Регистрировали 20 последовательных потенциалов от издающих спонтанные разряды полученных из ίΡδΟ кардиомиоцитов, получая устойчивые формы сигналов для анализа. Данные подвергали

- 7 028902

коррекции на потенциалы жидкостной границы в +15,9 мВ. Кальциевые транзиенты детектировали методом конфокальной визуализации кальция по ранее описанной методике (Ыд с1 а1., 2010, 1 Мо1 Се11 СагЙю1 48, 1129-1137). Вкратце, выделенные полученные из !Р8С кардиомиоциты нагружали при 5 мкМ Р1ио-3 АМ (1пуйгодеп) в течение 25 мин при 37°С в растворе Тироде, содержащем (мМ): 140 ЫаС1, 5 КС1, 1 МдС1₂, 0,4 КН₂РО₄, 1,8 СаС1₂, 10 глюкозы, 5 НЕРЕ8 при рН 7,4. Кальциевые транзиенты регистрировали с помощью конфокальной системы визуализации (О1утриз Р1ио\ае\у §уз!ет РУ300 Т1ЕМРО уегзюп 4.2), установленной на стоящий вертикально микроскоп О1утриз (1X71), а затем количественно измеряли в виде изменений интенсивности флуоресценции за вычетом фона, нормализованных по исходной флуоресценции за вычетом фона. Данные вводили в программу Рейх 32 (Рйо1оп Теейпо1оду 1п1егпайопа1) для анализа.

ί) Сбор мочи и размножение клеток.

Соответствующие контейнеры (объемом до 500 мл) стерилизировали перед сбором мочи. В стерильные контейнеры собирали только среднюю порцию мочи. Обычный объем образцов составлял 150200 мл. Затем образцы мочи под ламинаром переносили в пробирки на 50 мл и центрифугировали их при 400 д в течение 10 мин при комнатной температуре. Супернатант тщательно удаляли под ламинаром, оставляя примерно 1 мл или меньше мочи в пробирке. Осадки ресуспендировали по отдельности и все пробирки на 50 мл из одного сбора образцов объединяли в одну пробирку на 50 мл. Добавляли 10 мл РВ§, содержащего ампотерицин В и пенициллин/стрептомицин. Образцы центрифуги-ровали при 400 д в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, оставляя только около 0,2 мл образца. Добавляли 1 мл основной среды и ресуспендировали клеточный осадок. В состав основной среды входит ИМЕМ/Нат'з Р12 1:1 (Нус1опе), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (РВ§; РАА), §шд1е0ио1 Кй СС-4127 КЕОМ (Ьоп/а). амфотерицин В и пенициллин/стрептомицин. Клетки переносили в 12-луночные планшеты, покрытые Ьжелатином в 1 мл основной среды. Первые 2 дня добавляли по несколько сотен мл основной среды, чтобы поддержать концентрацию антибиотиков и уровень питательных веществ. В последующие дни среду тщательно заменяли на среду КЕВМ (Кепа1 Ерййейа1 Ваза1 Мебшт, йоп/а), содержащую 8шд1е0ио1 Кй СС-4127 КЕОМ (Ьоп/а) (сочетание этих двух именуется средой для мочевых клеток), но эта процедура никогда не проводилась полностью, чтобы сохранились факторы, секретируемые мочевыми клетками, и избежать ненужного стресса. Обычно через 3-6 дней появлялись видимые клетки/колонии. После появления первых клеток/колоний проводили первую полную замену среды. Клетки переносили на большую поверхность с помощью 0,25% трипсина, содержащего 1 мМ ЕИТА, когда культура достигала конфлюентности (становилась сплошной). Эти и другие процедуры были одобрены комитетом по этике Оиапд/Нон 1пз1йи1е5 о! ВютеФсше апй Неайй Клетки КРТЕС получали, как описано ^езег е1 а1., 2008, Ат 1 Рйузю1 Кепа1 Рйузю1 295, Р1365-1375, и содержали в среде для мочевых клеток. Фибробласты получали из кожных фибробластов, приобретенных из хранилища клеток СопеК и содержали в ИМЕМ (1пуйгодеп) + 10% (об/об) эмбриональной телячьей сыворотки (РВ§; Нус1опе).

На первый взгляд, культуры мочевых клеток состояли в основном из клеток плоского эпителия (вероятно, из мочеиспускательного канала) и небольшого количества клеток крови (в основном эритроцитов), но через 2-3 дня эти клетки исчезали и замещались небольшими колониями (в среднем 3 на образец), которые быстро росли. Эти колонии соответствовали 2 основным морфологическим типам: 1 типу или 2 типу, что соответствует предыдущим сообщениями по выделению мочевых клеток (ЛоггепНаиз е1 а1., Агсй Тох1со1 2000, 74, 618-626). Клетки 1 типа обычно имели более округлую форму и росли тесно сцепленными с соседними клетками, что соответствует эпителиальному фенотипу. Клетки 2 типа были несколько более вытянутыми и обычно росли немного более дисперсно. В некоторых сборах образцов все колонии соответствовали одному из 2 типов, но в других они были смешанными. Эти культуры клеток объединяли после достижения высокой плотности и разделяли на порции для дальнейшего изучения или параллельного перепрограммирования. Порции, обогащенные клетками 1 типа, проявляли хорошо сформировавшиеся межклеточные соединения, положительные на Е-кадгерин и р-катенин (маркеры зоны айНегепз) и 2О-1 (белок-1 зоны осс1ийепз; маркер плотных контактов), по данным иммунофлуоресцентной микроскопии. Они были также положительны на кератин-7 промежуточных филаментов, эпителиальный маркер, и маркер проксимальных почечных канальцев С.П13. Кроме того, распределение актина было кортикальным, а не как в стрессовых волокнах. Количественный ПЦР в реальном времени (кПЦР) также подтверждал преимущественно эпителиальное происхождение, как это видно по анализам на Е-кадгерин, окклюдин и клаудин-1 (белки плотных контактов) и транспортер §ЬС2А1 2-го семейства переносчиков растворимых веществ проксимальных почечных канальцев. В качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно, для иммунофлуоресценции и кПЦР использовали проксимальные почечные эпителиальные клетки (КРТЕСз; ^езег е1 а1., 2008, Ат 1 Рйузю1 Кепа1 Рйузю1 295, Р1365-1375) и кожные фибробласты. Обогащенные клетками 2 типа культуры проявляли почти такой же профиль флуоресценции, но с меньшей интенсивностью и более неоднородным распределением; результаты кПЦР также были сопоставимы. В обоих случаях почти не наблюдалось окрашивания на фибробластные маркеры фибронектин и виментин.

и) Получение и размножение клеток ШРЗС.

Подвергали перепрограммированию образцы от 12 молодых людей китайского или европейского

- 8 028902

происхождения, из которых было 7 мужчин и 5 женщин. Мочевые клетки после 2-3 пересевов трансдуцировали ретровирусами, продуцирующими δοχ2, Κ1ί4, Ос!4 и с-Мус (Са1 е! а1., 2010, 1 ΒίοΙ СЬет 285, 11227-11234; ЕЛеЬап е! а1., 2010, Се11 5>1ет Се11 6, 71-79). Ретровирусные плазмиды, продуцирующие факторы транскрипции Ос14. δοχ2, Κ1Ε4 и с-Мус человека, приобретали у фирмы Аййдепе (СатЬпйде, МА, И8А). Вирусные супернатанты собирали 2 дня подряд, начиная через 48 ч после трансфекции. Мочевые клетки после 2-4 пересевов подвергали трипсинизации и высеивали на 6-луночные планшеты по 60 000 клеток на лунку. Клетки инфицировали вирусными супернатантами, полученными при трансфекции клеток 293Т (с помощью липофектамина 2000, 1пуЬгодеп) ретровирусными векторами рМХз (Аййдепе), содержащими кДНК Ос!4, δοχ2, Κ1ί4 и с-Мус человека. Проводили подряд два раунда инфицирования (по 12 часов). Для повышения эффективности заражения добавляли полибрен (§1§та). После второго раунда инфицирования (эффективность заражения составляла почти 100%, как об этом свидетельствует контрольная трансдукция ОЕР-экспрессирующими векторами) культуральную среду у трансдуцированных клеток заменяли на среду для мочевых клеток и обновляли ежедневно. На 3 или 4 день клетки трипсинизировали и подсчитывали. Как правило, в чашки на 10 см высеивали 50 000 клеток на слой питающих клеток, используя среду для ЕЗС человека (Р12 |1пуПгодеп] + 20% ΚδΚ [Κпοск-οиΐ Зегит Кер1асетей, 1пуПгодеп] + 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов + заменимые аминокислоты [1пуЬгодеп], Ь-глутамин и β-меркаптоэтанол), которую обновляли каждый день. На 5 день среду заменяли на среду для ЕЗС человека + 1 мМ вальпроевой кислоты (УРА; §1§та) или половину среды ЕЗС + половину среды άΡΒδ (состоящей из ΌΜΕΜ с высоким содержанием глюкозы |1пуПгодеп] + 20% составленной для человека эмбриональной телячьей сыворотки [ΡΒδ, Нус^пе] + УРА. УРА оставляли только с 5-го по 12-й день. Среду заменяли на среду тТезК! (З!етсе11), которую обновляли ежедневно вплоть до последнего дня эксперимента. Начиная с 16 дня можно было механически отобрать те колонии, которые были достаточно большими и идентифицируемы как подобные клеткам ЕЗС человека (это плоская морфология с четкими границами и большими ядрами, содержащими заметные ядрышки), и размножить их в среде для ЕЗС человека на питающих клетках или в среде тТекК! на матригеле (Ма1пде1).

ίίί) Характеристика клеток И1Р8С.

Окрашивание на АР, встраивание трансгена, кариотипирование и бисульфатное секвенирование проводили, как описано в Са1 е! а1., 2010, 1 Βίο1 СЬет 285, 11227-11234; Ез1еЬап е! а1., 2010, Се11 З!ет Се11 6, 71-79.

Анализ 8ТК проводили на анализаторе АррЬей ЕюууЧепъ Оепейс Апа1у/ег (АЕ13130, АЕ1). Геномную ДНК экстрагировали с помощью набора ОЫеаву Т188ие кЬ (01адеп, Нййеп, Оегшапу), а тотальную РНК экстрагировали с помощью Т^^ζο1 Опуйгодеп, Ра181еу, И8А). кПЦР проводили на установке ТЬегта1 Сус1ег Июе™ Кеа1 Т1те 8у81ет (АЕ17300, АЕ1, Ρο8ΐе^, СаЬ&т1а, И8А) с использованием δΎΒΚ Огееп Ргет1х ЕХ Тад™ (Такага, ЗЫда, 1арап); для нормализации использовали β-актин, а все измерения проводили в тройных пробах. Микрочипирование ДНК проводили с использованием Нитап НТ-12 У4.0 Ехрге88юп ЕеайсЫр фирмы П1ит1па в соответствии с инструкциями производителя. Чипы сканировали при помощи Шитта ГеабСЫр Кеайег, а данные анализировали с помощью программы Шитта Βеайδΐий^ο АррЬса1юп. Для получения тератом вводили 2х10⁶ ШРЗСз подкожно или внутримышечно в правую заднюю лапку мышей ΝΟΌ-δΟΌ с ослабленным иммунитетом. Через 8-10 недель опухоли вырезали, фиксировали и заключали в парафин, делали срезы и окрашивали гематоксилином/ эозином. Для дифференцировки в ЕВ клетки ίΡδί'.' на питающем слое обрабатывали диспазой (ЗпуНгодеп) и собирали путем соскабливания. После центрифугирования кле-точные осадки ресуспендировали в среде для ΕδС человека без ЬРОР и культивировали в течение 8 дней в неадгезивных чашках. Затем ΕΒδ переносили в покрытые желатином чашки для дифференцировки еще на 8 дней, после чего обрабатывали для иммунофлуоресцентного анализа.

Изучение первичной культуры и полученных ШРЗСз показало, что небольшие колонии обычно появлялись на 9-16 день, но это колебалось в зависимости от донора без особого паттерна. Многие из этих колоний постепенно принимали морфологию ЕЗС человека и их отбирали с 16 по 25 день. Эффективность перепрограммирования также менялась в зависимости от донора, но в целом была достаточно высокой и составляла от 0,1 до 4%. Клетки υίΡδΕ также были получены от 65-летнего мужчины, причем эффективность перепрограммирования была ниже (0,01%), но все-таки значительно выше той, которая отмечалась для клеток периферической крови. Кроме того, можно было замораживать и оттаивать мочевые клетки от нескольких доноров перед трансдукцией, и это не ухудшало эффективность перепрограммирования. Мочевые клетки можно инфи-цировать и на поздних пересевах, хотя и с небольшим снижением эффективности.

После экспансии колоний клетки ШРЗС характеризировали по стандартным методикам, включая окрашивание на щелочную фосфатазу (АР), при этом были четко видны положительные колонии клеток с сильным окрашиванием на АР, что проявлялось темным окрашиванием целой колонии. Эти колонии также окрашивались положительно и при непрямом иммунофлуоресцентном окрашивании на маркеры клеток ЕЗ: ТКА-1-60, ТКА-1-81, №юд, ЗЗЕА-3 и ЗЗЕА-4. Кроме того, эндогенные гены ЕЗС отмечались методом кПЦР плюс наблюдался сайленсинг этих трансгенов. На микроматрицах ДНК проявлялась гло- 9 028902

бальная экспрессия генов, близкая к клеткам ЕЗС Н9, так как на графике произвольных единиц флуоресценции из микроматриц клеток ЕЗ против таковых у клеток ШРЗС проявлялся линейный наклон в 45°. Анализ одиночных тандемных повторов (ЗТК) у донорских мочевых клеток и ШРЗСз показал одинаковое происхождение их во всех случаях. Раз это так, то тем самым исключается загрязнение и перепрограммирование клеток от сексуального партнера.

После экспансии колоний клетки ШРЗС характеризировали по стандартным методикам, включая окрашивание на щелочную фосфатазу (АР), при этом были четко видны положительные колонии клеток с сильным окрашиванием на АР, что проявлялось темным окрашиванием целой колонии, тогда как нетрансфецированные клетки не проявляли окрашивания на щелочную фосфатазу. Они проявляли нормальный кариотип после встраивания трансгена в геномную ДНК, а также окрашивались положительно при непрямом иммунофлуоресцентном окрашивании на маркеры клеток ЕЗ: ТКЛ-1-60, ТКА-1-81, Ναηοπ, ЗЗЕА-3 и ЗЗЕА-4. Кроме того, методом кПЦР отмечались эндогенные гены ЕЗС плюс наблюдался сайленсинг этих трансгенов (представлено в таблице ниже; ЙТЕКТ означает обратную транскриптазу теломеразы человека. Значения относятся к донорским мочевым клеткам; в качестве контроля использовали клетки ЕЗС Н9). На микроматрицах ДНК проявлялась глобальная экспрессия генов, близкая к клеткам ЕЗС Н9, так как на графике произвольных единиц флуоресценции из микроматриц клеток ЕЗ против таковых у клеток ШРЗС проявлялся линейный наклон в 45°. Бисульфитное секвенирование показало сильное деметилирование проксимальных промоторов Ос14 и Ναηοπ у 2 репре-зентативных клонов ЕЧРЗС от одного и того же донора. Анализ одиночных тандемных повторов (ЗТК) у донорских мочевых клеток и ШРЗСз показал одинаковое происхож-дение их, а на микроматрицах ДНК проявлялся профиль глобальной экспрессии генов, близкий к клеткам ЕЗС Н9.

	Донорские клетки	ис С0406ΐΡδ С1Р5	ис С0406ίΡδ С4Р7	иС δΟ73Ο-ΪΡδ 2Р4	ис δ0730-ϊΡδ СЗР4	исого81бΐΡδ СЗРЗ	ис ΖΟΖ0816ΪΡδ С4Р2	Клетки ΕδС Н9
Ос14	1	110,43	120,98	101,28	91,59	153,20	108,96	269,94
δοχ2	1	992,36	1331,22	4195,71	3884,33	1651,03	1133,96	1587,38
№под	1	1178,53	856,14	111,00	113,12	1128,93	1172,23	402,32
ЬТЕКТ	1	11964,73	14498,34	1311,36	1263,01	10149,00	7608,26	9768,02

ίν) Доказательства множественной способности к дифференцировке у ЕЧРЗСА

Чтобы доказать, что клетки ЕЧРЗС являются плюрипотентными, проводили неспецифическую дифференцировку путем образования тератомы (фиг. 1) и эмбриоидных тел (ЕВ§). В обоих случаях наблюдалось появление производных всех 3 зародышевых листков, а тератомы содержали довольно сложные структуры без видимых признаков некроза или инвазии в капсулу опухоли (фиг. 1). Затем проводили направленную дифференцировку ШРЗСз в нейрональные линии (нейрональные стволовые клетки, нейроны и астроциты) (фиг. 2А), кардиомиоциты (фиг. 2В) и гепатоциты (фиг. 2В); накопление гликогена выявлялось по окрашиванию перйодной кислотой по Шиффу), что проверяли методом иммунофлуоресцентной микроскопии на соответствующие маркеры, а также кПЦР (только для гепатоцитов и кардиомиоцитов). Примечательно, что нейрональная дифференцировка произошла у 12 ШРЗСз, соответствующих 11 донорам, в гепатоциты -у 4 клонов от 3 доноров, и в кардиомиоциты - у 14 клонов от 11 доноров. Видеосъемка показала высокую долю спонтанно сокращающихся ЕВ§ (в районе 30-75%). Такие же результаты дало электрофизиологическое измерение потенциалов действия (фиг. 2Ό) и кальциевых транзиентов (электрофизиологические свойства кардиомиоцитов из двух клонов проявляли поведение, близкое кардиомиоцитам, полученным из клеток ЕЗС человека, или полученным из фибробластов клеткам 1РЗС).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения представляющих интерес дифференцированных клеток, который включает: ΐ) размножение отслоившихся соматических мочевых клеток из мочевыводящих путей и

и) получение дифференцированных клеток из данных размноженных клеток путем перепрограммирования данных клеток в индуцированные полученные из мочи плюрипотентные стволовые клетки (ЕЯРЗСА) и дифференцировки этих ЕЧРЗСТ в представляющие интерес клетки, где указанное перепрограммирование осуществляется при помощи смеси экзогенных перепрограммирующих факторов, включающей факторы, выбранные из семейства генов Ос1, семейства генов К1£, семейства генов Зох и семейства генов Мус.
2. Способ по п.1, где указанные отслоившиеся мочевые клетки были получены от больного или от здорового индивидуума и выбраны из эпителиальных, фибробластоидных или раковых клеток.
3. Способ по п.1, где перепрограммирование осуществляется при помощи смеси экзогенных перепрограммирующих факторов, выбранных из Зох2, Ос14, К1£4, с-Мус и дополнительно Иапод.

- 10 028902
4. Способ по п.1 или 3, где перепрограммирование включает экспрессию перепрограммирующих факторов клетками без встраивания в геном и/или без экспрессии онкогенов.
5. Способ по любому из пп.1-4, где перепрограммирование дополнительно включает применение небольших молекул, небольшой интерферирующей РНК или микроРНК, которые повышают эффективность или заменяют один или несколько из указанных перепрограммирующих факторов.
6. Способ по п.1, где указанные клетки представляют собой клетки человека.
7. Способ получения индуцированных плюрипотентных полученных из мочи стволовых клеток (ϋΐΡδϋδ), включающий:

ΐ) размножение отшелушившихся соматических клеток, полученных из мочи, и

ΐΐ) перепрограммирование указанных размноженных клеток в ϋΐΡδϋδ, где указанное перепрограммирование осуществляется при помощи смеси экзогенных перепрограммирующих факторов, включающей факторы, выбранные из семейства генов Ое1, семейства генов К1Г, семейства генов δοχ и семейства генов Мус.

Нейронные розетки Гладкие мышцы Кишечный эпителий