WO2009103731A1 - Systeme et procede de culture clonale de cellules epitheliales et leurs applications - Google Patents

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WO2009103731A1
WO2009103731A1 PCT/EP2009/051912 EP2009051912W WO2009103731A1 WO 2009103731 A1 WO2009103731 A1 WO 2009103731A1 EP 2009051912 W EP2009051912 W EP 2009051912W WO 2009103731 A1 WO2009103731 A1 WO 2009103731A1
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culture
clonal
cells
epithelial
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PCT/EP2009/051912
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Nicolas Fortunel
Michèle MARTIN
Pierre Vaigot
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Commissariat A L'energie Atomique
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
    • C12N2503/06—Screening or testing on artificial skin

Definitions

  • the present invention relates to the field of cell biology and tissue engineering.
  • the invention provides means and methods for evaluating and exploiting the specific properties of a particular epithelial cell present in a biological sample.
  • the present invention relates to an epithelial cell culture system, wherein at least one clonal culture is seeded with one and only one epithelial cell directly extracted from a biological sample of epithelial tissue.
  • the invention further relates to a method of culturing epithelial cells, comprising at least the steps of: a) extracting one or more epithelial cells directly from a biological sample of epithelial tissue; b) optionally, selecting at least one population and / or subpopulation of epithelial cells from the cells extracted in step a); c) performing a clonal culture seeded with a distinct and unique epithelial cell directly from step a) or b); and d) qualitatively and / or quantitatively assessing cell growth in the clonal culture of step c).
  • the invention is directed to the applications of such a system or method.
  • In vitro systems and methods for epithelial tissues such as the epidermis have applications in areas as diverse as medical research and clinical development, tissue engineering and toxicology.
  • epithelial tissues in particular the epidermis, the cornea, the mucous tissues, etc.
  • epidermis the epidermis, the cornea, the mucous tissues, etc.
  • epidermis the epidermis, the cornea, the mucous tissues, etc.
  • the epidermis constitutes the most superficial structure of the skin and in particular ensures the barrier function. Usually consisting of keratinocytes, it is renewed every 28 days on average. This tissue comprises 4 layers that correspond to the 4 stages of the differentiation program that the keratinocytes undergo during their migration from the basal layer, the deepest, to the stratum corneum, the most overperfective. The continuous physiological process of renewal of the different layers of keratinocytes is called keratinopoiesis.
  • the basal layer of the epidermis which has only one cell base, is the germinal compartment. It is at the level of this layer that the proliferation of keratinocytes takes place.
  • the basal keratinocytes there is a small proportion of cells called stem cells, which are believed to be responsible for long-term epidermal renewal.
  • the immediate offspring of stem cells is called the progenitor population.
  • These cells are characterized in particular by a high self-renewal capacity, which the progenitor cells do not possess, and a fortiori the keratinocytes involved in the differentiation.
  • an important property of stem cells is to sustainably conserve the potential for regeneration and reconstruction of the epidermal tissue.
  • the epidermis thus consists of a heterogeneous set of cells with variable degrees of differentiation (or immaturity). It is generally accepted that basal keratinocytes represent approximately 10% of the whole of the keratinocytes of the epidermis, and the epidermal stem cell compartment only of the order of 0.1%.
  • the cellular material routinely collected from cutaneous biopsies, namely all the keratinocytes obtained after dissociation of a sample of epidermis, allows the constitution of cell banks of sufficient size for use on an industrial scale.
  • the material used for the constitution of this type of library corresponds to a heterogeneous set of cells, comprising basal keratinocytes having different growth capacities, and supra-basal keratinocytes being differentiated and no longer having growth capacity.
  • a conventional method consists in freezing the cells at the end of a single multiplication stage in culture, so as to constitute a stock multiple equivalent ampoules, which are kept in liquid nitrogen. As needed, the ampoules of cells are thawed and placed in culture to perform a second stage of multiplication. At the end of the two successive multiplication steps, the keratinocytes have generally performed in the order of 10 population doublings. This type of approach has been used to analyze the heterogeneity of the growth potential of human keratinocytes (Barrandon and Green, 1987). The authors first made primary cultures derived from the epidermis, which they frozen in liquid nitrogen.
  • Subconfluent side crops were prepared from the frozen primary cultures.
  • the clones obtained after cloning were classified into three categories: holoclones (fast growing), paraclones (limited growth) and meroclones (intermediate population).
  • the keratinocytes conventionally obtained after two successive multiplication steps can be used for the production of reconstructed tissue models. Applying these systems as such to a rare cellular material, such as stem cells, is however impossible on an industrial scale where extensive testing campaigns must be conducted.
  • the biological material used in these tests may be: 1) immortalized cell lines; 2) normal cell banks extracted from tissue biopsies and amplified in culture; 3) reconstructed three-dimensional tissues.
  • cell populations amplified in vitro are used, which modifies certain properties as a function of the culture parameters applied.
  • rare cells such as progenitor cells or epidermal stem cells, these cells are obtained in insufficient quantities from tissue biopsies.
  • carcinomas are very heterogeneous tumors, in which a small proportion of tumor stem cells represent a key target for treatment.
  • cells having distinct characteristics are mixed in culture, the specific behavior of some of them can be modified or ignored within the mixture. An "average” result is thus observed on all the cells cultured.
  • structural and functional properties of a reconstructed epidermis from a heterogeneous global cell population are the result of all the properties of the cells involved.
  • An epidermis thus reconstructed can not in any case reflect the specific properties of a single cell.
  • the culture conditions applied can more or less severely modify the intrinsic characteristics of the cells. It is well known that placing cells derived from an epithelial tissue in an artificial culture environment leads to modifying their native characteristics. Consequently, epithelial cells used after one or more culture steps represent cell material that is no longer comparable to cells directly derived from a tissue sample. These modifications concern in particular the specific phenotype of the cells studied. For example, it has been shown that culturing human keratinocytes freshly isolated from an epidermis disrupts the expression of adhesion molecules and markers used to define a stem cell phenotype. in a variable manner depending on the culture medium used (Lorenz et al., 2008).
  • the present invention responds for the first time to this need by proposing means and methods of culture which (i), by their clonal character, allow access to the individual and specific properties of cells directly derived from pluristratified epithelial tissues, (ii) ) preserve the individual potential of said cells, (iii) are, even when implemented on a large scale, low consumption of cellular material, making them suitable for the study and exploitation on an industrial scale of the least represented cells (stem and progenitor cells), and (iv) allow to reach cell growth levels much higher than those obtained with the known tools.
  • an object of the present invention is directed to an optimized clonal epithelial cell culture system for evaluating and exploiting the unique properties of a single cell, wherein a culture support comprises at least one clonal culture seeded with a single epithelial cell directly extracted from a biological sample of epithelial tissue.
  • a culture support comprises at least two parallel clonal cultures, each of said cultures being seeded with a distinct and unique epithelial cell directly extracted from said biological sample.
  • such a system is in the form of a biochip.
  • Clonal cultures seeded in parallel are then for example micro-cultures.
  • the biochip may in particular be made from culture plates comprising multiple distinct wells, for example 6, 24, 96 wells or more.
  • the biochip may have as support a slide, made of glass or any other suitable material, on which multiple micro-surfaces are created for receiving the cells, for example by a surface treatment allowing the cells to adhere and grow.
  • Microchips made on slides can be physically compartmentalised, for example using grids, or chemically, for example following a surface treatment of the slides which prevents the cloned cells from migrating outside their respective micro-culture surfaces.
  • Another object of the present invention is an optimized clonally cultured epithelial cell culture method for evaluating and exploiting specific properties of a single cell, comprising at least the steps of: a) extracting one or more epithelial cells directly from a biological sample of epithelial tissue; b) optionally, selecting at least one population and / or subpopulation of epithelial cells from the cells extracted in step a); c) performing a clonal culture seeded with a distinct and unique epithelial cell directly from step a) or b); and d) qualitatively and / or quantitatively assessing cell growth in the clonal culture of step c).
  • the cells used in the method of the present invention may be total populations of cells directly extracted from these tissues, and / or subpopulations thereof, sorted on the basis of precise characters.
  • the cellular material of step b) may advantageously correspond to one or more subpopulations enriched in progenitors and / or epithelial stem cells.
  • step c) (which may be considered as a primary growth step), the cell preparation thus extracted is used to initiate parallel clonal cultures or micro-cultures. It involves inoculating the cells of interest individually under conditions allowing their growth, for example in separate culture wells.
  • clonal seeding can be carried out in an automated manner by technologies such as, in particular, flow cytometry or microfluidics.
  • step c) comprises the production of at least two parallel clonal cultures, each of said cultures being seeded with a distinct and unique epithelial cell directly derived from step a) or b).
  • step d the growth of the cloned cells is analyzed on the basis of one or more quantitative and / or qualitative parameters such as:
  • CFE clone-forming efficiency
  • the phenotype of the clones degree of differentiation of the cells composing the clones, expression of molecular markers.
  • the inventors have been able to observe that the growth potential of the cells cultured according to the clonal culture method of the present invention is higher than that of cells cultured according to conventional procedures (see Example B below). .
  • the clonal culture method of the invention comprises at least the steps of: a) extracting one or more epithelial cells as a single cell suspension (s) directly from a biological sample of epithelial tissue; b) selecting at least one population and / or subpopulation of epithelial cells from the cells extracted in step a); c) performing a clonal culture seeded with a distinct and unique epithelial cell from step b); and d) qualitatively and / or quantitatively assessing cell growth in the clonal culture of step c).
  • the method which is the subject of the present invention further comprises the step e) of amplifying the cell population of the clonal culture of step c), or its progeny, by one or more subcultures successive.
  • the clonal cell libraries that can thus be obtained also represent an object of the present invention. These banks are distinguished from existing banks by the fact that they integrate clonal cell cultures that give them specific structural and functional properties.
  • the method according to the invention further comprises the step f) of evaluating the tissue reconstruction potential of the cell population of the clonal culture of step c), or of his offspring. More precisely, step f) preferably consists in using the cell population of the clonal culture of step c), or its progeny, to reconstruct a three-dimensional tissue so as to evaluate its tissue reconstruction potential.
  • step f) preferably consists in using the cell population of the clonal culture of step c), or its progeny, to reconstruct a three-dimensional tissue so as to evaluate its tissue reconstruction potential.
  • cells derived from the primary clonal cultures or micro-cultures can be taken off their culture support and then used individually for each clone of interest to produce a three-dimensional organotypic culture model (for example, an epithelium, epidermis or reconstructed skin).
  • the three-dimensional tissues reconstructed from the clonal cultures that can be obtained at the end of step f) of the process according to the invention form part of the objects of the present invention.
  • These tissues are produced according to a new three-dimensional organotypic model because the structural and functional characteristics of the tissue objects of the invention are quite specific insofar as they derive from the properties of a single cell.
  • Such tissues are in particular chosen from the various epithelial tissues, the skin and the epidermis.
  • biochips comprising at least one tissue as described above constitute another object of the invention.
  • These biochips can for example be formed from micro-cultures made within a three-dimensional gel made of a biomaterial compatible with cell growth. It is also possible to envisage systems based on multiple reconstructed three-dimensional micro-tissues, each generated independently directly within the biochip, without prior culture step.
  • the method according to the invention further comprises the step g) of evaluating the long-term expansion potential of the cell population of the clonal culture of step c) . More specifically, step g) preferably consists in sub-culturing the cell population of the clonal culture of step c), under conditions promoting cell expansion until the expansion potential is exhausted, so as to evaluate the long-term expansion potential of said cell population.
  • cells derived from primary clonal cultures or micro-cultures can be removed from their culture support and then subcultured under conditions that promote their multiplication, until their multiplication potential is exhausted.
  • the method according to the invention further comprises the step h) of evaluating the clonogenic potential of the progeny of the cell population of the clonal culture of step c). More specifically, step h) preferably consists in evaluating the clonogenic potential of the progeny of the cell population of the clonal culture of step c), using a quantitative test of the clonogenicity in which one carries out strictly clonal secondary cultures and / or low density cultures allowing the growth of individualized colonies.
  • the initial biological sample is a sample of healthy or diseased epithelial tissue, for example obtained by biopsy in a mammal, preferably in humans.
  • the tissue sample may be selected from the epithelia, for example the interfollicular epidermis of adult or neonatal human skin, the cornea, the mucous membranes, the hair follicles.
  • Samples of diseased epithelial tissue are for example obtained by biopsy of patients with a genetic disease (such as xeroderma pigmentosum, epidermolysis bullosa, etc.), or by cicatricial skin biopsy (especially for burn victims).
  • the diseased epithelial tissues may also be tumor tissues (carcinomas, etc.)
  • the biological sample may optionally comprise cells derived from the epithelial (in particular keratinopoietic) differentiation of pluripotent stem cells chosen from embryonic, fetal and induced pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells chosen from embryonic, fetal and induced pluripotent stem cells.
  • Examples of cells having an epithelial potential derived from fetal stem cells are: cells of the ectodermal embryonic leaflet, cells of the epithelial tissues, keratinocytes, etc.
  • Cells with epithelial potential from so-called induced pluripotent stem cells (IPS) are generated by reprogramming cells from adult tissue that may be differentiated cells.
  • the epithelial cells directly extracted from the biological sample are healthy or diseased single cells chosen from progenitor cells, stem cells and keratinocytes.
  • kits may for example be diagnostic kits, evaluation tests for biological activity, toxicity tests, etc. It is clear to those skilled in the art that the terms "test”, “kit” and, possibly, “system” may be, depending on the context in which they are used herein, equivalent.
  • an optimized clonal epithelial cell culture system for evaluating and exploiting the specific properties of a single cell comprises, in the context of the invention, a culture support in which least one Clonal culture is seeded with a single epithelial cell directly extracted from a biological sample of epithelial tissue according to steps a) through c) of the previously described method.
  • the present invention also relates to the applications of the method and uses of the various means (system, kit, cell bank, tissue, biochip) described above.
  • An “agent” can be a candidate molecule that is tested for its biological activity and that is selected according to the applications, said activity being able to be positive (eg, for the selection of effectors of pharmaceutical interest, therapeutic, cosmetic, etc.) or negative (eg, for the selection of toxic molecules).
  • an “agent” may be of a non-chemical nature, for example UV rays, visible light, ionizing radiation, magnetic waves, etc. ;
  • RNAs interfering RNAs, overexpression and / or repression vectors, viral or non-viral, and the like.
  • agents having a biological activity such as molecules of pharmaceutical or cosmetic interest, and / or to evaluate the effectiveness of treatments using such agents (molecules or other types of stimuli, for example waves, light, radiation, physical parameters, etc.).
  • test effectors likely 1) to induce multiplication of stem cells or progenitor of pluristratified epithelial tissues, 2) to promote maintenance of the stump character in culture in the offspring of isolated stem cells;
  • Biochip technology parallel / massively parallel models of quantification and qualification of biological responses. - Functional genomic screens on two-dimensional cell cultures and / or three-dimensional organotypic models.
  • FIG. 2 graphical representation of the results of a long-term expansion experiment for the production of multiple keratinocyte libraries, each resulting from the progeny of a single cell;
  • FIG. 5 results of an experiment in which the long-term cultures initiated from strong Itgoc6 basal keratinocytes, which were placed in culture individually, were quantified;
  • FIG. 6 graphical representation of the results of an experiment in which the impact of irradiation on epidermal keratinocytes of distinct phenotypes was quantified on the scale of the single isolated cell
  • FIG. 7 results of an experiment in which the functional test of parallel clonal micro-cultures was used to evaluate the consequences of an irradiation carried out on an isolated cell, on the growth potential of its offspring, and in which we compared the behavior of epidermal keratinocytes of distinct phenotypes;
  • FIGS. 8A, 8B, 8C result of a search for chromosome 10 abnormalities by CGH chips: o Descendance of two non-irradiated keratinocytes: K1 and K2 o Descendancy of an irradiated keratinocyte: K3.
  • Tissue biopsies which are in the examples described herein, of adult human skin biopsies, were first decontaminated, for example by dipping into a skin. physiological solution containing betadine. In order to allow separation between the epithelial tissue and the associated connective tissue (in this case, epidermis and dermis), the samples were then incubated in an enzyme solution at 4 ° C for 10 to 15 hours (Gibco trypsin). At the end of this stage of
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Enzymatic digestion, the tissue samples were dissected using fine forceps, so as to isolate the epithelial part of the tissue (here, the interfollicular epidermis).
  • the enzymatic treatment completed by a step of mechanical dissociation by aspiration and discharge using a pipette, extracts the keratinocytes that make up the fragments of epithelia.
  • the cell suspension was finally filtered through a sieve of 50-70 micron mesh size (BD Falcon) to remove cell aggregates.
  • the cell samples are in the form of single-cell suspensions, which can be used for seeding clonal cultures.
  • the epithelial cells (keratinocytes obtained from interfollicular epidermis) were studied under clonal conditions in a culture system using as a support a feeder layer of fibroblasts rendered incapable of multiplication by gamma irradiation at a dose of 60 Grays.
  • these cells remained static but alive, and they supported the growth of the epithelial cells studied.
  • These fibroblasts can in particular be extracted from the dermal part of cutaneous biopsies.
  • dermal fragments were incubated in an enzymatic solution consisting of a mixture of dispase (Roche) and collagenase (Roche) for 2 to 4 hours at 37 ° C.
  • Enzyme digestion combined with mechanical agitation, allows the extraction of fibroblasts. After removal of the undigested tissue fragments by sieving (BD Falcon) and washing, the resulting fibroblasts were cultured in a medium composed of 90% DMEM (Gibco) and 10% original serum. bovine (Gibco), to be amplified. After multiplication in culture, the fibroblasts were irradiated and then frozen to be stored until use.
  • DMEM fetalarcomas
  • the epithelial cells used to illustrate certain embodiments of the invention are keratinocytes with a high level of expression of the ⁇ 6 integrin (Itga ⁇ or CD49 ⁇ and low level of expression of the transferrin receptor (CD71): Itga6 phenotype Box fa ⁇ ble CD71.
  • cell samples were placed in suspension in physiological saline buffer (PBS) supplemented with 2% bovine serum albumin ( SAB) (Sigma), then incubated for 10 minutes at 4 ° C with mouse immunoglobulins (Jackson Immuno-Research), in order to saturate the nonspecific sites of antibody binding .
  • PBS physiological saline buffer
  • SAB bovine serum albumin
  • the labeling of CD49f and CD71 antigens was then carried out by addition of specific antibodies coupled to fluorochromes, then incubation for 30 minutes at 4 ° C: anti-CD49f-PE (phycoerythrin) (clone GoH3, BD Pharmi ngen) and anti-CD71-APC (allophycocyanin) (clone M-A712, BD Pharmingen). After washing the excess antibodies, the samples were ready to be used for seeding the clonal cultures.
  • PBS physiological saline buffer
  • SAB bovine serum albumin
  • the keratinocyte clonal micro-cultures were inoculated in an automated manner using a flow cytometer equipped with a cloning module (MoFIo, Cytomation).
  • the excitation of the fluorochromes coupled to the labeling antibodies was performed using a 488 nm argon laser (Coherent) and a 630 nm laser diode.
  • the signals emitted by phycoerythrin (PE) and allophycocyanin (APC) were respectively detected and quantified in wavelength windows of 580 ⁇ 30 nm and 670 ⁇ 30 nm.
  • the sorting criterion chosen in this case corresponded to keratinocytes having the ITGA6 strong fa ⁇ ble CD71 phenotype and representative of the order of 1% of total keratinocytes: keratinocytes subpopulation described as being enriched in epidermal stem cells (Li et al. , 1998).
  • clonal micro-cultures of keratinocytes were made in culture plates comprising 96 wells in which type I collagen (Biocoat, Becton-Dickinson) was adsorbed. The day before seeding the epithelial cells under clonal conditions, a feeder layer of irradiated fibroblasts was placed in the culture wells. These support cells were seeded at a density of 6000 cells / cm 2 .
  • the culture medium used for the growth of keratinocytes was based on a mixture of DMEM medium (Gibco) and Ham F12 medium (Gibco), supplemented with serum of bovine origin (Hyclone).
  • This basal medium was in particular supplemented with EGF (Chemicon), insulin (Sigma), hydrocortisone (Sigma), adenine (Sigma), triiodothyronine (Sigma), L -glutamine (Gibco), and with a solution of antibiotics and antimycotics (Gibco).
  • the tissue reconstruction potential of the progeny of keratinocytes initially placed in culture individually has been demonstrated in an epidermal reconstruction model on dead human dermis epidermis (Régnier et al., 1986).
  • human skin samples were incubated for 10 days at 37 ° C in PBS buffer, in order to detach the epidermis, which was removed.
  • Dermis samples without epidermis were cut into squares of about 1 cm 2 . They then underwent several successive freezing / thawing cycles which led to the killing of the dermal cells.
  • the acellular dermas obtained were stored at -20 ° C. until use.
  • the process of reconstructing a three-dimensional epidermis consisted of two stages of successive cultures.
  • the cell samples from the clonal micro-cultures were first seeded on the dermal supports and cultured for 1 week in immersion in a comparable culture medium. Similar to that used for primary clonal culture (example of composition described above).
  • the second step of the epidermal reconstruction process was to place the epidermis in formation at the interface between the liquid medium and the ambient air of the incubator.
  • the culture was then continued for 1 to 2 weeks to achieve complete differentiation.
  • the histological features of the reconstructed three-dimensional tissues were visualized after fixation, cutting, and hemalum-eosin-saffron (HES) staining.
  • HES hemalum-eosin-saffron
  • the keratinocytes derived from the clonal micro-cultures were removed by trypsination (Gibco) and then placed in mass culture, individually for each clone studied. These cultures were carried out on plastic surfaces on which type I collagen was adsorbed (for example Petri dishes, Biocoat, Becton-Dickinson).
  • the culture conditions were equivalent to those used for primary clonal growth: feeder layer of irradiated fibroblasts, culture medium of similar composition. After one week, the cultures reached 50% to 80% confluence.
  • the keratinocytes were then removed by trypsination, counted and then reseeded at a density of 2000 to 3000 cells / cm 2 , under identical conditions.
  • N Number of cells obtained at the end of the culture step.
  • CFE colony-forming efficiency
  • CFE % of cells capable of giving birth to a colony (low density culture situation) or to a clone (single cell cultures per well). * * Average calculated on 3 experiments carried out from independent samples. * ** Non-exclusively.
  • C-1 Materials and methods - Extraction of keratinocytes from an epidermis resulting from an adult skin biopsy (breast reduction), dissociation and suspension. - Marking of keratinocytes in suspension using antibodies coupled to fluorochromes making it possible to sort a "stem" cell phenotype (high level of expression of the ⁇ 6 (Itg ⁇ ) integrin and weak level of expression of the transferrin receptor (CD71): Itga6 strong phenotype CD71 weak ; selection model: Li et al., 1998).
  • the 5 clones selected consisted of 8.64 ⁇ 10 4 to 1.1 ⁇ 10 5 keratinocytes, which is equivalent to 16.40 to 16.86 successive cell generations made since the cloned single cell stage. .
  • - 1 clone generated a cumulative progeny of 8.48x10 12 keratinocytes in 8 weeks of multiplication in culture (No. 1), which is equivalent to a cumulative average population of 42.95 doublings.
  • - 2 clones generated a cumulative progeny of 6.36x10 11 and 2.4x10 11 keratinocytes (No. 2 and No. 3), which equates to 39.21 and 37.80 mean doublings of population, respectively.
  • - 1 clone generated cumulative progeny of 2.03x10 10 keratinocytes in 6 weeks of multiplication in culture (No. 4), which is equivalent to a cumulative 34.24 average population doublings.
  • - 1 clone generated a cumulative progeny of 2.15x10 9 keratinocytes in 6 weeks of multiplication in culture (No. 5), which equates to a cumulative 31, 00 average population doublings.
  • the model of parallel clonal micro-cultures in accordance with the present invention represents a technology making it possible to generate, in a standardized manner, multiple keratinocyte libraries, each derived from the offspring of a single cell directly isolated from a tissue sample.
  • D-2 Results A cohort of 5 cell clones was tested for the individual ability of each clone to generate a reconstructed three-dimensional epidermis.
  • the experiment was carried out at a stage of growth of the clones equivalent to that described in the embodiment example No. 1 (multiplication corresponding to -16 to 17 successive cell generations).
  • the 5 clones tested were found to be capable of producing an epidermis having an organization representative of that of a native epidermis.
  • the technology of parallel clonal micro-cultures according to the invention makes it possible to produce reconstructed series of epidermis whose particularity is to be each derived from the offspring of a single cell, whereas the models conventionally used for campaigns large scale tests are generated from banks derived from a mixture of cells.
  • the reconstructed epidermis produced according to the method that is the subject of the present invention is generated from a cloned cell immediately after extraction from the tissue, and not after a multiplication step in culture, capable of modifying its characteristics.
  • the clones were used for epidermal reconstruction at a growth stage corresponding to -16 to 17 successive cell generations.
  • epidermal reconstructions may be performed from an earlier or later stage of growth of the cloned cells.
  • the culture model according to the present invention thus provides an original functional test for qualifying the organogenesis potential of initially cultured cells individually, immediately following selection from the tissue. It offers the possibility to evaluate the impact of a stimulus or stress at different stages of growth of cells placed in culture in isolation, and to study the consequences on the capacity for tissue reconstruction in the short or medium term after treatment.
  • E- 1 Materials and methods - Extraction of keratinocytes from an epidermis resulting from an adult skin biopsy (breast reduction), dissociation and suspension.
  • the technology of parallel clonal micro-cultures makes it possible to precisely estimate the individual clonogenic capacity of the cells of a sample of interest, in this exemplary embodiment a preparation of basal keratinocytes of the epidermis.
  • the method is resolutive in defining a clonal growth profile providing a representative functional signature of a tissue, or a sub-localization within a tissue, in this case the basal layer of tissue. the adult human interfollicular epidermis.
  • the system makes it possible to distinguish, within a cell sample of interest, cells having distinct potentialities, as a function of their clonal growth capacity in the short term.
  • the culture model according to the present invention thus provides an original functional test for estimating the clonogenic capacity of cohorts of cells placed in culture individually.
  • One possible application is the development of quality checks carried out at the individual cell scale to evaluate the functionality (or non-functionality) of cellular samples of interest, compared to a validated reference.
  • the clonal micro-culture system further provides the ability to generate cell samples from a single cell, each individually corresponding to a precisely defined short-term proliferation capability.
  • Another possible application is to use the system for conducting studies to analyze the short-term functional consequences of a treatment (beneficial or toxic) applied at the individual cell level.
  • Use of the parallel clonal micro-culture model to characterize the long-term growth potential of keratinocytes of a sample of interest involves detecting the presence of keratinocytes having one of the functional properties associated with epidermal stem cells, namely the ability to perform at least 100 population doublings in culture (FIG. 5).
  • the parallel clonal micro-culture technology makes it possible to precisely estimate the extent of the long-term growth potential of the cells of a sample of interest, in this exemplary embodiment a preparation of basal keratinocytes of 'epidermis.
  • the method is resolutive to distinguish a posteriori clones generated from a stem cell, thanks to their ability to accumulate at least 100 population doublings, clones from a progenitor cell, whose long-term proliferation capacity is more limited, usually between 30 and 80 population doublings.
  • the system makes it possible to generate cell samples corresponding to the progeny of stem cells and progenitor cells, the properties of which can be studied and compared with different phases of their long-term proliferation.
  • the culture model according to the present invention thus provides an original functional test for qualifying the long-term growth potential of cells initially placed in culture individually. For example, it offers the possibility of estimating the regenerative potential of a sample, in particular by evaluating the presence (or absence) of stem cells.
  • One possible use is to conduct studies to analyze the long-term functional consequences of a treatment (beneficial or toxic) applied at the individual cell level.
  • the percentage of keratinocytes with a strong CD71 Itg ⁇ 6 phenotype giving rise to a clone was lowered by 70.3% (control condition) at 47.3% (irradiation 2 Gy), which made it possible to estimate the maintenance of the clonogenic capacity of these cells at 67.3%.
  • the size of the clones produced also did not prove to be a criterion making it possible to clearly distinguish the two types of keratinocytes studied.
  • the keratinocytes of the two phenotypes have been shown to be capable of generating a large proportion of large clones, comprising at least 5 ⁇ 10 4 keratinocytes.
  • the analysis of the size distributions of the clones obtained provided parameters making it possible to clearly distinguish the specific irradiation responses of the keratinocytes from distinct phenotypes. - Moderate reduction of the capacity of Itg ⁇ 6 strong keratinocytes CD71 weak clones to generate large clones following irradiation (median size of the clones in control condition: 10.1x10 4 cells / clone, median size for the irradiated group: 6 8x10 4 cells / clone).
  • the model of parallel clonal micro-cultures according to the invention is efficient for analyzing the growth capacity of keratinocytes of specific phenotypes at the level of the individual cell. Indeed, the clonogenic efficiency values obtained in this model, reaching 60 to 70% of the cloned cells, prove to be much higher than what is generally described in conventional culture systems, concerning keratinocytes directly derived from a biopsy of tissue, for which the values are of the order of 10%.
  • This model is also effective to detect, qualify and quantify a deleterious effect on the cell growth potential.
  • This example illustrates the ability of the system to be enhanced by the development of in vitro tests of radio-toxicology.
  • EXAMPLE 6 Use of the functional test of parallel clonal micro-cultures to evaluate the consequences of the irradiation of a single cell on the growth potential of its offspring. Comparison of the behavior of epidermal keratinocytes of distinct phenotypes ( Figure 7).
  • the model of parallel clonal micro-cultures according to the present invention is adapted to highlight, qualify and quantify the non-immediate consequences of irradiation carried out on keratinocytes studied individually.
  • the effect deleterious highlighted was a loss of growth capacity measured on the progeny of cells placed in clonal culture.
  • genomic DNA samples corresponding to a late stage of long-term proliferation in this case the cultures having made about 150 doublings of population after clonal sowing.
  • search for genome zones presenting deletion and / or amplification anomalies by comparative genomic hybridization (CGH) versus reference DNA (CGH Constitutional Chip ® 4.0 chips, PerkinElmer, Inc. according to the method recommended by the manufacturer).
  • Grays results in the acquisition of chromosomal abnormalities transmitted to offspring, which are found to be detectable by a large number of cell divisions after application of genotoxic stress (Figure 8).
  • an amplification of a 44.3 mega-base locus located on chromosome 10 is detected at the level of the DNA of the offspring.
  • a keratinocyte 150 doublings of population after it has been irradiated.
  • the clonal micro-culture technology makes it possible to subject individual epidermal basal keratinocytes to genotoxic stress, in this case gamma irradiation, and then to evaluate the long-term consequences on the offspring.
  • genotoxic stress in this case gamma irradiation
  • the method is valid for analysis at the clonal level, the impact of stress on the genome integrity of basal keratinocytes.
  • the system makes it possible to demonstrate a genotoxic effect of gamma irradiation on keratinocytes derived from the basal layer of the epidermis.
  • the culture model according to the present invention thus provides an original system for performing toxicology tests at the individual cell scale. It offers, for example, the possibility of characterizing the individual sensitivity of basal keratinocytes of the epidermis to genotoxic agents.
  • One possible use is the performance of tests aiming at detecting the occurrence of genome defects such as deletions and / or amplifications, as a result of exposure to a toxin, and analyzing their transmission to the offspring during successive cell divisions, particularly in the long term.

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Abstract

La présente invention propose des moyens et méthodes permettant d'évaluer et exploiter les propriétés spécifiques d'une cellule épithéliale particulière présente dans un échantillon biologique. Ainsi, l'invention a pour objet un système de culture de cellules épithéliales, dans lequel au moins une culture clonale est ensemencée avec une et une seule cellule épithéliale directement extraite d'un échantillon biologiquede tissu épithélial. L'invention concerne également un procédé de culture de cellules épithéliales comprenant notamment la réalisation de cultures clonales, chacune étant ensemencée avec une cellule épithéliale distincte et unique, directement extraite d'un échantillon biologique de tissu épithélial, l'évaluation de la croissance cellulaire dans les cultures clonales et, avantageusement, l'analyse de l'aptitude du matériel cellulaire issu des cultures clonales à reconstruire un épithélium tridimensionnel représentatif d'un tissu natif. Cette invention est adaptée à la mise en parallèle d'un très grand nombre de cultures clonales, notamment pour réaliser des tests à grande échelle.

Description

SYSTEME ET PROCEDE DE CULTURE CLONALE DE CELLULES EPITHELIALES ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention se rapporte au domaine de la biologie cellulaire et de l'ingénierie tissulaire.
Plus précisément, l'invention propose des moyens et méthodes permettant d'évaluer et exploiter les propriétés spécifiques d'une cellule épithéliale particulière présente dans un échantillon biologique.
Ainsi, la présente invention a pour objet un système de culture de cellules épithéliales, dans lequel au moins une culture clonale est ensemencée avec une et une seule cellule épithéliale directement extraite d'un échantillon biologique de tissu épithélial.
L'invention concerne en outre un procédé de culture de cellules épithéliales, comprenant au moins les étapes consistant à : a) extraire une ou plusieurs cellules épithéliales directement à partir d'un échantillon biologique de tissu épithélial ; b) facultativement, sélectionner au moins une population et/ou sous- population de cellules épithéliales parmi les cellules extraites à l'étape a) ; c) réaliser une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale distincte et unique directement issue de l'étape a) ou b) ; et d) évaluer qualitativement et/ou quantitativement la croissance cellulaire dans la culture clonale de l'étape c).
De plus, l'invention vise les applications d'un tel système ou procédé. Les systèmes et procédés in vitro portant sur les tissus épithéliaux tels que l'épiderme trouvent des applications dans des domaines aussi divers que la recherche médicale et le développement clinique, l'ingénierie tissulaire et la toxicologie.
Les différents tissus épithéliaux pluristratifiés (notamment l'épiderme, la cornée, les tissus muqueux...) partagent un certain nombre de caractéristiques communes qui imposent des contraintes pour la conception d'architectures de tests in vitro à grande échelle. Ces caractéristiques générales sont bien exemplifiées dans le cas de l'épiderme.
L'épiderme constitue la structure la plus superficielle de la peau et en assure notamment la fonction barrière. Majoritairement constitué de kératinocytes, il se renouvelle tous les 28 jours en moyenne. Ce tissu comprend 4 couches qui correspondent aux 4 étapes du programme de différenciation que les kératinocytes subissent lors de leur migration de la couche basale, la plus profonde, vers la couche cornée, la plus surperficielle. Le processus physiologique continuel de renouvellement des différentes couches de kératinocytes est appelé kératinopoïèse.
La couche basale de l'épiderme, qui ne comporte qu'une seule assise cellulaire, est le compartiment germinatif. C'est au niveau de cette couche que s'effectue la prolifération des kératinocytes. Parmi les kératinocytes basaux, on trouve une faible proportion de cellules appelées cellules souches, dont il est admis qu'elles sont à l'origine du renouvellement à long terme de l'épiderme. La descendance immédiate des cellules souches est appelée population des progéniteurs. Ces derniers assurent le renouvellement rapide à court terme de l'épiderme. La notion de cellule souche, au sein de l'épiderme inter-folliculaire humain, définit donc le compartiment situé le plus en amont de la hiérarchie de la kératinopoïèse. Ces cellules se caractérisent notamment par une capacité d'auto-renouvellement importante, que ne possèdent pas les cellules progénitrices, et a fortiori les kératinocytes engagés dans la différenciation. De plus, une propriété importante des cellules souches est de conserver de manière durable le potentiel de régénération et de reconstruction du tissu épidermique.
Comme les autres tissus épithéliaux pluristratifiés, l'épiderme est donc constitué d'un ensemble hétérogène de cellules présentant des degrés de différenciation (ou d'immaturité) variables. Il est généralement admis que les kératinocytes basaux représentent environ 10% de l'ensemble des kératinocytes de l'épiderme, et le compartiment des cellules souches épidermiques seulement de l'ordre de 0,1 %.
Compte tenu des besoins quantitatifs nécessaires à la mise en œuvre des méthodes actuelles d'évaluation fonctionnelle et de criblage, le matériel cellulaire collecté en routine à partir de biopsies cutanées, à savoir l'ensemble des kératinocytes obtenus après dissociation d'un échantillon d'épiderme, permet la constitution de banques de cellules d'une taille suffisante pour une utilisation à l'échelle industrielle. Cependant, le matériel utilisé pour la constitution de ce type de banques correspond à un ensemble hétérogène de cellules, comprenant des kératinocytes basaux possédant différentes capacités de croissance, et des kératinocytes supra-basaux en cours de différenciation et ne possédant plus de capacité de croissance.
S'agissant des banques de kératinocytes, par exemple destinées à la production industrielle de kits d'épidermes reconstruits, un procédé classique consiste à congeler les cellules à l'issue d'une étape unique de multiplication en culture, de manière à constituer un stock de multiples ampoules équivalentes, qui sont conservées en azote liquide. En fonction des besoins, les ampoules de cellules sont décongelées et placées en culture afin de réaliser une seconde étape de multiplication. À l'issue des deux étapes de multiplication successives, les kératinocytes ont généralement effectué de l'ordre de 10 doublements de population. Ce type d'approche a d'ailleurs été utilisé pour analyser l'hétérogénéité du potentiel de croissance de kératinocytes humains (Barrandon et Green, 1987). Les auteurs ont d'abord réalisé des cultures primaires dérivées de l'épiderme, qu'ils ont congelées dans l'azote liquide. Des cultures secondaires sous-confluentes ont été préparées à partir des cultures primaires congelées. Les clones obtenus après clonage (troisième étape de culture ou « troisième passage ») ont été classifiés en trois catégories : les holoclones (à croissance rapide), les paraclones (à croissance limitée) et les méroclones (population intermédiaire). Les kératinocytes obtenus classiquement après deux étapes de multiplication successives peuvent être utilisés pour la production de modèles de tissus reconstruits. Appliquer en l'état ces systèmes à un matériel cellulaire rare, tel que les cellules souches, est en revanche impossible à l'échelle industrielle où de vastes campagnes de tests doivent être menées.
En somme, plusieurs types de modèles compatibles avec la réalisation de campagnes de tests in vitro à grande échelle sont actuellement disponibles. Le matériel biologique utilisé dans ces tests peut être : 1 ) des lignées cellulaires immortalisées ; 2) des banques de cellules normales extraites de biopsies de tissus et amplifiées en culture ; 3) des tissus tridimensionnels reconstruits. Cependant, pour la mise en œuvre à grande échelle de tels modèles, il est nécessaire de disposer de grandes quantités de matériel cellulaire. Par exemple, dans le cas de tests réalisés sur des cellules normales, on utilise des populations cellulaires amplifiées in vitro, ce qui en modifie certaines propriétés en fonction des paramètres de culture appliqués. En outre, si l'on s'intéresse aux sous-populations de cellules rares, telles que les cellules progénitrices ou les cellules souches épidermiques, ces cellules sont obtenues en quantités insuffisantes à partir de biopsies de tissus.
Gangatirkar et al. (2007) décrivent un procédé permettant de reconstruire un épiderme à partir de kératinocytes totaux ou à partir de sous-populations triées sur la base de phénotypes distincts. Les deux options proposées consistent d'une part à utiliser les cellules directement après extraction à partir du tissu et tri cellulaire, et d'autre part, à utiliser le matériel cellulaire après une phase d'expansion en culture. Cependant, les besoins quantitatifs en matériel cellulaire pour mettre en œuvre le procédé décrit restent inadaptés à la réalisation de campagnes de tests parallèles à grande échelle. En outre, le matériel cellulaire utilisé correspond à un mélange complexe de cellules différentes dont l'aptitude à reconstruire un épiderme est utilisée de manière globale. L'hétérogénéité des cellules composant les tissus épithéliaux pluhstratifiés, et notamment celle des kératinocytes de l'épiderme, est donc un facteur limitant dans l'élaboration de stratégies de tests in vitro.
En effet, dans la mesure où les cellules présentent certaines caractéristiques qui leur sont propres, elles sont susceptibles de répondre différemment à un stimulus ou à un stress. Il en est de même pour des tissus épithéliaux pathologiques. Par exemple, les carcinomes sont des tumeurs très hétérogènes, dans lesquelles une faible proportion de cellules souches tumorales représente une cible clé pour les traitements. En outre, lorsque des cellules présentant des caractéristiques distinctes sont mélangées en culture, le comportement spécifique de certaines d'entre elles peut être modifié ou ignoré au sein du mélange. On observe ainsi un résultat « moyenne » sur l'ensemble des cellules cultivées. Ainsi, les propriétés structurelles et fonctionnelles d'un épiderme reconstruit à partir d'une population cellulaire globale hétérogène (voir par exemple Larderet et al., 2006) sont le résultat de l'ensemble des propriétés des cellules mises en présence. Un épiderme ainsi reconstruit ne peut donc en aucun cas refléter les propriétés spécifiques d'une seule cellule. De plus, les conditions de culture appliquées peuvent plus ou moins sévèrement modifier les caractéristiques intrinsèques des cellules. Il est en effet bien connu que le fait de placer des cellules issues d'un tissu épithélial dans un environnement artificiel de culture conduit à modifier leurs caractéristiques natives. Conséquemment, des cellules épithéliales utilisées après une ou plusieurs étapes de cultures représentent un matériel cellulaire qui n'est plus comparable à des cellules directement issues d'un échantillon de tissu. Ces modifications concernent en particulier le phénotype spécifique des cellules étudiées. Par exemple, il a été montré que la mise en culture de kératinocytes humains fraîchement isolés d'un épiderme perturbe l'expression de molécules d'adhésion et de marqueurs utilisés pour définir un phénotype de cellules souches, et ce, de manière variable en fonction du milieu de culture utilisé (Lorenz et al. 2008).
En définitive, les solutions classiques qui consistent à travailler à partir de populations cellulaires complexes hétérogènes ne sont pas adéquates pour répondre aux besoins médicaux, cliniques et industriels actuels.
Il existe donc un besoin pour des moyens et méthodes qui permettent d'accéder aux propriétés individuelles des cellules issues des tissus épithéliaux pluristratifiés, tout en étant adaptés à la mise en œuvre de campagnes de tests in vitro à grande échelle, même dans le cas d'un matériel cellulaire 100 à 1000 fois plus rares que les populations tout- venant que l'on utilise actuellement.
La présente invention répond pour la première fois à ce besoin en proposant des moyens et méthodes de culture qui (i), de par leur caractère clonal, permettent d'accéder aux propriétés individuelles et spécifiques de cellules directement issues de tissus épithéliaux pluristratifiés, (ii) préservent le potentiel individuel desdites cellules, (iii) sont, même lorsqu'ils sont mis en œuvre à grande échelle, peu consommateurs de matériel cellulaire, ce qui les rend adaptés à l'étude et l'exploitation à l'échelle industrielle des cellules les moins représentées (cellules souches et progénitrices), et (iv) permettent d'atteindre des niveaux de croissance cellulaire largement supérieurs à ceux obtenus avec les outils connus.
Ainsi, un objet de la présente invention concerne un système de culture clonale de cellules épithéliales optimisé pour l'évaluation et l'exploitation des propriétés spécifiques d'une cellule unique, dans lequel un support de culture comprend au moins une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale unique directement extraite d'un échantillon biologique de tissu épithélial. Avantageusement, ledit support de culture comprend au moins deux cultures clonales parallèles, chacune desdites cultures étant ensemencée avec une cellule épithéliale distincte et unique directement extraite dudit échantillon biologique.
De préférence, un tel système se présente sous la forme de biopuce. Les cultures clonales ensemencées en parallèle sont alors par exemple des micro-cultures. En pratique, la biopuce peut être notamment réalisée à partir de plaques de cultures comprenant de multiples puits distincts, par exemple 6, 24, 96 puits, ou plus. Alternativement, la biopuce peut avoir comme support une lame, en verre ou en n'importe quel autre matériau approprié, sur laquelle on crée de multiples micro-surfaces destinées à recevoir les cellules, par exemple par un traitement de surface permettant aux cellules d'adhérer et de croître. Les biopuces réalisées sur lames peuvent être compartimentées physiquement, par exemple à l'aide de grilles, ou chimiquement, par exemple suite à un traitement de surface des lames qui empêche les cellules clonées de migrer en dehors de leurs micro-surfaces de culture respectives.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de culture clonale de cellules épithéliales optimisé pour l'évaluation et l'exploitation des propriétés spécifiques d'une cellule unique, comprenant au moins les étapes consistant à : a) extraire une ou plusieurs cellules épithéliales directement à partir d'un échantillon biologique de tissu épithélial ; b) facultativement, sélectionner au moins une population et/ou sous- population de cellules épithéliales parmi les cellules extraites à l'étape a) ; c) réaliser une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale distincte et unique directement issue de l'étape a) ou b) ; et d) évaluer qualitativement et/ou quantitativement la croissance cellulaire dans la culture clonale de l'étape c).
De manière intéressante, les cellules utilisées dans le procédé objet de la présente invention peuvent être des populations totales de cellules directement extraites de ces tissus, et/ou des sous-populations de celles- ci, triées sur la base de caractères précis. Ainsi, le matériel cellulaire issu de l'étape b) peut avantageusement correspondre à une ou plusieurs sous-populations enrichies en progéniteurs et/ou en cellules souches épithéliales.
Lors de l'étape c) (qui peut être considérée comme une étape de croissance primaire), on utilise la préparation cellulaire ainsi extraite pour initier des cultures ou micro-cultures clonales parallèles. Il s'agit d'ensemencer les cellules d'intérêt individuellement dans des conditions permettant leur croissance, par exemple dans des puits de culture séparés. En pratique, les ensemencements clonaux peuvent être effectués de manière automatisée par des technologies telles que notamment la cytométhe en flux ou la micro-fluidique. De préférence, l'étape c) comprend la réalisation d'au moins deux cultures clonales parallèles, chacune desdites cultures étant ensemencée avec une cellule épithéliale distincte et unique directement issue de l'étape a) ou b). En particulier, lors de l'étape d), on analyse la croissance des cellules clonées sur la base d'un ou plusieurs paramètres quantitatifs et/ou qualitatifs tels que :
- la fréquence de clones obtenus par rapport au nombre de cultures ensemencées : efficacité clonogénique ("clone-forming efficiency" [CFE]) ; - le potentiel prolifératif des clones : nombre de cellules composant chaque clone à un temps de culture donné ;
- le phénotype des clones : degré de différenciation des cellules composant les clones, expression de marqueurs moléculaires.
Ainsi, contrairement à toute attente, les Inventeurs ont pu observer que le potentiel de croissance des cellules cultivées selon le procédé de culture clonale de la présente invention est plus élevé que celui de cellules cultivées selon des procédures classiques (voir Exemple B ci-après).
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de culture clonale de l'invention comprend au moins les étapes consistant à : a) extraire une ou plusieurs cellules épithéliales sous forme d('un)e suspension(s) monocellulaire(s), directement à partir d'un échantillon biologique de tissu épithélial ; b) sélectionner au moins une population et/ou sous-population de cellules épithéliales parmi les cellules extraites à l'étape a) ; c) réaliser une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale distincte et unique issue de l'étape b) ; et d) évaluer qualitativement et/ou quantitativement la croissance cellulaire dans la culture clonale de l'étape c). Selon un autre mode de réalisation, le procédé objet de la présente invention comprend en outre l'étape e) consistant à amplifier la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), ou sa descendance, par une ou plusieurs sous-cultures successives.
Il s'agit ici de réaliser, à partir des clones cellulaires obtenus à l'issue de l'étape de croissance primaire c), des cultures cellulaires indépendantes, parallèles, à long terme via des sous-cultures successives amplifiées pendant plusieurs semaines. En fonction des besoins, l'amplification peut être conduite sur des périodes allant par exemple de 2 à 8 semaines environ, voire plus (cf. Exemple de réalisation n°1 , C.2, ci- dessous). Ces cultures indépendantes permettent d'obtenir une grande quantité de cellules que l'on peut congeler et stocker sous la forme d'une ou plusieurs banques de cellules, pour un usage ultérieur.
Les banques cellulaires clonales susceptibles d'être ainsi obtenues représentent également un objet de la présente invention. Ces banques se distinguent des banques existantes par le fait qu'elles intègrent des cultures cellulaires clonales qui leur confèrent des propriétés structurelles et fonctionnelles bien spécifiques.
Dans un autre mode de réalisation, additionnel ou alternatif, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape f) consistant à évaluer le potentiel de reconstruction tissulaire de la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), ou de sa descendance. Plus précisément, l'étape f) consiste de préférence à utiliser la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), ou sa descendance, pour reconstruire un tissu tridimensionnel, de manière à évaluer son potentiel de reconstruction tissulaire. En pratique, pour réaliser cette étape, on peut décoller de leur support de culture les cellules issues des cultures ou micro-cultures clonales primaires, puis les utiliser, individuellement pour chaque clone d'intérêt, afin de produire un modèle de culture organotypique tridimensionnel (par exemple, un épithélium, un épiderme ou une peau reconstruit(e)).
Les tissus tridimensionnels reconstruits à partir des cultures clonales, susceptibles d'être obtenus à l'issue de l'étape f) du procédé selon l'invention font partie des objets de la présente invention. Ces tissus sont produits selon un nouveau modèle organotypique tridimensionnel car les caractéristiques structurales et fonctionnelles des tissus objets de l'invention sont tout à fait spécifiques dans la mesure où elles découlent des propriétés d'une cellule unique. De tels tissus sont notamment choisis parmi les différents tissus épithéliaux, la peau, l'épiderme.
En outre, les biopuces comprenant au moins un tissu tel que décrit ci-dessus constituent un autre objet de l'invention. Ces biopuces peuvent par exemple être constituées à partir de micro-cultures réalisées au sein d'un gel tridimensionnel fait d'un biomatériau compatible avec la croissance cellulaire. On peut également envisager des systèmes à base de multiples micro-tissus tridimensionnels reconstruits, chacun généré indépendamment directement au sein de la biopuce, sans étape de culture préalable.
Dans un autre mode de réalisation, additionnel ou alternatif, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape g) consistant à évaluer le potentiel d'expansion à long terme de la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c). Plus précisément, l'étape g) consiste de préférence à sous-cultiver la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), dans des conditions favorisant l'expansion cellulaire jusqu'à épuisement du potentiel d'expansion, de manière à évaluer le potentiel d'expansion à long terme de ladite population cellulaire.
Par exemple, on pourra décoller de leur support de culture les cellules issues des cultures ou micro-cultures clonales primaires, puis les sous-cultiver dans des conditions favorisant leur multiplication, jusqu'à épuisement de leur potentiel de multiplication.
Dans un autre mode de réalisation, additionnel ou alternatif, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape h) consistant à évaluer le potentiel clonogénique de la descendance de la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c). Plus précisément, l'étape h) consiste de préférence à évaluer le potentiel clonogénique de la descendance de la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), à l'aide d'un test quantitatif de la clonogénicité dans lequel on réalise des cultures secondaires strictement clonales et/ou des cultures à faible densité permettant la croissance de colonies individualisées.
Pour cela, on pourra, par exemple, décoller de leur support de culture les cellules constituant chaque clone, puis réaliser, pour chacun d'entre eux, un test quantitatif de clonogénicité. Ainsi, on pourra par exemple réaliser des cultures secondaires strictement clonales et/ou des cultures à faible densité permettant la croissance de colonies individualisées.
De manière essentielle, dans le cadre de la présente invention, l'échantillon biologique initial est un échantillon de tissu épithélial sain ou malade, par exemple obtenu par biopsie chez un mammifère, de préférence chez l'homme. En particulier, l'échantillon tissulaire peut être choisi parmi les épithéliums, par exemple l'épiderme interfolliculaire de peau humaine adulte ou néonatale, la cornée, les muqueuses, les follicules pileux. Des échantillons de tissus épithéliaux malades sont par exemple obtenus par biopsie de patients atteints d'une maladie génétique (telle que xeroderma pigmentosum, les épidermolyses bulleuses, etc.), ou par biopsie de peau cicatricielle (chez les grands brûlés notamment). Les tissus épithéliaux malades peuvent également être des tissus tumoraux (carcinomes, etc.)
L'échantillon biologique peut éventuellement comprendre des cellules issues de la différenciation épithéliale (notamment kératinopoïétique) de cellules souches pluripotentes choisies parmi les cellules souches pluripotentes embryonnaires, fœtales et induites. On citera à titre d'exemples de cellules présentant un potentiel épithélial issues de cellules souches fœtales : cellules du feuillet embryonnaire ectodermique, cellules des tissus épithéliaux, kératinocytes, etc. Les cellules présentant un potentiel épithélial issues de cellules souches pluripotentes dites « induites » (IPS pour « induced pluripotent stem cells ») sont générées par reprogrammation de cellules issues d'un tissu adulte qui peuvent être des cellules différenciées. Avantageusement, les cellules épithéliales directement extraites de l'échantillon biologique sont des cellules saines ou malades uniques choisies parmi les cellules progénitrices, les cellules souches, les kératinocytes.
Un autre objet de la présente invention concerne un système de culture clonale (ou un kit comprenant un tel système) obtenu par la mise en œuvre des étapes a) à c) au moins du procédé selon l'invention. Ces systèmes présentent des propriétés particulières inhérentes au fait qu'ils dérivent de cultures clonales. Les kits peuvent par exemple être des kits de diagnostic, des tests d'évaluation d'une activité biologique, des tests de toxicité, etc. Il est bien clair pour l'homme du métier que les termes « test », « kit » et, éventuellement, « système » peuvent être, selon le contexte dans lequel ils sont utilisés ici, équivalents.
Dans un mode de réalisation particulier, un système de culture clonale de cellules épithéliales optimisé pour l'évaluation et l'exploitation des propriétés spécifiques d'une cellule unique, comprend, dans le contexte de l'invention, un support de culture dans lequel au moins une culture clonale est ensemencée avec une cellule épithéliale unique directement extraite d'un échantillon biologique de tissu épithélial conformément aux étapes a) à c) du procédé décrit précédemment.
La présente invention se rapporte également aux applications du procédé et utilisations des divers moyens (système, kit, banque cellulaire, tissu, biopuce) décrits plus haut.
Des exemples préférés de telles utilisations et applications sont :
- pour identifier et sélectionner des agents présentant une activité biologique d'intérêt. Un « agent » peut être une molécule candidate que l'on teste pour son activité biologique et que l'on sélectionne en fonction des applications, ladite activité pouvant être positive (e.g., pour la sélection d'effecteurs d'intérêt pharmaceutique, thérapeutique, cosmétique, etc.) ou négative (e.g., pour la sélection de molécules toxiques). Alternativement, un « agent » peut être de nature non chimique, par exemple les rayons UV, la lumière visible, les rayonnements ionisants, les ondes magnétiques, etc. ;
- pour le traitement et/ou le diagnostic (notamment in vitro) et/ou le pronostic (notamment in vitro) dans le domaine de la thérapie cellulaire et/ou génique, notamment dans le domaine des greffes ; - pour étudier le comportement et/ou les propriétés structurelles et/ou fonctionnelles individuelles spécifiques d'une cellule unique, d'un sous- type cellulaire, d'une sous-population cellulaire, ou d'une population cellulaire ;
- pour réaliser un ou plusieurs outils de génomique fonctionnelle, qui sont notamment utiles pour induire des phénomènes de gain ou perte d'activité biologique, à des fins médicales et/ou dans n'importe quel type d'exploration fonctionnelle. On citera par exemple les ARN interférents, les vecteurs de surexpression et/ou de répression, viraux ou non viraux, etc. ;
- pour évaluer l'efficacité d'agents présentant une activité biologique tels que des molécules d'intérêt pharmaceutique ou cosmétique, et/ou évaluer l'efficacité de traitements à l'aide de tels agents (molécules ou autres types de stimuli, par exemples ondes, lumière, rayonnements, paramètres physiques, etc.).
En définitive, les différents objets de la présente invention présentent, par rapport aux moyens et méthodes actuellement disponibles, les avantages considérables suivants : (i) La possibilité de réaliser des séries de micro-cultures parallèles, initiées à partir d'une cellule unique, ce qui rend possible en pratique la mise en œuvre de campagnes de tests à grande échelle ciblant des sous-populations rares, faiblement représentées au sein des tissus, ce qui n'est pas envisageable dans les modèles classiques, fortement consommateurs en matériel cellulaire.
(ii) La possibilité d'initier des cultures clonales à partir de cellules de phénotype choisi ensemencées individuellement, par exemple en micro- puits, immédiatement après sélection à partir du tissu, ce qui permet d'envisager la mise en place de stratégies de tests sur un matériel cellulaire n'ayant pas subi d'étape de multiplication en culture, et donc moins susceptible d'avoir été modifié par des paramètres artificiels de culture avant la réalisation des tests, en particulier lorsque le traitement ou stimulus est appliqué immédiatement après ensemencement des microcultures.
(iii) Le fait d'avoir, pour la première fois, accès au comportement de cellules placées en culture individuellement, ce qui offre la possibilité de qualifier et quantifier les propriétés biologiques et les réponses spécifiques des différentes cellules constituant une population d'intérêt, permettant l'analyse de l'hétérogénéité cellulaire, ce qui n'est pas possible dans des modèles classiques utilisant de manière globale des populations cellulaires.
Ainsi, les différents objets de la présente invention trouvent une utilité dans de très nombreux domaines. En sus des exemples d'applications déjà décrits plus haut, on pourra notamment citer, de manière non limitative :
(i) Evaluation de l'efficacité d'agents présentant une activité biologique : gains de fonction. • Évaluation de l'efficacité de composés porteurs d'une activité biologique bénéfique (par exemple, molécules d'intérêt pharmaceutique, actifs cosmétiques) :
- Réalisation de campagnes de criblage permettant de quantifier les effets d'actifs biologiques à l'échelle d'une cellule unique isolée : action d'un traitement sur la cellule cible elle-même, impact sur sa descendance.
- Possibilité de développer des stratégies de tests d'évaluation ciblés sur des populations faiblement représentées, telles que les cellules souches normales ou pathologiques.
• Exemples : - test d'effecteurs susceptibles 1 ) d'induire la multiplication des cellules souches ou progénitrices des tissus épithéliaux pluristratifiés, 2) de favoriser un maintien du caractère souche en culture dans la descendance de cellules souches isolées ;
- test de nouvelles molécules anti-cancéreuses sur des cellules souches isolées de carcinomes.
(ii) Problématiques de toxicologie : pertes de fonction, transformation cancéreuse.
• Estimation de l'impact de stress et de toxiques à l'échelle de cellules traitées isolément, après sélection sur la base de critères précis. Ces tests peuvent être appliqués sélectivement aux cellules responsables du renouvellement long terme (cellules souches) et court terme (progéniteurs) des tissus épithéliaux.
• Ils permettent également, suivant le type de cellules ciblées, de concevoir des tests adaptés au pronostic et à la distinction d'effets délétères aigus ou tardifs sur un tissu ou organe : - Réalisation de tests toxicologiques permettant d'estimer l'innocuité d'un traitement ou, au contraire, de quantifier ses effets toxiques : effet à court terme sur la cellule isolée elle-même, conséquences sur sa descendance.
- Évaluation de l'impact d'agressions génotoxiques : à l'échelle de cellules étudiées isolément, acquisitions de dommages à l'ADN, transmission de mutations et/ou d'anomalies génétiques à la descendance, conséquences sur l'organogénèse, etc.
(iii) Technologie des bio-puces : modèles parallèles / massivement parallèles de quantification et qualification de réponses biologiques. - Cribles de génomique fonctionnelle sur des cultures cellulaires bidimensionnelles et/ou des modèles organotypiques tridimensionnels.
- Criblage à haut débit de molécules porteuses d'une activité biologique / mise en évidence de propriétés délétères (« high throughput screening » [HTS]). (iv) Thérapie cellulaire et génique.
• Qualification d'échantillons de cellules destinées à être greffées, et/ou destinées à être utilisées pour la production de greffons de tissus reconstruits :
- Tests en culture permettant d'estimer le potentiel régénératif de cellules destinées à un usage clinique : potentiel de croissance estimé individuellement sur cellules en condition clonale.
- Tests pronostics de la capacité de prise de greffe de tissus reconstruits in vitro : estimation du maintien ou de la perte du potentiel de croissance des cellules utilisées pour la production de greffons. • Validation de protocoles de transfert de gènes à visée clinique :
- Évaluation de l'efficacité d'un protocole de correction génétique : estimation de la fréquence de cellules effectivement corrigées à l'issu du procédé de transfert de gènes.
- Évaluation de la stabilité de la correction génétique : transmission à la descendance de cellules individualisées. (v) Ingénierie cellulaire et tissulaire.
Systèmes cellulaires et modèles organotypiques compatibles avec la mise en œuvre de tests sur cellules suivies isolément et leur descendance :
- Production parallèle de banques de cellules, chacune constituée par la descendance d'une seule cellule placée en culture isolément.
- Modèles de tissus reconstruits in vitro, normaux ou pathologiques, générés à partir de la descendance d'une seule cellule placée en culture en condition clonale.
Les figures suivantes illustrent, en relation avec les exemples ci- dessous, des modes de réalisation de la présente invention :
- Figure 1 : schéma représentant un mode de réalisation du procédé selon l'invention ;
- Figure 2 : représentation graphique des résultats d'une expérience d'expansion à long terme pour la production de banques de kératinocytes multiples, chacune issue de la descendance d'une cellule unique ;
- Figure 3 : résultats d'une expérience de production d'épidermes reconstruits multiples, chacun issu de la descendance d'une cellule unique ; - Figure 4 : résultats de l'évaluation de la croissance clonale court terme de kératinocytes basaux Itgoc6fort placés en culture individuellement ;
- Figure 5 : résultats d'une expérience dans laquelle on a quantifié les cultures à long terme initiées à partir de kératinocytes basaux Itgoc6fort placés en culture individuellement ;
- Figure 6 : représentation graphique des résultats d'une expérience où l'on a quantifié à l'échelle de la cellule unique isolée l'impact d'une irradiation sur des kératinocytes épidermiques de phénotypes distincts ; Figure 7 : résultats d'une expérience dans laquelle on a utilisé le test fonctionnel des micro-cultures clonales parallèles pour évaluer les conséquences d'une irradiation effectuée sur cellule isolée, sur le potentiel de croissance de sa descendance, et dans laquelle on a comparé le comportement de kératinocytes épidermiques de phénotypes distincts ;
- Figures 8A, 8B, 8C : résultat d'une recherche d'anomalies au niveau du chromosome 10 par puces CGH : o Descendance de deux kératinocytes non irradiés : K1 et K2 o Descendance d'un kératinocyte irradié : K3.
Des modes de réalisation particuliers et avantages de la présente invention sont décrits dans les exemples de réalisation ci-dessous, qui portent sur les kératinocytes de l'épiderme in'terfolliculaire humain adulte.
Ces exemples sont fournis à titre purement illustratif ; ils ne limitent en aucune façon l'objet et la portée de l'invention.
EXEMPLES
A- PROCÉDURES EXPÉRIMENTALES
A-1 - Préparation du matériel cellulaire
A-1-1- Cellules épithéliales destinées à être utilisées pour les cultures clonales Les biopsies de tissu, qui sont dans les exemples décrits ici, des biopsies de peau humaine adulte, ont tout d'abord été décontaminées, par exemple par trempage dans une solution physiologique contenant de la bétadine. Afin de permettre la séparation entre le tissu épithélial et le tissu conjonctif associé (dans le cas présent, épiderme et derme), les échantillons ont ensuite été incubés dans une solution enzymatique à 4°C pendant 10 à 15 heures (trypsine Gibco). À l'issue de cette étape de
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) digestion enzymatique, les échantillons de tissu ont été disséqués à l'aide de pinces fines, de manière à isoler la partie épithéliale du tissu (ici, l'épiderme interfolliculaire). Le traitement enzymatique, complété par une étape de dissociation mécanique par aspirations et refoulement à l'aide d'une pipette, permet d'extraire les kératinocytes qui composent les fragments d'épithéliums . La suspension cellulaire a enfin été filtrée sur un tamis d'une maille de 50 à 70 microns (BD Falcon), afin d'éliminer les agrégats de cellules. À l'issue de ces étapes, les échantillons cellulaires se présentent sous la forme de suspensions monocellulaires, utilisables pour l'ensemencement des cultures clonales.
A- 1-2- Fibroblastes utilisés comme cellules de soutien
Dans les exemples décrits, les cellules épithéliales (kératinocytes obtenus à partir d'épiderme interfolliculaire) ont été étudiées en condition clonale dans un système de culture utilisant comme support une couche nourricière de fibroblastes rendus incapables de se multiplier par une irradiation gamma à une dose de 60 Grays. Ainsi, ces cellules restaient statiques mais vivantes, et elles soutenaient la croissance des cellules épithéliales étudiées. Ces fibroblastes peuvent notamment être extraits de la partie dermique de biopsies cutanées. Pour ce faire, des fragments de derme ont été incubés dans une solution enzymatique constituée d'un mélange de dispase (Roche) et de collagénase (Roche) pendant 2 à 4 heures à 37°C. La digestion par les enzymes, combinée à une agitation mécanique, permet l'extraction des fibroblastes. Après élimination des fragments de tissu non digérés par filtration sur un tamis (BD Falcon), puis lavage, les fibroblastes obtenus ont été placés en culture dans un milieu composé de 90% de DMEM (Gibco) et de 10% de sérum d'origine bovine (Gibco), pour être amplifiés. Après multiplication en culture, les fibroblastes ont été irradiés, puis congelés pour être stockés jusqu'à utilisation. A-2- Marquages immuno-phénotypiques
Les cellules épithéliales utilisées pour illustrer certains modes de réalisation de l'invention sont des kératinocytes présentant un fort niveau d'expression de l'intégrine α6 (Itgaβ ou CD49ή et faible niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71 ) : phénotype Itga6fort CD71faιble. Pour la réalisation du marquage à l'aide d'anticorps fluorescents nécessaire pour la définition de ce phénotype, les échantillons cellulaires ont été placés en suspension dans un tampon salin physiologique (PBS) supplémenté de 2% de sérum albumine bovine (SAB) (Sigma), puis incubés pendant 10 minutes à 4°C avec des immunoglobulines de souris (Jackson Immuno-Research), afin de saturer les sites non spécifiques de fixation des anticorps. Le marquage des antigènes CD49f et CD71 a ensuite été effectué par ajout d'anticorps spécifiques couplés à des fluorochromes, puis incubation pendant 30 minutes à 4°C : anti-CD49f-PE (phycoérythrine) (clone GoH3, BD Pharmingen) et anti-CD71 -APC (allophycocyanine) (clone M-A712, BD Pharmingen). Après lavage des anticorps en excès, les échantillons étaient prêts à être utilisés pour l'ensemencement des cultures clonales.
A-3- Ensemencement automatisé des micro-cultures cultures clonales
/4-3-7- Ensemencement
Dans les exemples de réalisations décrits, les micro-cultures clonales de kératinocytes ont été ensemencées de manière automatisée à l'aide d'un cytomètre en flux équipé d'un module de clonage (MoFIo, Cytomation). L'excitation des fluorochromes couplés aux anticorps de marquage a été réalisée en utilisant un laser argon à 488 nm (Cohérent) et une diode laser à 630 nm. Les signaux émis par la phycoérythrine (PE) et l'allophycocyanine (APC) ont été respectivement détectés et quantifiés dans des fenêtres de longueur d'onde de 580 ± 30 nm et 670 ± 30 nm. Le critère de tri choisi dans le cas présent correspondait à des kératinocytes présentant le phénotype Itga6fort CD71faιble et représentant de l'ordre de 1 % des kératinocytes totaux : sous-population de kératinocytes décrite comme étant enrichie en cellules souches épidermiques (Li et al., 1998).
A-3-2- Contrôle qualité des ensemencements clonaux
En parallèle des cultures clonales destinées à être utilisées pour les tests et études (conditions de culture décrites ci-après), des séries d'ensemencements clonaux ont été réalisées dans le but de valider la procédure de dépôt des cellules. Ces dépôts ont été effectués dans des conditions techniques rigoureusement identiques, mais dans un milieu plus favorable au repérage des cellules que celui utilisé pour leur croissance. Ce milieu d'observation peut être, par exemple, un tampon salin physiologique (PBS) additionné de Hoeschst 33342 (Sigma) à une concentration de 10 microgrammes / ml. Le Hoechst est un colorant de l'ADN qui fluoresce sous excitation aux UV. Dans ces conditions, les cellules ensemencées individuellement dans un grand nombre de puits de culture peuvent être repérées, ce qui permet de vérifier l'efficacité du procédé. Chaque micro-culture doit contenir une seule cellule, jamais deux, et la fréquence des puits vides doit être minimisée.
A-4- Conditions de culture
/4-4-7- Croissance clonale primaire Dans les exemples décrits, les micro-cultures clonales de kératinocytes ont été réalisées en plaques de culture comprenant 96 puits dans lesquelles était adsorbé du collagène de type I (Biocoat, Becton- Dickinson). La veille de l'ensemencement des cellules épithéliales en condition clonale, une couche nourricière de fibroblastes irradiés était mise en place dans les puits de culture. Ces cellules de soutien ont été ensemencées à une densité de 6000 cellules / cm2. Le milieu de culture utilisé pour la croissance des kératinocytes avait pour base un mélange de milieu DMEM (Gibco) et de milieu de Ham F12 (Gibco), additionné de sérum d'origine bovine (Hyclone). Ce milieu de base était notamment supplémenté avec de l'EGF (Chemicon), de l'insuline (Sigma), de l'hydrocortisone (Sigma), de l'adénine (Sigma), de la triiodothyronine (Sigma), de la L-glutamine (Gibco), et avec une solution d'antibiotiques et d'antimycotiques (Gibco). Après ensemencement automatisé des kératinocytes à raison d'une cellule unique par puits, les cultures ont été maintenues en culture à 37°C dans une atmosphère comprenant 90% d'humidité, en présence de 5% de CO2, dans le cas présent pendant 2 semaines. Au temps choisi, un comptage des puits dans lesquels un clone cellulaire s'était développé a été effectué, puis le nombre de kératinocytes constituant chaque clone a été déterminé individuellement, après décollement des cellules par trypsination (Gibco).
A-4-2- Étude du potentiel de reconstruction tissulaire
Dans les exemples décrits, le potentiel de reconstruction tissulaire de la descendance des kératinocytes initialement placés en culture individuellement a été mis en évidence dans un modèle de reconstruction épidermique sur derme humain mort dé-épidermisé (Régnier et al., 1986). Pour la préparation des supports dermiques, des échantillons de peau humaine ont été incubés pendant 10 jours à 37°C dans du tampon PBS, afin d'en détacher l'épiderme, qui a été éliminé. Les échantillons de derme exempts d'épiderme ont été coupés en carrés d'environ 1 cm2. Ils ont alors subi plusieurs cycles de congélation/ décongélation successifs qui ont conduit à tuer les cellules dermiques. Les dermes acellulaires obtenus ont été stockés à -200C jusqu'à utilisation. Le processus de reconstruction d'un épiderme tridimensionnel comprenait 2 étapes de cultures successives. Les échantillons cellulaires issus des micro-cultures clonales ont tout d'abord été ensemencés sur les supports dermiques et cultivés pendant 1 semaine en immersion dans un milieu de culture comparable similaire à celui utilisé pour la culture clonale primaire (exemple de composition décrit ci-dessus). La seconde étape du procédé de reconstruction épidermique consistait à placer les épidermes en formation à l'interface entre le milieu liquide et l'air ambiant de l'incubateur. La culture a alors été poursuivie pendant 1 à 2 semaines pour parvenir à une différenciation complète. Les caractéristiques histologiques des tissus tridimensionnels reconstruits ont été visualisées après fixation, coupe et coloration hémalum-éosine-safran (HES).
A-4-3- Évaluation de la capacité d'expansion à long terme
Les kératinocytes issus des micro-cultures clonales ont été décollés par trypsination (Gibco), puis placés en culture de masse, individuellement pour chaque clone étudié. Ces cultures ont été réalisées sur des surfaces plastiques sur lesquelles était adsorbé du collagène de type I (par exemple boites de Pétri, Biocoat, Becton-Dickinson). Les conditions de cultures étaient équivalentes à celles utilisées pour la croissance clonale primaire : couche nourricière de fibroblastes irradiés, milieu de culture de composition similaire. Au bout d'une semaine, les cultures atteignaient 50% à 80% de confluence. Les kératinocytes ont alors été décollés par trypsination, comptés, puis réensemencés à une densité de 2000 à 3000 cellules / cm2, dans des conditions identiques. Les cultures ont ainsi été repiquées et sous-cultivées chaque semaine, jusqu'à épuisement du potentiel d'expansion des cellules. À l'issue de l'étape de la croissance du clone primaire et des sous-cultures successives, la prolifération cellulaire a été estimée en termes de coefficient d'expansion et de nombre de doublements de population effectués, afin de quantifier le potentiel d'expansion total des kératinocytes initialement placés en culture individuellement. Nombre de doublements de population = (Log N/N0)/Log 2 N0 = Nombre de cellules ensemencées
N = Nombre de cellules obtenues à l'issue de l'étape de culture. A-4-4- Analyse de la capacité clonogénigue secondaire
II s'agit d'estimer le maintien ou la perte du potentiel à générer des colonies parmi les cellules constituant la descendance des kératinocytes clones. Pour ce faire, les cellules des clones primaires ont été décollées par trypsination (Gibco), puis ensemencées à faible densité de manière à obtenir une croissance de colonies séparées les unes des autres (par exemple, 5 cellules / cm2) dans des conditions similaires à celles décrites ci-dessus pour l'évaluation du potentiel d'expansion à long terme. Après 14 jours, les cultures ont été fixées à l'aide d'éthanol à 70%, séchées, puis colorées par deux bains successifs dans de l'éosine (Réactifs RAL) et du Bleu RAL 555 (Réactifs RAL). Les paramètres pris en compte pour quantifier la capacité clonogénique des cellules étudiées étaient notamment le nombre et la taille des colonies obtenues.
B- PERFORMANCE DES MOYENS DE L'INVENTION Un paramètre utilisé pour analyser le potentiel de croissance des cellules épithéliales est leur capacité à générer des colonies en culture à faible densité (CFE pour « colony-forming efficiency ») ou des clones lorsqu'il s'agit de cultures ensemencées avec une seule cellule (CFE pour « clone- forming efficiency »). Il est bien évident que plus les procédés permettront de mettre en évidence des valeurs de CFE élevées, plus ils seront utiles pour quantifier efficacement le potentiel de croissance des cellules épithéliales. Le tableau I ci-dessous présente les résultats obtenus selon deux méthodes connues de sélection et culture de kératinocytes (elles sont utilisées classiquement en laboratoire et ont été décrites dans des publications), ainsi que les résultats obtenus selon le procédé de l'invention.
Tableau I
Figure imgf000026_0001
* CFE = % de cellules capables de donner naissance à une colonie (situation de culture à faible densité) ou à un clone (cultures à 1 seule cellule par puits). ** Moyenne calculée sur 3 expériences réalisées à partir d'échantillons indépendants. *** De manière non exclusive.
C- EXEMPLE DE RÉALISATION N°1 Utilisation du modèle des micro-cultures clonales parallèles pour la production de banques de kératinocytes multiples, chacune issue de la descendance d'une cellule unique (Figure 2).
C-1- Matériels et méthodes - Extraction de kératinocytes à partir d'un épiderme issu d'une biopsie cutanée adulte (réduction mammaire), dissociation et mise en suspension. - Marquage des kératinocytes en suspension à l'aide d'anticorps couplés à des fluorochromes permettant de trier un phénotype de cellules "souches" (fort niveau d'expression de l'intégrine α6 (Itgαβ) et faible niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71 ) : phénotype Itga6fort CD71faιble ; modèle de sélection : Li ét al., 1998).
- À l'aide d'un module de clonage par cytométrie en flux, ensemencement automatisé de plaques de culture multi-puits, à raison d'une cellule de phénotype "souche" unique par puits.
- Après 2 semaines de culture, repérage des puits dans lesquels le kératinocyte clone a donné naissance à un clone cellulaire.
- Ensemencement de cultures de masse à partir de chaque micro-culture clonale, dans des conditions favorisant la multiplication cellulaire. - Repiquages successifs des cultures afin d'obtenir la descendance des cellules initiales clonées à différents stades d'amplification (par exemple : état de culture "jeune" ou "âgé"), et une quantité de matériel cellulaire issu des cellules clonées compatible avec la constitution de banques de cellules congelées. - Test du nombre de sous-cultures successives maximal qu'il était possible de réaliser pour chaque culture initiée à partir d'un kératinocyte unique et estimation du nombre total cumulé de kératinocytes produits à l'issue des cultures à long terme.
C-2- Résultats
Sur une cohorte de 5 clones cellulaires testés pour leur aptitude à générer une banque de kératinocytes, tous ont pu être sous-cultivés et leur descendance suffisamment amplifiée pour être congelée.
Deux semaines après l'initiation des cultures, les 5 clones choisis étaient constitués de 8,64x104 à 1 ,11x105 kératinocytes, ce qui équivaut à 16,40 à 16,86 générations cellulaires successives effectuées depuis le stade de la cellule unique clonée.
- 1 clone a généré une descendance cumulée de 8,48x1012 kératinocytes en 8 semaines de multiplication en culture (n°1 ), ce qui équivaut à un cumul de 42,95 doublements moyens de population. - 2 clones ont généré une descendance cumulée de 6,36x1011 et 2,4x1011 kératinocytes (n°2 et n°3), ce qui équivaut respectivement à 39,21 et 37,80 doublements moyens de population.
- 1 clone a généré une descendance cumulée de 2,03x1010 kératinocytes en 6 semaines de multiplication en culture (n°4), ce qui équivaut à un cumul de 34,24 doublements moyens de population. - 1 clone a généré une descendance cumulée de 2,15x109 kératinocytes en 6 semaines de multiplication en culture (n°5), ce qui équivaut à un cumul de 31 ,00 doublements moyens de population.
C-3- Conclusion
- Le modèle des micro-cultures clonales parallèles conforme à la présente invention représente une technologie permettant de générer de manière standardisée de multiples banques de kératinocytes, chacune issue de la descendance d'une cellule unique directement isolée à partir d'un prélèvement tissulaire.
- Il permet également d'estimer et de comparer, à l'échelle de la cellule individuelle, le potentiel de prolifération de types cellulaires distincts (par exemple : progéniteurs, cellules souches épidermiques).
D- EXEMPLE DE RÉALISATION N°2
Utilisation du système des micro-cultures clonales pour la production d'épidermes reconstruits multiples, chacun issu de la descendance d'une cellule unique (Figure 3).
D-1- Matériels et méthodes
- Extraction de kératinocytes à partir d'un épiderme issu d'une biopsie cutanée adulte (réduction mammaire), dissociation et mise en suspension.
- Marquage des kératinocytes en suspension à l'aide d'anticorps couplés à des flurochromes permettant de trier en cytométrie de flux un phénotype de cellules "souches" (fort niveau d'expression de l'intégrine α6 (Itgaβ) et faible niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71 ) : phénotype Itga6fort CD71faιble ; modèle de sélection : Li ét al., 1998).
- À l'aide d'un module de clonage par cytométrie en flux, ensemencement automatisé de plaques de culture multi-puits, à raison d'une cellule de phénotype "souche" unique par puits.
- Après 2 semaines de culture, repérage des puits dans lesquels le kératinocyte clone a donné naissance à un clone cellulaire.
- Utilisation des kératinocytes constituant les clones cellulaires, séparément pour chacun d'entre eux, pour la production d'épidermes reconstruits (par exemple : reconstruction d'un épiderme sur derme humain mort dé-épidermisé : Régnier et al., 1986).
D-2- Résultats Une cohorte de 5 clones cellulaires a été testée pour l'aptitude individuelle de chaque clone à générer un épiderme reconstruit tridimensionnel.
L'expérience a été réalisée à un stade de croissance des clones équivalent à celui décrit dans l'exemple de réalisation n°1 (multiplication correspondant à -16 à 17 générations cellulaires successives).
Les 5 clones testés se sont avérés capables de produire un épiderme présentant une organisation représentative de celle d'un épiderme natif.
D-3- Conclusion
- La technologie des micro-cultures clonales parallèles selon l'invention permet de produire des séries d'épidermes reconstruits dont la particularité est d'être chacun issus de la descendance d'une cellule unique, alors que les modèles classiquement utilisés pour des campagnes de tests à large échelle sont générés à partir de banques issues d'un mélange de cellules.
- Les épidermes reconstruits produits selon le procédé objet de la présente invention sont générés à partir d'une cellule clonée immédiatement après extraction à partir du tissu, et non après une étape de multiplication en culture, susceptible d'en modifier les caractéristiques.
- Dans cet exemple de réalisation, les clones ont été utilisés pour la reconstruction épidermique à un stade de croissance correspondant à -16 à 17 générations cellulaires successives. Dans d'autres modes de réalisation, les reconstructions épidermiques peuvent être réalisées à partir d'un stade plus précoce ou plus tardif de croissance des cellules clonées.
Le modèle de culture selon la présente invention fournit donc un test fonctionnel original permettant de qualifier le potentiel d'organogenèse de cellules initialement placées en culture individuellement, immédiatement à la suite de la sélection à partir du tissu. Il offre la possibilité d'évaluer l'impact d'un stimulus ou d'un stress à différents stades de croissance de cellules placées en culture isolément, puis d'en étudier les conséquences sur la capacité de reconstruction tissulaire à court ou moyen terme après traitement.
E- EXEMPLE DE REALISATION N°3
Utilisation du modèle des micro-cultures clonales parallèles pour caractériser la capacité clonogénique des kératinocytes présents au niveau d'une localisation tissulaire d'intérêt. Il s'agit en particulier d'estimer leur aptitude à donner naissance à un clone cellulaire, dont la taille représente un indicateur de leur potentiel de multiplication à court terme (Figure 4).
E- 1 - Matériels et méthodes - Extraction de kératinocytes à partir d'un épiderme issu d'une biopsie cutanée adulte (réduction mammaire), dissociation et mise en suspension.
- Marquage des kératinocytes en suspension à l'aide d'un anticorps couplé à un fluorochrome permettant de trier une population de kératinocytes correspondant à la couche basale de l'épiderme (fort niveau d'expression de l'intégrine α6 (Itgaβ) : phénotype Itga6fort).
- À l'aide du module de clonage par cytométrie en flux, ensemencement automatisé de plaques de culture multi-puits, à raison d'un kératinocyte basai unique par puits.
- Après 2 semaines de culture, repérage des puits dans lesquels le kératinocyte clone a donné naissance à un clone cellulaire, puis décollement et comptage des kératinocytes, individuellement pour chaque clone. - Classement des différents clones en fonction de leur taille individuelle.
E- 2 - Résultats
L'analyse de la distribution des tailles de clones générés par des kératinocytes issus de la couche basale de l'épiderme, réalisée sur une cohorte de cumulée de -800 clones, révèle l'hétérogénéité fonctionnelle de ce compartiment cellulaire (Figure 4).
- Au sommet de cette hiérarchie, se trouve une fraction minoritaire de clones se caractérisant par une importante capacité de prolifération à court terme, dont la taille peut excéder 15x104 kératinocytes en 2 semaines.
- En bas de la hiérarchie, se trouve une fraction de clones se caractérisant au contraire par une capacité de prolifération très restreinte. La taille de ces clones abortifs n'excède pas 104 kératinocytes après 2 semaines de culture. - Entre ces extrêmes, se trouve la majorité des clones, qui apparaissent distribués suivant un gradient de taille, la valeur taille majoritairement représentée étant située autour de 9x104 kératinocytes.
E- 3 - Conclusion
- La technologie des micro-cultures clonales parallèles selon l'invention permet d'estimer précisément la capacité clonogénique individuelle des cellules d'un échantillon d'intérêt, dans cet exemple de réalisation une préparation de kératinocytes basaux de l'épiderme. - En particulier, la méthode se montre résolutive pour définir un profil de croissance clonale fournissant une 'signature fonctionnelle' représentative d'un tissu, ou d'une sous-localisation au sein d'un tissu, dans le cas présent la couche basale de l'épiderme interfolliculaire humain adulte. - De plus, le système permet de distinguer, au sein d'un échantillon cellulaire d'intérêt, des cellules présentant des potentialités distinctes, en fonction de leur capacité de croissance clonale à court terme.
Le modèle de culture selon la présente invention fournit donc un test fonctionnel original permettant d'estimer la capacité clonogénique de cohortes de cellules placées en culture individuellement. Une application possible est le développement de contrôles qualité réalisés à l'échelle de la cellule individuelle visant à évaluer la fonctionnalité (ou non fonctionnalité) d'échantillons cellulaires d'intérêt, par comparaison avec une référence validée. Le système des micro-cultures clonales offre en outre la possibilité de générer des échantillons cellulaires à partir d'une seule cellule, chacun correspondant individuellement à une capacité de prolifération à court terme précisément définie. Une autre application possible consiste à utiliser le système pour la réalisation d'études visant à analyser les conséquences fonctionnelles à court terme d'un traitement (bénéfique ou toxique) appliqué à l'échelle de la cellule individuelle. F- EXEMPLE DE REALISATION N°4
Utilisation du modèle des micro-cultures clonales parallèles pour caractériser le potentiel de croissance à long terme des kératinocytes d'un échantillon d'intérêt. Il s'agit en particulier de détecter la présence de kératinocytes possédant l'une des propriétés fonctionnelles associées aux cellules souches épidermiques, à savoir la capacité à effectuer au moins 100 doublements de population en culture (Figure 5).
F- 1 - Matériels et méthodes
- Extraction de kératinocytes à partir d'un épiderme issu d'une biopsie cutanée adulte (réduction mammaire), dissociation et mise en suspension. - Marquage des kératinocytes en suspension à l'aide d'un anticorps couplé à un fluorochrome permettant de trier une population de kératinocytes correspondant à la couche basale de l'épiderme (fort niveau d'expression de l'intégrine α6 {Itgaβ) : phénotype Itga6fort).
- À l'aide du module de clonage par cytométhe en flux, ensemencement automatisé de plaques de culture multi-puits, à raison d'un kératinocyte basai unique par puits.
- Après 2 semaines de culture, repérage des puits dans lesquels le kératinocyte clone a donné naissance à un clone cellulaire.
- Ensemencement de cultures de masse à partir d'une cohorte représentative de micro-cultures clonales, dans des conditions favorisant la multiplication cellulaire.
- Repiquages successifs des différentes cultures séparément, chaque semaine, jusqu'à atteinte de la limite le leur potentiel de multiplication individuel. - Évaluation du nombre de sous-cultures successives que chaque culture d'origine clonale était capable de soutenir et estimation du nombre total cumulé de doublements de population effectués à chaque repiquage et à l'issue des cultures à long terme.
F- 2 - Résultats
L'analyse du potentiel de croissance à long terme d'une cohorte de 23 clones issus de kératinocytes basaux révèle l'hétérogénéité de potentiel marquée de ce compartiment (Figure 5). - En bas de la hiérarchie de potentiel observée, se trouvent des clones possédant un potentiel de croissance restreint, ne pouvant être maintenus en culture que durant 6 à 7 semaines et seulement capables d'effectuer un total de 30 à 40 doublements de population.
- En haut de la hiérarchie de potentiel, se trouvent des clones possédant un potentiel de croissance très important, pouvant être sous- cultivés durant plus de 24 semaines sans réduction notable de leur capacité de croissance et ainsi capables de dépasser le niveau d'expansion de 100 doublements de population.
- Entre ces extrêmes, se trouvent des clones distribués selon un large gradient de potentiel, pouvant être sous-cultivés durant 9 à 18 semaines, et majoritairement capables d'effectuer 40 à 80 doublements de population.
F- 3 - Conclusion
- La technologie des micro-cultures clonales parallèles selon l'invention permet d'estimer précisément l'étendue du potentiel de croissance à long terme des cellules d'un échantillon d'intérêt, dans cet exemple de réalisation une préparation de kératinocytes basaux de l'épiderme. - En particulier, la méthode se montre résolutive pour distinguer a posteriori des clones générés à partir d'une cellule souche, grâce à leur capacité à effectuer un cumul d'au moins 100 doublements de population, de clones issus d'une cellule progénitrice, dont la capacité de prolifération à long terme est plus limitée, généralement comprise entre 30 et 80 doublements de population.
- Le système permet de générer des échantillons cellulaires correspondant à la descendance de cellules souches et de cellules progénitrices, dont les propriétés peuvent être étudiées et comparées à différentes phases de leur prolifération à long terme.
Le modèle de culture selon la présente invention fournit donc un test fonctionnel original permettant de qualifier le potentiel de croissance à long terme de cellules initialement placées en culture individuellement. Il offre par exemple la possibilité d'estimer le potentiel régénératif d'un échantillon, notamment en évaluant la présence (ou l'absence) de cellules souches. Une utilisation possible consiste à réaliser des études visant à analyser les conséquences fonctionnelles à long terme d'un traitement (bénéfique ou toxique) appliqué à l'échelle de la cellule individuelle.
G- EXEMPLE DE RÉALISATION N°5
Utilisation du test fonctionnel des micro-cultures clonales parallèles pour quantifier à l'échelle de la cellule unique isolée l'impact d'une irradiation sur des kératinocytes épidermiques de phénotypes distincts (Figure 6).
G-1 - Matériels et méthodes
- Extraction de kératinocytes à partir d'un épiderme issu d'une biopsie cutanée adulte (réduction mammaire), dissociation et mise en suspension.
- Marquage des kératinocytes en suspension à l'aide d'anticorps couplés à des flurochromes permettant de trier en cytométrie de flux un phénotype de cellules "souches" (fort niveau d'expression de l'intégrine α6 (Itgaβ) et faible niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71 ) : phénotype Itga6fort CD71faιblθ) et un phénotype de "cellules progénitrices" (fort niveau d'expression de l'intégrine α6 {Itgaβ) et fort niveau d'expression du récepteur de la transferrine (CD71 ) : phénotype Itga6fort CD71fort) (modèle de sélection : Li et al., 1998).
- À l'aide d'un module de clonage par cytométrie en flux, ensemencement automatisé de plaques de culture multi-puits, à raison d'une cellule unique par puits, et ce, pour chacun des deux phénotypes cellulaires étudiés.
- Vingt heures après ensemencement, irradiation de chaque cellule isolée, à une dose unique de 2 Gy (rayonnements γ).
- Après 2 semaines de culture, comptage des puits dans lesquels un clone cellulaire s'était développé, puis décollement et comptages des kératinocytes, individuellement pour chaque clone.
G-2- Résultats
G-2-1- Impact de l'irradiation sur la capacité clonogénique des kératinocytes isolés (Figure 6A)
En condition contrôle (sans irradiation), les deux phénotypes de kératinocytes testés montraient une forte capacité à générer un clone cellulaire. Ils ne se distinguaient pas de manière notable sur ce critère.
- 70,3% des kératinocytes de phénotype Itgα6fort CD71faιblθ (sous- population enrichie en cellules souches) ensemencés individuellement ont donné naissance à un clone cellulaire.
- 61 ,7% des kératinocytes de phénotype Itgα6fort CD71fort (sous-population composée de progéniteurs) ont généré un clone.
Les kératinocytes des deux phénotypes étaient en revanche affectés de manière différente par l'irradiation.
- Le pourcentage de kératinocytes de phénotype Itgα6fort CD71faιble donnant naissance à un clone était abaissé de 70,3% (condition contrôle) à 47,3% (irradiation 2 Gy), ce qui a permis d'estimer le maintien de la capacité clonogénique de ces cellules à 67,3%.
- La capacité clonogénique des kératinocytes de phénotype Itga6fort CD71fort était diminuée de manière plus drastique par l'irradiation : 61 ,7% de cellules donnant naissance à un clone en condition contrôle versus 23,0% en condition d'irradiation, ce qui a permis d'estimer un maintien de la capacité clonogénique à seulement 37,3%.
G-2-2- Impact de l'irradiation sur le potentiel de croissance des clones (Figure 6B)
En condition contrôle, la taille des clones produits ne s'est pas non plus avérée être un critère permettant de distinguer nettement les deux types de kératinocytes étudiés.
- Les kératinocytes des deux phénotypes se sont montré capables de générer une proportion importante de clones de taille importante, comprenant au moins 5x104 kératinocytes.
L'analyse des distributions de la taille des clones obtenus a fourni des paramètres permettant de distinguer clairement les réponses spécifiques à l'irradiation des kératinocytes de phénotypes distincts. - Réduction modérée de la capacité des kératinocytes Itgα6fort CD71faιble clones à générer des clones de grande taille suite à l'irradiation (taille médiane des clones en condition contrôle : 10,1x104 cellules / clone ; taille médiane pour le groupe irradié : 6,8x104 cellules / clone).
- Réduction fortement marquée de la capacité des kératinocytes Itgα6fort CD71fort à produire des clones de grande taille suite à l'irradiation (taille médiane des clones, groupe contrôle : 8,5x104 cellules / clone ; taille médiane pour le groupe irradié : 1 ,2x104 cellules / clone).
G-3- Conclusion - Le modèle des micro-cultures clonales parallèles selon l'invention se montre performant pour analyser la capacité de croissance de kératinocytes de phénotypes précis à l'échelle de la cellule individuelle. En effet, les valeurs d'efficacités clonogéniques obtenues dans ce modèle, atteignant 60 à 70% des cellules clonées, s'avèrent très supérieures à ce qui est généralement décrit dans des systèmes de culture conventionnels, concernant des kératinocytes directement issus d'une biopsie de tissu, pour lesquels les valeurs sont de l'ordre de 10%.
- Ce modèle s'avère également performant pour détecter, qualifier et quantifier un effet délétère sur le potentiel de croissance cellulaire. Le présent exemple illustre l'aptitude du système à être valorisé par le développement de tests in vitro de radio-toxicologie.
H- EXEMPLE DE RÉALISATION N°6 Utilisation du test fonctionnel des micro-cultures clonales parallèles pour évaluer les conséquences de l'irradiation d'une cellule unique sur le potentiel de croissance de sa descendance. Comparaison du comportement de kératinocytes épidermiques de phénotypes distincts (Figure 7).
H-1- Matériels et méthodes
À la suite de la procédure décrite dans le cadre de l'exemple de réalisation n°5 :
- Ensemencement à faible densité d'une partie des kératinocytes issus des clones, de manière à obtenir des colonies individualisées : dans cet exemple, densité de 5 kératinocytes / cm2.
- Après 2 semaines de culture, fixation et coloration des colonies, de manière à pouvoir effectuer une observation microscopique et macroscopique.
H-2- Résultats En condition contrôle (sans irradiation des cellules initiales placées en culture individuellement), les groupes de clones testés pour leur aptitude à générer des colonies secondaires ont montré des caractéristiques très similaires pour ce critère. - La capacité à produire des colonies secondaires des 2 séries de clones, respectivement issus de kératinocytes Itga6fort CD71faιblθ [clones (1 ) à (5)] et de kératinocytes Itga6fort CD71fort [clones (11 ) à (15)], s'est avérée comparable.
- Ces 2 groupes comprenaient à la fois des clones cellulaires donnant naissance en abondance à des colonies secondaires de grande taille [par exemple : clones (1 ) et (11 )] et des clones donnant naissance à des colonies peu abondantes et de petite taille [par exemple : clones (5) et (15)].
Pour ce qui était des groupes des clones issus d'une cellule ayant subi une irradiation (dose unique 2 Gy), l'aptitude à générer des colonies secondaires s'est avérée clairement distincte pour les 2 phénotypes de kératinocytes testés.
- Le groupe de clones issus de kératinocytes Itga6fort CD71faιble [clones (6) à (10)] montrait une capacité à produire des colonies secondaires équivalente à celle des groupes non irradiés.
- En revanche, le groupe de clones issus de kératinocytes Itga6fort CD71fort ayant subi une irradiation [clones (16) à (20)] montrait une capacité clonogénique secondaire diminuée (pertes des colonies de diamètre > 5 mm).
H-3- Conclusion
Le modèle des micro-cultures clonales parallèles selon la présente invention est adapté pour mettre en évidence, qualifier et quantifier, les conséquences non immédiates d'une irradiation réalisée sur des kératinocytes étudiés individuellement. Dans le cas présent, l'effet délétère mis en évidence était une perte de capacité de croissance mesurée sur la descendance des cellules placées en culture clonale.
I- EXEMPLE DE REALISATION N°7
Utilisation du modèle des micro-cultures clonales parallèles pour analyser les conséquences à long terme d'un stress génotoxique appliqué sur des cellules placées en condition clonale. Il s'agit d'appliquer un stress quelques heures après ensemencement des cellules individuellement dans des puits de culture séparés, puis d'initier des cultures à long terme après que les cellules se sont divisées. La présence d'anomalies au niveau du génome est alors recherchée au niveau de la descendance des cellules clonées, après que celle-ci a effectué un nombre de doublement de population déterminé. Cette recherche est par exemple réalisée en utilisant une technique permettant de mettre en évidence les déséquilibres de représentation de séquences d'ADN dans le génome (délétions, amplifications) : l'hybridation génomique comparative (CGH) (Figure 8).
1-1 - Matériels et méthodes
- Extraction de kératinocytes à partir d'un épiderme issu d'une biopsie cutanée adulte (réduction mammaire), dissociation et mise en suspension.
- Marquage des kératinocytes en suspension à l'aide d'un anticorps couplé à un fluorochrome permettant de trier une population de kératinocytes correspondant à la couche basale de l'épiderme (fort niveau d'expression de l'intégrine α6 {Itgaβ) : phénotype Itga6fort).
- À l'aide du module de clonage par cytométhe en flux, ensemencement automatisé de plaques de culture multi-puits, à raison d'un kératinocyte basai unique par puits. - Séparation des micro-cultures clonales en 2 groupes : 1 ) groupe soumis à une dose unique de 2 Grays de rayonnement gamma 19 heures après ensemencement ; 2) groupe contrôle non irradié.
- Après 2 semaines de culture, pour chacun des 2 groupes, repérage des puits dans lesquels le kératinocyte clone a donné naissance à un clone cellulaire.
- Ensemencement de cultures de masse à partir de cohortes de micro-cultures clonales représentatives de chacun des 2 groupes, dans des conditions favorisant la multiplication cellulaire. - Repiquages successifs des différentes cultures séparément, chaque semaine, jusqu'à atteinte de la limite le leur potentiel de multiplication individuel.
- Évaluation du nombre de sous-cultures successives que chaque culture d'origine clonale était capable de soutenir et estimation du nombre total cumulé de doublements de population effectués à chaque repiquage et à l'issue des cultures à long terme.
- Parmi des groupes contrôles et irradiés, sélection de cultures montrant une capacité de prolifération à long terme très importante, notamment capables d'effectuer au moins 150 doublements de population.
- Pour chaque candidat choisi, préparation d'échantillons d'ADN génomique correspondant à un stade tardif de prolifération à long terme, dans le cas présent les cultures ayant effectué de l'ordre de 150 doublements de population après ensemencements clonaux. - Sur les échantillons d'ADN générés, issus des groupes contrôles et irradiés, recherche de zones du génome présentant des anomalies de type délétion et/ou amplification par hybridation génomique comparative (CGH) versus ADN de référence (puces CGH Constitutional Chip® 4.0, PerkinElmer, Inc ; selon procédé recommandé par le fabricant).
I-2 - Résultats L'analyse cytogénétique par puces CGH des cultures à long terme d'origine clonale montre que la dose de rayons gamma étudiée de 2
Grays a pour conséquence l'acquisition d'anomalies chromosomiques transmises à la descendance, qui s'avèrent détectables un grand nombre de divisions cellulaires après application du stress génotoxique (Figure 8).
- Dans l'exemple présenté, une amplification d'un locus d'une taille de 44,3 Méga bases situé sur le chromosome 10 (région 10q11.21 - 10q23.1 ) est détectée au niveau de l'ADN de la descendance d'un kératinocyte, 150 doublements de population après que celui-ci ait été irradié.
- En revanche, ce même segment génomique étudié au niveau de l'ADN de la descendance de 2 exemples de kératinocytes n'ayant pas été irradiés ne présente pas ce type d'altération du génome.
1-3 - Conclusion
- La technologie des micro-cultures clonales permet de soumettre des kératinocytes basaux de l'épiderme individuellement à un stress génotoxique, dans le cas présent une irradiation gamma, puis d'en évaluer les conséquences à long terme sur la descendance. - En particulier, la méthode se montre valide pour analyser à l'échelon clonal, l'impact d'un stress sur l'intégrité du génome des kératinocytes basaux.
- Dans cet exemple de réalisation, le système permet de mettre en évidence un effet génotoxique d'une irradiation gamma sur des kératinocytes issus de la couche basale de l'épiderme.
Le modèle de culture selon la présente invention fournit donc un système original permettant de réaliser des tests de toxicologie à l'échelle de la cellule individuelle. Il offre par exemple la possibilité de caractériser la sensibilité individuelle des kératinocytes basaux de l'épiderme aux agents génotoxiques. Une utilisation possible est la réalisation de tests visant à détecter l'apparition d'anomalies au niveau du génome de type délétions et/ou amplifications, conséquemment à une exposition à un toxique, et analyser leur transmission à la descendance au cours des divisions cellulaires successives, en particulier sur le long terme.
REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Système de culture clonale de cellules épithéliales optimisé pour l'évaluation et l'exploitation des propriétés spécifiques d'une cellule unique, dans lequel un support de culture comprend au moins une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale unique directement extraite d'un échantillon biologique de tissu épithélial sain ou malade.
2. Système selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit support de culture comprend au moins deux cultures clonales parallèles, chacune desdites cultures étant ensemencée avec une cellule épithéliale distincte et unique directement extraite dudit échantillon biologique.
3. Système selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme de biopuce.
4. Procédé de culture clonale de cellules épithéliales optimisé pour l'évaluation et l'exploitation des propriétés spécifiques d'une cellule unique, comprenant au moins les étapes consistant à : a) extraire une ou plusieurs cellules épithéliales directement à partir d'un échantillon biologique de tissu épithélial sain ou malade ; b) facultativement, sélectionner au moins une population et/ou sous-population de cellules épithéliales parmi les cellules extraites à l'étape a) ; c) réaliser une culture clonale ensemencée avec une cellule épithéliale distincte et unique directement issue de l'étape a) ou b) ; et d) évaluer qualitativement et/ou quantitativement la croissance cellulaire dans la culture clonale de l'étape c).
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape e) consistant à amplifier la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), ou sa descendance, par une ou plusieurs sous-cultures successives.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape f) consistant à utiliser la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), ou sa descendance, pour reconstruire un tissu tridimensionnel, de manière à évaluer son potentiel de reconstruction tissulaire.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape g) consistant à sous- cultiver la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), dans des conditions favorisant l'expansion cellulaire jusqu'à épuisement du potentiel d'expansion, de manière à évaluer le potentiel d'expansion à long terme de ladite population cellulaire.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape h) consistant à évaluer le potentiel clonogénique de la descendance de la population cellulaire de la culture clonale de l'étape c), à l'aide d'un test quantitatif de clonogénicité dans lequel on réalise des cultures secondaires strictement clonales et/ou des cultures à faible densité permettant la croissance de colonies individualisées.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que l'étape c) comprend la réalisation d'au moins deux cultures clonales parallèles, chacune desdites cultures étant ensemencée avec une cellule épithéliale distincte et unique directement issue de l'étape a) ou b).
10. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique de tissu épithélial est obtenu par biopsie chez un mammifère, de préférence chez l'homme.
11. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10, ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que ledit tissu épithélial est choisi parmi les épithéliums, par exemple l'épiderme interfolliculaire de peau humaine adulte ou néonatale, la cornée, les muqueuses, les follicules pileux.
12. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, 10 et 11 , ou procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 11 , caractérisé en ce que la ou les cellules épithéliales directement extraites dudit échantillon biologique est(sont) une(des) cellule(s) saine(s) ou malade(s) unique(s) choisie(s) parmi les cellules progénitrices, les cellules souches, les kératinocytes.
13. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est obtenu par la mise en œuvre des étapes a) à c) au moins du procédé selon la revendication 4.
14. Banque cellulaire clonale susceptible d'être obtenue à l'issue de l'étape e) du procédé selon la revendication 5.
15. Tissu tridimensionnel reconstruit à partir d'une culture clonale susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape f) du procédé selon la revendication 6.
16. Tissu selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les épithéliums, la peau, l'épiderme.
17. Biopuce comprenant au moins un tissu selon la revendication 15 ou 16.
18. Utilisation :
- du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou
- de la banque cellulaire selon la revendication 14, ou
- du tissu selon la revendication 15 ou 16, ou - de la biopuce selon la revendication 17, ou application du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, pour identifier et sélectionner des agents présentant une activité biologique d'intérêt.
19. Utilisation :
- du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou
- de la banque cellulaire selon la revendication 14, ou
- du tissu selon la revendication 15 ou 16, ou - de la biopuce selon la revendication 17, ou application du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, pour le diagnostic in vitro et/ou le pronostic in vitro dans le domaine de la thérapie cellulaire et/ou génique, notamment dans le domaine des greffes.
20. Utilisation :
- du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou
- de la banque cellulaire selon la revendication 14, ou - du tissu selon la revendication 15 ou 16, ou
- de la biopuce selon la revendication 17, ou application du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, pour étudier le comportement et/ou les propriétés structurelles et/ou fonctionnelles individuelles spécifiques d'une cellule, d'un sous-type cellulaire, d'une sous-population cellulaire, ou d'une population cellulaire.
21. Utilisation :
- du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou
- de la banque cellulaire selon la revendication 14, ou - du tissu selon la revendication 15 ou 16, ou
- de la biopuce selon la revendication 17, ou application du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, pour réaliser un ou plusieurs outils de génomique fonctionnelle.
22. Utilisation :
- du système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 10 à 13, ou
- de la banque cellulaire selon la revendication 14, ou
- du tissu selon la revendication 15 ou 16, ou - de la biopuce selon la revendication 17, ou application du procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, pour évaluer l'efficacité ou l'impact de traitements, notamment par des agents présentant une activité biologique, des stress, des toxiques, des agressions génotoxiques.
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