JP6182728B2 - 幹細胞を標的とした薬効及び毒性の評価法 - Google Patents
幹細胞を標的とした薬効及び毒性の評価法 Download PDFInfo
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Description
下記の発明は、以上の成果及び考察に基づく。
[1]毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーの発現又は活性を指標とした、毛髪又は皮膚に対する薬効又は皮膚毒性の評価法。
[2]老化関連マーカーがSenescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal)、、p53、p16、p21、p15、p18、p19及び/又はp27である、[1]に記載の評価法。
[3]毛髪又は皮膚に対する薬効が、脱毛、白髪、又は角化異常及び表皮層の肥厚化を伴う肌荒れに対する予防又は治療効果である、[1]又は[2]に記載の評価法。
[4]以下のステップ:
(1)複数匹の同種同系非ヒト哺乳動物を用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(2)試験群に対して被験物質を投与するステップ;
(3)ステップ(2)後の試験群と、被験物質を投与しないこと以外は試験群と同様の処置を施した対照群について、毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ;及び
(4)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群において老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の有効性の指標となるステップ;
を含む、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の評価法。
[5]以下のステップ:
(i)生体から採取された毛根組織又はヒト若しくは非ヒト哺乳動物皮膚3次元モデルを用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(ii)試験群を被験物質の存在下で培養するステップ;
(iii)ステップ(ii)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ;及び
(iv)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群において老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の有効性の指標となるステップ;
を含む、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の評価法。
[6]以下のステップ:
(I)複数匹の同種同系非ヒト哺乳動物を用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(II)試験群に対して被験物質を投与するステップ;
(III)ステップ(II)後の試験群と、被験物質を投与しないこと以外は試験群と同様の処置を施した対照群について、毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ;及び
(IV)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の毒性を判定するステップであって、試験群において老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の毒性の指標となるステップ;
を含む[1]又は[2]に記載の評価法。
[7]以下のステップ:
(a)皮膚ケラチノサイトを用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(b)試験群を被験物質の存在下で培養するステップ;
(c)ステップ(b)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、皮膚ケラチノサイトでの老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ;及び
(d)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性又は毒性を判定するステップであって、試験群において老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の有効性又は毒性の指標となるステップ;
を含む、毛髪又は皮膚に対する薬効又は皮膚毒性の評価法。
[8]以下のステップ:
(A)皮膚ケラチノサイトを用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(B)老化を誘導する条件下且つ被験物質の存在下で試験群を培養するステップ;
(C)ステップ(B)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、皮膚ケラチノサイトでの老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ;及び
(D)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性又は毒性を判定するステップであって、試験群と対照群の間で老化関連マーカーの発現又は活性に相違を認めることが被験物質の有効性又は毒性の指標となるステップ;
を含む、毛髪又は皮膚に対する薬効又は皮膚毒性の評価法。
[9]老化関連マーカーがSA-β-gal、p53、p16、p21、p15、p18、p19及び/又はp27である、[7]又は[8]に記載の評価法。
[10]老化関連マーカーがエンドセリンである、[7]又は[8]に記載の評価法。
[11]エンドセリンがエンドセリン1、エンドセリン2及び/又はエンドセリン3である、[10]に記載の評価法。
[12]毛髪又は皮膚に対する薬効が、脱毛、白髪、又は角化異常及び表皮層の肥厚化を伴う肌荒れに対する予防又は治療効果である、[7]〜[11]のいずれか一項に記載の評価法。
[13]皮膚ケラチノサイトが不死化皮膚ケラチノサイトである、[7]〜[12]のいずれか一項に記載の評価法。
[14]不死化皮膚ケラチノサイトがHaCaT細胞である、[13]に記載の評価法。
[15]皮膚ケラチノサイトが初代培養ケラチノサイトである、[7]〜[12]のいずれか一項に記載の評価法。
[16]以下のステップ:
(5)[1]〜[5]、[7]〜[15]のいずれか一項に記載の評価法によって有効性を示した被験物質を有効な物質として選抜するステップ、
を含む、脱毛、白髪、又は角化異常及び表皮層の肥厚化を伴う肌荒れの予防又は治療に有効な物質のスクリーニング方法。
in vivo評価法では、典型的には、以下のステップ(1)〜(4)を実施する。
(1)複数匹の同種同系非ヒト哺乳動物を用意し、試験群と対照群に分けるステップ
(2)試験群に対して被験物質を投与するステップ
(3)ステップ(2)後の試験群と、被験物質を投与しないこと以外は試験群と同様の処置を施した対照群について、毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ
(4)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群において老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の有効性の指標となるステップ
ex vivo評価法では、毛根組織の培養技術(毛根オーガンカルチャー)を利用する。典型的には、以下の(i)〜(iv)のステップを行う。
(i)生体から採取された毛根組織又はヒト若しくは非ヒト哺乳動物皮膚3次元モデルを用意し、試験群と対照群に分けるステップ
(ii)試験群を被験物質の存在下で培養するステップ
(iii)ステップ(ii)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ
(iv)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群において、老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の有効性の指標となるステップ
(I)複数匹の同種同系非ヒト哺乳動物を用意し、試験群と対照群に分けるステップ
(II)試験群に対して被験物質を投与するステップ
(III)ステップ(II)後の試験群と、被験物質を投与しないこと以外は試験群と同様の処置を施した対照群について、毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ
(IV)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の毒性を判定するステップであって、試験群において老化関連マーカーの発現又は活性の変化(例えば発現又は活性の促進)を認めることが被験物質の毒性の指標となるステップ
本発明は更にin vitro評価法も提供する。in vitro評価法では皮膚ケラチノサイトを利用し、毛髪又は皮膚に対する薬効又は皮膚毒性を評価する。一態様では、典型的には、以下の(a)〜(d)のステップを行う。
(a)皮膚ケラチノサイトを用意し、試験群と対照群に分けるステップ
(b)試験群を被験物質の存在下で培養するステップ
(c)ステップ(b)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、皮膚ケラチノサイトでの老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ
(d)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群において老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の有効性又は毒性の指標となるステップ
(A)皮膚ケラチノサイトを用意し、試験群と対照群に分けるステップ
(B)老化を誘導する条件下且つ被験物質の存在下で試験群を培養するステップ
(C)ステップ(B)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、皮膚ケラチノサイトでの老化関連マーカーの発現又は活性を検出するステップ
(D)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群と対照群の間で老化関連マーカーの発現又は活性に相違を認めることが被験物質の有効性又は毒性の指標となるステップ
1.免疫組織化学
(1)p16陽性細胞の検出
皮膚を採取し4%PFA液中にて4℃で一晩固定した。4μmのパラフィン切片を作製し、1/1200希釈したp16マウスモノクローナル抗体 (Santacruz biotechnology, California, USA)を滴下し4℃で一晩反応させた。2次抗体反応および3.3’-diaminobenzidine chromogenによる発色は、EnVision System-HRP (DAKO, California, USA)キットを用いて行った。
皮膚を採取し4%PFA液中にて4℃で一晩固定し、4μmのパラフィン切片を作製し、1/1200希釈したp16マウスモノクローナル抗体(Santacruz biotechnology, California, USA)と1/1000に希釈したCK15 ニワトリ抗体(Covance, California, USA)、あるいは、1/500に希釈したDctヤギ抗体(Santacruz biotechnology, California, USA)を滴下、4℃で一晩反応させた。二次抗体は、Alexa594-抗マウス抗体、Alexa488-抗ニワトリ抗体、Alexa488-抗ヤギ抗体(Invitrogen, Oregon, USA)を用い、室温で10分反応させた。二次抗体の希釈率は、すべて1/1000とした。核は、4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)を用いて染色した。
皮膚を採取し4%PFA液中にて4℃で一晩固定した。4μmのパラフィン切片を作製し、1/100希釈したp53ウサギ抗体 (Santacruz biotechnology, California, USA)を滴下し4℃で一晩反応させた。2次抗体反応および3.3’-diaminobenzidine chromogenによる発色は、EnVision System-HRP (DAKO, California, USA)キットを用いて行った。
採取した皮膚を0.25%グルタルアルデヒド溶液にて4℃で一晩固定した。凍結切片を作製したのち、pH6に調整されたX-gal溶液中で37℃にて一晩反応させた。反応液はSenescence Detection Kit(Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan)のプロトコールに従って調整した。ヘマトキシリンにより核染色を行った。
1.SA-β-gal活性の検出
SA-β-gal活性を調べた。その結果、加齢性の脱毛及び白髪化がみられる12ヶ月齢マウスでは、毛根バルジに存在する約5%(白毛毛根)及び約3%(脱毛毛根)のSA-β-gal陽性細胞が観察された(図1)。1ヶ月齢のマウスの毛根バルジ領域ではSA-β-gal陽性細胞検出されなかった(図1)。
SA-β-galと共に細胞老化関連マーカーとして良く用いられているp53発現を調べたところ、SA-β-galと同様、毛根バル時領域で検出された(図2A)。1ヶ月齢の黒毛毛根では、バルジ領域におけるp53陽性細胞の割合は1.3%であったのに対し、12ヶ月齢の白毛毛根では20.5%、脱毛毛根では18.7%であった。12ヶ月齢マウスの白毛および脱毛毛根におけるp53陽性細胞の割合は、1ヶ月齢のマウスの黒毛毛根におけるp53陽性細胞の割合に比べて有意に高かった(図2B)。もうひとつの細胞老化関連マーカーであるp16陽性細胞のバルジ領域における割合は、12ヶ月齢マウスでは、34.3%(白毛毛根)及び51.4%(脱毛毛根)であった (図3A)。一方、1ヶ月齢のマウスの黒毛毛根におけるp16陽性細胞の割合は5.3%(黒毛毛根)であった (図3A)。12ヶ月齢マウスの白毛および脱毛毛根におけるp16陽性細胞の割合は、1ヶ月齢のマウスの黒毛毛根におけるP16陽性細胞の割合に比べて有意に高かった(図3B)。
毛根ケラチノサイトの老化と加齢性の脱毛及び白髪化との関連を明らかにするために、まずは毛根ケラチノサイト幹細胞の老化の進行と毛根ケラチノサイト幹細胞の数との相関を調べた。その結果、毛根ケラチノサイト幹細胞の老化と毛根ケラチノサイト幹細胞の数の間に負の相関が認められた(図5A)。次に、毛根ケラチノサイト幹細胞の老化と白髪化との相関を調べたところ、毛根ケラチノサイト幹細胞の老化と白髪率との間に正の相関が認められた(図5B)。
12ヶ月齢のマウスの皮膚では、角質層の重層および錯角化等の角化異常および表皮層の肥厚化を伴う肌荒れ(接触性皮膚炎様皮膚障害、乾皮症性湿疹様皮膚障害、尋常性乾癬様皮膚障害等)が観察された(図6、7)。そこで、角化異常および表皮層の肥厚化がみられた皮膚におけるp16の発現を免疫染色により調べた。その結果、1ヶ月齢の正常皮膚では、p16陽性細胞はほとんど検出されなかったのに対し(図7A, a)、12ヶ月齢の角化異常を伴う皮膚では、毛根バルジ領域にp16陽性細胞が検出された(図7B, b, c, d)。
加齢に伴って発症した白髪毛根及び脱毛毛根のバルジ領域に存在するケラチノサイト幹細胞において細胞老化関連マーカー(SA-β-gal、p53、p16)陽性シグナルが観察された。また、p16陽性の老化細胞の数の増加に伴い、ケラチノサイト幹細胞の減少、白髪率の増加が確認された。これらの結果より、バルジ領域のケラチノサイト幹細胞の老化が、ケラチノサイト幹細胞の消失を伴う脱毛・白髪化に関連することが示唆された。
1.HaCaT細胞における過酸化水素曝露実験
0.25 x 105 cellsのHaCaT細胞 (Boukamp P, et al. J Cell Biol 106: 761-771, 1988)を10%ウシ胎児血清(FBS)含有Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)が3ml入った6ウェルプレートに播種した。6時間後に10%FBS-DMEM培地を除き、1%FBS-DMEM培地に置き換えた。24時間後、0μM、60μM、あるいは360μMの過酸化水素を含有した1%FBS-DMEM培地に置き換え、2時間インキュベートした。
過酸化水素処理したHaCaT細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗った後、2% パラホルムアルデヒド/PBS溶液を用いて、4℃にて15分間固定した。固定後、HaCaT細胞を0.1% tween20含有PBSにて3回洗った後、0.2%ゼラチン含有1%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS溶液により、室温で30分間ブロッキング処理を行った。抗p16 マウスポリクローナル抗体 (1:1000, Santacruz, CA, USA)、および抗エンドセリン1/2/3抗体 (1:100, santacruz, CA, USA)を4℃で一晩反応させた後、2次抗体として、Alexa Fluor 594抗ウサギIgG、およびAlexa Fluor 488抗マウスIgG (1:1000, Invitrgen, Oregon, USA)を室温で10分反応させた。核染色には、4',6-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI) (和光純薬工業株式会社)を用いた。
蛍光細胞免疫染色によって染色された蛍光シグナル強度の定量は、WinRoof画像解析ソフト(三谷商事株式会社)を用いて行った(Ohgami et al., PNAS, 2010)。
0μMあるいは360μMの過酸化水素で処理したHaCaT細胞の培地を無血清DMEMに置き換え、3日間培養した後、上清を回収した。Endothelin EIA Kit (Cayman, MI, USA)を用いて上清中に分泌されたエンドセリン1/2/3タンパク量の測定を行った。酵素基質反応産物は、マイクロプレートリーダー(Bio Rad, model 680)を用いて定量した。
初代培養ケラチノサイトでは、分裂回数が限界に達すると老化することが知られている(David Bernard et al., CANCER RESEARCH 64, 472-481, 2004))。そこで、初代培養ケラチノサイトの継代培養を繰り返したところ、SA-β-gal陽性の細胞が出現した(図8A)。さらに、細胞老化は、紫外線、酸化剤、放射線等によっても誘発される事が知られている(Xiao-Yong Wang et al., Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine 27, 203-212, 2011; David Bernard et al., Cancer Research 64, 472-481, 2004)。本試験では、簡便かつ最も主要な酸化剤として知られる過酸化水素を用いて、HaCaTに細胞老化を誘導できるかどうか検討した。HaCaT細胞に0μM、60μM、あるいは360μMの過酸化水素を2時間作用させ、細胞老化マーカーのひとつであるp16陽性細胞の割合を調べた。p16陽性細胞の割合は、過酸化水素処理をしていないコントロールのものと比較し、60μM過酸化水素の曝露では約1.4倍、360μM過酸化水素の曝露では約2倍と濃度依存的に増加した(図8B)。
Claims (8)
- 毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーSenescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal)、p53又はp16、の発現又は活性を指標とした、脱毛又は白髪に対する薬効の評価法。
- 以下のステップ:
(1)複数匹の同種同系非ヒト哺乳動物を用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(2)試験群に対して被験物質を投与するステップ;
(3)ステップ(2)後の試験群と、被験物質を投与しないこと以外は試験群と同様の処置を施した対照群について、毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーSenescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal)、p53又はp16、の発現又は活性を検出するステップ;及び
(4)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群において前記老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の有効性の指標となるステップ;
を含む、請求項1に記載の評価法。 - 以下のステップ:
(i)生体から採取された毛根組織又はヒト若しくは非ヒト哺乳動物皮膚3次元モデルを用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(ii)試験群を被験物質の存在下で培養するステップ;
(iii)ステップ(ii)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、毛根ケラチノサイト幹細胞での老化関連マーカーSenescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal)、p53又はp16、の発現又は活性を検出するステップ;及び
(iv)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群において前記老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の有効性の指標となるステップ;
を含む、請求項1に記載の評価法。 - 以下のステップ:
(a)HaCaT細胞を用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(b)試験群を被験物質の存在下で培養するステップ;
(c)ステップ(b)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、前記HaCaT細胞での老化関連マーカーSenescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal)、p53又はp16、の発現又は活性を検出するステップ;及び
(d)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群において前記老化関連マーカーの発現又は活性の変化を認めることが被験物質の有効性の指標となるステップ;
を含む、脱毛又は白髪に対する薬効の評価法。 - 以下のステップ:
(A)HaCaT細胞を用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(B)老化を誘導する条件下且つ被験物質の存在下で試験群を培養するステップ;
(C)ステップ(B)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、前記HaCaT細胞での老化関連マーカーSenescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal)、p53又はp16、の発現又は活性を検出するステップ;及び
(D)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、試験群と対照群の間で前記老化関連マーカーの発現又は活性に相違を認めることが被験物質の有効性の指標となるステップ;
を含む、脱毛又は白髪に対する薬効の評価法。 - 以下のステップ:
(a)HaCaT細胞を用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(b)試験群を被験物質の存在下で培養するステップ;
(c)ステップ(b)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、前記HaCaT細胞での老化関連マーカーエンドセリンの発現又は活性を検出するステップ;及び
(d)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、対照群よりも試験群の方がエンドセリンの値が高い場合に、被験物質が薬効を示すと判定するステップ;
を含む、脱毛又は白髪に対する薬効の評価法。 - 以下のステップ:
(A)HaCaT細胞を用意し、試験群と対照群に分けるステップ;
(B)老化を誘導する条件下且つ被験物質の存在下で試験群を培養するステップ;
(C)ステップ(B)後の試験群と、被験物質が非存在下であること以外は同一の条件で培養した対照群について、前記HaCaT細胞での老化関連マーカーエンドセリンの発現又は活性を検出するステップ;及び
(D)試験群と対照群の間で検出結果を比較し、比較結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、対照群よりも試験群の方がエンドセリンの値が高い場合に、被験物質が薬効を示すと判定するステップ;
を含む、脱毛又は白髪に対する薬効の評価法。 - 以下のステップ:
(5)請求項1〜7のいずれか一項に記載の評価法によって有効性を示した被験物質を有効な物質として選抜するステップ、
を含む、脱毛又は白髪の予防又は治療に有効な物質のスクリーニング方法。
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