WO2010084275A1 - Procédé simplifié de reprogrammation génétique et épigénétique partielle de cellules. - Google Patents

Procédé simplifié de reprogrammation génétique et épigénétique partielle de cellules. Download PDF

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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS

Definitions

  • the present invention relates to the partial genetic reprogramming and epigenetic reprogramming, including rejuvenation, of biological cells, such as specialized adult cells, in particular to regenerate and / or increase their specific functions, their immune power and their active life.
  • Such rejuvenation is particularly useful in the field of cellular treatments, especially for the realization of autografts from differentiated cells, which have become insufficient by their biological age or their functional health status, as well as to obtain extracts capable of invigorating a genetically tissue.
  • Cellular treatments, and in particular autografts, especially genetically manipulated, are currently practiced for the purpose of repairing a damaged tissue suffering from a disease, a cell deficit or a necrosis.
  • This technique often involves either taking a few healthy cells of the tissue concerned, placing them in a cell multiplication culture in order to constitute a cell stock or tissue and then re-implanting these cells in the tissue to be treated, or at first, dedifferentiate these cells in the embryonic state using a few factors imported into their cytoplasm and / or nucleus, and then artificially redifferentiate them.
  • iPS induced pluripotent cells
  • Pluripotent Stemcells "). During the subsequent artificial differentiation of these stem cells, part of the epigenetic information is lost, in particular the phenotype of the original cell is not maintained in all its specificity and stability, the cell thus losing some memory of his origin.
  • the article by Valery Krizhanovsky & Scott W. Lowe indicates that decrease of the p53 gene, which generates risks of cellular instability and cancers. These techniques are thus for the moment inappropriate for the man.
  • the invention proposes a direct and rapid partial cell reprogramming unlike current stem cell methods that use long and indirect pathways, since they first require artificial return of the embryonic adult cells and then proceed to artificial differentiation. , with a risk of some genetic instability.
  • WO 2005/046790 and US 2006/0252062 describe a method called "partial cloning" which consists of temporarily transferring a nucleus of a cell to be treated in a genetic reprogramming medium, in particular an enucleated oocyte.
  • the manipulation and transfer of isolated nuclei from cells is relatively complex and therefore quite difficult.
  • the object of the present invention is to provide systems and methods for epigenetic reprogramming not having the aforementioned disadvantages.
  • the present invention is intended in particular to rejuvenate a cell by preserving the transcription factors specific to the cell line to maintain all its immunologically autologous specificity with respect to the original tissue.
  • the object of the present invention is to provide systems and methods for genetic and epigenetic reprogramming of cells making it possible to reduce the biological age of the treated cells, such as the suppression of cellular senescence, without ever inducing a total functional dedifferentiation. of these.
  • the purpose of the present invention is to achieve a partial cell reprogramming which, in particular, maintains during its realization of the functional and immunological specificities of the cell (monopotent reprogramming).
  • the present invention also aims to restart several viable successive mitoses in permanently quiescent senescent cells or in abnormal mitoses, to generate genetically rejuvenated mitoses, and also to rejuvenate genetically cells independently of their mitoses.
  • the present invention also aims to provide a partial cell reprogramming method that is simple, inexpensive and quick to implement and use.
  • the subject of the present invention is therefore a method for genetic and epigenetic reprogramming of biological cells, comprising partially reprogramming a cell to be treated, without returning to its embryonic state, in order to modify the biological age of said cell to be treated without causing functional dedifferentiation.
  • said cell to be treated said cell to be treated constantly remaining a specialized functional cell immunologically autologous to the donor tissue from which said cell to be treated is derived, and whose phenotype is preserved and / or rejuvenated.
  • the method comprises the following steps:
  • MRG genetic reprogramming medium
  • CSG genetic reprogramming cell
  • said cell to be treated completely is subjected to a pretreatment to temporarily open one or more passage (s) in its membrane, allowing influences and / or interactions and / or exchanges between said pretreated cell and said MRG through said passage (s) open (s) in the membrane of said pretreated cell.
  • said pretreatment of said cell to be treated causes pore opening or mechanical or physical cracking of said membrane.
  • said cell to be treated is soaked in a bath, in particular saponin or streptolysin O, and then washed, in particular with a physiological solution.
  • MRG is performed before the end of the first mitosis of said rejuvenated cell.
  • said MRG comprises an enucleated and activated oocyte.
  • activating substances capable of activating nuclear metabolism such as cells or cell extracts appearing during cicatrization and / or signaling proteins or peptides or stimulating metabolism and / or growth and / or cells or extracts of cancer cells, are added during a pretreatment and / or added to said MRG and / or added during the multiplication of rejuvenated cells.
  • the method comprises the following steps:
  • siRNAs acting specifically on HP1 heterochromatins in particular anti HP1 siRNAs, for inhibiting the RNAs that control the evolution of HP1 heterochromatins.
  • the step of introducing anti HP1 siRNA comprises simultaneously introducing anti HP1 ⁇ siRNA, anti HP1 ⁇ siRNA and anti HP1 ⁇ siRNA.
  • said adult cell is a senescent cell, functional or not, the introduction of anti HP1 siRNA causing the recovery of mitosis, including durable mitosis, viable and regenerating, said senescent cell.
  • after the introduction into the cell of anti siRNAs comprises simultaneously introducing anti HP1 ⁇ siRNA, anti HP1 ⁇ siRNA and anti HP1 ⁇ siRNA.
  • heterochromatin HP1 the structural aspect of heterochromatin HP1 becomes more homogeneous and / or less anisotropic.
  • said cell to be treated is a viable senescent cell, functional or not, the rejuvenation causing the recovery of mitosis, including durable mitosis, viable and regenerating, said senescent cell.
  • the method is adapted to the reprogramming of adult cells such as thymus cells, cardiac, dendritic, adipose, auditory, ocular, olfactory, articular, renal, bone, dental, periodontal, cartilaginous, bone, muscle, pancreatic cells. , hepatic, nerve, prostatic, hematopoietic, immune, lymphocytic, pulmonary, arterial, retinal, cutaneous, dermal, epidermal, conjunctive, glandular, tendinous, vascular, splenic, parathyroid, adrenal and / or gastrointestinal tract, respiratory, and urinary.
  • adult cells such as thymus cells, cardiac, dendritic, adipose, auditory, ocular, olfactory, articular, renal, bone, dental, periodontal, cartilaginous, bone, muscle, pancreatic cells.
  • the rejuvenation of said rejuvenated treatment cell is measured by the analysis of markers associated with biological age, in particular the SAHF markers ("Sénescence Associated").
  • Heterochromatin Foci Heterochromatin Foci
  • SASP components Senescence Associated Secretory Phenotype "
  • said method modifies mainly or only the biological age of said cell to be treated.
  • the invention particularly relates to partial epigenetic reprogramming, in particular respecting the monopotent state, of a biological cell adult, without it being dedifferentiated functionally and / or without losing its original phenotype.
  • the aim of the invention is to be able to gradually modify the biological age of the cells, in particular to rejuvenate them, while constantly keeping these functional, specialized and immunologically autologous cells to the donor tissue from which the original cell is derived. the phenotype of these cells being preserved and / or enhanced and / or rejuvenated.
  • the present invention relates in particular to methods applying to the field of treatments and / or repairs and / or functional and / or morphological cellular improvements intended to open up numerous perspectives for the fight in particular against diseases caused or promoted by advanced age, cell senescence, intoxication and tissue degeneration resulting for example from chronic infections, atopy or wear.
  • the present invention relates to processes capable of treating cells of a tissue, in particular to rejuvenate and / or repair these cells.
  • the cells can then be cultured in a suitable medium, in vitro or in vivo, so as to create a genetically and epigenetically and partially reprogrammed cell stock or tissue that can be implanted in or at a distance from the tissue in question.
  • DNA and its chromatin and heterochromatin can bind radicals (for example methyl or diacetyl radicals) which deactivate the normal functions of the genes or histones with which they are associated.
  • radicals for example methyl or diacetyl radicals
  • cell reprogramming methods such as obtaining induced pluripotent cells (iPS), where the epigenetic type is changed to an embryonic epigenetic type.
  • iPS induced pluripotent cells
  • the present invention aims to invert in a targeted way mainly or only those epigenetic modifications responsible for aging cells, while respecting the functions of these cells.
  • the reprogrammed cells according to the invention can retain all their original phenotype. This reprogramming is called monopotent. Also in a known manner, senescent cells, such as cells which are no longer mitoses, can be allowed to divide again. This is for example described in the article "Critical requirement for cell cycle inhibitors in sustaining non-proliferative states" by D. Pajalunga et al. ; The Journal of CeII Biology; Flight. 176; No. 6; March 12, 2007; pages 807 to 818. However, these methods do not make it possible to know whether a short and non-physiological artificial prolongation of the age of survival of the cell has been obtained or whether it has been rejuvenated durably and physiologically.
  • a fully processed cell ie including in particular the nucleus, the cytoplasm and the cell membrane
  • a suitable medium in which the cell will be partially reprogrammed, in particular rejuvenated.
  • This type of treatment is similar to that called by the inventor "partial cloning", which was previously described in the documents WO 2005/046790 and US 2006/0252062.
  • the invention provides for bringing into contact for a given time a complete cell to be treated, preferably pretreated beforehand, with a suitable genetic reprogramming medium (MRG). It is therefore the complete cell that is temporarily transferred into an MRG, and not only its core or a part thereof, as described in the aforementioned prior art documents.
  • MRG genetic reprogramming medium
  • the process is considerably simplified, the transfer of a complete cell in and out of a MRG, for example an enucleated and activated oocyte, being relatively easy, for example by means of a micromanipulator.
  • the manipulation of an isolated cell nucleus is more complex and difficult.
  • this method can better filter and remove mitochondrial and ribosomal RNA and DNA from the MRG oocyte cytoplasm to protect the immunological specificity of the nucleus of the cell to be treated. found inside its own filtering cytoplasm.
  • This method is also direct and rapid, typically of the order of a few days, compared to durations of several weeks for stem cell-based methods.
  • MRG comprises at least the natural cytoplasm of at least one genetic reprogramming cell (CRG) and / or synthetic cytoplasm.
  • the MRG comprises all or part of one or more CRGs.
  • a CRG is advantageously an oocyte, an embryonic cell, an embryonic or adult stem cell, a fetal cell, or a cellular container reconstituted from these cells, or synthesized.
  • the MRG is formed by an enucleated and activated oocyte, in particular artificially.
  • Reconstituted and / or synthetic cytoplasm may include embryonic serum extracts, scarring and / or metabolically activated cells and / or cytoplasm of certain embryonic cancer cells.
  • a completely synthetic cytoplasm for example made by physical and chemical reconstitution of active substances, is possible. It is also conceivable to produce a MRG in the form of a "slurry" of CRG, with or without cores. It is also possible to add in the MRG extracts of cells or cytoplasm and / or other substances known for their ability to activate nuclear metabolism, such as cells or cell extracts appearing during healing. and / or proteins or peptides for signaling or stimulating metabolism and / or growth factors and / or cells or extracts of cancer cells.
  • the cell or cytoplasmic extracts can be obtained by well-known physical or chemical treatments.
  • the advantage of using cancer cells, and in particular the cytoplasm thereof, is explained by the fact that metabolic activation, signaling and mitosis factors are particularly intense and may induce a temporary metabolic or nuclear reactivation of a cell to be treated.
  • the cancerous contagion is unlikely because the cancers are not generally not transmissible to a different tissue, and their cytoplasm remains generally normal.
  • Other substances that may be added to the MRG include siRNAs, which will be described hereinafter, and / or proteins, such as p53 and / or Chd 1 proteins, and / or markers, such as the KI marker. -67.
  • Other substances include, for example, the KLF4 and C-myc genes supplemented with poly-arginine radicals.
  • Other protein factors are also possible.
  • the treated cell Prior to introduction into the MRG, the treated cell is preferably pretreated to temporarily open one or more passages in the membrane of said cell. Upon contact with the MRG, exchanges will occur between said MRG and said pretreated cell through said passages, causing partial reprogramming of said cell.
  • the pretreatment is used to temporarily open pores or cause mechanical or physical cracking of said cell membrane.
  • An advantageous pretreatment process consists of dipping said cell to be treated in a bath, in particular saponin or streptolysin O, which causes the pores to be opened temporarily, typically for a few hours. This temporary opening is nontoxic to the cell. Before transfer of the cell into the MRG, it is washed, for example by means of a physiological solution. This washing does not prevent the temporary opening of the pores.
  • the pretreatment of the cell to form passages or openings in the cell membrane may be of chemical type (in particular use of saponin), physical (in particular use of ultrasound or lasers, for example plasmon lasers), mechanical (In particular use of piezoelectric needles or micro needles, or use of fluid flow with or without powder) or biological (including use of bacterial, plant or mycotic secretions, for example toxins).
  • chemical type in particular use of saponin
  • physical in particular use of ultrasound or lasers, for example plasmon lasers
  • mechanical In particular use of piezoelectric needles or micro needles, or use of fluid flow with or without powder
  • biological including use of bacterial, plant or mycotic secretions, for example toxins.
  • plasmon laser as described in the article of
  • Rupert F. Oulton and others ("Plasmon lasers at deep subwavelength scale", NATURE, advance online publication, August 30, 2009; 10.1038 / nature08364; published online on August 30, 2009), makes it possible to obtain laser rays with an extremely small diameter, for example of the order of one nanometer. Microdissection lasers also provide very small diameter laser beams. The dimensions and shapes of said openings or passages in the cell membrane may for example be determined by appropriate dyes.
  • various molecules, proteins, peptides or the like can enter or leave the cell through the open pores of the membrane. This allows a partial reprogramming of the cell, and in particular its epigenetic rejuvenation, without loss of cellular functions and immune properties of said cell.
  • the pretreated cell is left in the MRG for a predetermined time and then removed.
  • the pretreated cell is removed from the
  • MRG before the end of the telophase of the nucleus of the cell, that is to say before its division into two cells, in other words before the end of its first mitosis.
  • MRG can be optimized depending on the degree of partial reprogramming desired. For example, removal of the rejuvenated MRG cell can be done in anaphase, for limited rejuvenation, or in telophase, for greater rejuvenation.
  • cellular rejuvenation as measured by the decrease in SAHF (Senescence Associated Heterochromatin Foci) markers, may be manifested without any cellular mitosis.
  • SAHF Signal Associated Heterochromatin Foci
  • the rejuvenated cell is then subjected to a multiplication culture, making it possible, for example, to obtain millions of rejuvenated differentiated cells.
  • siRNA small RNA interference
  • a cell in particular into its cytoplasm, which has the effect of blocking the inhibition of certain target genes, which are reactivated.
  • siRNAs acting specifically on HP1 heterochromatins namely anti HP1 siRNAs. This blocks or inhibits the RNA that drives the evolution of HP1.
  • these siRNAs can also be introduced into the MRG of the variant embodiment described above.
  • anti HP1 ⁇ siRNA, anti HP1 ⁇ siRNA and anti HP1 ⁇ siRNA are simultaneously introduced into the cell.
  • specific siRNAs are also added to inhibit the p53, p21 and p19 genes. This causes not only a significant number of mitoses, but these have a normalized appearance under an optical microscope.
  • the simultaneous introduction of anti HP1 siRNA not only causes the recovery of mitoses in a senescent cell, but also modifies the structural aspect of heterochromatins by making them less anisotropic and more homogeneous. Such an effect can cause a real rejuvenation of the cell.
  • one of the causes of aging of a cell is the formation of foci of heterochromatin HP1 associated with senescence, known by the term SAHF ("Senescence Associated Heterochromatin Foci"). But here, these foci or clusters or pieces of heterochromatin HP1 are at least partially eliminated, giving a more homogeneous appearance to these aged heterochromatins.
  • siRNA into the cytoplasm of a cell causes a temporary effect on said cell, which disappears after a few days, but its rejuvenating effect persists.
  • mRNA messenger RNA
  • mRNA messenger RNA
  • micro-RNAs which do not finally transform into proteins, such as messenger RNAs, but which act by their own constitution by causing certain epigenetic regulations.
  • messenger RNAs and / or microRNAs can be used in place of siRNAs, or together.
  • this treatment is intended to rejuvenate the treated cell, but without dedifferentiating it, and keeping it all its specificity.
  • messenger RNAs often require more than 20 days to return the cell to the dedifferentiated embryonic state.
  • a genome analysis for example by means of biochips, makes it possible to rapidly detect the activation of the desired genes, and thus to carry out targeted reprogramming of the genes responsible for senescence or functional failure of the cells. It may be advantageous to reverse cell senescences progressively in the reverse order of their appearance, which can be detected by successive examinations with specialized biochips. It is thus possible to reactivate genes that are gradually extinguished as they are extinguished, either by activating them in groups by partial reprogramming or, if possible, annoyance by using rather targeted mRNAs or microRNAs or siRNAs or RNAs. It becomes possible to combat aging genetics as it appears, and precisely at the level of genes that go out in succession.
  • one of the variants of the invention consists in reprogramming the gene expression and their epigenetic corollary, so as to act preferentially starting with the most recently inhibited genes, that is to say in reverse chronology of that of spontaneous aging.
  • This makes it possible to respect as much as possible a progressivity and specific stability well tolerated since respecting the natural stages of genetic revolution of the tissue by its retrograde involution directed along the same functional and / or local road.
  • This requires, on the one hand, to analyze the spontaneous evolution of the genome to be treated and, on the other hand, to try to reverse it partially in chronological order going back up the biological time. This method is facilitated by the fact that the most recent genetic evolutions are often the least stable and that the function of the oocyte naturally respects this chronology of nuclear involution.
  • microchips preferably rechargeable and robotic readings, adapted to the target genes in contact with the cell in vivo to periodically monitor the deactivation and subsequent activation by gene treatment.
  • An implementation of such an automated device becomes possible.
  • means may be used to create at least one opening of the pores in the membrane of said cell, and means, such as a pipette, for transferring messenger RNA and / or microRNA into said cell through said at least one opening or puncture.
  • An electroporation method may also be used, and in some cases, adenoviruses and certain other plasmids or cosmids that do not penetrate genomic DNA or cell reprogramming factor genes called PiPS, which may serve as cytoplasmic introductions to these selected factors. This can in particular be used in addition to partial cloning. All categories of RNA and polymerases are currently in principle synthesizable and / or synthetically modifiable, which can make it possible to achieve these factors in a genetically even more efficient manner, for example using slight chemical modifications of certain radicals .
  • Another treatment may also be envisaged to cause the modification of the biological age of a specialized adult cell, namely an ultrasound-based treatment.
  • an ultrasound-based treatment With specific frequencies and amplitudes, it is possible to resonate one or more of the radicals that have attached to the DNA or its chromatin with the effect of regulating certain genes.
  • This selective resonance setting may make it possible to change in a targeted manner certain radicals regulating genes involved in cell rejuvenation without affecting the other properties of the cell, and in particular its specific phenotype.
  • this ultrasonic treatment method can be used in addition to the method for introducing messenger RNA and / or microRNA and / or siRNA into the cell, but it could also be implemented independently of this one.
  • the cell to be treated can be subjected to treatments based on laser beams, for example a plasmon laser, or other rays, such as microwaves, having the effect of changing certain radicals to be regulated. DNA and histone code.
  • laser beams for example a plasmon laser, or other rays, such as microwaves, having the effect of changing certain radicals to be regulated.
  • DNA and histone code can be used in addition to those described above, or independently of them, to reprogram partially and stably the cells to be treated.
  • the cells are furthermore possible to treat the cells with chemical substances, drugs, chemical agents, such as specific natural or synthetic co-repressors or RNA polymerases, the activation of certain genes, and / or agents agonists or antagonists to certain cellular metabolic reactions which makes it possible to inhibit or activate certain cellular metabolisms which are more generally associated with the biological age of the cells.
  • chemical substances drugs, chemical agents, such as specific natural or synthetic co-repressors or RNA polymerases
  • the activation of certain genes and / or agents agonists or antagonists to certain cellular metabolic reactions which makes it possible to inhibit or activate certain cellular metabolisms which are more generally associated with the biological age of the cells.
  • a chemical capable of demethylating the cytosine of certain genes dopamine to temporarily accelerate metabolism, or beta-blockers to slow down this metabolism or a decrease or rise in temperature.
  • beta-blockers to slow down this metabolism or a decrease or rise in temperature.
  • cell fusion involves bringing together two whole cells (or parts of cells, such as the nucleus or cytoplasm). For example, by bringing young cells together with cells or parts of older cells (particularly specialized adult cells), the aged cells can be partially rejuvenated.
  • the invention thus makes it possible to potentiate reprogramming without massively obtaining pluripotent cells, by using one or more of the following methods:
  • a partial partial cell reprogramming is carried out so that this reprogramming does not go too far far below the desired biological age.
  • the introduction of the active factors into the cells to be treated is done either in several successive doses of all these factors or by first applying a part of the factors and subsequently another part of the active factors. In all these cases it is possible to combine the temporary introduction or the contact of the cells either in an oocyte or its extracellular extract or in certain embryonic or cancerous cells or their extracts.
  • the present invention can be applied without limitation to the partial and stable epigenetic regeneration of any specialized adult cell, such as thymus cells, cardiac, dendritic, adipose, auditory, ocular, olfactory, articular, renal, bone, dental cells. desmodontal, cartilaginous, bony, muscular, pancreatic, hepatic, nerve, prostatic, hematopoietic, immune, pulmonary, arterial, retinal, cutaneous, dermal, epidermal, conjunctive, glandular, tendinous, vascular, splenic, parathyroid, adrenal and / or tubular digestive, respiratory, and urinary tract.
  • any specialized adult cell such as thymus cells, cardiac, dendritic, adipose, auditory, ocular, olfactory, articular, renal, bone, dental cells.
  • an organic functional unit such as for example a nephron, retinal pigment cells of different categories or pulmonary alveoli
  • a particular application relates to the thymus tissues, existing or to be recreated genetically by cellular reprogramming and / or forced transcription, and B and T lymphocytes.
  • the methods of the present invention can make it possible to rejuvenate the defenses of the organs and tissues of the body. donor against infections and autoimmune diseases that increase with age. It is also possible to selectively treat B and T lymphocytes while they are subject to partial epigenetic reprogramming of the invention, by adding antigens (eg antibiotic resistant staphylococci) to induce the lymphocyte to develop. specific antibodies against these antigens. If the cell survives, then it will have developed effective antibodies.
  • antigens eg antibiotic resistant staphylococci
  • immobilized antigens can be selected from a matrix for bringing them into contact with specific and rejuvenated T lymphocytes according to the invention.
  • Treatment of immuno-active cells such as B and T lymphocytes, dendritic and lymphoid ganglion cells or splenic cells can also be considered in order to prevent tissue damage or destruction caused by autoimmune or degenerative diseases.
  • Another particular application relates to myocardial cells, which, when rejuvenated by one or more methods of the invention, can be used for electrostimulation as described in WO 2005/046790.
  • fibroblasts which can be multiplied after rejuvenation while maintaining all the specificities and cellular functions. This multiplication can then form a rejuvenated tissue reimplantable in the original tissue.
  • rejuvenated cells may be associated with some older cells to improve implantation.
  • Heterochromatin Foci and / or the SASP components (" Senescence Associated Secretory Phenotype "), in particular the IL-6 component. It is the same with the analysis of cell cycle inhibitors, such as p53 or p21 proteins. Moreover, for certain cells, the times or speeds that a cell puts to recover its membrane potential and its action potential after having been subjected to a stress (such as a lack of oxygen or a slight excess of potassium) can be compared before and after treatment. If the recovery time is shorter, then the cell is functionally rejuvenated.
  • a stress such as a lack of oxygen or a slight excess of potassium

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Abstract

Procédé de reprogrammation génétique et épigénétique partielle, rapide et direct, sans retour à l'état embryonnaire, de cellules biologiques, permettant de reprogrammer partiellement une cellule à traiter pour modifier spécifiquement l'âge biologique de ladite cellule à traiter sans provoquer la dédifférenciation fonctionnelle de ladite cellule à traiter, ladite cellule à traiter restant constamment une cellule fonctionnelle spécialisée immunologiquement parfaitement autologue au tissu donneur dont ladite cellule à traiter est issue, et dont le phénotype est préservé et/ou rajeuni.

Description

Procédé simplifié de reprogrammation génétique et épigénétique partielle de cellules.
La présente invention concerne la reprogrammation génétique et épigénétique partielle, notamment le rajeunissement, de cellules biologiques, telles que des cellules adultes spécialisées, afin notamment de régénérer et/ou accroître leurs fonctions spécifiques, leur pouvoir immunitaire et leur durée de vie active.
Un tel rajeunissement est notamment utile dans le domaine des traitements cellulaires, notamment pour la réalisation d'autogreffes à partir de cellules différenciées, devenues insuffisantes par leur âge biologique ou leur état de santé fonctionnel, ainsi que pour obtenir des extraits capables de revigorer génétiquement un tissu. Les traitements cellulaires, et en particulier les autogreffes, notamment génétiquement manipulées, sont à ce jour pratiquées dans l'optique de réparer un tissu endommagé souffrant d'une maladie, d'un déficit cellulaire ou d'une nécrose. Cette technique consiste souvent soit à prélever quelques cellules saines du tissu concerné, à les mettre en culture de multiplication cellulaire afin de constituer un stock ou tissu de cellules puis à réimplanter ces cellules dans le tissu à traiter, soit à, d'abord, dédifférencier ces cellules à l'état embryonnaire à l'aide de quelques facteurs importés dans leur cytoplasme et/ou noyau, et ensuite de les redifférencier artificiellement. Les résultats obtenus restent toutefois encore inapplicables à l'homme.
Ainsi, il est connu, de reprogrammer des cellules pour créer des cellules souches embryonnaires. Durant cette dédifférenciation cellulaire, les ADN et ses chromatines et hétérochromatines sont changés notamment au niveau de radicaux methyl ce qui active les gènes inhibés. Les cellules ainsi obtenues sont dites cellules pluripotentes induites (iPS : « induced
Pluripotent Stemcells »). Lors de la différenciation ultérieure artificielle de ces cellules souches, une partie de l'information épigénétique est perdue, en particulier le phénotype de la cellule d'origine n'est pas maintenu dans toute sa spécificité et stabilité, la cellule perdant ainsi une certaine mémoire de son origine. L'article de Valéry Krizhanovsky & Scott W. Lowe (« Stem CeIIs : The promises and périls of p53 » ; NATURE, advance online publication ; 12 août 2009; doi: 10.1038/nature8367; publié en ligne le 12 août 2009) indique une diminution du gène p53, ce qui engendre des risques d'instabilité cellulaire et de cancers. Ces techniques sont donc pour l'instant inappropriées pour l'homme. L'invention propose une reprogrammation cellulaire partielle directe et rapide contrairement aux méthodes actuelles de cellules souches qui utilisent des parcours longs et indirects, car ils exigent d'abord un retour artificiel des cellules adultes à l'état embryonnaire pour ensuite procéder à une différenciation artificielle, avec un risque d'une certaine instabilité génétique.
Les documents WO 2005/046790 et US 2006/0252062 décrivent un procédé appelé « clonage partiel » qui consiste à transférer provisoirement un noyau d'une cellule à traiter dans un milieu de reprogrammation génétique, en particulier un ovocyte énucléé. La manipulation et le transfert de noyaux isolés de cellules est relativement complexe et donc assez difficile.
Le but de la présente invention est de fournir des systèmes et des procédés de reprogrammation épigénétique ne présentant pas les inconvénients susmentionnés.
La présente invention a notamment pour but de rajeunir une cellule en préservant les facteurs de transcription spécifiques de la lignée cellulaire pour maintenir toute sa spécificité immunologiquement autologue par rapport au tissu d'origine. En particulier, la présente invention a pour but de fournir des systèmes et des procédés de reprogrammation génétique et épigénétique de cellules permettant une diminution de l'âge biologique des cellules traitées tels que la suppression de la sénescence cellulaire, sans jamais induire une dédifférenciation fonctionnelle totale de celles-ci. Plus particulièrement, la présente invention a pour but de réaliser une reprogrammation cellulaire partielle qui notamment maintienne durant sa réalisation les spécificités fonctionnelles et immunologiques de la cellule (reprogrammation monopotente).
La présente invention a aussi pour but de relancer plusieurs mitoses successives viables dans des cellules sénescentes définitivement quiescentes ou en mitoses anormales, de générer des mitoses génétiquement rajeunies, et aussi de rajeunir génétiquement des cellules indépendamment de leurs mitoses.
La présente invention a aussi pour but de fournir un procédé de reprogrammation cellulaire partielle qui soit simple, peu coûteux et rapide à mettre en œuvre et à utiliser.
La présente invention a donc pour objet un procédé de reprogrammation génétique et épigénétique de cellules biologiques, comprenant de reprogrammer partiellement une cellule à traiter, sans retour à son état embryonnaire, pour modifier l'âge biologique de ladite cellule à traiter sans provoquer la dédifférenciation fonctionnelle de ladite cellule à traiter, ladite cellule à traiter restant constamment une cellule fonctionnelle spécialisée immunologiquement autologue au tissu donneur dont ladite cellule à traiter est issue, et dont le phénotype est préservé et/ou rajeuni.
Selon une première variante avantageuse, le procédé comprend les étapes suivantes :
- fournir une cellule à traiter,
- fournir un milieu de reprogrammation génétique (MRG), comprenant au moins du cytoplasme naturel d'au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) et/ou du cytoplasme synthétique, et - introduire ladite cellule à traiter complète dans ledit MRG pour rajeunir ladite cellule à traiter par influences et/ou interactions et/ou échanges entre ladite cellule à traiter et ledit MRG,
- séparer ladite cellule rajeunie dudit MRG, et
- cultiver et multiplier ladite au moins une cellule rajeunie. Avantageusement, avant introduction de la cellule à traiter complète dans ledit MRG, ladite cellule à traiter complète est soumise à un prétraitement pour ouvrir temporairement un ou plusieurs passage(s) dans sa membrane, permettant des influences et/ou interactions et/ou échanges entre ladite cellule prétraitée et ledit MRG à travers ledit ou lesdits passage(s) ouvert(s) dans la membrane de ladite cellule prétraitée.
Avantageusement, ledit prétraitement de ladite cellule à traiter provoque l'ouverture de pores ou une fissuration mécanique ou physique de ladite membrane.
Avantageusement, lors dudit prétraitement, ladite cellule à traiter est trempée dans un bain, notamment de saponine ou de streptolysine 0, puis lavée, notamment avec une solution physiologique. Avantageusement, ladite étape de séparer ladite cellule rajeunie dudit
MRG est réalisée avant la fin de la première mitose de ladite cellule rajeunie.
Avantageusement, ledit MRG comprend un ovocyte énucléé et activé.
Avantageusement, des substances d'activation capables d'activer le métabolisme nucléaire, telles que des cellules ou extraits de cellules apparaissant au cours d'une cicatrisation et/ou des protéines ou peptides de signalisation ou de stimulation du métabolisme et/ou des facteurs de croissance et/ou des cellules ou extraits de cellules cancéreuses, sont ajoutées lors d'un prétraitement et/ou ajoutées audit MRG et/ou ajoutées lors de la multiplication des cellules rajeunies. Selon une autre variante avantageuse, le procédé comprend les étapes suivantes :
- fournir au moins une cellule souche ou différenciée adulte issue d'un tissu donneur, et
- introduire dans ladite cellule adulte spécialisée, notamment dans son cytoplasme, des siARN agissant spécifiquement sur les hétérochromatines HP1 , en particulier des siARN anti HP1 , pour inhiber les ARN qui commandent l'évolution des hétérochromatines HP1.
Avantageusement, l'étape d'introduire des siARN anti HP1 comprend d'introduire simultanément du siARN anti HP1 α, du siARN anti HP1 β et du siARN anti HP1 γ. Avantageusement, ladite cellule adulte est une cellule sénescente, fonctionnelle ou non, l'introduction des siARN anti HP1 provoquant la reprise de mitoses, notamment de mitoses durables, viables et régénérescentes, de ladite cellule sénescente. Avantageusement, après l'introduction dans la cellule des siARN anti
HP1 , l'aspect structurel des hétérochromatines HP1 devient plus homogène et/ou moins anisotrope.
Avantageusement, ladite cellule à traiter est une cellule sénescente viable, fonctionnelle ou non, le rajeunissement provoquant la reprise de mitoses, notamment de mitoses durables, viables et régénérescentes, de ladite cellule sénescente.
Avantageusement, le procédé est adapté à la reprogrammation de cellules adultes telles que des cellules du thymus, des cellules cardiaques, dendritiques, adipeuses, auditives, oculaires, olfactives, articulaires, rénales, osseuses, dentaires, desmodontales, cartilagineuses, osseuses, musculaires, pancréatiques, hépatiques, nerveuses, prostatiques, hématopoïétiques, immunitaires, lymphocytaires, pulmonaires, artérielles, rétiniennes, cutanées, dermiques, épidermiques, conjonctives, glandulaires, tendineuses, vasculaires, spléniques, parathyroïdiennes, surrénaliennes et/ou des tuyaux des appareils digestifs, respiratoires, et urinaires.
Avantageusement, le rajeunissement de ladite cellule à traiter rajeunie est mesuré par l'analyse de marqueurs associés à l'âge biologique, notamment les marqueurs SAHF (« Sénescence Associated
Heterochromatin Foci ») et/ou les composants SASP (« Sénescence Associated Secretory Phenotype »), notamment le composant IL-6.
Avantageusement, ledit procédé modifie principalement ou uniquement l'âge biologique de ladite cellule à traiter.
Des avantages, caractéristiques et applications de l'invention apparaîtront plus clairement au cours de la description détaillée suivante, de plusieurs modes de réalisation et variantes de l'invention.
L'invention concerne en particulier la reprogrammation épigénétique partielle, en particulier respectant l'état monopotent, d'une cellule biologique adulte, sans que celle-ci soit dédifférenciée fonctionnellement et/ou sans qu'elle ne perde son phénotype d'origine. Au contraire, le but de l'invention est de pouvoir modifier graduellement l'âge biologique des cellules, notamment de les rajeunir, tout en gardant constamment ces cellules fonctionnelles, spécialisées et immunologiquement autologues au tissu donneur dont la cellule d'origine est issue, le phénotype de ces cellules étant préservé et/ou renforcé et/ou rajeuni.
La présente invention concerne notamment des procédés s'appliquant au domaine des traitements et/ou réparations et/ou améliorations cellulaires fonctionnelles et/ou morphologiques destinés à ouvrir de nombreuses perspectives pour la lutte notamment contre les maladies causées ou favorisées par l'âge avancé, la sénescence cellulaire, les intoxications et les dégénérescences tissulaires résultants par exemple d'infections chroniques, d'atopies ou d'usures. En particulier, la présente invention a pour objet des procédés aptes à traiter des cellules d'un tissu, notamment pour rajeunir et/ou réparer ces cellules. Les cellules peuvent ensuite être cultivées dans un milieu adéquat, in vitro ou in vivo, de manière à créer un stock ou tissu de cellules différentiées génétiquement et épigénétiquement partiellement reprogrammées capables d'être implantées dans le tissu considéré, ou à distance de celui-ci, où ces cellules pourront émettre notamment des hormones, protéines et/ou peptides de signalisation et/ou de stimulation du métabolisme, et/ou des enzymes de réparation de l'ADN, pour le tissu considéré. De manière connue, l'ADN et ses chromatines et hétérochromatines peuvent fixer des radicaux (par exemple des radicaux méthyl ou diacétyl) qui désactivent les fonctions normales des gènes ou histones auxquels ils sont associés. Il existe des procédés de reprogrammation cellulaire connus, tels que l'obtention de cellules pluripotentes induites (iPS), où le type épigénétique est changé vers un type épigénétique embryonnaire. Au contraire, la présente invention a pour but d'inverser de manière ciblée principalement ou uniquement celles des modifications épigénétiques responsables du vieillissement des cellules, tout en respectant les fonctions de ces cellules. Ainsi, les cellules reprogrammées selon l'invention peuvent garder tout leur phénotype d'origine. Cette reprogrammation est appelée monopotente. De manière connue également, on peut amener des cellules sénescentes, tels que des cellules qui ne font plus de mitoses, à se diviser à nouveau. Ceci est par exemple décrit dans l'article « Critical requirement for cell cycle inhibitors in sustaining nonproliferative states » de D. Pajalunga et al. ; The Journal of CeII Biology ; Vol. 176 ; No. 6 ; 12 mars 2007 ; pages 807 à 818. Toutefois, ces méthodes ne permettent pas de savoir si on a obtenu une prolongation artificielle courte et non physiologique de l'âge de survie de la cellule ou si celle-ci a été rajeunie durablement et physiologiquement.
Selon un aspect de l'invention, une cellule à traitée complète, c'est à dire incluant en particulier le noyau, le cytoplasme et la membrane cellulaire, est introduite temporairement dans un milieu approprié dans lequel la cellule sera partiellement reprogrammée, notamment rajeunie. Ce type de traitement est similaire à celui appelé par l'inventeur « clonage partiel », qui a été précédemment décrit dans les documents WO 2005/046790 et US 2006/0252062. Plus précisément, l'invention prévoit de mettre en contact pendant un temps déterminé une cellule à traiter complète, de préférence préalablement prétraitée, avec un milieu de reprogrammation génétique (MRG) approprié. C'est donc la cellule complète qui est transférée temporairement dans un MRG, et pas uniquement son noyau ou une partie de celui-ci, comme décrit dans les documents de l'art antérieur susmentionnés. Le procédé en est considérablement simplifié, le transfert d'une cellule complète dans et hors d'un MRG, par exemple un ovocyte énucléé et activé, étant relativement aisé, par exemple au moyen d'un micromanipulateur. Au contraire, la manipulation d'un noyau isolé de cellule est plus complexe et difficile. De plus, ce procédé peut permettre de mieux filtrer et éliminer les ARN et ADN mitochondriaux et ribosomiques du cytoplasme ovocytaire du MRG afin de protéger la spécificité immunologique du noyau de la cellule à traiter qui se trouve à l'intérieur de son propre cytoplasme filtrant. Ce procédé est également direct et rapide, typiquement de l'ordre de quelques jours, à comparer à des durées de plusieurs semaines pour les procédés à base de cellules souches. Le MRG comprend au moins du cytoplasme naturel d'au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) et/ou du cytoplasme synthétique. Avantageusement, le MRG comprend tout ou partie d'une ou plusieurs CRG. Dans ce cas, une telle CRG est avantageusement un ovocyte, une cellule embryonnaire, une cellule souche embryonnaire ou adulte, une cellule fœtale, ou un récipient cellulaire reconstitué à partir de ces cellules, ou synthétisé. Dans sa version la plus simple, le MRG est formé par un ovocyte énucléé et activé, notamment artificiellement. Un cytoplasme reconstitué et/ou synthétique peut être notamment composé d'extraits de sérums embryonnaires, de cicatrisation et/ou de cellules soumises à une activation métabolique et/ou de cytoplasmes de certaines cellules cancéreuses embryonnaires. Un cytoplasme totalement synthétique, par exemple réalisé par reconstitution physique et chimique de substances actives, est possible. Il est aussi envisageable de réaliser un MRG sous la forme d'une « bouillie » de CRG, avec ou sans noyaux. II est aussi possible d'ajouter dans le MRG des extraits de cellules ou de cytoplasme et/ou d'autres substances connues pour leur capacité d'activation du métabolisme nucléaire, telles que des cellules ou extraits de cellules apparaissant au cours d'une cicatrisation et/ou des protéines ou peptides de signalisation ou de stimulation du métabolisme et/ou des facteurs de croissance et/ou des cellules ou extraits de cellules cancéreuses.
Les extraits de cellules ou de cytoplasme peuvent être obtenus par des traitements physiques ou chimiques bien connus. L'intérêt d'utiliser des cellules cancéreuses, et en particulier du cytoplasme de celles-ci, s'explique par le fait que les facteurs d'activation métabolique, de signalisation et de mitoses y sont particulièrement intenses et susceptibles d'induire temporairement une réactivation métabolique ou nucléaire d'une cellule à traiter. La contagion cancéreuse est improbable car les cancers ne sont en général pas transmissibles à un tissu différent, et leurs cytoplasmes restent en général normaux. D'autres substances susceptibles d'être ajoutées au MRG comprennent des siARN, qui seront décrits ci-après, et/ou des protéines, telles que les protéines p53 et/ou Chd 1 , et/ou des marqueurs, tels que le marqueur KI-67. D'autres substances comprennent par exemple les gènes KLF4 et C-myc additionnés de radicaux poly-arginine. D'autres facteurs protéiniques sont aussi possibles.
Avant son introduction dans le MRG, la cellule à traitée est de préférence soumise à un prétraitement, pour ouvrir temporairement un ou des passage(s) dans la membrane de ladite cellule. Lors de son contact avec le MRG, des échanges se produiront entre ledit MRG et ladite cellule prétraitée à travers lesdits passages, provoquant la reprogrammation partielle de ladite cellule. Avantageusement, le prétraitement est utilisé pour ouvrir temporairement des pores ou provoquer des fissurations mécaniques ou physiques de ladite membrane cellulaire.
Un procédé de prétraitement avantageux consiste à tremper ladite cellule à traiter dans un bain, notamment de saponine ou de streptolysine 0, ce qui provoque l'ouverture temporaire, typiquement pendant quelques heures, des pores. Cette ouverture temporaire est non toxique pour la cellule. Avant transfert de la cellule dans le MRG, celle-ci est lavée, par exemple au moyen d'une solution physiologique. Ce lavage n'empêche pas l'ouverture temporaire des pores.
De manière générale, le prétraitement de la cellule pour former des passages ou ouvertures dans la membrane cellulaire peut être de type chimique (notamment utilisation de la saponine), physique (notamment utilisation d'ultrasons ou de lasers, par exemple lasers plasmon), mécanique (notamment utilisation d'aiguilles piézoélectriques ou de micro aiguilles, ou utilisation de flux de fluide avec ou sans poudre) ou biologique (notamment utilisation de sécrétions bactériennes, végétales ou mycosiques, par exemple des toxines). L'utilisation de laser plasmon, tel que décrit dans l'article de
Rupert F. Oulton et autres (« Plasmon lasers at deep subwavelength scale », NATURE, advance online publication ; 30 août 2009; doi: 10.1038/nature08364; publié en ligne le 30 août 2009), permet d'obtenir des rayons lasers d'un diamètre extrêmement réduits, par exemple de l'ordre du nanomètre. Les lasers de microdissection fournissent aussi des rayons laser de très petit diamètre. Les dimensions et formes desdites ouvertures ou passages dans la membrane cellulaire peuvent par exemple être déterminées par des colorants appropriés.
Pendant le contact temporaire de la cellule prétraitée avec le MRG, diverses molécules, protéines, peptides ou autres peuvent entrer ou sortir de la cellule à travers les pores ouverts de la membrane. Ceci permet une reprogrammation partielle de la cellule, et en particulier son rajeunissement épigénétique, sans perte des fonctions cellulaires et des propriétés immunitaires de ladite cellule.
La cellule prétraitée est laissée dans le MRG pendant un temps prédéterminé, puis retiré. De préférence, la cellule prétraitée est retirée du
MRG avant la fin de la télophase du noyau de la cellule, c'est-à-dire avant sa division en deux cellules, autrement dit avant la fin de sa première mitose.
On parle alors de « clonage partiel » ou PCL. La durée de contact avec le
MRG peut être optimisée en fonction du degré de reprogrammation partielle souhaité. Par exemple, le retrait de la cellule rajeunie du MRG peut se faire en anaphase, pour un rajeunissement limité, ou en télophase, pour un rajeunissement plus important.
Alternativement, le rajeunissement cellulaire, tel que mesuré par la diminution des marqueurs SAHF (« Sénescence Associated Heterochromatin Foci »), peut se manifester sans aucune mitose cellulaire.
La cellule rajeunie est ensuite soumise à une culture de multiplication, permettant d'obtenir par exemple des millions de cellules différenciées rajeunies.
Il est à noter que les substances d'activation susmentionnées, qui peuvent être ajoutées au MRG, pourraient aussi, en remplacement ou en complément, être ajoutées lors d'une ou plusieurs étapes du procédé, par exemple lors du prétraitement et/ou dans le bain de culture de multiplication. Selon une autre variante de réalisation, on introduit des siARN (« small interfèrent ARN ») dans une cellule, notamment dans son cytoplasme, ce qui a pour effet de bloquer l'inhibition de certains gènes ciblés, qui se trouvent réactivés. Plus précisément, on peut introduire des siARN agissant spécifiquement sur les hétérochromatines HP1 , à savoir des siARN anti HP1. Ceci bloque ou inhibe l'ARN qui commande l'évolution des HP1. Lorsque la cellule est une cellule sénescente quiescente on constate la reprise de mitoses viables. Comme expliqué ci-dessus, ces siARN peuvent aussi être introduits dans le MRG de la variante de réalisation décrite précédemment.
De préférence, on introduit simultanément dans la cellule du siARN anti HP1 α, du siARN anti HP1 β et du siARN anti HP1 γ. De préférence, on ajoute aussi des siARN spécifiques pour inhiber les gènes p53, p21 et p19. Ceci provoque non seulement un nombre important de mitoses, mais celles- ci ont un aspect normalisé au microscope optique.
On sait aujourd'hui que la constitution des hétérochromatines et l'âge des cellules sont liés. Ceci ressort notamment de l'article « Aging by epigenetics - a conséquence of chromatine damage ? » de J. M. Sedivy et al. ; Exp CeII Res. ; 10 Juin 2008 ; 314(9) : 1909-1917. Or, l'hétérochromatine HP1 , dont il existe trois formes, à savoir l'hétérochromatine HP1 α, l'hétérochromatine HP1 β et l'hétérochromatine HP1 γ, est une chromatine condensée située à proximité de l'ADN. Avec l'âge, il se forme des plus grands blocs d'hétérochromatines. Or, l'introduction simultanée des siARN anti HP1 provoque non seulement la reprise des mitoses dans une cellule sénescente, mais modifie aussi l'aspect structurel des hétérochromatines en les rendant moins anisotrope et plus homogène. Un tel effet peut provoquer un réel rajeunissement de la cellule. En effet, une des causes de vieillissement d'une cellule est la formation de foyers d'hétérochromatines HP1 associée à la sénescence, connue sous le terme SAHF (« Sénescence Associated Heterochromatin Foci »). Or, ici, ces foyers ou amas ou morceaux d'hétérochromatines HP1 sont au moins partiellement éliminés, redonnant un aspect plus homogène à ces hétérochromatines âgées.
Selon l'auteur, les siARN anti HP1 α + β + γréduisent l'expression des HP1 notamment en interférant probablement avec leur transcription ou translation.
Il est aussi à noter que l'introduction des siARN dans le cytoplasme d'une cellule provoque un effet temporaire sur ladite cellule, qui disparaît après quelques jours, mais son effet rajeunissant persiste.
Selon une autre variante, on peut introduire dans une cellule adulte spécialisée de l'ARN messager (mARN) sélectionné, pour ainsi contribuer à l'activation de gènes spécifiques, qui accroissent le rajeunissement cellulaire. On peut aussi utiliser des micro-ARN, qui ne se transforment pas finalement en protéines, comme les ARN messagers, mais qui agissent par leur propre constitution en provoquant certaines régulations épigénétiques. Ces ARN messagers et/ou ces micro-ARN peuvent être utilisés à la place des siARN, ou conjointement.
De préférence, ce traitement a pour but de rajeunir la cellule traitée, mais sans la dédifférencier, et en lui gardant toute sa spécificité. Ainsi, dans les procédés connus de reprogrammation intégrale, les ARN messagers nécessitent souvent plus de 20 jours pour ramener la cellule à l'état embryonnaire dédifférencié.
Au contraire, une analyse du génome, par exemple au moyen de biopuces, permet de détecter rapidement l'activation des gènes souhaités, et donc de réaliser la reprogrammation ciblée des gènes responsables de la sénescence ou de la défaillance fonctionnelle des cellules. Il peut être avantageux d'inverser progressivement les sénescences cellulaires dans l'ordre inverse de leurs apparitions, ce qui peut être détecté par des examens successifs avec des biopuces spécialisées. On peut ainsi réactiver les gênes éteints progressivement au fur et à mesure de leur extinction, soit en les activant en groupe par reprogrammation partielle, soit, si possible, gêne par gêne en utilisant plutôt des mARN ou microARN ou siARN ou ARN synthétiques ciblés. Il devient ainsi possible de combattre le vieillissement génétique au fur et à mesure de son apparition, et précisément au niveau des gènes qui s'éteignent successivement.
Ainsi, une des variantes de l'invention consiste à reprogrammer l'expression génétique et leur corollaire épigénétique, de manière à agir préférentiellement en commençant par les gènes les plus récemment inhibés, c'est à dire en chronologie inverse de celle du vieillissement spontané. Ceci permet de respecter le plus possible une progressivité et stabilité spécifique bien tolérée puisque respectant les étapes naturelles de révolution génétique du tissu par son involution rétrograde dirigée le long de la même route fonctionnelle et/ou locale. Ceci nécessite d'une part d'analyser l'évolution spontanée du génome à traiter et d'autre part d'essayer de l'inverser partiellement en ordre chronologique remontant le temps biologique. Cette méthode est facilitée par le fait que les évolutions génétiques les plus récentes sont souvent les moins stables et que probablement la fonction de l'ovocyte respecte naturellement cette chronologie d'involution nucléaire.
Il serait possible d'introduire une ou plusieurs mini biopuces spécifiques, de préférence rechargeables et à lectures robotisées, adaptées aux gènes ciblés en contact de la cellule in vivo pour suivre périodiquement la désactivation et l'activation successive par traitement des gènes. Une implantation d'un tel dispositif automatisé devient envisageable.
Pour réaliser l'introduction des ARN messagers et/ou des micro-ARN et/ou des siARN dans la cellule, on peut utiliser des moyens pour créer au moins une ouverture des pores dans la membrane de ladite cellule, et des moyens, tels qu'une pipette, pour transférer de l'ARN messager et/ou du micro-ARN dans ladite cellule à travers ladite au moins une ouverture ou piqûre. On peut aussi utiliser une méthode d'électroporation, et dans certains cas, des adeno-virus et certains autres plasmides ou cosmides qui ne pénètrent pas l'ADN du génome ou des protéines de gènes facteurs de reprogrammation cellulaire appelés PiPS, qui peuvent servir d'introductions cytoplasmiques à ces facteurs sélectionnés. Ceci peut notamment être utilisé en complément avec le clonage partiel. Toutes les catégories d'ARN et de polymérases sont actuellement en principe synthétisables et/ou synthétiquement modifiables, ce qui peut permettre de réaliser ces facteurs d'une manière génétiquement encore plus efficace, par exemple à l'aide de légères modifications chimiques de certains radicaux.
Un autre traitement peut aussi être envisagé pour provoquer la modification de l'âge biologique d'une cellule adulte spécialisée, à savoir un traitement à base d'ultrasons. Avec des fréquences et des amplitudes déterminées, il est possible de mettre en résonance un ou plusieurs des radicaux qui se sont fixés à l'ADN ou à ses chromatines avec pour effet de réguler certains gènes. Cette mise en résonance sélective peut permettre de changer de manière ciblée certains radicaux régulant des gènes qui interviennent dans le rajeunissement cellulaire sans affecter les autres propriétés de la cellule, et notamment son phénotype spécifique. Il est à noter que ce procédé de traitement par ultrasons peut être utilisé en complément au procédé d'introduction d'ARN messager et/ou de micro-ARN et/ou de siARN dans la cellule mais il pourrait aussi être mis en œuvre indépendamment de celui-ci.
En variante, on peut soumettre la cellule à traiter à des traitements à base de rayons laser, par exemple un laser plasmon, ou d'autres rayons, tels que les micro-ondes, ayant pour effet de changer certains radicaux à réguler de l'ADN et du code d'histones. Ici aussi, ces méthodes peuvent être utilisées en compléments de celles précédemment décrites, ou indépendamment de celles-ci, pour reprogrammer partiellement et d'une manière stable les cellules à traiter.
Avantageusement, on peut en outre prévoir de traiter les cellules avec des substances chimiques, des médicaments, des agents chimiques, tels que des co-répresseurs ou ARN polymérases spécifiques, naturels ou synthétiques, de l'activation de certains gènes, et/ou des agents agonistes ou antagonistes à certains réactions métaboliques cellulaires ce qui permet d'inhiber ou d'activer certains métabolismes cellulaires qui sont plus généralement associés à l'âge biologique des cellules. Par exemple, on peut envisager l'utilisation d'une substance chimique capable de déméthyliser la cytosine de certaines gènes, la dopamine pour accélérer temporairement le métabolisme ou des bêtabloquants pour ralentir ce métabolisme ou une baisse ou élévation de la température. Cette catégorie de traitement sera avantageusement complémentaire à ceux décrits précédemment.
Avantageusement, on peut aussi utiliser la fusion cellulaire pour reprogrammer partiellement épigénétiquement une cellule. La fusion cellulaire consiste à réunir deux cellules entières (ou parties de cellules, tel que le noyau ou le cytoplasme). En réunissant ainsi par exemple des cellules jeunes avec des cellules ou parties de cellules âgées (en particulier des cellules adultes spécialisées), les cellules âgées peuvent être partiellement rajeunies.
L'invention permet ainsi de potentialiser la reprogrammation sans obtention massive de cellules pluripotentes, en utilisant un ou plusieurs des procédés suivants :
1 ) Introduction de siARN anti HP1.
2) Introduction d'ARN messagers.
3) Introduction de micro-ARN sélectionnés.
4) Clonage partiel. 5) Clonage partiel simplifié.
6) Introduction de certains médicaments ou substances chimiques agonistes ou antagonistes à certaines réactions cellulaires biochimiques génétiques ou épigénétiques.
7) Rayonnements : ultrasonores sélectifs, micro-ondes ou lasers. 8) Fusions cellulaires.
9) Echanges de chromosomes entre une cellule adulte et une cellule rajeunie.
Ces différents moyens, séparément ou en diverses combinaisons, peuvent également servir à changer certains facteurs indésirables pouvant gêner la reprogrammation partielle.
Dans une variante de l'invention on réalise une reprogrammation cellulaire partielle graduelle afin que cette reprogrammation n'aille pas trop loin en deçà de l'âge biologique désiré. A cette fin l'introduction des facteurs actifs dans les cellules à traiter se fait soit en plusieurs doses successives de tous ces facteurs soit en appliquant d'abord une partie des facteurs et ultérieurement une autre partie des facteurs actifs. Dans tous ces cas on peut combiner l'introduction temporaire ou le contact des cellules soit dans un ovocyte ou son extrait extra-cellulaire soit dans certaines cellules embryonnaires ou cancéreuses ou leurs extraits. Ces reprogrammations cellulaires partielles et progressives permettent de graduer la reprogrammation, presque en temps réel, à l'aide par exemple de marqueurs, ou d'inspections fréquentes.
La présente invention peut être appliquée sans limitation à la régénération épigénétique partielle et stable de toute cellule adulte spécialisée, telle que des cellules du thymus, des cellules cardiaques, dendritiques, adipeuses, auditives, oculaires, olfactives, articulaires, rénales, osseuses, dentaires, desmodontales, cartilagineuses, osseuses, musculaires, pancréatiques, hépatiques, nerveuses, prostatiques, hématopoïétiques, immunitaires, pulmonaires, artérielles, rétiniennes, cutanées, dermiques, épidermiques, conjonctives, glandulaires, tendineuses, vasculaires, spléniques, parathyroïdiennes, surrénaliennes et/ou des tuyaux des appareils digestifs, respiratoires, et urinaires.
Il peut être souhaitable de reprogrammer partiellement ensemble ou séparément avec assemblage ultérieur une pluralité de cellules représentant une unité fonctionnelle organique, telle que par exemple un néphron, des cellules rétiniennes pigmentaires des différentes catégories ou des alvéoles pulmonaires, pour former une unité fonctionnelle organique rajeunie.
De nombreuses applications du système et du procédé selon l'invention sont envisageables, et notamment (la liste étant non limitative) pour traiter l'insuffisance rénale, les maladies dégénératives des articulations telles que les arthroses, l'ostéoporose, des sujets ayant subi des inflammations graves, notamment par affaiblissements réactionnels des différents lymphocytes producteurs d'anticorps et de cytokines pro et antiinflammatoires, pour perfectionner les traitements anticancéreux, pour soigner des ulcères, pour lutter génétiquement contre la sénescence de la peau, en modifiant les collagènes et en augmentant la vitesse et la qualité des cicatrisations et réparations dermiques, épidermiques et des tissus connectifs sous cutanées, notamment en les rajeunissant, pour améliorer l'épaisseur et l'élasticité de la peau, pour régénérer des zones tissulaires nécrosées, fibrosées ou inactives, par exemple au niveau d'un myocarde, notamment suite à un infarctus ou à une insuffisance cardiaque sévères ou par exemple au niveau d'un organe ayant développé une tumeur visée par un traitement anti-cancéreux destructeur, pour aider à la détermination du mécanisme responsable d'un trouble de l'état de santé d'un mammifère, notamment en diminuant son âge biologique pour évaluer ou déterminer le moment de l'installation de la maladie, pour traiter des maladies se caractérisant par un déficit cellulaire, pour favoriser le maintien d'un implant dans une articulation ou un os à l'aide d'une enveloppe ou charpente simple ou de soutien de cellules régénérées, pour assurer des bonnes histo- compatibilité et morpho-compatibilité entre un greffon d'un donneur et notamment des prothèses osseuses et articulaires et vertébrales notamment pour améliorer la fixation d'implants métalliques céramiques, plastiques et/ou biologiques, pour limiter le rejet des greffes non autologues par le receveur, pour rajeunir des tissus rétiniens et oculaires, etc.
Une application particulière concerne les tissus du thymus, existants ou à recréer génétiquement par reprogrammation cellulaire et/ou transcription forcée, et les lymphocytes B et T. En effet, les procédés de la présente invention peuvent permettre de rajeunir les défenses des organes et tissus du donneur contre les infections et maladies auto-immunes qui augmentent avec l'âge. Il est aussi possible de réaliser un traitement sélectif des lymphocytes B et T pendant que ceux-ci sont soumis à la reprogrammation épigénétique partielle de l'invention, en ajoutant des antigènes (par exemple de staphylocoques résistants aux antibiotiques) pour inciter le lymphocyte à développer des anticorps spécifiques contre ces antigènes. Si la cellule survit, alors elle aura développée des anticorps efficaces. Par exemple, on peut sélectionner des antigènes immobilisés sur une matrice pour les mettre en contact avec des lymphocytes T spécifiques et rajeunis selon l'invention. On peut aussi envisager un traitement des cellules immuno-actives tels que lymphocytes B et T, cellules dendritiques et lymphoïdes ganglionnaires ou spléniques afin d'éviter une lésion ou destruction tissulaire causée par les maladies auto-immunes ou dégénératives.
Une autre application particulière concerne les cellules du myocarde, qui une fois rajeunies par un ou plusieurs procédés de l'invention, peuvent être utilisées pour une électrostimulation telle que décrite dans le document WO 2005/046790.
Encore une autre application particulière concerne les fibroblastes, qui peuvent être multipliées après rajeunissement en maintenant toutes les spécificités et fonctions cellulaires. Cette multiplication peut alors former un tissu rajeuni réimplantable dans le tissu d'origine. Eventuellement, des cellules rajeunies peuvent être associées à quelques cellules âgées, pour améliorer l'implantation.
Il est à noter que la modification de l'âge biologique d'une cellule (rajeunissement ou vieillissement) peut être évaluée par différents procédés et marqueurs. Ainsi, on peut utiliser l'analyse de marqueurs associés à l'âge biologique, notamment les marqueurs SAHF (« Sénescence Associated
Heterochromatin Foci ») et/ou les composants SASP (« Sénescence Associated Secretory Phenotype »), notamment le composant IL-6. Il en est de même avec l'analyse d'inhibiteurs de cycle cellulaire, tels que les protéines p53 ou p21. Par ailleurs, pour certaines cellules, les temps ou vitesses que mettent une cellule pour récupérer son potentiel de membrane et son potentiel d'action après avoir été soumise à une contrainte (telle qu'un manque d'oxygène ou un léger excès de potassium) peuvent être comparés avant et après traitement. Si le temps de récupération est plus court, alors la cellule est fonctionnellement rajeunie. D'autres procédés consistent à comparer, avant et après traitement, les vitesses de répétition des mitoses, les vitesses des mitoses ou l'aspect des mitoses elles-mêmes, les vitesses de cicatrisation, ou les modifications des dimensions (volume et/ou longueurs) des télomères, l'utilisation de marqueurs biochimiques colorants ou non, l'étude des fonctionnements cellulaires, la résistance aux toxiques et infections, etc. Il est à noter qu'aucune méthode connue à ce jour ne donne une mesure précise et absolue de l'âge biologique, mais plutôt une indication.
Bien que la présente invention ait été décrite en référence à divers aspects de celle-ci, et aux moyens de divers exemples d'application, il est entendu qu'elle n'y est pas limitée, l'homme du métier pouvant y apporter diverses modifications.

Claims

Revendications
1.- Procédé de reprogrammation génétique et épigénétique de cellules biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend de reprogrammer partiellement une cellule à traiter, sans retour à son état embryonnaire, pour modifier l'âge biologique de ladite cellule à traiter sans provoquer la dédifférenciation fonctionnelle de ladite cellule à traiter, ladite cellule à traiter restant constamment une cellule fonctionnelle spécialisée immunologiquement autologue au tissu donneur dont ladite cellule à traiter est issue, et dont le phénotype est préservé et/ou rajeuni.
2.- Procédé selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes :
- fournir une cellule à traiter,
- fournir un milieu de reprogrammation génétique (MRG), comprenant au moins du cytoplasme naturel d'au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) et/ou du cytoplasme synthétique, et
- introduire ladite cellule à traiter complète dans ledit MRG pour rajeunir ladite cellule à traiter par influences et/ou interactions et/ou échanges entre ladite cellule à traiter et ledit MRG,
- séparer ladite cellule rajeunie dudit MRG, et - cultiver et multiplier ladite au moins une cellule rajeunie.
3.- Procédé selon la revendication 2, dans lequel, avant introduction de la cellule à traiter complète dans ledit MRG, ladite cellule à traiter complète est soumise à un prétraitement pour ouvrir temporairement un ou plusieurs passage(s) dans sa membrane, permettant des influences et/ou interactions et/ou échanges entre ladite cellule prétraitée et ledit MRG à travers ledit ou lesdits passage(s) ouvert(s) dans la membrane de ladite cellule prétraitée.
4.- Procédé selon la revendication 3, dans lequel ledit prétraitement de ladite cellule à traiter provoque l'ouverture de pores ou une fissuration mécanique ou physique de ladite membrane.
5.- Procédé selon la revendication 4, dans lequel lors dudit prétraitement, ladite cellule à traiter est trempée dans un bain, notamment de saponine ou de streptolysine 0, puis lavée, notamment avec une solution physiologique.
6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel ladite étape de séparer ladite cellule rajeunie dudit MRG est réalisée avant la fin de la première mitose de ladite cellule rajeunie.
7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel ledit MRG comprend un ovocyte énucléé et activé.
8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans lequel des substances d'activation capables d'activer le métabolisme nucléaire, telles que des cellules ou extraits de cellules apparaissant au cours d'une cicatrisation et/ou des protéines ou peptides de signalisation ou de stimulation du métabolisme et/ou des facteurs de croissance et/ou des cellules ou extraits de cellules cancéreuses, sont ajoutées lors d'un prétraitement et/ou ajoutées audit MRG et/ou ajoutées lors de la multiplication des cellules rajeunies.
9.- Procédé selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes :
- fournir au moins une cellule souche ou différenciée adulte issue d'un tissu donneur, et - introduire dans ladite cellule adulte, notamment dans son cytoplasme, des siARN agissant spécifiquement sur les hétérochromatines HP1 , en particulier des siARN anti HP1 , pour inhiber les ARN qui commandent l'évolution des hétérochromatines HP1.
10.- Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'étape d'introduire des siARN anti HP1 comprend d'introduire simultanément du siARN anti HP1 α, du siARN anti HP1 β et du siARN anti HP1 γ.
11.- Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel ladite cellule adulte est une cellule sénescente, fonctionnelle ou non, l'introduction des siARN anti HP1 provoquant la reprise de mitoses, notamment de mitoses durables, viables et régénérescentes, de ladite cellule sénescente.
12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 , dans lequel, après l'introduction dans la cellule des siARN anti HP1 , l'aspect structurel des hétérochromatines HP1 devient plus homogène et/ou moins anisotrope.
13.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite cellule à traiter est une cellule sénescente viable, fonctionnelle ou non, le rajeunissement provoquant la reprise de mitoses, notamment de mitoses durables, viables et régénérescentes, de ladite cellule sénescente.
14.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le procédé est adapté à la reprogrammation de cellules adultes telles que des cellules du thymus, des cellules cardiaques, dendritiques, adipeuses, auditives, oculaires, olfactives, articulaires, rénales, osseuses, dentaires, desmodontales, cartilagineuses, osseuses, musculaires, pancréatiques, hépatiques, nerveuses, prostatiques, hématopoïétiques, immunitaires, lymphocytaires, pulmonaires, artérielles, rétiniennes, cutanées, dermiques, épidermiques, conjonctives, glandulaires, tendineuses, vasculaires, spléniques, parathyroïdiennes, surrénaliennes et/ou des tuyaux des appareils digestifs, respiratoires, et urinaires.
15.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le rajeunissement de ladite cellule à traiter rajeunie est mesuré par l'analyse de marqueurs associés à l'âge biologique, notamment les marqueurs SAHF (« Sénescence Associated Heterochromatin Foci ») et/ou les composants SASP (« Sénescence
Associated Secretory Phenotype »), notamment le composant IL-6.
16.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit procédé modifie principalement ou uniquement l'âge biologique de ladite cellule à traiter.
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